JP5031370B2 - 外用皮膚潰瘍治療剤 - Google Patents
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Description
本発明は、褥瘡（床ずれ）、糖尿病性皮膚潰瘍、虚血性皮膚潰瘍などの難治性皮膚潰瘍に対して治癒効果に優れる新規な外用皮膚潰瘍治療剤に関する。
現在、日本を含む先進国では、高齢化と生活環境などの変化から、糖尿病を含め生活習慣病が急増している。糖尿病や動脈硬化などで循環障害がある場合、入院患者や在宅看護を受けている人々に褥瘡形成をきたす。褥瘡は、その難治性から、これまでのところ優れた治療法が存在しないので、有効な治療法の開発が待たれている。褥瘡は仙骨部や踵部に好発し、圧迫、湿潤、低栄養などによる組織耐久性の低下が原因とされ、特に、高齢者の場合、皮膚組織や皮下組織が脆弱化しており、組織治癒力の低下が褥瘡の治癒をさらに遅らせる要因となっている。今まで、褥瘡をはじめとする難治性皮膚潰瘍は、血管新生能の低下、線維芽細胞の増殖不良など、いわゆる患部での肉芽形成能の低下が原因とされてきたものの、正確な肉芽形成の機序は未だ解明されていない。そのため、患部組織の保持法や増殖因子の直接噴霧などがその治療法として用いられているのみであり、未だ根本的な治療法は確立されていない。
巨核球は血小板の前駆細胞であり、その成熟過程でPDGF（血小板由来増殖因子）、TGF-β（トランスフォーミング成長因子-β）、IGF（インスリン様成長因子）などの多くの細胞成長因子、サイトカインが合成され、血小板内に包含される。巨核球の骨髄内での分化過程は他の体細胞と同様に、2倍体（2N）の染色体を有し、前骨髄巨核球では4倍体（4N）となり、さらに8N→16N→32N（時に→64N）と倍加していくが、細胞質が分裂しないため、細胞は徐々に巨大化していく。成熟巨核球の細胞質内には多数のα顆粒と細胞内隔壁膜（demarcation membrane）の形成が見られ、血小板分泌は初期段階の“前血小板”として分断、放出され、さらなる分断化により成熟血小板となる。形成された血小板は障害された内皮細胞、内皮下組織にいち早く接着、崩壊することで、内包している多くの物質が放出され、障害部位近傍の組織細胞の再生、または線維芽細胞が増殖し、血管や結合組織の増殖とともに肉芽が形成されてゆく。現在、血小板付着は傷害組織修復の最も重要な律速反応と位置付けされている。
骨髄内巨核球の分化に必要なケモカインとして、TPO（トロンボポエチン）が知られている。一方、G-CSF（顆粒球コロニー形成刺激因子）は細菌感染など炎症に対し、中心的役割を演ずる好中性顆粒球を増加させることで発見されたサイトカインであり、生体防御における最も重要な緊急性サイトカインとされ、血液幹細胞の動員も起こさせることが知られている。G-CSF活性は種々の組織で認められ、主に単球マクロファージ、血管内皮細胞、骨髄ストローマ細胞などにより産生、分泌されるが、現在のところ、医薬品としてのG-CSFの使用目的は、好中球増加に限られている。
組織修復・再生では、局所組織のみならず骨髄由来の細胞の重要性も最近報告され始めている。組織傷害がある場合、血液中に存在する骨髄由来の線維細胞（fibrocytes）が傷害部位に動員され、筋線維芽細胞へと分化することが報告されているが、詳細は未だ解明されていない。近頃、G-CSFを腹腔内注射することで創傷治癒効果を得ることができるとの報告がある（非特許文献1）。また、特許文献1には、G-CSFまたはGM-CSF（顆粒球マクロファージコロニー形成刺激因子）を局所投与または非経口投与することで創傷治癒を促進する方法が提案されている。しかし、特許文献1にはG-CSFのかかる作用を示すデータは一切なく、そこに存在するのはGM-CSFのデータのみである。G-CSFとGM-CSFとは生体内における機能が全く異なるので、当業者であってもGM-CSFのデータからG-CSFの作用を予測することは不可能である。従って、G-CSFを外用剤として直接患部へ塗布したり患部に皮下注射したりした場合における効果については未だもって未知の領域にある。また、CXCR4（T細胞指向性HIV-1ウィルス感染補助受容体）の生理学的リガンドであり、アルファケモカイン（CXC）ファミリーの一種であるSDF-1（ストローマ細胞由来因子-1：別名CXCL12）が、骨髄内での巨核球の血小板分泌のための内皮細胞直下のニッチへの移動（ホーミング）に重要であることや、創傷治癒の過程において白血球系細胞が血液内から患部に集簇することに関与することが報告されているが（非特許文献2および非特許文献3）、SDF-1を局所投与した場合における効果については未だもって未知の領域にある。
特表平5-506673号公報
Eroglu E, et al., Effects of granulocyte-colony stimulating factor on wound healing in a mouse model of burn trauma. Tohoku J. Med. 204, 11-16 (2004)
Heissing B et al., Recruitment of stem and progenitor cells from bone marrow niches MMP-9 mediated release of kit-ligand. Cell 109, 625-637 (2002)
Daniel J Ceradini et al., Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1. Nature Medicine 10, 858-864 (2004)
巨核球は血小板の前駆細胞であり、その成熟過程でPDGF（血小板由来増殖因子）、TGF-β（トランスフォーミング成長因子-β）、IGF（インスリン様成長因子）などの多くの細胞成長因子、サイトカインが合成され、血小板内に包含される。巨核球の骨髄内での分化過程は他の体細胞と同様に、2倍体（2N）の染色体を有し、前骨髄巨核球では4倍体（4N）となり、さらに8N→16N→32N（時に→64N）と倍加していくが、細胞質が分裂しないため、細胞は徐々に巨大化していく。成熟巨核球の細胞質内には多数のα顆粒と細胞内隔壁膜（demarcation membrane）の形成が見られ、血小板分泌は初期段階の“前血小板”として分断、放出され、さらなる分断化により成熟血小板となる。形成された血小板は障害された内皮細胞、内皮下組織にいち早く接着、崩壊することで、内包している多くの物質が放出され、障害部位近傍の組織細胞の再生、または線維芽細胞が増殖し、血管や結合組織の増殖とともに肉芽が形成されてゆく。現在、血小板付着は傷害組織修復の最も重要な律速反応と位置付けされている。
