JP5048838B2 - ヒト敗血症を測定する方法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、体液中の膵石タンパク質／再生タンパク質（ＰＳＰ／ｒｅｇ）の濃度に基づいてヒトにおける全身性感染症の予測および／または診断、特に敗血症の発症の予測のための方法、および測定キットに関する。

発明の背景
重症外傷に対する全身性の応答には、先天性免疫、炎症反応および細胞活動に影響する多くのパラメータが含まれる。重症外傷患者には、感染症のない良性の結果を示す者もいれば、感染症または敗血症に苦しむ者もいる。敗血症は複数の臓器不全を伴い、死亡率が高い。敗血症の診断のために最も広く用いられているマーカーとしては、白血球数、Ｃ反応性タンパク質およびプロカルシトニンがある。後の２つは、外傷後に多く誘導されるが、機能はまだ知られていないタンパク質である。また、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１８などのサイトカインも患者の観察に利用されている。しかしながら、上記のマーカーのいずれも、敗血症を含む感染症について予測する指標としては働かず、治療は敗血症が発症してからと遅れる。

動物パイロット実験において、膵臓組織の損傷がない場合であっても、取り扱いのストレスで膵タンパク質が誘導されることがわかっている（非特許文献１）。このタンパク質、膵石タンパク質／再生タンパク質（ＰＳＰ／ｒｅｇ）は、レクチン結合タンパク質のファミリーに属する。急性または慢性の膵炎の状態において、このタンパク質は高度にアップレギュレートされて血清中に現れることもある。このタンパク質の調節は他の酵素前駆体のように単に食誘導性分泌には限定されないので、他の状態、たとえば膵炎の間に上昇が見られることもある。したがって、現在までこのタンパク質の研究は主に膵臓内について行われてきた。このタンパク質は小腸のパネート（ＰＡＮＥＴＨ）細胞および胃底細胞中でも合成されている。ＰＳＰ／ｒｅｇの機能については、いまだに論争が盛んに行われているが、一般には再生過程における細胞増殖の促進に関与していると見られている（非特許文献２）。

ＰＳＰ／ｒｅｇを疾病マーカーとして確立するための努力が行われてきている。血清濃度は様々な胃腸疾患において上昇するために、血清値と特定の疾病の存在との相関性を確立することはこれまでのところできていない（非特許文献３）。

発明の概要
本発明は、ヒトにおける全身性感染症の予測および／または診断、特に敗血症の発症の予測のための方法に関し、膵石タンパク質／再生タンパク質（ＰＳＰ／ｒｅｇ）の濃度を体液試料中で測定し、高濃度であることを敗血症の発症についての当該疾患の初期における指標とする。また、本発明は、体液中のＰＳＰ／ｒｅｇ濃度を測定する方法、およびそのような方法のための部品からなるキットに関する。

アール グラーフ（R. Graf）ら、J SurgRes、２００２年、１９５巻、１３６〜１４４頁 ワイ キノシタ（Y. Kinoshita）ら、J. Gastroenterol、２００４年、３９巻、５０７〜５１３頁 ワイ サトムラ（Y. Satomura）ら、J Gastroenterol、１９９５年、３０巻、６４３〜６５０頁

