JP5038536B2 - 流路内の種を分析するための非感熱液状媒体 - Google Patents

Description

本発明は、「分離媒体」（“ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ”）として知られる流体において種（ｓｐｅｃｉｅｓ）を移行することが必要である方法により、種を分析、分離および精製する方法の領域に関する。

本発明は、少なくとも１つの寸法がサブミリメートル、そして通常２０μｍ〜２００μｍである流路（ｃｈａｎｎｅｌｓ）もしくは細管（ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ）（ここでは、以下、微小流路（ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｅｓ）という）内で種を分離するのに適した分離媒体を提案することに特に関する。本発明は、とくに、細管電気泳動、クロマトグラフィー、または微小流路において使用されるいかなる方法（細管電気泳動および細管クロマトグラフィー、微小流体系、ならびに「チップ実験室」（“ｃｈｉｐ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ”））によっても、生物学的巨大分子（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を分離もしくは分析する方法に関する。

以下に、「微小流体系」（“ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄ ｓｙｓｔｅｍ”）という表現は、流体および／または流体に含まれる種が、少なくとも１つの寸法がサブミリメートルである流路もしくは一連の流路内で移動される系をいい、そして「細管電気泳動（ＣＥ）」（“ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＣＥ）”）は種の輸送が電場の作用により行なわれる微小流体系をいう。

ＣＥおよび微小流体系は従来のゲル電気泳動法よりも高い分離能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）で比較的速い分離を可能にし、対流防止（ａｎｔｉｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ）媒体を必要とせず、そしてそれらの性質は液状媒体中でイオン分離を実施するのに広く使用されている。現在では、ＣＥにより実施される生物学的な巨大分子の分離の大多数は、必要なときはいつでも置換され得る利点を有する、結合された線状水溶性ポリマーの分離能を用いる。

多くの非架橋ポリマーが、流路内、特に細管電気泳動において、種を分離するための媒体として提案されている。所定の用途のための最良の選択はいくつかのパラメータに依存する。たとえば、それらのサイズに応じて被検体の分離のために、媒体が十分に抵抗性の位相的障害物を被検体に与えることが必要である（Ｖｉｏｖｙら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９９３，１４，３２２）。これは高度に結合され、そして比較的粘性のある分離媒体を含む。さらに、分離媒体中に存在するポリマーは被検体との引力相互作用を受けないことが必要である。この理由はこの種類の相互作用はある被検体の減速およびさらなる分散をもたらすからである（Ｈ．Ｚｈｏｕら、ＨＰＣＥ ２０００，Ｓａａｒｂｒｕｃｋｅｎ ２０〜２４／２／２０００）。このように、ＤＮＡ塩基配列決定について、またはタンパク分離について、マトリックスがもっと疎水性を有すると不十分な結果が得られることがよく知られている。

さらに、分離媒体としてコポリマーを使用することが文献で提案されている。ＭｅｎｃｈｅｎのＷＯ９４／０７１３３において、細管電気泳動における分離媒体として、「規則的」（“ｒｅｇｕｌａｒ”）といわれるブロックコポリマー型のコポリマーを含む媒体を使用することが提案されている。それらはポリマー間に重複濃度よりも高い濃度で、選ばれた本質的な均一な長さの親水性セグメントならびに多数の規則的に間隔をおかれた疎水性セグメントを有するので「規則的」である。これらの媒体はせん断を低下させる（ｓｈｅａｒ−ｔｈｉｎｎｉｎｇ）利点を有する。すなわち、それらは、高圧下で細管に導入され得るが、同時に外部圧力なしで固体位相障害物を示す。不幸にも、この原理にもとづいて使用され得る媒体は合成するのが困難であり、そのことはそれらを高価にし、意図され得る構造の型を制限する。さらに、これらのポリマーは比較的疎水性であり、たとえばＤＮＡ塩基配列決定のためにそれらの性能品質は並みである。

さらに、分離媒体として感熱媒体を使用することも提案され、その粘度は温度の増加時に大いに変化する。この種類の媒体は、低粘度の状態での第１の温度で細管に該媒体を注入すること、ならびにゲル電気泳動（特にアガロースを用いる）で通常実施されるように、良好な分離効率を示す比較的高い粘度の状態での第２温度で分離することを可能にする利点を有する。特許出願ＷＯ９４／１０５６１およびＷＯ９５／３０７８２は、温度を上昇させることによりもっと容易な注入を可能にする媒体を特に提案する。事実上、該特許出願は、高温で容積を減少させ（低粘度の不連続粒子の希釈溶液をもたらす）、そして低温で膨潤して分離流路を完全に充たす（このように媒体にゲル性と良好な分離性能を付与する）ことが可能なミクロゲルを本質的に記載する。特許出願ＷＯ９８／１０２７４自体は、少なくとも１種類のブロックコポリマーを含む分子分離媒体を提案し、それは第１の温度で溶液であり、第２の温度でゲル型状態である。記載される媒体は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン（ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥ）族、もっと具体的にはＰＯＥ_９９−ＰＯＰ_６９−ＰＯＥ_９９（指数は各ブロックのモノマー数を示す）（商標「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７」）の、低分子量（典型的には２０，０００未満）のトリブロックポリマーを含む。低温で、トリブロック系の末端の２つのＰＯＥセグメントは水溶性であり、そして、コポリマーの低分子量を付与され、その溶液は高濃度まで比較的非粘性である。温度を約１５〜２５℃上昇させることにより、中央のＰＯＰセグメントはもっと疎水性になり、そしてこれらのポリマーは会合してゲル型状態になる。しかし、このメカニズムは電気泳動においていくつかの難点を示す。第１に、それは１５ｇ／１００ｍＬもしくは２０ｇ／１００ｍＬより大きい、高いポリマー濃度でのみ、良好な電気泳動分離特性を与え、それは高い摩擦および長い移行時間をもたらす。さらに、温度の変化速度の関数としての特性の依存は結果の再現性をランダムにする。最後に、多くの用途および多くの装置について、流路の充填段階および分離段階の間で温度を変化させることは不都合、もしくは不可能でさえある。

Ｍｏｄａｂｈｕｓｈｉの米国特許第５，５５２，０２８、ＷＯ９５／１６９１０およびＷＯ９５／１６９１１において、さらに、スクリーニング媒体、および壁吸着特性を有するポリマー（２置換アクリルアミドポリマー型で、５，０００〜１，０００，０００の分子量を有する）からなる表面相互作用成分を含む分離媒体を使用することも提案されている。これらのマトリックス、もっと具体的にはポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡ）は、電気浸透を低下し、ある用途で、たとえば塩基配列決定で、良好な分離特性をもたらすことを可能にする。しかし、それらは比較的疎水性であり、ある用途、たとえばＤＮＡ塩基配列決定についてその性能の質を制約し、そして他の用途、たとえばタンパク分離について、もっと有害でさえある。さらに、それらは遅い分離をもたらす。

したがって、数多くの研究および提案されたシステムにもかかわらず、コスト、分離効率、壁との相互作用の低減、および使用の便利さの種々のすべての観点に最適な媒体は、上述のすべての用途については現時点では入手し得ない。

本発明の１つの目的は、流路内の種の分離、分析もしくは精製のための非感熱液状分離媒体として特に有利であるポリマー群の使用をまさに提案することである。

さらに詳しくは、本発明の主題は、流路内の種を分析、精製もしくは分離するための非感熱液状媒体であり、いくつかのポリマーセグメントからなる少なくとも１つのポリマーを含み、該ポリマーは不規則ブロックコポリマー型または不規則な櫛型（ｃｏｍｂ）ポリマー型であり、そして異なる化学的もしくは位相的（ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ）性質のポリマーセグメントの間に設けられた平均して少なくとも３つの接合点を有することを特徴とする。