骨髄内巨核球の分化に必要なケモカインとして、TPO（トロンボポエチン）が知られている。一方、G-CSF（顆粒球コロニー形成刺激因子）は細菌感染など炎症に対し、中心的役割を演ずる好中性顆粒球を増加させることで発見されたサイトカインであり、生体防御における最も重要な緊急性サイトカインとされ、血液幹細胞の動員も起こさせることが知られている。G-CSF活性は種々の組織で認められ、主に単球マクロファージ、血管内皮細胞、骨髄ストローマ細胞などにより産生、分泌されるが、現在のところ、医薬品としてのG-CSFの使用目的は、好中球増加に限られている。
組織修復・再生では、局所組織のみならず骨髄由来の細胞の重要性も最近報告され始めている。組織傷害がある場合、血液中に存在する骨髄由来の線維細胞（fibrocytes）が傷害部位に動員され、筋線維芽細胞へと分化することが報告されているが、詳細は未だ解明されていない。近頃、G-CSFを腹腔内注射することで創傷治癒効果を得ることができるとの報告がある（非特許文献1）。また、特許文献1には、G-CSFまたはGM-CSF（顆粒球マクロファージコロニー形成刺激因子）を局所投与または非経口投与することで創傷治癒を促進する方法が提案されている。しかし、特許文献1にはG-CSFのかかる作用を示すデータは一切なく、そこに存在するのはGM-CSFのデータのみである。G-CSFとGM-CSFとは生体内における機能が全く異なるので、当業者であってもGM-CSFのデータからG-CSFの作用を予測することは不可能である。従って、G-CSFを外用剤として直接患部へ塗布したり患部に皮下注射したりした場合における効果については未だもって未知の領域にある。また、CXCR4（T細胞指向性HIV-1ウィルス感染補助受容体）の生理学的リガンドであり、アルファケモカイン（CXC）ファミリーの一種であるSDF-1（ストローマ細胞由来因子-1：別名CXCL12）が、骨髄内での巨核球の血小板分泌のための内皮細胞直下のニッチへの移動（ホーミング）に重要であることや、創傷治癒の過程において白血球系細胞が血液内から患部に集簇することに関与することが報告されているが（非特許文献2および非特許文献3）、SDF-1を局所投与した場合における効果については未だもって未知の領域にある。
そこで本発明は、褥瘡、糖尿病性皮膚潰瘍、虚血性皮膚潰瘍などの難治性皮膚潰瘍に対して治癒効果に優れる新規な外用皮膚潰瘍治療剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、糖尿病患者などに多く見られる難治性皮膚潰瘍を対象とし、皮膚再生のメカニズムの解明、その治療法の確立を目指して鋭意研究を重ねてきた。現在、虚血性組織への対処方法として、創傷治癒過程での幹細胞（前駆細胞）の役割を明らかにしないまま、細胞を分離・採取し、培養条件下で増殖因子などにより特定の細胞へ分化誘導した後、細胞を障害組織に注入するという、創傷治癒効果を加速することを目的とした再生医療も検討されている。しかし、このような方法は、難治性皮膚潰瘍の根本的な治療法にはなり得ない。本発明者らは、まず、正常マウスを用い、創傷治癒過程のメカニズムの解明を行った。それにより、皮膚組織修復に関わる現象には、創傷部収縮と肉芽形成があり、両者は協同的に作用し合うことを見出し、さらに、創傷部収縮には骨髄由来細胞が約60%を受け持ち、残りの約40%は末梢組織細胞が受け持つことを明らかにした。肉芽形成に関しては、骨髄由来筋線維芽細胞が最も重要であり、骨髄が機能しない場合、肉芽形成は全く起こらない。これらの基礎的知見は、今まで全く解明されていなかったものである。さらにこれらの基礎的知見をもとに、幹細胞や巨核球を動員させることができるG-CSF（なおG-CSFの巨核球動員作用は本発明者らによる今般の新知見である）、骨髄由来幹細胞が持つCXCR4、そのリガンドであるSDF-1などのケモカインが創傷部位で有機的に作用しあうことが、その修復に極めて重要であることを見出した。
上記の知見に基づいてなされた本発明の外用難治性皮膚潰瘍治療剤は、請求項１記載の通り、Ｇ−ＣＳＦと親水性高分子としてのコラーゲン、アルギン酸またはその塩から選ばれる少なくとも１つとを含む組成物からなることを特徴とする。
本発明によれば、褥瘡、糖尿病性皮膚潰瘍、虚血性皮膚潰瘍などの難治性皮膚潰瘍に対して治癒効果に優れる新規な外用皮膚潰瘍治療剤が提供される。
本発明の外用皮膚潰瘍治療剤の有効成分となるG-CSFは、顆粒球を分化増殖させる作用を有するなど、当業者にG-CSFとして認識されうるものであれば、既知のアミノ酸配列を持つヒト由来の天然体に限らず、その遺伝子工学的手法による産生体や、そのアミノ酸配列に対して1以上のアミノ酸が置換・欠失・付加・挿入した類縁体であってもよい。G-CSFの創傷治癒における主作用は、骨髄からの好中球、線維細胞、巨核球などの組織修復細胞全般の動員を助けることである。この作用は、他の血管内皮細胞の増殖因子、例えば、線維芽細胞増殖因子（FGF：fibroblast growth factor）などを併用することで、増強されることが期待でき、肉芽形成能をさらに増幅させうる。従って、G-CSFの投与は、創傷治癒能力が低下した難治性皮膚潰瘍に対し、組織修復に必要な複数の骨髄由来細胞を血中に増加させ、結果的に創傷部における潜在的治癒能力を最大限に発揮させることで、難治性皮膚潰瘍の治癒のための基盤的反応を促進させる。また、G-CSFの皮膚潰瘍部への局所投与（皮下注射と外用塗布）による効果としては、皮膚潰瘍部近傍に浸潤した幹細胞などの分化程度の低い骨髄由来細胞の分化促進による創傷治癒促進効果も考えられる。SDF-1は、CXCR4の生理学的リガンドとしての作用を有するなど、当業者にSDF-1として認識されうるものであれば、既知のアミノ酸配列を持つヒト由来の天然体に限らず、その遺伝子工学的手法による産生体や、そのアミノ酸配列に対して1以上のアミノ酸が置換・欠失・付加・挿入した類縁体であってもよい。また、CXCR4の生理学的リガンドとしての作用を有するペプチドや低分子合成化合物であってもよい。CXCR4を保有する骨髄由来組織修復細胞は、創傷部で発現したSDF-1をその標的蛋白として認識し、浸潤すると考えられるため、骨髄からの組織修復細胞の血中での増加が確認できた場合、創傷部においてSDF-1濃度を増加させることにより、選択的に組織修復細胞を創傷部に動員せしめることが可能となる。SDF-1は、難治性皮膚潰瘍病変内で不足した肉芽形成細胞の動員惹起と、それによる肉芽形成誘導のために用いることができ、SDF-1の作用は、他の血管内皮細胞の増殖因子、例えば、FGFなどを併用することで、増強されることが期待できる。CD41陽性細胞としては、例えば、CD41を表面発現している巨核球および血小板が挙げられる。例えば、自家骨髄より採取されたCD41陽性細胞は、創傷部に投与されることで、拒絶反応を起こさないまま細胞内に保持する多量で様々な種類の増殖因子を分泌し、肉芽形成に必要な線維芽細胞の増殖や血管内皮細胞の増殖を促進させるため、病変内での肉芽形成を最適な条件下で促進させ、良好な創傷治癒促進効果を発揮する。
親水性高分子としては、コラーゲン（蛋白質分解酵素により可溶化されて免疫原性が排除されたアテロコラーゲンが望ましい）、アルギン酸またはその塩（ナトリウム塩など）などが挙げられる。これらは保湿効果が高く、また、コラーゲンは蛋白質などの巨大分子の徐放性を有し、アルギン酸は巨大分子の組織浸潤性や細胞内取り込みを促進する作用があるので、創傷治癒過程で有利に機能する。