重症外傷を負った患者の入院後の血清中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）値の測定。次のように遡及的（retrospectively）に患者を分類した。感染症なし（白抜きボックス、ｎ＝１４）、感染症を伴った患者（斜線ボックス、ｎ＝２２）、敗血症を伴った患者（黒ボックス、ｎ＝２７）。３つの群のＣＲＰ値（ｌｏｇ_１０ｎｇ／ｍＬ）を平均および９５％信頼区間とともにボックスプロットとしてプロットしている。ｄ＝外傷後の日数。統計分析は、多変量解析を用いて行った。ｐ＝有意性、＊＝非感染に対する敗血症のｐ値。 重症外傷を負った患者の入院後の血清中のＩＬ−６値の測定。患者の分類と、ボックスブロットにおけるＩＬ−６値（ｌｏｇ_１０ｐｇ／ｍＬ）の表示は、図１のＣＲＰ値についてと同様である。 重症外傷を負った患者の入院後の血清中のプロカルシトニン（ＰＣＴ）値の測定。患者の分類と、ボックスブロットにおけるＰＣＴ値（ｌｏｇ_１０ｎｇ／ｍＬ）の表示は、図１のＣＲＰ値についてと同様である。 膵石タンパク質／再生タンパク質（ＰＳＰ）の測定。０日における外傷後のＰＳＰ／ｒｅｇの時間的プロファイル。すべての値は各時点で合わせたものである。Ｃ（＝対照）は、健常な被験者についての値を示し、ｄは外傷後の日数である。 重症外傷を負った患者の入院後の血清中のＰＳＰ／ｒｅｇ値の測定。患者の分類と、白抜きボックス、斜線ボックスおよび黒ボックスの意味は、図１のＣＲＰ値についてと同様である。３つの群のＰＳＰ／ｒｅｇ値（ｎｇ／ｍＬ）を平均±ＳＥＭとしてプロットしている。ｄ＝外傷後の日数。 重症外傷を負った患者の入院後の血清中のＰＳＰ／ｒｅｇ値の測定。患者の分類と、ボックスブロットにおけるＰＳＰ／ｒｅｇ値（ｎｇ／ｍＬ）の表示は、図１のＣＲＰ値についてと同様である。ｐ＝有意性、＊＝非感染に対する敗血症のｐ値。

発明の詳細な説明
本発明は、ヒトにおける全身性感染症の予測および／または診断、特に敗血症の発症の予測のための方法に関し、膵石タンパク質／再生タンパク質（ＰＳＰ／ｒｅｇ）の濃度を体液試料、たとえば血清中で測定し、高濃度であることを敗血症の発症についての当該疾患の初期における指標とする。

ＰＳＰ／ｒｅｇ濃度を測定するのに有用な血清以外の体液は、たとえば、全血、尿、唾液、脳脊髄液、涙液、汗、乳、または固体組織または糞便からの抽出物である。
ついての指標となるＰＳＰ／ｒｅｇ濃度は、測定のために選ばれた体液に依存する。血清に関して、この濃度は３日目、４日目または５日目において６０〜８０ｎｇ／ｍＬである。したがって、より詳細には本発明は、敗血症の発症の予測および／または診断の方法に関し、膵石タンパク質／再生タンパク質（ＰＳＰ／ｒｅｇ）の濃度を血清中で測定し、３日目、４日目または５日目に６０ｎｇ／ｍＬ以上の濃度、特に８０ｎｇ／ｍＬ以上の濃度であることを敗血症の発症の指標とする。

体液中のＰＳＰ／ｒｅｇの濃度を測定するためには任意の既知の方法を用いることができる。考えられる方法としては、たとえば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ，質量分析、またはマイクロアレイ分析がある。こうした方法は、たとえば敗血症などの全身性感染症の診断に用いられる場合、本発明のさらなる目的である。

ヒト体液、たとえば血清中のＰＳＰ／ｒｅｇの測定のための好ましい方法は、ＥＬＩＳＡである。本発明の一実施形態において、ＰＳＰ／ｒｅｇＥＬＩＳＡは、サンドイッチアレイからなる。従来のマイクロタイタープレートをＰＳＰ／ｒｅｇに対する一種類の抗体（「第１」の抗体）、たとえばモルモットポリクローナル抗体で被覆する。その後、このプレートをブロックし（block）、試料または標準を入れる。インキュベーションの後、ＰＳＰ／ｒｅｇに対する異なる種類の抗体（「第２」の抗体）、たとえばポリクローナルウサギ抗体を与える。その後、特定の種類の「第２」の抗体を検出する第３の抗体、たとえば、発色検出用の酵素などの適当な標識と結合した抗ウサギ抗体を加える。最後に、ＰＳＰ／ｒｅｇの有無および量の尺度となる標識の検出および定量のために、このプレートを標識についての基質で展開（develop）する。標識が発色検出用の酵素の場合、基質は共役酵素の発色性基質である。そしてこの色反応をマイクロプレートリーダにおいて検出し、標準と比較する。
当な抗体のペア（「第１」および「第２」の抗体）は、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ニワトリ、ロバ、またはウマの組み合わせである。ポリクローナル抗体が好ましいが、モノクローナル抗体または抗体断片を用いることもできる。適当な標識は、発色標識、すなわち検出可能な着色または蛍光化合物に基質を変化させるのに用いうる酵素、分光学的標識、たとえば蛍光標識または可視色を呈する標識、標識に特異的なさらなる化合物によって形成可能であって容易な検出および定量を可能にするアフィニティ標識、または標準的なＥＬＩＳＡにおいて使用される他の標識である。

