JP5052451B2 - 細胞測定装置および細胞測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞測定装置および細胞測定方法に関するものである。

従来、染色された測定対象の細胞を含有する培養液に近赤外光を照射して、培養液からの反射光または透過光を受光して分析する分光分析装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。この特許文献１の分光分析装置によれば、培養液と細胞との屈折率の違いから得られた位相差値の分布に基づいて細胞の形状や大きさを測定することができる。

特開２００３−１４９１４４号公報

この特許文献１の分光分析装置を用いれば、培養液と細胞との屈折率の違いから得られた位相差値の分布に基づいて細胞の存在する領域の形状や大きさを測定することができる。
しかしながら、培養中の細胞は密集して成長することが多いため、隣接する細胞どうしが近接しており、相互に影響を及ぼし合って輪郭形状を歪めてしまっている。このため、単に密集した細胞群の輪郭形状をそのまま、あるいは分割して抽出しただけでは、正確な細胞の形状や大きさを測定することはできないという問題がある。また、細胞が密集していない場合であっても、例えば、培養容器の底面に付着している細胞とその上方で培養液内を浮遊している細胞との関係のように、平面視等による見かけ上、複数の細胞同士が重畳し、各細胞の正確な輪郭形状を測定することが困難な場合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、密集している細胞群や観察時の見かけ上重畳している細胞群等から個々の細胞の大きさおよび形状を正確に測定することができる細胞測定装置および細胞測定方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、入力された細胞集合体の２次元的な位相差分布に基づいて、該位相差がピークをとる位置を細胞候補として特定する候補特定部と、該候補特定部により特定された細胞候補を含む領域の境界であって、他の細胞候補を含む領域と隣接しない境界線を抽出する境界線抽出部と、前記候補特定部により特定された細胞候補の周囲において位相差値が等しい点を結んで得られた環状の等位相差線の内、隣接する他の細胞候補の周囲に形成される等位相差線と交差しない等位相差線の形状を抽出する形状抽出部と、該形状抽出部により抽出された等位相差線を、その形状を維持したまま、前記境界線抽出部により抽出された境界線に接触するかまたは該境界線との差が最小となる位置まで拡大して細胞の輪郭を予測する輪郭予測部とを備える細胞測定装置を提供する。

本発明によれば、細胞集合体の２次元的な位相差分布が入力されると、候補特定部により位相差がピークをとる位置が細胞候補として特定され、境界線抽出部により細胞候補を含む領域の境界が抽出される。細胞集合体の位相差分布は、細胞を構成する物質の屈折率の相違に基づいて発生するため、材質の変化や厚さの変化の情報を含んでいる。位相差値がピークとなる位置は屈折率の大きな細胞核が存在することが多い。したがって、位相差値がピークをとる位置の周囲に細胞が存在し、その領域の境界線のうち他の細胞候補を含む領域と隣接しない境界線は各細胞の境界線の一部となる。

また、位相差値はピークとなる細胞候補位置から全方向に向かって滑らかに下降する。したがって、細胞候補の周囲には、境界線までの間に、複数の同心の環状の等位相差線を形成することができる。境界線抽出部により抽出された境界線のうち他の細胞候補を含む領域と隣接する境界線の近傍においては、細胞間の相互作用により細胞の本来の形状から歪んだ形状となっている。そこで、形状抽出部が、環状の等位相差線の内、隣接する他の細胞候補の周囲に形成される等位相差線と交差しない等位相差線の形状を抽出することにより、大きさのみ異なる細胞本来の輪郭形状を得ることができる。

そして、輪郭予測部により、形状抽出部により得られた細胞本来の輪郭形状を、境界線抽出部により抽出された他の細胞候補を含む領域と隣接しない境界線に接触するかまたは該境界線との差が最小となる位置まで拡大することにより、細胞本来の輪郭形状および大きさを有する細胞の形態を精度よく測定することができる。