本発明の外用皮膚潰瘍治療剤は、例えば、G-CSF、SDF-1、CD41陽性細胞から選ばれる少なくとも1つの有効成分を、親水性高分子または溶媒を用いたその希釈溶液に溶解乃至分散して得られる組成物（好適な組成物としては、例えば、親水性高分子を、精製水、生理的食塩水、燐酸緩衝液、塩酸溶液などの溶媒に0.01mg〜10g/100mlの濃度となるように溶解して調製した親水性高分子溶液に、G-CSFおよび／またはSDF-1をその含有量が0.001mg〜10g/100mlになるように溶解して得られるものや、CD41陽性細胞をその細胞数が1×105〜1×1010個/100mlになるように分散して得られるものが挙げられる）をそのまま外用製剤として用いてもよいし、必要に応じて、適宜、自体公知の基材や溶媒を利用して、軟膏やゲルやクリームやローションなどに製剤化して用いてもよい。いずれの方法によっても、例えば、この組成物を、1日1〜数回や1回/1〜2日で1週間〜1ヶ月間、創傷部に有効成分として0.1〜500μg/cm2の割合で塗布したり噴霧したりすることで優れた治療効果を期待することができる。また、この組成物を自体公知の基材シート（リント布や不織布など）に担持させてパップ剤としたり、創傷被覆材用のポリウレタンフィルムなどからなるドレッシング材に担持させて創傷被覆材としたりすることで、創傷部に貼付して用いてもよい。この場合、例えば、創傷被覆材を1回/1〜2日で交換しながら1週間〜1ヶ月間、創傷部に有効成分が0.1〜500μg/cm2の割合で投与されるように適用すればよい。また、G-CSFおよび/またはSDF-1の凍結乾燥品（例えば1バイアル中にG-CSFおよび/またはSDF-1を280μg含有するもの）と、その溶解液（例えば精製水100ml中にコラーゲンを0.3gおよび/またはアルギン酸を5g含有するもの）から用時調製型速乾性スプレーを構成し、例えば、創傷部3cm2を目処にG-CSFおよび/またはSDF-1を1回当たり20μg噴射するようにしてもよい。なお、各種の製剤化に際しては、自体公知の安定化剤、増粘剤、溶解補助剤、保存剤、増量剤、等張化剤、殺菌剤、防腐剤、ゲル化剤などの各種成分を添加してもよいことは言うまでもない。
なお、G-CSF、SDF-1、CD41陽性細胞は、自体公知の方法で製剤化された注射剤の形態で、皮下注射や静脈内注射することによっても皮膚潰瘍治療剤の有効成分として用いることができる。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は以下の記載に何ら限定して解釈されるべきものではないことに留意すべきである。
（1）皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルの作製
C57BL/6マウスを用いて、皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルの作製を行った。麻酔下で、背部皮膚組織全層を2×1.5cmの大きさで剥離すると、出血はほとんどないまま、創傷部表面に筋膜が露呈する。その直後に、創傷部に対して70%エタノール暴露を行うことにより、創傷部周囲組織に凝固的かつ壊死性の変化を惹起せしめることが可能となる。具体的には以下の方法でこの皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルを作製した。C57BL/6マウスの背部皮膚組織全層を2×1.5cmの大きさで剥離し（SP） 、70%エタノールに十分浸した綿で創傷部を完全に覆うことで、30秒間（E30）、60秒間（E60）、300秒間（E300）および600秒間エタノール暴露を行った。その後、創傷部を自然乾燥させ、創傷部面積を測定した（0日目）。そして、実験終了の7日後に創傷部の面積を測定し、0日目の創傷部面積と比較して、創傷部面積の変化を調べた（変化の割合を相対創傷部面積として% of initial areaで規定：以下同じ）。その結果、エタノールの暴露時間が長い程、創傷部収縮は鈍化し、300秒間暴露では収縮はほとんど起こらなかった（図1）。なお、エタノール暴露を600秒間行ったマウスは、実験3日後に全身状態の悪化から死亡した。30秒間暴露や60秒間暴露のようにエタノールの暴露時間が短い場合、創傷部周囲組織が直接的にエタノールにより変性的障害を受けて治癒が遅れたものの、その後1週間で創傷部には肉芽が形成され、約3週間で表皮に覆われ、治癒は完了した。60秒間暴露は、創傷部収縮の遅延因子となるが全身症状がなく、かつその作用が十分であるため、本実施例においてはこれを皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルとして採用した。
GFP-Tg（緑色蛍光強発現マウス）骨髄の移植が成立したC57BL/6マウスを用い、皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルの作製方法に従って皮膚剥離とエタノール暴露を行い、肉芽組織を観察すると、肉芽を構成する細胞の大多数がGFP陽性の細胞だった。この肉芽内の浸潤細胞のα-平滑筋アクチン（α-SMA）発現を、同一切片を用いて免疫組織化学的に検討すると、骨髄由来GFP陽性細胞（GFP）の中にはα-SMA（SMA）を発現する紡錘型細胞が認められ、筋線維芽細胞への分化が示された（図2）。以上の知見から、皮膚創傷部の治癒、すなわち肉芽形成に骨髄由来細胞が貢献しているものと考えられた。
C57BL/6マウスを用いて、皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルの作製を行った。麻酔下で、背部皮膚組織全層を2×1.5cmの大きさで剥離すると、出血はほとんどないまま、創傷部表面に筋膜が露呈する。その直後に、創傷部に対して70%エタノール暴露を行うことにより、創傷部周囲組織に凝固的かつ壊死性の変化を惹起せしめることが可能となる。具体的には以下の方法でこの皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルを作製した。C57BL/6マウスの背部皮膚組織全層を2×1.5cmの大きさで剥離し（SP） 、70%エタノールに十分浸した綿で創傷部を完全に覆うことで、30秒間（E30）、60秒間（E60）、300秒間（E300）および600秒間エタノール暴露を行った。その後、創傷部を自然乾燥させ、創傷部面積を測定した（0日目）。そして、実験終了の7日後に創傷部の面積を測定し、0日目の創傷部面積と比較して、創傷部面積の変化を調べた（変化の割合を相対創傷部面積として% of initial areaで規定：以下同じ）。その結果、エタノールの暴露時間が長い程、創傷部収縮は鈍化し、300秒間暴露では収縮はほとんど起こらなかった（図1）。なお、エタノール暴露を600秒間行ったマウスは、実験3日後に全身状態の悪化から死亡した。30秒間暴露や60秒間暴露のようにエタノールの暴露時間が短い場合、創傷部周囲組織が直接的にエタノールにより変性的障害を受けて治癒が遅れたものの、その後1週間で創傷部には肉芽が形成され、約3週間で表皮に覆われ、治癒は完了した。60秒間暴露は、創傷部収縮の遅延因子となるが全身症状がなく、かつその作用が十分であるため、本実施例においてはこれを皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルとして採用した。