不規則な序列ブロックコポリマーの概略図。太線は１種類の化学的性質に相当し、そして細線はもう１つの種類の化学的性質に相当する。 不規則な、櫛型ポリマーの概略図。太線は１種類の化学的性質に相当し、そして細線はもう１つの種類の化学的性質に相当する。 不規則な、櫛型コポリマーの概略図。太線は１種類の化学的性質に相当し、そして細線はもう１つの種類の化学的性質に相当する。 未処理細管、および分離媒体として、Ｎａ ＴＡＰＳ １００ｍＭ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ、尿素緩衝液７Ｍを用いて（そこではポリアクリルアミド型の市販ホモポリマー（分子量７００，０００〜１，０００，０００）５％が溶解される）、ＡＢＩ３１０機械（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で５０℃において得られる、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ５０〜５００ｂｐサイザーの分離を示す、対照の電気泳動図。種々のピークに相当するＤＮＡサイズは塩基数として図に示される。 ＢＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販の分離媒体「ＰＯＰ６」で、図２における同一の条件下での分離を示す、対照の電気泳動図。 Ｎａ ＴＡＰＳ １００ｍＭ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ、尿素７Ｍの分離媒体（そこでは例２に記載されるＰ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−２ 櫛型コポリマー５％が溶解される）を用いて、図２におけるのと同一の条件下での分離を示す電気泳動図。種々のピークに相当するＤＮＡサイズは塩基数として図に示される。 分離媒体として以下のものを用いて、ＡＢＩ３１０機械（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で５０℃において得られる１塩基〜５００塩基で異なるピーク間で計算される分離能の比較： ａ：ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販の分離媒体「ＰＯＰ６」． ｂ：Ｎａ ＴＡＰＳ ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ、尿素緩衝液７Ｍ、そこでは線状アクリルアミド（分子量７００，０００〜１，０００，０００）５％が溶解されている。 ｃ：同一の緩衝液、そこでは本発明による不規則ブロックコポリマーである例２に記載されるＰ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−２が５％溶解されている。 線状アクリルアミド（ＬＰＡ）の、ならびに本発明によるコポリマーである、例２により調製されたポリ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−１、例４により調製されたポリ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−２、および例５により調製されたポリ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−３の３％溶液の粘度。 線状アクリルアミド（ＬＰＡ）の、市販ポリマー（ＰＯＰ５）の、ならびに本発明によるコポリマーである、例２により調製されたポリ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−１、例４により調製されたポリ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−２、および例５により調製されたポリ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−３の３％および５％での溶液における、ＤＮＡ電気泳動分離時に得られる分離能。

本発明の目的のために、「ポリマー」（“ｐｏｌｙｍｅｒ”）という用語は一連の巨大分子からなり、そしてある特性、たとえば分子量、多分散性、化学組成およびミクロ構造により特徴づけられる生成物を示す。多分散性はこの分野で親しまれている質量平均の意味で、巨大分子の分子量分布を特徴づける。「ミクロ構造」（“ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”）という用語は、巨大分子の化学組成の一部を形成するモノマーが巨大分子内で配置される仕方を意味する。

本発明によれば、「液体」（“ｌｉｑｕｉｄ”）という用語は、「ゲル」（“ｇｅｌ”）とは対照的に、それがニュートン流体か粘弾性かで、以下のことが可能である、いかなる濃縮された媒体をも意味する。

本発明において、２官能もしくは多官能架橋剤の存在下でモノマーの共重合から得られるゲルは本発明の範囲から除かれる。この理由は、それらの架橋状態を与えられると、それらのゲルは固体もしくは弾性があり、したがって液体ではないからである。特に、それらは細管への導入に適さない。

本発明による液状媒体は非感熱性である。すなわち、それはその固化点＋１０℃と沸点−１０℃の間で粘度の急激な変化を示さない。「急激な変化」（“ｓｕｄｄｅｎ ｃｈａｎｇｅ”）は２０℃以下の温度範囲にわたってファクター２以上の変動を意味する。

本発明の目的のために、「分離方法」（“ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ”）という表現は試料中に含まれる種のすべてもしくはいくつかを分離、精製、同定もしくは分析するいかなる方法も包含する。この場合、液体は「分離媒体」（“ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ”）といわれ、それにより、分離プロセスの過程で分離される種、もしくは少なくともそれらのいくらかを通過させる。

「種」（“ｓｐｅｃｉｅｓ”）という用語は、粒子、細胞小器官もしくは細胞、分子もしくは巨大分子、そして特に生物学的巨大分子、たとえば核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡもしくはオリゴヌクレオチド）、合成もしくは化学修飾により得られる核酸類縁体、タンパク、ポリペプチド、グリコペプチドおよび多糖類を示すのが通常である。分析的方法において、該種は通常「被検体」（“ａｎａｌｙｔｅｓ”）といわれる。

本発明は界面動電（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ）分離法の場合に特に有利である。
「界面動電分離」（“ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ”）という用語は、電場の作用により媒体中で種を移行させることにより混合物中に含まれる種のすべて、もしくはいくらかを分離するいかなる方法も包含するものである。それは、たとえば電気クロマトグラフィーにおいて、媒体自体の変位により、またはミセル電気クロマトグラフィーの場合にミセルのような会合種の変位により、または直接もしくは間接的作用の組み合わせにより、電場が直接的もしくは間接的に電解液へのモータ作用を及ぼすかどうかにかかわらない。電場の該作用が非電気源のもう一つのモータ作用に結合されるいかなる分離法も本発明による界面動電分離と考えられる。したがって、「チップ」（“ｃｈｉｐｓ”）の細管電気泳動もしくは電気泳動は、「界面動電」（“ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ”）といわれる。

有利には、特に界面動電の場合には、液体は電解質からなる。
本発明の目的のために、「電解液」（“ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ”）という用語はイオンを伝導し得る液体をいう。最も一般的には、この媒体は緩衝された水性媒体、たとえばリン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、ホウ酸塩、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、ヒスチジン、リジン等にもとづく緩衝液である。電気泳動で使用され得る緩衝液の数多くの例は当業者に知られており、そしてそれらの多くは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）に記載されている。しかし、いかなる種類の電解液も本発明に関して使用され得、特に水性−有機溶媒、たとえば水−アセトニトリル、水−ホルムアルデヒドもしくは水−尿素混合物、または極性有機溶媒、たとえば例としてＮ−メチルホルムアミドである。かなりの割合の尿素および／またはホルムアミドを含むアルカリ性ｐＨでの水性緩衝液からなる「配列決定緩衝液」（“ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ”）電解液は本発明に関して特に有用である。

「流路」（“ｃｈａｎｎｅｌ”）という用語は、１つ以上の固体壁により境界づけられるいかなる容積をも示し、少なくとも２つのオリフィスを有し、流体を含み、またはそれを流体が通過するように意図されている。

本発明は少なくとも１つの流路を含む系で特に有利であり、その少なくとも１つの寸法はサブミリメートルであり、たとえば細管界面動電分離系、微小流体系、そしてもっと一般的には微小流路（ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ）を用いて種を分離するための系である。

好適な変形により、本発明は、少なくとも４つの接合点、好ましくは４〜１００の接合点数、もっと好ましくは４〜４０の接合点数を平均で有するポリマーを含む溶液を、液体分離媒体として使用することに関する。

「接合点」（“ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｐｏｉｎｔ”）は、たとえばブロックコポリマーの場合に、著しく異なる化学的性質を有する両方の２つのポリマーセグメントを結合する点、またはたとえば櫛型ポリマーの場合に、同一もしくは異なる化学的性質を有する２つより多いポリマーセグメントの間の架橋点を意味する。例として、３つの側枝を有する櫛型ポリマーは３つの接合点および７つの別個のポリマーセグメントを有する。同様に、Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ型の序列ブロックコポリマーは３つの接合点および４つの別個のポリマーセグメントを有する。