ＰＳＰ／ｒｅｇ検出の他の好ましい方法は、単一の抗体を用いた放射免疫測定または競合免疫測定、および市販の自動分析ロボットでの化学発光検出である。微粒子増強蛍光、蛍光偏光法、または質量分析を用いてもよい。検出装置、たとえばマイクロアレイは、ＰＳＰ／ｒｅｇの読み取り装置として有用な部品である。

本発明はさらに、全身性感染症の診断／予測用にＰＳＰ／ｒｅｇを測定するための部品からなるキットに関し、たとえば、装置と、試薬と、ＰＳＰ／ｒｅｇの標準溶液とを含む。考えられる装置としては、たとえば、ＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート、プレコートされたＥＬＩＳＡプレート、およびプレートカバーが挙げられる。試薬は、ＰＳＰ／ｒｅｇの検出のために特別に開発および設計された試薬である。ＰＳＰ／ｒｅｇの標準溶液は、好ましくは、以下の説明に従って合成されるＰＳＰ／ｒｅｇを含む。部品からなるキットは、ピペットなどのさらなるハードウェア、バッファやブロッキング溶液などの溶液、フィルタ、カラーテーブル、および使用説明書を含んでいてもよい。
臓ｍＲＮＡからクローニングし、酵母発現ベクターにサブクローニングすることができる。タンパク質はＡＤＨの制御下で発現させることができる。適当な発現培地は、ＰＳＰ／ｒｅｇの分泌を誘導および維持するためにメタノールを含んでいてもよい。ＰＳＰ／ｒｅｇは好ましくは、ｐＨおよび塩勾配によりＳＰ−セファロース−セルロースを用いて精製される。このような精製ＰＳＰ／ｒｅｇは、体液中のＰＳＰ／ｒｅｇ濃度と比較するための標準溶液を調製するのに用いられる。このタンパク質に対するポリクローナル抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリ、ロバ、ウマおよびモルモットまたは他の適当な動物から標準的な方法を用いて得ることができる。

敗血症の発症初期の段階において血清中のＰＳＰ／ｒｅｇが増加する理由は、完全には分かっていない。ラットのパイロット実験において、膵臓の損傷がない場合にＰＳＰ／ｒｅｇ合成の増加が観察され、他の臓器への有意な外傷性損傷がＰＳＰ／ｒｅｇの血中濃度の増加に繋がることが明白となった。さらなる研究のために、重症外傷を負っているが明らかな膵臓損傷の無いヒト患者の組を選んだ（実施例を参照）。血清中へのＰＳＰ／ｒｅｇの出現は、膵液からのタンパク質を血液中へそらす経路変更を意味するものであろう。また、レクチン結合ファミリー（たとえば、膵炎関連タンパク質）の一部がサイトカインによって誘導可能であることも分かっている。外傷後にはサイトカインが強力にかつ協調して作用する。多くの異なるサイトカインが放出されるサイトカイン応答の複雑性は理解されていない。したがって、ＰＳＰ／ｒｅｇは、全身性のストレスまたは外傷の状況下で上昇するサイトカインに対して反応すると思われる。これに対し、たとえばアミラーゼやリパーゼなどの他の膵酵素はサイトカインによって調節されないらしく、それらの血液中への出現は迂回のみによるものである。血清中のＰＳＰ／ｒｅｇ濃度は、敗血症の信頼できる指標であることがここで示されている。血中のＰＳＰ／ｒｅｇの増加は、特異的なストレス応答を意味するのであろう。