GFP-Tg（緑色蛍光強発現マウス）骨髄の移植が成立したC57BL/6マウスを用い、皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルの作製方法に従って皮膚剥離とエタノール暴露を行い、肉芽組織を観察すると、肉芽を構成する細胞の大多数がGFP陽性の細胞だった。この肉芽内の浸潤細胞のα-平滑筋アクチン（α-SMA）発現を、同一切片を用いて免疫組織化学的に検討すると、骨髄由来GFP陽性細胞（GFP）の中にはα-SMA（SMA）を発現する紡錘型細胞が認められ、筋線維芽細胞への分化が示された（図2）。以上の知見から、皮膚創傷部の治癒、すなわち肉芽形成に骨髄由来細胞が貢献しているものと考えられた。
（2）骨髄抑制による難治性皮膚潰瘍モデルの作製
皮膚創傷部に形成された肉芽を構成する細胞のほとんどは骨髄由来であり、同細胞は局所で筋線維芽細胞へと分化し、組織修復を行っていることが示されたが、次に、フルオロウラシル系抗腫瘍剤である5-フルオロウラシル（5-FU）投与により骨髄抑制を行い、肉芽形成能の検討を行った。C57BL/6マウスの腹腔内に濃度11.25mg/mlの5-FU（溶媒は滅菌精製水を使用：以下同じ）を750μl投与した翌日に、マウスの背部皮膚組織全層を2×1.5cmの大きさで剥離し、70%エタノール暴露を60秒間行い、7日後に形成された肉芽を正常マウスのそれと比較すると、5-FUによる骨髄抑制マウスでの肉芽形成は強く抑制され、ほとんど浸潤細胞も見られなかった。同様に、GFP-Tg骨髄の移植が成立したC57BL/6マウスに5-FUを投与し、皮膚剥離とエタノール暴露を行って肉芽組織を観察すると、肉芽内へのGFP含有細胞の浸潤は劇的に減少していた。
C57BL/6マウスに濃度11.25mg/mlの5-FUをそれぞれ100,250,500,750μl腹腔内投与した翌日に背部皮膚剥離とエタノール暴露を行った。皮膚剥離とエタノール暴露7日後の相対創傷部面積と白血球数を、5-FUを投与せずに背部皮膚剥離とエタノール暴露を行ったものと比べると、白血球数は5-FU濃度依存的な減少が見られた。一方、相対創傷部面積は5-FU濃度依存的にその減少の程度が低下していた。この結果から、皮膚創傷治癒に骨髄細胞が密接な関与を有することがわかった（図3）。
以上の結果から、5-FU投与による皮膚創傷後の肉芽形成不良は、骨髄機能不全による難治性皮膚潰瘍の1つのモデルと考えられ、さらには、ラットやマウスなどのげっ歯目に属する動物に代表される非ヒト動物に、骨髄形成や造血機能に障害を及ぼす作用を有するフルオロウラシル系抗腫瘍剤などの抗腫瘍剤を、1〜1000mg/kgの投与量で非経口投与（腹腔内投与や静脈内投与など）し、その1〜3日後に背部皮膚を剥離すると、皮膚剥離部分に難治性皮膚潰瘍を形成せしめることができることがわかった。
皮膚創傷部に形成された肉芽を構成する細胞のほとんどは骨髄由来であり、同細胞は局所で筋線維芽細胞へと分化し、組織修復を行っていることが示されたが、次に、フルオロウラシル系抗腫瘍剤である5-フルオロウラシル（5-FU）投与により骨髄抑制を行い、肉芽形成能の検討を行った。C57BL/6マウスの腹腔内に濃度11.25mg/mlの5-FU（溶媒は滅菌精製水を使用：以下同じ）を750μl投与した翌日に、マウスの背部皮膚組織全層を2×1.5cmの大きさで剥離し、70%エタノール暴露を60秒間行い、7日後に形成された肉芽を正常マウスのそれと比較すると、5-FUによる骨髄抑制マウスでの肉芽形成は強く抑制され、ほとんど浸潤細胞も見られなかった。同様に、GFP-Tg骨髄の移植が成立したC57BL/6マウスに5-FUを投与し、皮膚剥離とエタノール暴露を行って肉芽組織を観察すると、肉芽内へのGFP含有細胞の浸潤は劇的に減少していた。
C57BL/6マウスに濃度11.25mg/mlの5-FUをそれぞれ100,250,500,750μl腹腔内投与した翌日に背部皮膚剥離とエタノール暴露を行った。皮膚剥離とエタノール暴露7日後の相対創傷部面積と白血球数を、5-FUを投与せずに背部皮膚剥離とエタノール暴露を行ったものと比べると、白血球数は5-FU濃度依存的な減少が見られた。一方、相対創傷部面積は5-FU濃度依存的にその減少の程度が低下していた。この結果から、皮膚創傷治癒に骨髄細胞が密接な関与を有することがわかった（図3）。
以上の結果から、5-FU投与による皮膚創傷後の肉芽形成不良は、骨髄機能不全による難治性皮膚潰瘍の1つのモデルと考えられ、さらには、ラットやマウスなどのげっ歯目に属する動物に代表される非ヒト動物に、骨髄形成や造血機能に障害を及ぼす作用を有するフルオロウラシル系抗腫瘍剤などの抗腫瘍剤を、1〜1000mg/kgの投与量で非経口投与（腹腔内投与や静脈内投与など）し、その1〜3日後に背部皮膚を剥離すると、皮膚剥離部分に難治性皮膚潰瘍を形成せしめることができることがわかった。
(3) ストレプトゾトシン（STZ）誘発による糖尿病性難治性皮膚潰瘍モデルの作製
C57BL/6マウスにSTZ（4mg/20g体重，溶媒は0.2Mクエン酸緩衝液pH4.8を使用）を腹腔内投与し、高血糖状態の糖尿病モデルを作製した。STZ投与により骨髄形成は一過性に抑制されるが、2週間後には回復してくる。STZ投与3週間後、マウスの背部皮膚組織全層を2×1.5cmの大きさで剥離し、70%エタノール暴露を60秒間行ってから7日後の相対創傷部面積と肉芽形成能を、正常マウスを用いた皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルのそれと比較した。その結果、相対創傷部面積はこのモデルでは約80%で、皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデル（約40%）に比べ極めて悪かった。さらに肉芽形成能も不良となっていた（図4）。以上の結果から、このモデルは糖尿病による難治性皮膚潰瘍の病態モデルと考えられた。
C57BL/6マウスにSTZ（4mg/20g体重，溶媒は0.2Mクエン酸緩衝液pH4.8を使用）を腹腔内投与し、高血糖状態の糖尿病モデルを作製した。STZ投与により骨髄形成は一過性に抑制されるが、2週間後には回復してくる。STZ投与3週間後、マウスの背部皮膚組織全層を2×1.5cmの大きさで剥離し、70%エタノール暴露を60秒間行ってから7日後の相対創傷部面積と肉芽形成能を、正常マウスを用いた皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルのそれと比較した。その結果、相対創傷部面積はこのモデルでは約80%で、皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデル（約40%）に比べ極めて悪かった。さらに肉芽形成能も不良となっていた（図4）。以上の結果から、このモデルは糖尿病による難治性皮膚潰瘍の病態モデルと考えられた。