本発明の目的のために、「ポリマーセグメント」（“ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔ”）および「セグメント」（“ｓｅｇｍｅｎｔ”）という用語は、線状で共有結合して一緒に結合され、そして所定の種類の化学的組成に属する、すなわち、特に溶媒和、固体壁との相互作用、ある分子への特異的親和性、もしくはそれらの特性の組み合わせに関して、特定の全体的物理化学的性質を有するような一連のモノマーをいう。

本発明のためにポリマーセグメントの例は、すべてが同一であるモノマーのコポリマー（ホモポリマーセグメント）内の、または２，３よりも多いモノマーの距離にわたって有意の組成相関を有さないコポリマー（ランダムコポリマー型のセグメント）内の配列により与えられる。本発明によるポリマーはいくつかの「異なる」ポリマーセグメントから構成される。化学的性質および／または位相、すなわちたとえば側枝に相対する骨格等の互いに関連するセグメントの空間分布において異なる２つのポリマーセグメントは、本発明の目的のため異なる。

第１の好適な変形によれば、本発明によるポリマーは不規則なブロックコポリマー型である。

本発明の目的のために、「ブロックコポリマー」（“ｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ”）は、共有結合的に一緒に結合された、いくつかのポリマーセグメントからなり、そして少なくとも２つの異なる種類の化学組成に属するコポリマーをいう。このように、線状ブロックコポリマー内の２つの隣接するポリマーセグメントは、必然的に有意に異なる化学的性質を有する。ブロックコポリマーは、各セグメントが同一組成で同一サイズのホモポリマーのものに匹敵する物理化学的性質、特に溶媒和を、分離媒体内で有するのに十分な数のモノマーを含むという事実により定義される。これは、種々の種類のモノマーが本質的にランダムな順序で互いに続き、そして考慮中のそれぞれの種のホモポリマーのものとは位置的にすべてにわたって異なる性質を鎖に与えるようなランダムコポリマーと対比される。このブロック特性を得るのに要求されるホモポリマーセグメントのサイズは、モノマーおよび電解液の種類に応じて変動し得るが、該セグメントの骨格に沿う数十の原子であるのが通常である。ある大きさで、物理化学的性質、特に溶媒和に有意の変動をセグメント毎に生じるに十分な化学組成の差異を有するポリマーセグメントを該ブロックコポリマー内で区別することが可能である限り、本発明の意味の範囲内で、セグメント自体のすべてもしくはいくつかがランダム型のコポリマーからなるブロックコポリマーを製造することが可能であることを留意すべきである。特に、本発明の意味における「ポリマーセグメント」として考慮されるために、ポリマーの一部は骨格に沿って少なくとも１０原子を含まなければならない。

この変形の１つの好適な態様にしたがって、本発明によるポリマーは不規則な序列のブロックコポリマー型である。
本発明の目的のために、「序列ブロックコポリマー」は、少なくとも２つの化学的種類に属し、線状に一緒に結合されているポリマーセグメントからなるブロックコポリマーを意味する。

第２の好適な変形によれば、本発明によるポリマーは不規則な櫛型ポリマー型である。

本発明の目的のために、「櫛型ポリマー」（“ｃｏｍｂ ｐｏｌｙｍｅｒ”）という用語は、ある化学的性質の線状骨格および同一もしくは異なる化学的性質を有する「側枝」（“ｓｉｄｅ ｂｒａｎｃｈｅｓ”）として知られるポリマーセグメントを有するポリマーを示し、そのセグメントは線状であるが骨格より有意に短かく、そしてそれらの末端の１つにより該骨格に共有結合的に結合されている。櫛型ポリマーにおいて、骨格を構成するポリマーセグメントおよび側枝を構成するポリマーセグメントは位相的性質を異にする。もし櫛型ポリマーの側枝を構成するポリマーセグメントと骨格を構成するポリマーセグメントも化学的性質が異なると、そのポリマーは「櫛型ポリマー」の特徴と「ブロックコポリマー」の特徴を同時に有する。「櫛型コポリマー」として知られるこのようなポリマーは、一連の（ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ）櫛型ポリマーを構成し、そしてもちろん本発明に関して使用され得る。

いうまでもなく、本発明により媒体中でブロックコポリマーと櫛型ポリマーを組み合わせて使用することも期待され得る。

本発明によるポリマー中に存在する所定の化学的もしくは位相的種類のポリマーセグメントの数は平均値として理解され、それは該数においてある多分散性を有する多数の分子の集団の事項であると理解される。

本発明の説明において、他に言及がなければ、すべての分子量、およびすべての鎖もしくはすべてのポリマーセグメントについてのすべての平均値、たとえば平均分子量、もしくは骨格に沿った平均原子数、接合点の数、もしくは櫛型ポリマーの場合におけるグラフトの平均数は、ポリマー物理学における通常の意味の範囲での質量平均として理解される。

本発明により考慮中のすべてのポリマー、すなわちブロックコポリマーもしくは櫛型ポリマーは、不規則型である有利な特徴をさらに有し、すなわち、その組成の１部を形成する少なくとも１種類の化学的もしくは位相的性質を有するすべてのセグメントは少なくとも１．５、そして好ましくは１．８より大きい多分散性を有する。

本発明によるポリマーの組成の１部を形成する１種類のポリマーセグメントの多分散性は、該ポリマーの組成の１部を形成するこの種類のすべてのセグメントに引継がれる、該セグメントの分子量の平均値（ポリマー物理化学の通常の意味における質量平均）であると理解される。

不規則な櫛型ポリマーの１つの好適な変形は、少なくとも１．５の、そして好ましくは１．８より大きい側枝の多分散性を示すことにある。

不規則な櫛型ポリマーのもう１つの好適な変形は、少なくとも１．５の、そして好ましくは１．８より大きい、２つの側枝の間に含まれる骨格のセグメントの多分散性を示すことにある。

もう１つの好適な態様において、本発明によるポリマー組成の１部を形成する化学的もしくは位相的性質の種類を有するそれぞれのセグメントは、少なくとも１．５の、そして好ましくは１．８より大きい多分散性を示す。
１つの好適な態様によれば、本発明によるポリマーの多分散性は１．５より大きく、そして好ましくは１．８より大きい。

本発明により媒体中で使用される櫛型ポリマーもしくはコポリマー中に存在する異なるポリマーセグメントの長さおよび数、ならびにその化学的性質は、本発明に関して有意に変動し得、そして該媒体の性質は、実施例の説明でさらに詳しく示されるように、所望の用途に依存して広く変動され得る。

１つの好適な態様によれば、本発明によるポリマーは、５０，０００より大きい、好ましくは３００，０００より大きい、もっと好ましくは１，０００，０００より大きい、そしてなお好ましくは３，０００，０００より大きい分子量（質量平均）を有する。

１つの好適な態様によれば、本発明による該ポリマーは該流路の壁に対して分離媒体内で有意の親和性を示す。

特に好適な１態様は、本発明によるポリマー中に、壁に対して特異的な親和性を分離媒体中で示す少なくとも１種類のポリマーセグメント、および該媒体中で壁に対してほとんどもしくは全く親和性を示さない少なくとも１種類のポリマーセグメントを与えることにある。

この種類のポリマーセグメントの存在は、本発明による媒体に、流路の壁上への種の吸着および／または電気浸透を低減させる。

特に、流路内で種を伴うすべての方法に関する１つの問題は、該流路の壁上への該種の吸着である。この問題は、小さな流路および生物学的巨大分子の場合に特に悪化され、後者は両性であることが多い。試料もしくは流体に含まれる種の壁上へのこの吸着の現象は、分析法の場合に、ある被検体を阻止し、付加的な分散を創出し、そして分離能の損失という結果になる。この吸着は、その後に該流路に導入されるのが望ましい流体にも影響し得る、流路の壁のある量の汚染をさらに生じさせ得る。