また、本発明は、入力された細胞集合体の２次元的な位相差分布に基づいて、該位相差がピークをとる位置を細胞候補として特定する候補特定ステップと、該候補特定ステップにより特定された細胞候補を含む領域の境界であって、他の細胞候補を含む領域と隣接しない境界線を抽出する境界線抽出ステップと、前記候補特定ステップにより特定された細胞候補の周囲において位相差値が等しい点を結んで得られた環状の等位相差線の内、隣接する他の細胞候補の周囲に形成される等位相差線と交差しない等位相差線の形状を抽出する形状抽出ステップと、該形状抽出ステップにより抽出された等位相差線を、その形状を維持したまま、前記境界線抽出ステップにより抽出された境界線に接触するかまたは該境界線との差が最小となる位置まで拡大して細胞の輪郭を予測する輪郭予測ステップとを含む細胞測定方法を提供する。

本発明によれば、密集している細胞群や観察時の見かけ上重畳している細胞群等から個々の細胞の大きさおよび形状を正確に測定することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る細胞測定装置１および細胞測定方法について、図１〜図９を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞測定装置１は、細胞Ａの大きさ（面積）を測定する装置であって、例えば、培養容器内において培養されている状態の多数の細胞Ａ群（細胞集合体）から個別の細胞Ａの大きさを測定する装置である。なお、細胞Ａ群とは、複数（本実施形態では３個）の細胞Ａが直接的に接触している状態以外にも、例えば、培養容器の底面に付着している細胞とその上方で培養液内を浮遊している細胞との関係のように、測定方向（例えば、平面視）で複数の細胞が重畳している状態等も含むものである。

本実施形態に係る細胞測定装置１および細胞測定方法は、図１および図２に示されるように、細胞群の位相差分布を示す位相差画像が入力され、該位相差画像から細胞候補を特定する（ステップＳ１）候補特定部２と、該候補特定部２において特定された細胞候補を含む領域の境界線を抽出する（ステップＳ２）境界線抽出部３と、細胞の形状を抽出する（ステップＳ３）形状抽出部４と、該形状抽出部４により抽出された細胞の形状と前記境界線抽出部３により抽出された境界線とに基づいて細胞Ａの輪郭形状を予測する（ステップＳ４）輪郭予測部５とを備えている。

位相差画像は、例えば、透明な培養容器の底面に接着して培養されている細胞Ａ群に対して、近赤外光を透過させることにより得られた透過光と、細胞Ａ群を透過させていない近赤外光からなる参照光とを干渉させることにより得ることができる。屈折率の大きな物質を透過した近赤外光の位相は屈折率の小さな物質を透過した近赤外光の位相よりも遅れているので、位相差の分布が発生する。また、観察対象の屈折率が均一な場合には、厚さ寸法が異なることで、同様に位相差の分布が発生する。

位相差画像は、上述した光の干渉により取得することにしてもよいし、焦点位置をずらした少なくとも２枚の画像から、例えば、オーストラリア特許出願公開第２００４２０１１０９号公報に示される方法を用いて計算により求めることにしてもよい。

候補特定部２は、図３に示されるように、まず、位相差画像が入力される（ステップＳ１１）と、入力された位相差画像に対して、平滑化処理（ステップＳ１２）を行った後に、２値化処理（ステップＳ１３）を行うようになっている。平滑化処理は、入力された位相差画像に含まれるノイズや細胞表面の形状による細かな凹凸の影響を除去するために行われるもので、平滑化フィルタ、ガウシアンフィルタあるいはバイラテラルフィルタ等の公知のフィルタによって行われる。これにより、位相差の細かい変動を無くした平滑化位相差画像を得ることができる。また、２値化処理は、平滑化位相差画像に対して、背景（例えば、シャーレの底面）か細胞かを区別する程度の閾値によって位相差画像を２つに区分けするものである。

次に、候補特定部２は、このようにして２値化処理された位相差画像において、背景ではないとされた各抽出領域に対してラベリング処理（ステップＳ１４）を行うようになっている。ラベリング処理は、８連結処理でも４連結処理でもよい。

この段階で１つのラベルに対し１つの細胞がラベリングされるケースもあれば、１つのラベルに対して複数の細胞がラベリングされるケースもある。すなわち、複数の細胞が相互に近接している場合に、細胞の輪郭どうしが接触しており、２値化された場合に単一の領域として抽出されてしまう場合がある。