（4）皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルと難治性皮膚潰瘍モデルにおける骨髄移植による肉芽形成促進作用
次に、骨髄細胞が肉芽形成促進に関わっているかを検討するため、C57BL/6マウスを用いて3種類のモデル、第1群：GFP-Tg骨髄移植成立マウスに背部皮膚剥離とエタノール暴露を行った群、第2群：5-FU投与（濃度11.25mg/mlの5-FUを250μl腹腔内投与）翌日の背部皮膚剥離とエタノール暴露およびGFP-Tg骨髄移植の同時施行群、第3群：5-FU投与（同）翌日にGFP-Tgの骨髄移植を行い、翌日、血中から完全に蛍光細胞の消失を確認後、背部皮膚剥離とエタノール暴露を行った群、を作製した。肉芽形成能は全て皮膚剥離とエタノール暴露から7日後に検討した。その結果、いずれの群でも、組織修復能は良好で、3群間に差はなかった。しかし、蛍光顕微鏡下で観察すると、第1群では瘡蓋から壊死巣、および肉芽までの全層にGFP陽性細胞が広がっていた。一方、第2群では瘡蓋部で蛍光細胞が欠損し、第3群では、瘡蓋およびその下の壊死巣まで、蛍光細胞が欠損していた。しかし、いずれの群でも肉芽内にはGFP陽性細胞が分布し、骨髄移植による創傷治癒促進作用が確認された。よって、骨髄細胞が皮膚創傷の治癒に大きな役割を果たすことがわかった。
次に、骨髄細胞が肉芽形成促進に関わっているかを検討するため、C57BL/6マウスを用いて3種類のモデル、第1群：GFP-Tg骨髄移植成立マウスに背部皮膚剥離とエタノール暴露を行った群、第2群：5-FU投与（濃度11.25mg/mlの5-FUを250μl腹腔内投与）翌日の背部皮膚剥離とエタノール暴露およびGFP-Tg骨髄移植の同時施行群、第3群：5-FU投与（同）翌日にGFP-Tgの骨髄移植を行い、翌日、血中から完全に蛍光細胞の消失を確認後、背部皮膚剥離とエタノール暴露を行った群、を作製した。肉芽形成能は全て皮膚剥離とエタノール暴露から7日後に検討した。その結果、いずれの群でも、組織修復能は良好で、3群間に差はなかった。しかし、蛍光顕微鏡下で観察すると、第1群では瘡蓋から壊死巣、および肉芽までの全層にGFP陽性細胞が広がっていた。一方、第2群では瘡蓋部で蛍光細胞が欠損し、第3群では、瘡蓋およびその下の壊死巣まで、蛍光細胞が欠損していた。しかし、いずれの群でも肉芽内にはGFP陽性細胞が分布し、骨髄移植による創傷治癒促進作用が確認された。よって、骨髄細胞が皮膚創傷の治癒に大きな役割を果たすことがわかった。
（5）皮膚創傷による内因性（マウス）G-CSF血中濃度の変化
次に、皮膚創傷治癒過程の肉芽形成に骨髄細胞の動員が必要であることに基づき、内因性G-CSFの創傷治癒における体内動態を調べた。皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルの作製方法に従ってC57BL/6マウスに背部皮膚剥離とエタノール暴露を行った後、眼窩採血で得た血漿を用いて、血漿内G-CSF濃度をELISA法（R&D system）で測定した。その結果、皮膚剥離とエタノール暴露後1日目で無処置対照群に比べ100倍以上の血中G-CSF濃度の増加が起こり、その後、2日目、4日目と徐々に減少した（図5）。つまり、皮膚剥離とエタノール暴露後に起こる創傷部への骨髄由来修復細胞の出現前に、血中G-CSF濃度の急峻な増加が起こることが明らかとなり、組織傷害→G-CSF増加→骨髄細胞の動員→骨髄細胞による組織修復→肉芽形成という一連の治癒過程が存在することが考えられ、組織損傷後のG-CSFの血中での増加は極めて生理的、合目的かつ必要不可欠な生体反応であることが考えられた。
次に、皮膚創傷治癒過程の肉芽形成に骨髄細胞の動員が必要であることに基づき、内因性G-CSFの創傷治癒における体内動態を調べた。皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルの作製方法に従ってC57BL/6マウスに背部皮膚剥離とエタノール暴露を行った後、眼窩採血で得た血漿を用いて、血漿内G-CSF濃度をELISA法（R&D system）で測定した。その結果、皮膚剥離とエタノール暴露後1日目で無処置対照群に比べ100倍以上の血中G-CSF濃度の増加が起こり、その後、2日目、4日目と徐々に減少した（図5）。つまり、皮膚剥離とエタノール暴露後に起こる創傷部への骨髄由来修復細胞の出現前に、血中G-CSF濃度の急峻な増加が起こることが明らかとなり、組織傷害→G-CSF増加→骨髄細胞の動員→骨髄細胞による組織修復→肉芽形成という一連の治癒過程が存在することが考えられ、組織損傷後のG-CSFの血中での増加は極めて生理的、合目的かつ必要不可欠な生体反応であることが考えられた。
（6）骨髄細胞動員作用を有するG-CSF投与による骨髄由来細胞の一つ巨核球の生物学的動態
今までの報告では、マウスへのG-CSFの皮下投与により、骨髄から血液中に血液幹細胞は動員され、巨核球前駆細胞（CFU-MK）も血液中に増加することが知られているものの、培養的手法を用いているため、その臓器内での量や、分化の程度など正確な情報は不明のままである。そこで、C57BL/6マウスを用い、巨核球の細胞マーカーであるCD41とAChE（アセチルコリンエステラーゼ）活性から、骨髄、脾臓、血液および他の臓器内での巨核球の分布を直接的に検討した。大腿骨の骨髄、脾臓、肝臓、肺の組織内の巨核球は、酵素組織化学的にAChE活性を染色した後、形態計測し、単位面積当たりの数、およびサイズ別頻度を算出した。血液内巨核球数はCD41陽性の細胞にマイクロビーズを結合させ、自動磁気細胞分離装置でCD41陽性細胞を分離後、自動血球測定装置で血小板を除いた細胞数で表した。その結果、250μg/kgの投与量で、G-CSF（ヒトのリコンビナントG-CSF，lenograstim，中外製薬の商品名：以下同じ）を1日1回連続7日間皮下投与（腰部皮下注射：以下同じ）すると、骨髄内の巨核球は徐々に減少し、7日後には対照群のそれより1/3以下に低下した（図6）。特に、AChE活性を持つ細胞サイズが小さいものでのその減少は大きかった（図7：骨髄と脾臓内のAChE陽性部位を細胞の大きさとし、100μm2毎に分け、単位面積あたりの各サイズの巨核球数で表した）。
一方、血液内での骨髄由来細胞であるCD41陽性細胞を検討すると、正常でもわずかながらCD41陽性細胞が存在するものの、投与量250μg/kgのG-CSFの1日1回連続7日間皮下投与により、7日後には投与前の約5倍まで細胞数が増加した（図8：それぞれのG-CSF投与期間終了後のマウスを麻酔後、心臓針刺により全血を採取し、血小板除去後、分離した白血球分画を用い、CD41陽性細胞をCD41抗体+マイクロビーズで反応させた後に、自動磁気細胞分離装置で分離し、血液細胞測定装置で血小板を除いたCD41陽性細胞数で表した）。また、異なる濃度のG-CSFを投与すると、脾臓内での同細胞数は濃度依存的な増加を示した。このように、G-CSF投与によるAChE活性またはCD41陽性細胞浸潤は脾臓内で多く認められるものの、肝臓内と肺内ではほとんど認められなかった。