炎症の他の指標とは違ってＰＳＰ／ｒｅｇの濃度は、敗血症の臨床徴候が明白となる間または前に患者において高度に増加することが分かっている。血清ＰＳＰ／ｒｅｇの検出および定量は、たとえば、１００ｐｇ／ｍＬ未満の検出限界を有するサンドイッチＥＬＩＳＡによって行われる。正常な血清値は５〜１５ｎｇ／ｍＬである。重症外傷を負った患者は、その外傷の原因となった事故の７〜１０日後に敗血症を発症する。血清値は、敗血症の重症度と相関する。それは２００ｎｇ／ｍＬを超えることもある。ＰＳＰ／ｒｅｇ値は、敗血症の臨床徴候が得られる以前に３日目から５日目に増加し始め、６０〜８０ｎｇ／ｍＬを超える値に達する。これらの値は、患者が敗血症を発症するかどうか、したがって高額な抗生物質による治療や集中治療室に滞在することを含む集中治療の必要性の予測を可能にする。市販の診断的測定と比べて、ＰＳＰ／ｒｅｇＥＬＩＳＡは、推定敗血症患者をモニタするのに著しく優れている。

実施例
ＰＳＰ／ｒｅｇの単離とサブクローニング
ＰＳＰ／ｒｅｇに特異的な抗体の生産のためのｃＤＮＡを得るべく、最先端の実験手法を用いて、膵臓ｍＲＮＡの逆転写によりそのようなｃＤＮＡを調製する。ＰＳＰ／ｒｅｇをコードする配列に特異的なプライマーを用いて、ＰＳＰ／ｒｅｇのｃＤＮＡを選択的に増幅させるＰＣＲ反応を行う。伸長プライマーを用いてこのＰＣＲ反応を繰り返し、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）トランスフェクションベクターへの挿入に特異的な配列を付加する。プライマーは、アルファ接合因子のシグナルペプチドのコーディング領域を、ＫＥＸ２部位および成熟ヒトＰＳＰ／ｒｅｇのコーディング領域に融合させるように設計される。ピキア・パストリスベクターへのサブクローニングは２段階法である。まず、ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ベクター（インビトロジェン（Invitrogen）、ＴＡクローニング）にライゲーションし、配列を確認する。次に、このＰＣＲ産物をＸｈｏｌ／Ｎｏｔｌの制限消化により切断し、トランスファーベクターｐＰＩＣ９（インビトロジェン）にライゲーションする。ピキア・パストリスＫＭ７１株（インビトロジェン）を形質転換し、組み換えタンパク質の拡張および生産のために最も生産的なクローンを選択する。

ＰＣＲ増幅およびサブクローニングに用いたプライマー
ヒトＰＳＰ／ｒｅｇ／ｒｅｇ１アルファ
順方向プライマー
５’ＧＡＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＣＡＧＡＧＴＴ３’（配列番号１）
５’ＧＴＡＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡ３’（伸長）（配列番号２）
逆方向
５’ＣＴＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＣＴＴＧＣＡＴＡＣ３’（配列番号３）
ヒトＰＳＰ／ｒｅｇ／ｒｅｇ１ベータ
順方向プライマー
５’ＧＡＡＡＡＧＡＣＡＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＡＧＣＴＧ３’（配列番号４）
５’ＧＴＡＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＣＡＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＡＣ３’（伸長）（配列番号５）
逆方向プライマー
５’ＡＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＴＴＣＴＡＧＡＣ３’（配列番号６）
タンパク質の大量発現
単一のコロニーを用い、２５０ｍＬのバッフル付きフラスコ中の２５ｍＬのＢＭＧ（緩衝化最小グリセロール、１００ｍＭリン酸カリウム ｐＨ６．０、１．３４％酵母窒素塩基、４×１０^−５％ビオチン、１％グリセロール）に植え付け、２９℃の振盪培養器（３００ｒｐｍ）中で一晩培養する。この培養液の１０ｍＬを、３リットルバッフル付きフラスコ中の１リットルのＢＭＧに接種し、２９℃にて一晩培養（３００ｒｐｍ）する。室温で５分間、１５００〜３０００×ｇの遠心分離により細胞を回収する。同じバッフル付きフラスコ中の１／５容積（２００ｍＬ）のＢＭＭ（緩衝化最小メタノール、グリセロールが０．５％メタノールに置換されたＢＭＧ）に細胞を再懸濁することにより、発現を誘導する。誘導の最適時間に達するまでの２４時間毎に１００％メタノールを加え、０．５％（１ｍＬ）の濃度を得る。室温で１５００〜３０００×ｇの遠心分離により細胞を回収する。培地の上清を回収し、ペプチドの精製まで冷凍しておく。