特に界面動電分離法に関するもう１つの制約は、電気浸透、すなわち細管もしくは流路の壁での電荷の存在により分離媒体の全体としての移動である。この移動は時間により変動しやすく、そして不均一であるので、測定の再現性および分離能には有害である。それは化学的構造により細管の表面上に存在し得る電荷により引起されるが、分離されるべき試料、特にタンパクに最初に含まれる電荷を帯びた種の壁への吸着により創出もしくは増加され得る。

分離媒体内で壁に対する特異的親和性を示す少なくとも１つの種類のポリマーセグメントを含む種類の本発明によるポリマーは、この種類の多数のセグメントの存在のために、そして該セグメントの比較的高い平均分子量のために、高い吸着エネルギーを有し、したがって永続する態様で電気浸透を低減させる。さらに、本発明によるポリマーは、その構造に、該媒体中で壁に対してほとんどもしくは全く親和性を示さないポリマーセグメントも含むので、分離能に有害である過度に疎水性の性質を避け、そして壁から被検体をより効率的にはね返す。

通常、壁に対する親和性を示さないポリマーセグメントの種類は、分離媒体中で良好な溶解性を示すポリマーからなる。しかし、該媒体において溶解性であるが、それにもかかわらずその中で壁に対して特定の親和性を示すポリマーがあり得る。分離媒体が水性溶液であるとき、壁に対して親和性を有さないセグメントは非常に親水性のセグメントであるのが通常である。一方、親和性を有するセグメントは、比較的非親水性であるか、もしくは疎水性でさえある。いうまでもなく、壁の性質および分離媒体の性質に依存して、他のもっと特異的な種類の親和性が使用され得る。

本発明を実施するのに最適なコポリマーは、特に、壁に対する特異的な親和性を有するすべてのセグメントが、該コポリマーの全平均モル質量（ｍｏｌａｒ ｍａｓｓ）の２質量％〜８０質量％、そして好ましくは５質量％〜３０質量％、またはモノマーのモル数でコポリマー全組成の３％〜８５％、そして好ましくは５％〜５０％を示すものである。

被検体が生物学的巨大分子であるとき、特に有利な、もう一つの好適な態様は、１つ以上の被検体に対して特異的な親和性を示す本発明によるポリマーを用いることである。

この親和性は、ある被検体に対して特異的な親和性を示すことのできるポリマーセグメントを該ポリマーの構造に組入れることにより得られ得る。このようなポリマーセグメントは、たとえば、あるいは排他的でない態様で（ｉｎ ａ ｎｏｎｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ ｍａｎｎｅｒ）、たとえばポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのような異なるモノマーの予め定められた配列からなり得る。この親和性は、本発明によるポリマーに、天然もしくは変性タンパク、タンパク分画もしくはタンパク複合体、あるいは酸性もしくは塩基性基、および／またはルイス酸もしくはルイス塩基型の基を結合させることによっても得られ得る。

本発明によるコポリマーにより構成され得る種々の構造の例として、該コポリマーのすべてもしくはいくつかは詳しくは次のようなものであると言及され得る：
− 不規則な序列ブロックコポリマー。この場合、１つの好適な変形は、ポリマーに沿って、壁に対する特異的親和性を有するセグメントと、壁に対する親和性を低減したもしくは全く有さないセグメントを交互にすることにある。さらに、ポリマーに沿って、ある被検体に対して特異的な親和性を示すセグメントと、該被検体に対して親和性を低減したもしくは全く示さないセグメントを交互にすることも意図され得る。
− 不規則な櫛型コポリマーの形態。この場合、１つの好適な変形は次のように特徴づけられる。すなわち、該ポリマーは、櫛型ポリマーの形態にあり、その骨格は壁に対して特異的な親和性を示すいくつかのポリマーセグメントからなり、そしてその側枝は壁に対する親和性を低減された、もしくは全く示さないポリマーセグメントからなる。あるいは、該ポリマーは、櫛型ポリマーの形態にあり、その側枝は壁に対して特異的な親和性を示すポリマーセグメントからなり、そしてその骨格は壁に対する親和性を低減された、もしくは全く示さないポリマーセグメントからなる。さらに、これらのポリマーは、櫛型ポリマーの形態であり得て、ある側枝はある被検体に対して特異的な親和性を示すポリマーセグメントからなり、そしてその骨格はこれらの被検体に対する親和性を低減された、もしくは全く示さないポリマーセグメントからなる。

いうまでもなく、いくつかの種類の上述の好適な変形が、２種より多い異なる種類のポリマーセグメントを組み合わせることにより、もしくは異なるコポリマーの混合物の形態で、一緒に組み合わされる系も、本発明の範囲内である。このように、たとえば壁に対して親和性を示すポリマーセグメント、ある被検体に対し特異的な親和性を示すポリマーセグメントもしくは基、および壁もしくは被検体のいずれかに対して特異的な親和性を示さないポリマーセグメントを、本発明によるコポリマー内で組み合わせることができる。さらに、例として、壁に対して親和性を示すポリマーセグメント、および壁もしくは被検体のいずれにも特異的な親和性を示さないポリマーセグメントを含むブロックコポリマーと、ある被検体に対し特異的な親和性を示すポリマーセグメントもしくは基、および壁もしくは被検体のいずれにも特異的な親和性を示さないポリマーセグメントを含むポリマーを、本発明による媒体内で組み合わせることもできる。

本発明の好適な１態様において、所定の種類の化学的もしくは位相的性質のすべてのポリマーは平均で骨格に沿って７５より多い、好ましくは２１０より多い原子数を有するか、または１，５００より大きい、好ましくは４，５００より大きい分子量を有する。
もっと好適な態様によれば、種々の種類のセグメントは、骨格に沿って７５より大きい、好ましくは２１０より大きい平均原子数、または１，５００より大きい、好ましくは４，５００より大きい分子量を有する。

好適な１態様によれば、分離媒体は、本発明による少なくとも１つのポリマーが０．１ｗｔ％〜２０ｗｔ％、そして好ましくは１ｗｔ％〜６ｗｔ％の割合で溶解される液体からなる。

ブロックコポリマーもしくは櫛型ホモポリマーを使用することは、本発明を実施するのに特に有利であり、そこでは少なくとも１種類のセグメントが、ポリエーテル、たとえばポリグリコール酸のようなポリエステル、たとえばポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレンもしくはポリオキシエチレンのようなポリオキシアルキレン型の溶解性ランダムホモポリマーおよびコポリマー、多糖類、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシド、ポリオキサゾリン、ポリスチレンスルホネート、ならびに置換もしくは非置換のアクリルアミド、メタクリルアミド、およびアリルポリマーおよびコポリマーから選ばれるポリマーからなる。

水性分離媒体中で、壁に対して親和性をほとんどもしくは全く示さないポリマーセグメントの種類の典型例として、最も具体的には、ポリアクリルアミドおよびポリアクリル酸、ポリアクリロイルアミノプロパノ−ル、水溶性アクリルおよびアリルポリマーおよびコポリマー、デキストラン、ポリエチレングルコール、多糖類、およびたとえばヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはヒドロキシメチルセルロースのような種々のセルロース誘導体、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシド、ポリオキサゾリン、ポリスチレンスルホネート、およびヒドロキシル基をもつポリマー類、ならびに上述の誘導体のランダムコポリマーのすべてが挙げられ得る。

いうまでもなく、分離媒体に溶解性である他のポリマーセグメントも、該流体の性質、流路の壁の性質、特定の用途、および所望の構造のブロックポリマーへの導入の容易さに応じて、本発明により使用され得る。

水性溶媒に溶解し得る、もしくはし得ず、そして壁に対して特定の親和性をそこで示し得るポリマーセグメントの典型例として、ジメチルアクリルアミド、アルキル基でＮ−置換されたアクリルアミド、アルキル基でＮ，Ｎ−二置換されたアクリルアミド、アリルグリシジルエーテル、上述のアクリル誘導体同志、または該誘導体と他のアクリル誘導体のコポリマー、アルカン類、フルオロ誘導体、シラン類、フルオロシラン類、ポリビニルアルコール、オキサゾリン誘導体を含むポリマーおよびコポリマー、さらに通常、炭素−炭素結合、エーテルオキシド基およびエポキシド基の組合せを有するポリマー、ならびにこれらの化合物のランダムコポリマーのすべてが挙げられ得る。