G-CSFの生体内での半減期は約4〜5時間とされ、C57BL/6マウスに投与量250μg/kgのG-CSFを1日1回連続7日間皮下投与すると、好中球など顆粒球系細胞が骨髄内で徐々に増加しながら、血中へと動員され、7日後に最高値に達する。G-CSFは血液幹細胞を血中に動員することも知られているが、好中球が持つエラスターゼやマトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs）などの蛋白分解酵素が、細胞のストローマとの接着部分を切断すると考えられている。つまり、G-CSFによる巨核球の血液内遊出も、骨髄内での好中球増加による二次的な細胞反応の可能性もある。このことから、巨核球系細胞の骨髄からの動員が、直接的なものかどうかを明らかにするため、C57BL/6マウスに濃度の異なるG-CSFを1回のみ皮下投与し、その後の脾臓内での巨核球の変動を検討した。その結果、G-CSFの1回皮下投与のみでも、濃度依存的な脾臓内巨核球の出現を認めた。また、C57BL/6マウスに投与量250μg/kgでG-CSFを1日1回連続7日間皮下投与または1回のみ皮下投与し、脾臓内での巨核球数の時間的変動を比較すると、連続投与の場合は指数関数的な増加を示すものの、1回投与では直線的な増加を示した（図9：連続投与の1回目と1回投与は横軸1日目に行いその結果は翌日の横軸2日目に測定して図中に表示。連続投与については3,5,7回目の実施の結果を横軸4,6,8日目に表示。1回投与については投与後3,5,7日目の結果を横軸4,6,8日目に表示）。このことから、G-CSF投与により骨髄から巨核球系細胞は即座に遊出され、脾臓に生着し、成熟すると考えられた。
今までの報告では、マウスへのG-CSFの皮下投与により、骨髄から血液中に血液幹細胞は動員され、巨核球前駆細胞（CFU-MK）も血液中に増加することが知られているものの、培養的手法を用いているため、その臓器内での量や、分化の程度など正確な情報は不明のままである。そこで、C57BL/6マウスを用い、巨核球の細胞マーカーであるCD41とAChE（アセチルコリンエステラーゼ）活性から、骨髄、脾臓、血液および他の臓器内での巨核球の分布を直接的に検討した。大腿骨の骨髄、脾臓、肝臓、肺の組織内の巨核球は、酵素組織化学的にAChE活性を染色した後、形態計測し、単位面積当たりの数、およびサイズ別頻度を算出した。血液内巨核球数はCD41陽性の細胞にマイクロビーズを結合させ、自動磁気細胞分離装置でCD41陽性細胞を分離後、自動血球測定装置で血小板を除いた細胞数で表した。その結果、250μg/kgの投与量で、G-CSF（ヒトのリコンビナントG-CSF，lenograstim，中外製薬の商品名：以下同じ）を1日1回連続7日間皮下投与（腰部皮下注射：以下同じ）すると、骨髄内の巨核球は徐々に減少し、7日後には対照群のそれより1/3以下に低下した（図6）。特に、AChE活性を持つ細胞サイズが小さいものでのその減少は大きかった（図7：骨髄と脾臓内のAChE陽性部位を細胞の大きさとし、100μm2毎に分け、単位面積あたりの各サイズの巨核球数で表した）。
一方、血液内での骨髄由来細胞であるCD41陽性細胞を検討すると、正常でもわずかながらCD41陽性細胞が存在するものの、投与量250μg/kgのG-CSFの1日1回連続7日間皮下投与により、7日後には投与前の約5倍まで細胞数が増加した（図8：それぞれのG-CSF投与期間終了後のマウスを麻酔後、心臓針刺により全血を採取し、血小板除去後、分離した白血球分画を用い、CD41陽性細胞をCD41抗体+マイクロビーズで反応させた後に、自動磁気細胞分離装置で分離し、血液細胞測定装置で血小板を除いたCD41陽性細胞数で表した）。また、異なる濃度のG-CSFを投与すると、脾臓内での同細胞数は濃度依存的な増加を示した。このように、G-CSF投与によるAChE活性またはCD41陽性細胞浸潤は脾臓内で多く認められるものの、肝臓内と肺内ではほとんど認められなかった。
G-CSFの生体内での半減期は約4〜5時間とされ、C57BL/6マウスに投与量250μg/kgのG-CSFを1日1回連続7日間皮下投与すると、好中球など顆粒球系細胞が骨髄内で徐々に増加しながら、血中へと動員され、7日後に最高値に達する。G-CSFは血液幹細胞を血中に動員することも知られているが、好中球が持つエラスターゼやマトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs）などの蛋白分解酵素が、細胞のストローマとの接着部分を切断すると考えられている。つまり、G-CSFによる巨核球の血液内遊出も、骨髄内での好中球増加による二次的な細胞反応の可能性もある。このことから、巨核球系細胞の骨髄からの動員が、直接的なものかどうかを明らかにするため、C57BL/6マウスに濃度の異なるG-CSFを1回のみ皮下投与し、その後の脾臓内での巨核球の変動を検討した。その結果、G-CSFの1回皮下投与のみでも、濃度依存的な脾臓内巨核球の出現を認めた。また、C57BL/6マウスに投与量250μg/kgでG-CSFを1日1回連続7日間皮下投与または1回のみ皮下投与し、脾臓内での巨核球数の時間的変動を比較すると、連続投与の場合は指数関数的な増加を示すものの、1回投与では直線的な増加を示した（図9：連続投与の1回目と1回投与は横軸1日目に行いその結果は翌日の横軸2日目に測定して図中に表示。連続投与については3,5,7回目の実施の結果を横軸4,6,8日目に表示。1回投与については投与後3,5,7日目の結果を横軸4,6,8日目に表示）。このことから、G-CSF投与により骨髄から巨核球系細胞は即座に遊出され、脾臓に生着し、成熟すると考えられた。
（7）皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルにおけるG-CSFによる皮膚創傷部の修復促進作用
そこで次に、骨髄細胞の動員作用を有するG-CSFによる創傷治癒促進効果を検討した。C57BL/6マウスを用いて作製した皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルに投与量250μg/kgのG-CSFを1日1回連続7日間皮下投与し、創傷部の肉芽形成能を生理的食塩水投与の対照マウスのそれと比較した。その結果、G-CSF投与群の肉芽は厚く、紡錘型細胞の増殖が多く、さらにマトリックスも豊富で、明らかに肉芽形成能は亢進しており、骨髄細胞を動員する能力のあるG-CSFにより、皮膚創傷治癒遅延状態が改善されることがわかった。