さらに、候補特定部２は、ラベルが付された各抽出領域について、対応する平滑化位相差画像内を探索し、図４に示されるように、位相差がピークとなる位置Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３を細胞候補として特定するようになっている（ステップＳ１５）。さらに具体的には、各抽出領域に含まれる平滑化位相差画像内の任意の画素を注目画素として選択し、該注目画素に対応づけられている位相差値が、注目画素の周囲８個の近傍画素に対応づけられている位相差値のいずれよりも大きい場合に、その注目画素を細胞候補として特定するようになっている。

一方、該注目画素に対応づけられている位相差値が、注目画素の周囲８個の近傍画素に対応づけられている位相差値のいずれかよりも小さい場合には、注目画素をずらして同様の特定作業を行い、これをくり返すようになっている。これにより、ラベルが付された全ての抽出領域内において、それぞれ１以上の細胞候補が特定されるようになっている。

境界線抽出部３は、細胞候補と背景との境界線Ｂ１については、上述した２値化により抽出するようになっている。これにより、細胞候補を含む領域が他の細胞領域を含む領域と隣接しない境界線Ｂ１（すなわち、細胞候補と背景との境界線Ｂ１）を抽出することができる。
細胞候補間の境界線Ｂ２については、分水嶺領域分割法を用いて、図５に示されるように、等位相差線Ｃどうしが接触する点を結ぶことにより抽出することとしてもよいが、本実施形態においては、抽出しなくてもよい。

形状抽出部４は、位相差画像と候補特定部２により特定された各細胞候補の位置Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３とを入力されて、各細胞候補を含む部分領域毎に等位相差線Ｃにより細胞の形状を抽出するものである。図５に示されるように、異なる細胞候補の位置Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３を取り囲む等位相差線Ｃが相互に接触しないものを選択することにより各細胞候補が属する各細胞Ａの形状を抽出するようになっている。

すなわち、位相差値は、細胞候補として特定されたピークの位置Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３から全方向にわたって滑らかに減少して境界線Ｂ１まで連続的に減少していく。この減少の過程では、細胞Ａはその本来の形状を備えている。そして、境界線Ｂ１に近接するにつれて、隣接する他の細胞候補の影響を受けて形状が歪んでいく。
したがって、図６に示されるように、形状抽出部４により、境界線Ｂ１において隣接する他の細胞Ａの等位相差線Ｃと接触する等位相差線Ｃよりも小さい等位相差線Ｃを選択することにより、細胞Ａ本来の大きさより小さく細胞Ａ本来の形状と相似な形状が抽出されることになる。

輪郭予測部５は、図７〜図８に示されるように、細胞候補毎に形状抽出部４により抽出された等位相差線Ｃが、境界線抽出部３により抽出された背景との境界線Ｂ１に接するまで拡大することにより、細胞本来の大きさおよび形状を有する輪郭線Ｃ′を予測するようになっている。ここで、拡大された等位相差線Ｃが境界線Ｂ１に接するとは、１箇所において接することとしてもよいが、背景との境界線Ｂ１として抽出された１以上の区間における境界線Ｂ１と拡大された等位相差線Ｃとの差が最も小さくなることを意味することとしてもよい。

この場合、等位相差線Ｃは実際上、所定の極小ピッチ毎に拡大されることから、上述した最も小さくなる状態とは、等位相差線Ｃと境界線Ｂ１の所定位置の内側との差（距離、間隔）が最小となる場合だけでなく、等位相差線Ｃの一部が境界線Ｂ１を越えた位置まで拡大された状態で、等位相差線Ｃと境界線Ｂ１の外側の所定位置との差が最小となる場合も含む。すなわち、輪郭予測部５は、拡大される等位相差線Ｃが境界線Ｂ１の内側の所定位置に接触もしくは最接近した状態、または、拡大される等位相差線Ｃが境界線Ｂ１の外側の所定位置に接触もしくは最接近した状態の内、いずれかの状態まで等位相差線Ｃを拡大することにより輪郭線Ｃ′を予測するように構成してもよい。さらに、等位相差線Ｃの一部が境界線Ｂ１の一部を超えた状態で、１以上の区間において等位相差線Ｃが境界線Ｂ１に接触するかまたはその差が最小となった状態としてもよい。

このように、本実施形態に係る細胞測定装置１および細胞測定方法によれば、単に位相差画像の２値化により細胞Ａを特定するのではなく、複数の細胞Ａが密集して相互に輪郭形状を歪めている場合や、複数の細胞Ａが観察時の見かけ重畳している場合等においても、細胞Ａ本来の大きさおよび形状を予測することができ、正確な面積を測定することができるという利点がある。