多くの種類のポリマーセグメントが、当業者に知られているすべての種類のポリマーから、特に水性媒体に溶解性であるポリマーから、意図される電解液に応じて、本発明によるポリマーを構成するポリマーセグメントを形成するために選定され得る。参照は、書籍である「Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ 」（Ｂｒａｎｄｒｕｐｔ ＆ Ｉｍｍｅｒｇｕｔ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）についてなされ得る。

本発明によるポリマーは天然もしくは合成であり得る。微細構造に関して許容する多様性および調節のための１つの好適な変形によれば、本発明によるポリマーは合成ポリマーである。

本発明にとくに適切なものは次のとおりである：
− 櫛型コポリマー型のコポリマーであり、その骨格は、デキストラン、アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノールもしくは（Ｎ，Ｎ）−ジメチルアクリルアミド型であり、その上に、アクリルアミド、置換アクリルアミドもしくは（Ｎ，Ｎ）−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）型、またはＤＭＡ／アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）コポリマー型、またはオキサゾリンもしくはオキサゾリン誘導体のホモポリマーもしくはコポリマーの側セグメントがグラフトされているコポリマー；
− 不規則な序列コポリマー型の非感熱コポリマーであり、その骨格に沿って、ポリオキシエチレン型のセグメントおよびポリオキシプロピレン型のセグメントの交互変化、またはポリオキシエチレン型のセグメントおよびポリオキシブチレン型のセグメントの交互変化、またはより一般的にポリエチレンのセグメントおよびポリエーテル型のセグメント（それらはポリオキシエチレンよりも疎水性である）の交互変化を有するコポリマー；
− 不規則な序列ブロックポリマー型のコポリマーであり、その骨格に沿って、アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノールもしくはジメチルアクリルアミド型のセグメント、および一方では（Ｎ，Ｎ）−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）型、またはＤＭＡ／アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）コポリマー型、またはオキサゾリンもしくはオキサゾリン誘導体のホモポリマーもしくはコポリマーのセグメントの交互変化を有するコポリマー；
− 不規則な櫛型ポリマー型のポリマーであり、その骨格は、アガロース、アクリルアミド、置換アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノール、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、もしくはアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）ポリマー型のもの、ＤＭＡ／ＡＧＥランダムコポリマー型のもの、オキサゾリンおよびオキサゾリン誘導体のもの、デキストランのもの、メチルセルロースのもの、ヒドロキシエチルセルロースのもの、変性セルロースのもの、多糖のもの、またはエーテルオキシド型のものであり、そしてその上にアガロース、アクリルアミド、置換アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノール、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、もしくはアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）ポリマー型の側セグメント、ＤＭＡ／ＡＧＥランダムコポリマー型の側セグメント、オキサゾリンおよびオキサゾリン誘導体の側セグメント、デキストランの側セグメント、メチルセルロースの側セグメント、ヒドロキシエチルセルロースの側セグメント、変性セルロースの側セグメント、多糖の側セグメント、またはエーテルオキシド型の側セグメントがグラフトされているポリマー；
− 不規則な櫛型コポリマー型のコポリマーであり、その骨格は、アクリルアミド、置換アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイアルアミノエタノール、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、もしくはアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）ポリマー型のもの、ＤＭＡ／ＡＧＥランダムコポリマー型のもの、オキサゾリンおよびオキサゾリン誘導体のもの、デキストランのもの、アガロースのもの、メチルセルロースのもの、ヒドロキシエチルセルロースのもの、変性セルロースのもの、多糖のもの、またはエーテルオキシド型のものであり、そしてアルキル鎖、芳香族誘導体、フルオロアルキル、シランまたはフルオロシランのような短鎖疎水性側セグメントを担持するコポリマー。

大部分の用途において、本質的に中性である本発明のポリマーを使用するのが好ましいことが留意されるべきである。しかし、特定の用途、特に電荷および疎水性部分を含む種の吸着を避けるために、意図的に荷電された、好ましくは該種の電荷と逆の電荷を帯びた本発明によるポリマーを選定するのが有用であり得る。

本発明により使用されるコポリマーの調製に関して、それは従来のいかなる重合もしくは共重合法によっても実行され得る。調製法の選択は、コポリマーに望まれる構造、すなわち櫛型もしくは線状構造、ならびに構成される種々のブロックの化学的性質を考慮することによりなされるのが通常である。

これらの調製法の変形の典型例として、該ポリマーが得られる次の方法がとくに挙げられ得る：
− 同一もしくは異なるモノマーの、同一もしくは異なる巨大モノマーの、または同一もしくは異なるモノマーおよび巨大モノマーの混合物の、重縮合、イオンもしくはフリーラジカル重合もしくは共重合、または
− 同一もしくは異なる化学的性質を有する線状もしくは分枝ポリマー骨格上のいくつかのポリマーセグメントをグラフトすることによる。

好適には、本発明により使用されるコポリマーのすべてもしくはいくつかは、
−ａ：末端の少なくとも１つに反応性基を含むモノマーもしくは巨大モノマーの共重合、または
−ｂ：構造に少なくとも１つの反応性基を含む巨大モノマーの共重合、
により得られ得る。

本発明の目的のために、「反応性基」（”ｒｅａｃｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）という用語は、この基を持つ分子が共重合を妨害することなく共重合反応時に巨大分子に組入れられることを可能にする基を意味する。

上述の規定および好適な態様の助けにより、当業者は、１つの用途もしくは他の用途に望ましい分離特性に応じて、該ポリマーの構造、性質および調製法を適合させることにより、本発明によるコポリマーを調製することができる。

さらに、本発明の主題は、試料に含まれる種を分離、分析および／または同定する方法であり、次の工程を実施することを特徴とする：
ａ／本発明よる分離媒体を分離装置の流路に充填すること、
ｂ／該種を含む該試料を該流路の一端に導入すること、
ｃ／試料に含まれる特定の種を移動させるように意図された外部フィールド、特に電場を用いること、ならびに
ｄ／試料の導入点とは異なる流路に沿った点で、該種を回収すること、またはそれらの通過を検出すること。

１つの好適な変形において、細管充填段階と分析段階の間の温度を変える必要はない。
特定の用途に関して、分離溶媒は、本発明によるポリマーの外に、他の成分、特に種もしくは壁と相互作用する成分を含有し得る。この種類の成分の多くは当業者に知られている。

本発明において、単独で用いられた本発明によるポリマーで得られたものに比べて性能を向上させるために、不規則なブロックコポリマー型のポリマーと、立体的相互作用により、もしくは親和性により被検体と相互作用し得る他のポリマーを、分離媒体中で組み合わせることができる。この場合に、本発明による特に好適なポリマーは、これらのポリマーが単独で使用されるときよりも大きい、壁に対する特異的な親和性を示すポリマーセグメントの質量分率を有するものである。この分率は２０％〜８０％であり得る。

さらに本発明の主題は、分子もしくは巨大分子種、特にたとえば核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはオリゴヌクレオチド）、合成もしくは化学修飾により得られる核酸類縁体、タンパク、ポリペプチド、グリコペプチドおよび多糖類のような生物学的巨大分子、有機分子、合成巨大分子、もしくはたとえば鉱物粒子、ラテックス（ｌａｔｉｃｅｓ）、細胞もしくは細胞小器官のような粒子から選ばれる種を分離、精製、ろ過もしくは分析するための、本発明による分離媒体の使用である。