そこで次に、骨髄細胞の動員作用を有するG-CSFによる創傷治癒促進効果を検討した。C57BL/6マウスを用いて作製した皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルに投与量250μg/kgのG-CSFを1日1回連続7日間皮下投与し、創傷部の肉芽形成能を生理的食塩水投与の対照マウスのそれと比較した。その結果、G-CSF投与群の肉芽は厚く、紡錘型細胞の増殖が多く、さらにマトリックスも豊富で、明らかに肉芽形成能は亢進しており、骨髄細胞を動員する能力のあるG-CSFにより、皮膚創傷治癒遅延状態が改善されることがわかった。
（8）皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルと難治性皮膚潰瘍モデルを用いたG-CSF投与における肉芽形成と血中CD41陽性細胞動態への影響
皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルと難治性皮膚潰瘍モデルにおける肉芽形成反応と血中CD41陽性細胞数との関係を検討するため、血小板数、CD41陽性細胞数、肉芽の厚さを測定した。試験群は次の通りである。1）対照群（正常マウス：Control）、2）皮膚剥離とエタノール暴露を行った群（SP）、3）皮膚剥離とエタノール暴露を行ってから投与量250μg/kgのG-CSFを1日1回連続7日間皮下投与した群（SP+G-CSF）、4）濃度11.25mg/mlの5-FUを250μl腹腔内投与した翌日に皮膚剥離とエタノール暴露を行った群（SP+5-FU）、5）濃度11.25mg/mlの5-FUを250μl腹腔内投与した翌日に皮膚剥離とエタノール暴露を行ってから投与量250μg/kgのG-CSFを1日1回連続7日間皮下投与した群（SP+5-FU+G-CSF）。結果を表1に示す。
皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルと難治性皮膚潰瘍モデルにおける肉芽形成反応と血中CD41陽性細胞数との関係を検討するため、血小板数、CD41陽性細胞数、肉芽の厚さを測定した。試験群は次の通りである。1）対照群（正常マウス：Control）、2）皮膚剥離とエタノール暴露を行った群（SP）、3）皮膚剥離とエタノール暴露を行ってから投与量250μg/kgのG-CSFを1日1回連続7日間皮下投与した群（SP+G-CSF）、4）濃度11.25mg/mlの5-FUを250μl腹腔内投与した翌日に皮膚剥離とエタノール暴露を行った群（SP+5-FU）、5）濃度11.25mg/mlの5-FUを250μl腹腔内投与した翌日に皮膚剥離とエタノール暴露を行ってから投与量250μg/kgのG-CSFを1日1回連続7日間皮下投与した群（SP+5-FU+G-CSF）。結果を表1に示す。
表1から明らかなように、血小板数は皮膚剥離とエタノール暴露を行うことで対照群に比べて増加していたが、皮膚剥離とエタノール暴露とともにG-CSF投与したものでは対照群に比べて減少していた。CD41陽性細胞数は皮膚剥離とエタノール暴露を行うことで対照群より約35%減少していたが、皮膚剥離とエタノール暴露とともにG-CSF投与したものでは皮膚剥離とエタノール暴露だけを行ったものに比べて約2倍に増加していた。形成された肉芽の厚さはG-CSF投与により増加していた。特に、難治性皮膚潰瘍モデルであるSP+5-FU群とSP+5-FU+G-CSF群を比べると、G-CSFを投与したことにより明らかに肉芽形成は改善していた。肉芽の厚さとCD41陽性細胞数または血小板数の相関を見ると、CD41陽性細胞数との間に強い正の相関が見られるものの、血小板数との間には相関は見られなかった（図10）。以上の結果から、G-CSFの皮下投与は、皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルと難治性皮膚潰瘍モデルの両者に有効であることが確認された。
（9）皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルにおけるG-CSF投与後のCD41陽性細胞の動態解析
先の図8に示したように、G-CSFの投与3日後よりCD41陽性細胞が血中に増加してくる。GFP-Tg骨髄移植成立C57BL/6マウスに背部皮膚剥離とエタノール暴露を行うと、翌日からGFP陽性骨髄由来細胞浸潤が少量認められ、3日後に明らかな増加が見られる。この時期は、肉芽形成開始時期と一致している。投与量250μg/kgのG-CSFを1日1回連続3日間皮下投与したC57BL/6マウスに背部皮膚剥離とエタノール暴露を行い、その翌日に採血を行い、血液中CD41陽性細胞数を測定した（G-CSF+Skin Peel）。あわせて、G-CSF非投与のマウスの血液中CD41陽性細胞数（control）、G-CSFの投与だけを行ったマウスのその翌日の血液中CD41陽性細胞数（G-CSF）、背部皮膚剥離とエタノール暴露だけを行ったマウスのその翌日の血液中CD41陽性細胞数（Skin Peel）を測定した。その結果、G-CSFの投与だけを行った群ではCD41陽性細胞は増加するものの、G-CSFを投与してから背部皮膚剥離とエタノール暴露を行った群ではG-CSFの投与だけを行った群に比べCD41陽性細胞数は有意に減少していた（図11）。GFP-Tg骨髄移植成立C57BL/6マウスに背部皮膚剥離とエタノール暴露を行った後に形成された肉芽内には、GFP陽性の多核で、胞体の広い細胞が見られ、これらの細胞はCD41陽性であることから、巨核球系細胞であることが確認された。つまり、G-CSFの投与により骨髄から血中に動員された巨核球は、創傷がある場合にはそこに引き寄せられ、浸潤したと考えられた。また、創傷部での巨核球は多くの増殖因子を有することから、肉芽形成の重要な促進因子になっていることが考えられた。
先の図8に示したように、G-CSFの投与3日後よりCD41陽性細胞が血中に増加してくる。GFP-Tg骨髄移植成立C57BL/6マウスに背部皮膚剥離とエタノール暴露を行うと、翌日からGFP陽性骨髄由来細胞浸潤が少量認められ、3日後に明らかな増加が見られる。この時期は、肉芽形成開始時期と一致している。投与量250μg/kgのG-CSFを1日1回連続3日間皮下投与したC57BL/6マウスに背部皮膚剥離とエタノール暴露を行い、その翌日に採血を行い、血液中CD41陽性細胞数を測定した（G-CSF+Skin Peel）。あわせて、G-CSF非投与のマウスの血液中CD41陽性細胞数（control）、G-CSFの投与だけを行ったマウスのその翌日の血液中CD41陽性細胞数（G-CSF）、背部皮膚剥離とエタノール暴露だけを行ったマウスのその翌日の血液中CD41陽性細胞数（Skin Peel）を測定した。その結果、G-CSFの投与だけを行った群ではCD41陽性細胞は増加するものの、G-CSFを投与してから背部皮膚剥離とエタノール暴露を行った群ではG-CSFの投与だけを行った群に比べCD41陽性細胞数は有意に減少していた（図11）。GFP-Tg骨髄移植成立C57BL/6マウスに背部皮膚剥離とエタノール暴露を行った後に形成された肉芽内には、GFP陽性の多核で、胞体の広い細胞が見られ、これらの細胞はCD41陽性であることから、巨核球系細胞であることが確認された。つまり、G-CSFの投与により骨髄から血中に動員された巨核球は、創傷がある場合にはそこに引き寄せられ、浸潤したと考えられた。また、創傷部での巨核球は多くの増殖因子を有することから、肉芽形成の重要な促進因子になっていることが考えられた。