ポリペプチドを培地の上清から精製する。培地の上清を蒸留水で１：３に希釈する。ｐＨはＨＣｌを用いてｐＨ３．５に調整する。培地の上清をＳＰ−セファロースカラムにアプライし、塩およびｐＨ勾配（１０ｍＭ ＬｉＣｌ、５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．３開始バッファ、２Ｍ ＬｉＣｌ、５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．３終了バッファ）によって溶出する。画分を回収し、ＳＤＳゲル電気泳動によって分析する。最も高く純度も大きいタンパク質含量を有する画分を合わせ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５に対して透析する。ポリペプチドの配列をＮ末端配列決定法により確認し、アミノ酸分析によって濃度を判定する。

ＰＳＰ／ｒｅｇＥＬＩＳＡ
トータルのＰＳＰ／ｒｅｇの測定には、組み換えヒトＰＳＰ／ｒｅｇに対して産生されたモルモット抗血清および同じタンパク質に対するウサギ抗血清に基づいたサンドイッチＥＬＩＳＡを用いてもよい。ウサギ抗体の特異性および感受性を高めるために、プロテインＡビーズ（ハイトラップ（HiTrap）（登録商標）、ファルマシア（Pharmacia））のカラム上への吸着によってＩｇＧを精製する。ハイトラップ（登録商標）カラムは、ｐＨ７の２００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４によって平衡化する。同じバッファ溶液（最終濃度２０ｍＭ）を用いてウサギ抗血清をｐＨ調整してから、それをカラムに入れ、その後、１００ｍＭおよび１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８で連続して洗浄する。ＩｇＧ画分を０．１Ｍのクエン酸 ｐＨ３で溶出する。溶出画分は、１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．９ですぐに中和させる。

ＴＢＳ（１００μＬ／ウェル）に１：５００で希釈したモルモット抗ラットＰＳＰ／ｒｅｇ ＩｇＧ画分で、９６ウェルのマイクロタイタープレート（コスター（Costar）ＥＩＡプレート、平底、高結合性）を一晩の間、４℃で被覆する。洗浄工程の後、プレートを１５０μＬの１％ＢＳＡ／ＴＢＳで１時間ブロックし、その後、異なる標準濃度の組み換えヒトＰＳＰ／ｒｅｇ（０、０．１、０．５、１．０、１．５、２．５、３．５または５．０ｎｇ／ｍＬ）１００μＬまたは希釈した試料１００μＬで置き換える。試料および標準を２サンプルずつ充填し、室温で１時間インキュベートする。繰り返し洗浄した後、１：５００に希釈した１００μＬのウサギ抗ラットＰＳＰ／ｒｅｇ ＩｇＧでプレートを１時間インキュベートする。もう一度洗浄してから、１００μＬの市販のマウスモノクローナル抗ウサギＩｇＧ抗体による３０分間のインキュベートを開始する（マウス抗ウサギアルカリホスファターゼ共役のＩｇＧ画分、１：１０００希釈、シグマ（Sigma）より購入）。次にプレートをもう一度洗浄し、アルカリホスファターゼバッファ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．８ｍＭ ＭｇＣｌ_２）に加えた可溶性ホスファターゼ基質、ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（シグマ１０４（登録商標）錠剤）を加える。約２０分間のインキュベーションの後、４０５ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）をＭＲＸマイクロプレートリーダ（ダイナテックラボラトリーズ（Dynatech Laboratories））において測定する。

すべての希釈物（コーティング抗体以外）は１％のＢＳＡ／ＴＢＳ中で調製する。室温でのすべてのインキュベーションは、回転式ＥＬＩＳＡプレート振盪機（タイトラマックス（Titramax）１００、ハイドルフ（Heidolph）、バイオブロックサイエンティフィック（Bioblock Scientific））上で行う。すべての洗浄工程は、自動マイクロタイタープレート洗浄機（ＭＲＷ、ダイナテックラボラトリーズ）を用いてＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％、ｖ／ｖ）によって行う。健常なボランティアに由来する希釈した血清への組み換えＰＳＰ／ｒｅｇの収率は以下の通りである。１：１０の希釈では７１％、１：２０の希釈では１８％、１：４０の希釈では９５％。プレート内およびプレート間での差異は、標準の範囲内の濃度（０．１〜３．５ｎｇ／ｍＬ）でそれぞれ５％未満および１０％未満である。