電気泳動分析法の場合に、本発明はＤＮＡ塩基配列決定に特に有用であり、それについては、最小限のバンド幅が得られることを可能にする。さらに、タンパク、プロテオグリカンもしくは細胞を分離するのに特に好適であり、それについては、壁上への吸着の問題が特に不利であり、解決が特に困難である。
有利なことには、本発明の媒体は、少なくとも１つの寸法がサブミリメートルのサイズである流路に使用され得る。

装置に関して、本発明の媒体は微小流体系について特に有利である。なぜなら、永続的な処理を得るために流路表面に対して良好な親和性を示すブロック、ならびに分離されるべき種に対して良好な反発を示すブロックを、該種と該流路の化学的性質とにかかわりなく、ポリマー内で種々のブロックの最適の種類を選択することにより組み合わせることを、それが可能にするからである。

本発明による媒体およびこれらの媒体を用いる分離法は、電気泳動分離および診断用途、遺伝子の型検出（ｇｅｎｅ ｔｙｐｉｎｇ）、および大流量スクリーニング、品質管理のために、または製品中の遺伝学的に変成された生物の存在を検出するために、特に有利である。

実際に、本発明に関して考慮中の分離媒体が構成されるポリマーはいくつかの点で有利であることがわかる。

第１に、「ブロックポリマー」の性質を示すそれらの能力は、異なる化学的性質のポリマーに属するが、ホモポリマーもしくはランダムコポリマーに必ずしも結合され得ないような特性をそれらに組み合わせることができる。このように、それらは、第１に分離されるべき種に応じて、そして第２に分離が実施される流路の化学的性質に応じて、分離媒体の化学的性質をもっと柔軟に適合させることができる。こうして、それらは、たとえばＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートもしくはポリイミドのようなポリマーもしくはエラストマー、またはたとえばガラス、セラミックス、ケイ素、ステンレス鋼、もしくはチタンのような鉱物材料からなる流路を用いる用途、ならびに壁が溶融シリカで作成される流路を使用するより伝統的な用途の双方に特に有利である。

従来技術のブロックコポリマーと比べて、本発明によるポリマーは、分離能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）の点で優れた性能をさらに示し、それはその不規則な性質、すなわち、本発明によるポリマーの一部を形成するポリマーセグメントの多分散性に関与しているのであろう。従来技術で用いられている一連のブロックコポリマーは、規則的に間隔をあけたセグメントを含有し、および／または選択された本質的に均一な長さ（すなわち低い多分散性）を有するコポリマーを意図的に含むので、この特徴は特に驚くべきことである。さらに、本発明によるポリマーにおけるセグメントのこの多分散性は、配合におけるコストおよび柔軟性の点でさらに利点を示す。なぜなら、そのような多分子セグメントを含有するポリマーはもっと効率的であるばかりでなく、調製するのがもっと容易であるからである。特に、それらは高い分子量で調製され得る。

壁に対する種の電気浸透もしくは相互作用の減少が望まれる用途において、本発明によるポリマーは、壁に対する有意の親和性を示す数多くのポリマーセグメントの構造の存在のために、高い吸着エネルギーを有し、そして永続的な態様で種の電気浸透および吸着を低減させることができる。

最後に、線状骨格の、そして多数の接合点の組合せは、本発明による分離媒体に、局部的な規模でゲルの性質をいくらか付与しそうであるが、それは分離効率の点で有利であり、同時に、大きな規模において、特に線状ポリマーにも匹敵し得る流動性に関して、それらを保護する。

以下に示す図および例は、本発明の非制限的な例示として表される。
例１： 本発明によるコポリマーの調製のために１０，０００の領域の分子量を有する機能化ＰＤＭＡ巨大モノマーの調製
１）ＰＤＭＡの重合
Ｎ，Ｎ−ジメチル−アクリルアミド（ＤＭＡ）のフリーラジカル重合が純水中で実施された。開始剤はレドックスカップルであり、それについて酸化剤は過硫酸カリウムＫ_２Ｓ_２Ｏ_８（ＫＰＳ）であり、そして還元剤はアミノエタンチオールＡＥＴ・ＨＣｌである。開始反応は次のとおりである。
Ｋ_２Ｓ_２Ｏ_８＋２Ｃｌ⁻，ＮＨ_３ ^＋−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＳＨ→２ＫＨＳＯ_４＋２Ｃｌ⁻，ＮＨ_３ ^＋−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ^＋
ＡＥＴ・ＨＣｌも転移剤（ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｇｅｎｔ）として作用し、鎖長を調節させる。
手順
ＤＭＡ０．１８モルおよび水２００ｍＬが、三つ口フラスコに入れられ、その上に凝縮器が取付けられ、そして窒素注入口を備える。ついで、混合物は攪拌され、水浴で２９℃に加熱される。窒素の散布が開始される。４５分後に、水２０ｍＬに予め溶解されたＡＥＴ・ＨＣｌ ０．６１ｇ（０．００５４モル）が添加され、ついで最小量の水に溶解された過硫酸カリウム（ＫＰＳ）０．００１８モルが添加される。混合物は３時間、攪拌される。ついで溶液は濃縮され、凍結乾燥される。

ポリマーを単離するために、沈殿が次の手順にしたがって実施される：
得られた固体はメタノール１００ｍＬに再溶解される。存在する塩化水素は、溶液に滴下して配合されるＫＯＨ０．００５４モル（すなわちメタノール約２５ｍＬに溶解された０．３０ｇ）を添加することにより中和される。生成される塩であるＫＣｌが沈殿し、ろ過により分取される。そして、回収されるろ液は濃縮され、エーテル４Ｌに滴下して注がれる。沈殿ポリマーはＮｏ．４燒結漏斗によりろ過して回収される。ついで固体はベーンポンプ（ｖａｎｅ−ｐｕｍｐ）真空下で乾燥される。質量収率は約５０％である。

上述のプロトコールは、「ＰＤＭＡ」として知られるアミノポリマーを生成させ、開始剤／モノマー比Ｒ_０＝０．０３およびＡ_０＝０．０１に相当し、ここで
Ｒ_０＝［Ｒ−ＳＨ］／［ＮＩＰＡＭ］、およびＡ_０＝［ＫＰＳ］／［ＮＩＰＡＭ］
である。
２）アミノＰＤＭＡの変性
合成されたＰＮＩＰＡＭ巨大分子は鎖末端にアミン基を含み、これらの鎖は開始剤であるアミノエタンチオールＡＥＴ・ＨＣｌに由来する。

アミン基のアクリル酸との反応により、ビニル二重結合は次の反応スキームにしたがって鎖末端に結合される：

手順：
塩化メチレン５０ｍＬ、アクリル酸１．５ｇ（０．０２１モル）、ＰＤＭＡ９ｇおよびジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）（０．０２１モル）が１００ｍＬビーカーに入れられる。

反応媒体は１時間攪拌される。アクリル酸はＰＤＭＡに対し大過剰であるので（アクリル酸の量はＰＤＭＡの量の約２０倍である）、すべてのアミノ基は変性されている。ついで混合物はＮｏ．４燒結漏斗でろ過され、ＤＣＣＩの変換から得られる副生物である沈殿したジシクロへキシルウレアを除去する。精製はエーテルからの沈殿により実施される。

鎖端にアリル基を有する巨大モノマーＰＤＭＡ−１は、このようにして質量収率約７０％で得られる。
このようにして調製され、ＳＥＣ（立体排除クロマトグラフィー）により測定される巨大モノマーの平均モル質量（ｍｏｌａｒ ｍａｓｓ）および多分散性は、それぞれ１５，０００のオーダーおよび２である。