なお、本発明は上記実施形態に限らず、本発明の要旨を逸脱することなく、種々の構成を採り得ることは言うまでもない。
例えば、上記実施形態では、細胞候補間の境界線Ｂ２については必ずしも抽出しなくてもよいとしたが、測定条件等によっては境界線Ｂ２を抽出し、各境界線Ｂ２と各位置Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３との位置関係を比較することにしてもよい。これにより、各細胞Ａ（細胞候補）を一層正確に特定するように構成することもできる。すなわち、例えば、隣り合う２本の境界線Ｂ２間に位置Ｐ１，Ｐ２の２点が含まれている場合には、位置Ｐ１等の誤検出等の可能性を把握することができる。

また、例えば、輪郭予測部５による輪郭線Ｃ′の予測工程において、等位相差線Ｃを拡大し境界線Ｂ１との接触等を判定する際に、等位相差線Ｃが境界線Ｂ２と交差していることを必要条件として設定することで、細胞Ａの本来形状の予測精度の向上を図ることもできる。図７〜図９により明らかなように、通常、細胞Ａ本来の形状は、隣接する他の細胞Ａとの境界線Ｂ２を越える大きさにあると予測できるからである。

本発明の一実施形態に係る細胞測定装置を示すブロック図である。 図１の細胞測定装置による細胞測定方法を示すフローチャートである。 図２の細胞候補特定ステップを示すフローチャートである。 図３の細胞候補特定ステップにより、細胞群の中に特定された細胞候補の位置および境界線を示す図である。 細胞群の中に図４において特定された細胞候補を含む等位相差線を示す図である。 図５に示された等位相差線から細胞候補毎に抽出された形状を細胞群の中に示す図である。 図６により抽出された形状を拡大して予測された一の細胞の輪郭を示す図である。 予測された他の細胞の輪郭を示す図７と同様の図である。 予測された他の細胞の輪郭を示す図７と同様の図である。

符号の説明

Ａ 細胞
Ｂ１，Ｂ２ 境界線
Ｃ 等位相差線
Ｃ′ 輪郭線
Ｓ１ 候補特定ステップ
Ｓ２ 境界線抽出ステップ
Ｓ３ 形状抽出ステップ
Ｓ４ 輪郭予測ステップ
１ 細胞測定装置
２ 候補特定部
３ 境界線抽出部
４ 形状抽出部
５ 輪郭予測部

Claims (2)

1. 入力された細胞集合体の２次元的な位相差分布に基づいて、該位相差がピークをとる位置を細胞候補として特定する候補特定部と、
   該候補特定部により特定された細胞候補を含む領域の境界であって、他の細胞候補を含む領域と隣接しない境界線を抽出する境界線抽出部と、
   前記候補特定部により特定された細胞候補の周囲において位相差値が等しい点を結んで得られた環状の等位相差線の内、隣接する他の細胞候補の周囲に形成される等位相差線と交差しない等位相差線の形状を抽出する形状抽出部と、
   該形状抽出部により抽出された等位相差線を、その形状を維持したまま、前記境界線抽出部により抽出された境界線に接触するかまたは該境界線との差が最小となる位置まで拡大して細胞の輪郭を予測する輪郭予測部とを備える細胞測定装置。
2. 入力された細胞集合体の２次元的な位相差分布に基づいて、該位相差がピークをとる位置を細胞候補として特定する候補特定ステップと、
   該候補特定ステップにより特定された細胞候補を含む領域の境界であって、他の細胞候補を含む領域と隣接しない境界線を抽出する境界線抽出ステップと、
   前記候補特定ステップにより特定された細胞候補の周囲において位相差値が等しい点を結んで得られた環状の等位相差線の内、隣接する他の細胞候補の周囲に形成される等位相差線と交差しない等位相差線の形状を抽出する形状抽出ステップと、
   該形状抽出ステップにより抽出された等位相差線を、その形状を維持したまま、前記境界線抽出ステップにより抽出された境界線に接触するかまたは境界線との差が最小となる位置まで拡大して細胞の輪郭を予測する輪郭予測ステップとを含む細胞測定方法。

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