試験は、組み換えヒトＰＳＰ／ｒｅｇ１アルファを用いて行う。同じ技術を用いて、第２のアイソフォームである組み換えＰＳＰ／ｒｅｇ１ベータを作製した。ＰＳＰ／ｒｅｇ１ベータは、ＥＬＩＳＡによって同様によく認識される。したがって、ＥＬＩＳＡは、既知のＰＳＰ／ｒｅｇファミリーのタンパク質に対して特異的である。

原理を証明するための試験患者
調査する集団には、２００２年１月から２００３年９月の期間にチューリッヒ大学病院の外傷外科（レベルＩ外傷センター）に入院してきた６３人の負傷患者が含まれる。包含する基準は、外傷重症度スコア（ＩＳＳ）が１６点を超えること、患者年齢が１５歳を超えること、事故から入院までが４時間未満であること、集中治療室（ＩＣＵ）での監視下で５日を超えて生存したこととした。膵臓の損傷を有する患者は除外した。外傷二次救命処置（ＡＴＬＳ）ガイドラインおよび標準外傷プロトコールに従ってすべての患者を治療した。簡単に説明すると、気道の確保、通気、および心血管機能のモニタリングの後、体腔の減圧、出血および汚染の管理を含む救命処置を行った。続いて、根治的創面切除、コンパートメントの減圧、および殆どは外固定（「初日手術」）による大きな骨折の一次安定化を行った。その後、臓器機能の回復のために患者をＩＣＵに移した。注目すべきは、正常な腸内細菌叢および腸粘膜を維持するために、すべての患者が外傷後２４時間以内に経腸栄養摂取を受けたことである。陽性の細菌培養物によって感染病巣が確認された場合には、抗生物質を用いた。さらに、開放骨折に対しては、標準的な抗生物質を５日間与え、骨折の骨接合術に対する予防としてセファロスポリンを単発で与えた。

表１は、入院日における人口学的データおよび外傷スコアをまとめたものである。外傷の重症度と性別分布は非常に類似していた。

外傷患者の血液状態
ａ）非感染、ｂ）感染症、およびｃ）敗血症のスコアに基づいて遡及的に患者を３つの群に割り振る（表２）。炎症および外傷の程度を判定するために用いたいくつかのパラメータの経過を明らかにするために、血液白血球数およびＣ反応性タンパク質を測定した。重症度の群に関係なく、すべての患者が入院１日目に血液白血球の強い減少を示した。白血球は、１０日目で１８×１０^６／Ｌという有意に高い白血球数に達する敗血症患者を除いては、徐々に正常にまで増加する。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の同時測定によって、すべての群において、入院時の低い濃度から３日目の約１５０ｎｇ／ｍＬにまで徐々に増加することがわかった（図１）。非感染群は他の群に比べて一貫して低い濃度を有するが、３つの患者群を区別する明白なパターンはない。このように５日目と７日目の間、および１４日目と２１日目の間で、敗血症の患者は敗血症でない患者と比べて高いＣＲＰを示すが、その違いは２倍未満である。

外傷患者における炎症の標準指標の測定
一般的に用いられる炎症の指標、たとえばＩＬ−６（図２）やプロカルシトニン（ＰＣＴ、図３）が３つの重症度の群の間を区別することができるかどうかを調べるために、入院中の全期間にわたってこれらのタンパク質の血中濃度を測定した。ＩＬ−６は、外傷後すぐに増加して１日目に最高濃度に達した。最初の２日間は、敗血症群（１２００ｐｇ／ｍＬ）および感染症群（６００ｐｇ／ｍＬ）において非感染群よりも高く、３つの重症度の群で違いがみられた。５〜１０日目において差異があるが、データのばらつきが大きいために統計値は有意性を示さない。敗血症（３５０ｐｇ／ｍＬ）の期間中にわずかな増加が見られるが、これらの濃度は入院１日目と比べて低い。