例２： アクリルアミド骨格およびＰＤＭＡグラフトを有し、分子量１，５００キロダルトンのコポリマーＰ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−１の調製
アミノＰＤＭＡ（０．４ｇ）およびアクリルアミド（２．８ｇ）の共重合が、室温で水５０ｍＬ中で４時間実施され、同時にアルゴンで強く脱気される。使用される開始剤は、過硫酸アンモニウム（（ＮＨ_４）_２Ｓ_２Ｏ_８）［モノマーの量の０．０７５モル％］／二亜硫酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_５）（モノマーの量の０．０２２５モル％）のレドックスカップルである。得られるコポリマーはアセトンからの沈殿により精製され、そして真空下に乾燥される。その分子量は１，５００キロダルトンであり、そしてその多分散性Ｍ_ｗ／Ｍ_ｎは約２である。プロトンＮＭＲで測定された巨大モノマーの配合度は約６％であり、骨格上の側枝の平均数約６に相当する。

使用されるフリーラジカル重合法のために、側鎖を構成する巨大モノマーは、分子間の衝突により偶然に決定されるランダムな位置（ランダム分布）でポリマー鎖に組込まれる。この重合法は、およそ指数関数の形（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｓｈａｐｅ）の、２つの側枝の間に骨格のポリマーセグメントの分子量分布をもたらし、そして１．８を大きく超える骨格の該ポリマーセグメントの多分散性をもたらす。

例３： 種々の分離媒体中のＮａ ＴＡＰＳ１００ｍＭ，ＥＤＴＡ２ｍＭ，尿素緩衝液７Ｍで、５０℃でＡＢＩ３１０機械（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）において、一本鎖ＤＮＡ（５０〜５００ｂｐサイザー（ｓｉｚｅｒ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）について得られた分離特性
本発明による分離媒体Ｐ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−２が、側枝を有さない同一のポリマー骨格に対して（ＰＡＭ，図２および５）、さらに線状ＰＤＭＡにもとづく商業的製品に対しても（ＰＯＰ６、図３および５）分離能を改良することが、視覚的に（図４）、そして分離能測定（図５）によりもっと定量的に観察される。分離時間も低減され、それは本発明による媒体の付加的な利点でもある。大きな部分のアクリルアミドおよび比較的小さな部分のＰＤＭＡを含む本発明によるこのポリマーが、本発明を特徴づける該部分の特定の配置および結合点の存在のために、ホモポリマー形態におけるそれぞれの該成分のものに比べて優れた性質を有することは、意外であるが有利である。

例４： アクリルアミド骨格およびＰＤＭＡグラフトを含み、分子量約３，０００キロダルトンのコポリマーＰ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−２の調製
調製は（（ＮＨ_４）_２Ｓ_２Ｏ_８）の濃度（モノマーの量の０．０７５モル％の代わりの０．１モル％）および（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_５）の濃度（モノマーの量の０．０２２５モル％）および（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_５）の濃度（モノマーの量の０．０２２５モル％の代わりの０．０１５モル％）を除けば、例２に記載されたのと同一である。図６に示される粘度は、結合された（ｉｎｔｅｒｌｏｃｋｅｄ）ポリマーについての分子量の関数として粘度の３次依存関係を用いて、Ｐ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−１のものから開始して、約３，０００キロダルトンの分子量を評価することを可能にする。

例５: ＰＤＭＡグラフトを有する、分子量約３０，０００のコポリマーＰ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−３の調製
第１段階において、分子量３０，０００の巨大モノマーが、０．０３の代わりに０．０１５に設定される比Ｒｏを除けば、例１に記載されるように調製される。この巨大モノマーは、ついで例４に記載されるプロトコールに従ってアクリルアミドと重合される。

例６： 例２、４および５に記載されるポリマー、およびさらに線状アクリルアミドホモポリマーで得られる３％溶液の粘度測定
この例で、各ポリマーが３ｇ／１００ｍＬの率で精製水（ＭｉｌｌｉＱ）に導入された。対応する各溶液の粘度が、Ｒｈｅｏｃａｌｃソフトウェア（Ｓｅｄｅｘｉｍ，Ｍｕｉｚｏｎ，Ｆ）により運転されるＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＤＶ３コーンプレートレオメータにより測定された。選ばれたせん断速度は１℃／分の温度勾配で１０（１／ｓ）である。本発明によるコポリマーが感熱性の性質を有さず（それらの粘度は、温度とともに小さく均一な低下を示す）、そして適度の粘度を有することが、図６で観察される。さらに、コポリマーの構造および性質が重合条件を調節することにより変動され得ることも観察される。

例７： 例２，４および５に記載されるコポリマーに基づく本発明による媒体中で、ならびに比較のために線状ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）および市販の分離媒体「ＰＯＰ５」（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で、一本鎖ＤＮＡフラグメントの電気泳動分離
分離条件は、試料が１００〜１，５００塩基の「サイザー」（ＢｉｏＶｅｎｔｕｒｅ，米国）であることを除いて、例４のものと同一である。配列決定に最も有利な範囲（フラグメントサイズ６００〜１，０００）において、本発明によるコポリマーにもとづく媒体、とくに３％の分離媒体における質量濃度に相当するものは、従来技術のポリマーで得られたものよりも著しく優れる分離能をもたらすことが、図７で観察される。０．３〜０．５のオーダーの分離能が１塩基内でＤＮＡの配列決定をするのに十分であることを考慮すると、本発明による媒体は８００塩基より大きい長さを読み取ることを可能にするはずである。

Claims (30)

1. ５０，０００より大きい平均分子量を有する少なくとも１つのポリマーを含む、流路内の種を分析、精製もしくは分離するための液状媒体であって、
   該少なくとも１つのポリマーが、
   （ａ）不規則ブロックコポリマーまたは
   （ｂ）不規則な櫛型ポリマーであり、
   いくつかのポリマーセグメントからなり、そして異なる化学的もしくは位相的性質のポリマーセグメント間に設けられた、平均して少なくとも３つの接合点を有し、
   該異なるポリマーセグメント型の少なくとも一つのポリマーセグメントの全てが少なくとも１．５の多分散性を有し、
   該媒体が非感熱性である、
   液状媒体。
2. 該少なくとも１つのポリマーが、３００，０００より大きい平均分子量を有する、請求項１に記載の媒体。
3. 該少なくとも１つのポリマーが、１，０００，０００より大きい平均分子量を有する、請求項１に記載の媒体。
4. 該少なくとも１つのポリマーが該流路の壁に対する特異的な親和性を示す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の媒体。
5. 該少なくとも１つのポリマーが、該壁に対する特異的な親和性を示す少なくとも１種類のポリマーセグメント、ならびに該壁に対してほとんどもしくは全く親和性を示さない少なくとも１種類のポリマーセグメントを有する、請求項４に記載の媒体。
6. 該少なくとも１つのポリマーが、少なくとも１種類のポリマーセグメントを有し、該ポリマーセグメントが、水性溶媒に溶解し得るかまたは溶解し得ず、該壁に対して特定の親和性を示し、そしてジメチルアクリルアミドポリマー、アルキル基でＮ−置換されたアクリルアミドポリマー、アルキル基で（Ｎ，Ｎ）−二置換されたアクリルアミドポリマー、アリルグリシジルエーテルポリマー、該アクリル誘導体と他のアクリル誘導体のコポリマー、アルカン類、フルオロ誘導体、シラン類、フルオロシラン類、オキサゾリンポリマーおよびオキサゾリンコポリマー、さらに炭素−炭素結合、エーテルオキシド基およびエポキシド基の組合せを有するポリマ−、ならびにこれらの化合物のランダムコポリマーのすべてからなる群から選ばれるものである、請求項４または５に記載の媒体。
7. 該流路の壁に対して親和性を示すポリマーセグメントが、ジメチルアクリルアミドポリマー、アルキル基でＮ−置換されたアクリルアミドポリマー、アルキル基で（Ｎ，Ｎ）−二置換されたアクリルアミドポリマーおよびアリルグリシジルエーテルポリマーからなる群から選ばれるものである、請求項４〜６のいずれか一項に記載の媒体。
8. 該流路の壁に対して親和性を示すポリマーセグメントが、（Ｎ，Ｎ）−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）である、請求項４〜７のいずれか一項に記載の媒体。
9. 該流路の壁に対してほとんどもしくは全く親和性を示さないポリマーセグメントが、ポリアクリルアミドセグメントである、請求項５に記載の媒体。
10. 該壁に対する特異的な親和性を示すすべてのセグメントが、該少なくとも１つのポリマーの平均全モル質量の２質量％〜８０質量％を示す、請求項４〜９のいずれか一項に記載の媒体。
11. 該ポリマーが１つ以上の被検体に対して特異的な親和性を示す、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の媒体。
12. 少なくとも１種類の化学的もしくは位相的性質のすべてのポリマーセグメントが、平均で、７５より多い原子数を有するか、または１，５００より大きい分子量を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の媒体。
13. 該少なくとも１つのポリマーが平均して４〜１００の接合点の数を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の媒体。
14. 該少なくとも１つのポリマーが平均して少なくとも４つのポリマーセグメントを含むブロックコポリマーである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の媒体。
15. 該少なくとも１つのポリマーが平均して少なくとも２つの側鎖を含む櫛型ポリマーである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の媒体。
16. 該少なくとも１つのポリマーが、ポリエーテル、ポリエステル、ポリオキシアルキレンの溶解性ランダムホモポリマー、ポリオキシアルキレンの溶解性ランダムコポリマー、
    多糖類、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシド、ポリオキサゾリン、ポリスチレンスルホネート、置換もしくは非置換アクリルアミドのポリマーおよびコポリマー、置換もしくは非置換メタクリルアミドのポリマーおよびコポリマー、ならびに置換もしくは非置換アリルポリマーおよびコポリマーからなる群から選ばれる少なくとも１種類のポリマーセグメントを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の媒体。
17. 該少なくとも１つのポリマーが：
    − デキストランポリマー、ポリアクリルアミド、アクリル酸ポリマー、アクリロイルアミノエタノールポリマーおよび（Ｎ，Ｎ）−ジメチルアクリルアミドポリマーからなる群から選ばれる骨格と、ポリアクリルアミド、置換アクリルアミドポリマー、（Ｎ，Ｎ）−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）ポリマー、ＤＭＡ／アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）コポリマー、オキサゾリンホモポリマーおよびオキサゾリンコポリマーからなる群から選ばれるポリマーセグメントである側枝を有する、異なる化学的性質のポリマーセグメントを有する、櫛型コポリマー；
    − ポリオキシエチレンのポリマーセグメントとポリオキシプロピレンのポリマーセグメントの交互変化、ポリオキシエチレンのポリマーセグメントとポリオキシブチレンのポリマーセグメントの交互変化、またはポリエチレンのポリマーセグメントとポリオキシエチレンよりも疎水性であるポリエーテルのポリマーセグメントの交互変化を有する、不規則ブロックコポリマー；
    − ポリアクリルアミド、アクリル酸ポリマー、アクリロイルアミノエタノールポリマーおよびジメチルアクリルアミドポリマーからなる群から選ばれるポリマーセグメントと、（Ｎ，Ｎ）−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）ポリマー、ＤＭＡ／アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）コポリマー、オキサゾリンホモポリマーおよびオキサゾリンコポリマーからなる群から選ばれるポリマーセグメントの交互変化を有する、不規則ブロックコポリマー；
    − アガロースポリマー、ポリアクリルアミド、置換アクリルアミドポリマー、アクリル酸ポリマー、アクリロイルアミノエタノールポリマー、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）ポリマー、アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）ポリマー、ＤＭＡ／ＡＧＥランダムコポリマー、オキサゾリンポリマー、デキストランポリマー、メチルセルロースポリマー、ヒドロキシエチルセルロースポリマー、変性セルロースポリマー、多糖類およびエーテルオキシドポリマーからなる群から選ばれる骨格と、アガロースポリマー、ポリアクリルアミド、置換アクリルアミドポリマー、アクリル酸ポリマー、アクリロイルアミノエタノールポリマー、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）ポリマー、アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）ポリマー、ＤＭＡ／ＡＧＥランダムコポリマー、オキサゾリンポリマー、デキストランポリマー、メチルセルロースポリマー、ヒドロキシエチルセルロースポリマー、変性セルロースポリマー、多糖類およびエーテルオキシドポリマーからなる群から選ばれるポリマーセグメントである側枝を有する、不規則な櫛型ポリマー；または
    − ポリアクリルアミド、置換アクリルアミドポリマー、アクリル酸ポリマー、アクリロイルアミノエタノールポリマー、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）ポリマー、アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）ポリマー、ＤＭＡ／ＡＧＥランダムコポリマー、オキサゾリンポリマー、デキストランポリマー、アガロースポリマー、メチルセルロースポリマー、ヒドロキシエチルセルロースポリマー、変性セルロースポリマー、多糖類およびエーテルオキシドポリマーからなる群から選ばれる骨格を有し、アルキル鎖、芳香族誘導体、フルオロアルキル、シランまたはフルオロシランからなる群から選ばれる短鎖疎水性側セグメントを担持する、不規則な櫛型コポリマー、
    である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の媒体。
18. 該少なくとも１つのポリマーが、デキストランポリマー、ポリアクリルアミド、アクリル酸ポリマー、アクリロイルアミノエタノールポリマーおよび（Ｎ，Ｎ）−ジ−メチルアクリルアミドポリマーからなる群から選ばれる骨格と、ポリアクリルアミド、置換アクリルアミドポリマー、（Ｎ，Ｎ）−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）ポリマー、ＤＭＡ／アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）コポリマー、オキサゾリンホモポリマーおよびオキサゾリンコポリマーからなる群から選ばれるポリマーセグメントである側枝を有する、異なる化学的性質のポリマーセグメントを有する、櫛型ポリマーである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の媒体。
19. 該種と相互作用して、分離媒体としての性能を向上させるように構成された別のポリマーをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の媒体。
20. 分子もしくは巨大分子種、核酸の生物学的巨大分子、合成もしくは化学修飾により得られる核酸類縁体、タンパク、ポリペプチド、グリコペプチドおよび多糖類、有機分子、合成巨大分子、または粒子から選ばれる種を分離、精製、ろ過もしくは分析するための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の媒体の使用。
21. 少なくとも１つの寸法がサブミリメートルサイズである流路における、請求項２０に記載の使用、または請求項１〜１９のいずれか一項に記載の媒体の使用。
22. 界面動電分離のための、請求項２０もしくは２１に記載の使用、または請求項１〜１９のいずれか一項に記載の媒体の使用。
23. 該界面動電分離が細管電気泳動である、請求項２２に記載の使用。
24. 診断、遺伝子検出および高流量スクリーニング、品質管理のため、または製品における遺伝学的に変性された生物の存在を検出するための、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の使用、または請求項１〜１９のいずれか一項に記載の媒体の使用。
25. 該種が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、または合成もしくは化学修飾により得られる核酸類縁体から選ばれる、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の使用、または請求項１〜１９のいずれか一項に記載の媒体の使用。
26. 試料に含まれる種を分離、分析および／または同定する方法であって、
    ａ／請求項１〜１９のいずれか一項に記載の媒体を分離装置の流路に充填すること、
    ｂ／該種を含む該試料を該流路の一端に導入すること、
    ｃ／試料に含まれる特定の種を移動させるように適合された外部フィールドを用いること、ならびに
    ｄ／試料の導入点とは異なる流路に沿った点で、該種を回収、または該種の通過を検出すること
    を含む、方法。
27. 該種が分子もしくは巨大分子種から選ばれる、請求項２６に記載の方法。
28. 該巨大分子種が、核酸、合成もしくは化学修飾により得られる核酸類縁体、タンパク、ポリペプチド、グリコペプチド、または多糖類である、請求項２７に記載の方法。
29. 該外部フィールドが電場である、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 該種の通過が検出される、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。

Images