ＰＣＴは、敗血症の以前および最中の敗血症患者で２０倍にまで明らかに増加したが、他の群では０．５〜２ｎｇ／ｍＬ前後の濃度に留まっている（図３）。ＰＣＴの最大の増加は健常者の２５倍であった。試料中の大きなばらつきのために統計値は有意差を示さない。

ＰＳＰ／ｒｅｇは外傷後にアップレギュレートされる
ＰＳＰ／ｒｅｇは、大部分は膵臓および腸内で合成される。局所的な組織損傷に応答して、それは高度にアップレギュレートされる。膵臓組織の損傷がない場合には、ＰＳＰ／ｒｅｇがアップレギュレートされることはないと予想される。しかしながら、ＰＳＰ／ｒｅｇの発現および分泌に影響しうるサイトカインの放出が多発性外傷により起こる。したがって、膵臓の損傷はないが重症外傷を負っている患者においてこれらのタンパク質が増加しているかどうかを調べた。多発性外傷後のすべての患者のいずれのデータも、０日目ならびに健常者に比べて、１日目に増加を示し、それが３日目に有意となっている（図４）。

このように、膵石タンパク質は、多発性外傷後にわずかに増加する。非感染の患者、感染症を伴った患者および敗血症を伴った患者に割り振った層別化を用いてデータを解析した。非感染の患者におけるＰＳＰ／ｒｅｇ値は、７〜１０日目がピークとなるようにわずかに増加した（図５Ａ、図５Ｂ）。感染症を示した多発性外傷の患者においては、さらなる増加が見られる。最後に、敗血症を示した多発性外傷の患者は、血清ＰＳＰ／ｒｅｇの大きな増加を示す。

増加は、敗血症の臨床基準が満たされる数日前に始まる。ＰＳＰ／ｒｅｇは敗血症に高度に相関している。患者がまだ敗血症でない３日目において、血中のＰＳＰの平均濃度は有意に増加して１００ｎｇ／ｍＬを超え、敗血症の期間中には約２０倍に達する（図５Ａ、図５Ｂ、５〜１０日目）。

したがって、敗血症を伴った患者におけるＰＳＰ／ｒｅｇの初期の増加は、敗血症を予測するための血清マーカーとして用いることができる。したがって、特異性、正および負の予測値は、３日目および５日目における３つの潜在的なカットオフ値、たとえば３０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬおよび８０ｎｇ／ｍＬに集約される。特異性は、６０ｎｇ／ｍＬおよび８０ｎｇ／ｍＬのカットオフ値の８０％前後である。上記正および負の値もまた６０〜８０％であり、本方法によって早い時期に患者の識別を行うことができることが示される。

Claims (7)

1. 膵石タンパク質／再生タンパク質（ＰＳＰ／ｒｅｇ）を全身性感染症のマーカーとして使用する方法であって、ＰＳＰ／ｒｅｇの濃度を体液試料中で測定し、高濃度であることを敗血症の発症の指標とする方法。
2. ＰＳＰ／ｒｅｇ濃度を血清中で測定する、請求項１に記載の方法。
3. 外傷後敗血症の発症の指標となる前記高濃度が６０ｎｇ／ｍＬである、請求項２に記載の方法。
4. 敗血症の発症の指標となる前記高濃度が、外傷から３日目、４日目または５日目において８０ｎｇ／ｍＬである、請求項２に記載の方法。
5. ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ，質量分析またはマイクロアレイ分析によりＰＳＰ／ｒｅｇの濃度を測定する、請求項１に記載の方法。
6. サンドイッチＥＬＩＳＡによりＰＳＰ／ｒｅｇの濃度を測定し、マイクロタイタープレートをＰＳＰ／ｒｅｇに対する一種類の抗体で被覆した後、該プレートをブロックし、試料または標準を入れ、ＰＳＰ／ｒｅｇに対する第２の種類の抗体を与えた後、適当な標識と結合した特定の種類の第２の抗体を検出する第３の抗体を加え、前記標識はＰＳＰ／ｒｅｇの量を定量するのに用いられる、請求項１に記載の方法。
7. 前記サンドイッチＥＬＩＳＡにおける標識は発色検出用の酵素である、請求項６に記載の方法。

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