（10）G-CSF投与回数と創傷部収縮効果
次に、G-CSF投与回数と創傷部収縮効果を検討し、創傷治癒促進作用が投与回数に依存するかを検討した。C57BL/6マウスを用いて作製した皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルに、投与量250μg/kgのG-CSFを1回（G1）、1日1回連続2日間（G2）、1日1回連続4日間（G4）皮下投与し、7日後の相対創傷部面積を調べた。その結果、G-CSF投与回数が増えるとともに創傷部は収縮し、1日1回連続4日間投与で対照群（C）より約10%収縮していた（図12）。また、濃度50μg/mlでG-CSFを、連続2日間で総投与量が10μg,20μg,40μgになるように皮下投与し、7日後の相対創傷部面積を調べた。その結果、対照群に比べて、G-CSF投与濃度依存的に創傷部が収縮し、治癒が促進された（図13）。
次に、G-CSF投与回数と創傷部収縮効果を検討し、創傷治癒促進作用が投与回数に依存するかを検討した。C57BL/6マウスを用いて作製した皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルに、投与量250μg/kgのG-CSFを1回（G1）、1日1回連続2日間（G2）、1日1回連続4日間（G4）皮下投与し、7日後の相対創傷部面積を調べた。その結果、G-CSF投与回数が増えるとともに創傷部は収縮し、1日1回連続4日間投与で対照群（C）より約10%収縮していた（図12）。また、濃度50μg/mlでG-CSFを、連続2日間で総投与量が10μg,20μg,40μgになるように皮下投与し、7日後の相対創傷部面積を調べた。その結果、対照群に比べて、G-CSF投与濃度依存的に創傷部が収縮し、治癒が促進された（図13）。
（11）G-CSF外用剤の皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルにおける創傷治癒効果
G-CSFを、濃度5μg/200μlでアテロコラーゲン溶液（3mg/ml塩酸溶液：以下同じ）に溶解し、これをC57BL/6マウスを用いて作製した皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルの創傷部に塗布後、凝固させた。そして、皮膚剥離とエタノール暴露直後および7日後の創傷部面積を測定した。その結果、無処置群（w/o C）とアテロコラーゲン溶液塗布群（C）では、7日後の相対創傷部面積に差はなかったが、アテロコラーゲン溶液・G-CSF塗布群（C+G）では約10%の相対創傷部面積の減少を認めた（図14）。よって、G-CSFは外用皮膚潰瘍治療剤の有効成分として有用であることがわかった。
G-CSFを、濃度5μg/200μlでアテロコラーゲン溶液（3mg/ml塩酸溶液：以下同じ）に溶解し、これをC57BL/6マウスを用いて作製した皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルの創傷部に塗布後、凝固させた。そして、皮膚剥離とエタノール暴露直後および7日後の創傷部面積を測定した。その結果、無処置群（w/o C）とアテロコラーゲン溶液塗布群（C）では、7日後の相対創傷部面積に差はなかったが、アテロコラーゲン溶液・G-CSF塗布群（C+G）では約10%の相対創傷部面積の減少を認めた（図14）。よって、G-CSFは外用皮膚潰瘍治療剤の有効成分として有用であることがわかった。
（12）G-CSF外用剤の創傷部治療効果に対する濃度依存性
G-CSFを、濃度10,20,40μg/200μlでアテロコラーゲン溶液に溶解し、これをC57BL/6マウスを用いて作製した皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルの創傷部に塗布後、凝固させた。そして、皮膚剥離とエタノール暴露直後および7日後の創傷部面積を測定した。その結果、アテロコラーゲン溶液塗布群（SPC）と対照群（SP）では、7日後の相対創傷部面積に差はなかったが、アテロコラーゲン溶液・G-CSF塗布群（SPC+G10,G20,G40）ではG-CSF濃度が20μg/200μlまで濃度依存的に相対創傷部面積が減少した。しかし、G-CSF濃度40μg/200μlでは創傷部の収縮効果は減弱した（図15）。よって、外用皮膚潰瘍治療剤としてG-CSFは有効であり、その作用は用量依存的であることがわかった。
G-CSFを、濃度10,20,40μg/200μlでアテロコラーゲン溶液に溶解し、これをC57BL/6マウスを用いて作製した皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルの創傷部に塗布後、凝固させた。そして、皮膚剥離とエタノール暴露直後および7日後の創傷部面積を測定した。その結果、アテロコラーゲン溶液塗布群（SPC）と対照群（SP）では、7日後の相対創傷部面積に差はなかったが、アテロコラーゲン溶液・G-CSF塗布群（SPC+G10,G20,G40）ではG-CSF濃度が20μg/200μlまで濃度依存的に相対創傷部面積が減少した。しかし、G-CSF濃度40μg/200μlでは創傷部の収縮効果は減弱した（図15）。よって、外用皮膚潰瘍治療剤としてG-CSFは有効であり、その作用は用量依存的であることがわかった。
（13）皮膚剥離とエタノール暴露を行った部位に対するG-CSFを用いた処置方法の違いと血清G-CSF濃度の変動との関係
C57BL/6マウスを用いて作製した皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルに対し、皮膚創傷部に100μlのアテロコラーゲン溶液を塗布し、G-CSFを5または20μg皮下投与したもの（皮下投与群：G5sc,G20sc）、100μlのアテロコラーゲン溶液にG-CSFを5または20μg溶解したものを創傷部に塗布し、凝固させたもの（アテロコラーゲン単独使用群：C+G5,C+G20）、100μlのアルギン酸溶液（30mg/ml燐酸緩衝溶液：以下同じ）にG-CSFを5または20μg溶解したものを創傷部に塗布し、さらに100μlのアテロコラーゲン溶液を塗布し、凝固させたもの（アルギン酸単独使用群：A+G5,A+G20）、100μlのアテロコラーゲン溶液を創傷部に塗布後、100μlのアルギン酸溶液にG-CSFを5または20μg溶解したものを塗布し、さらに100μlのアテロコラーゲン溶液を塗布し、凝固させたもの（アテロコラーゲン・アルギン酸併用群：C+A+G5,C+A+G20）を用い、6時間後、12時間後、18時間後、1日後、2日後に眼窩採血を行い、得られた血漿を用いて投与したG-CSFのマウス血漿内への漏出の程度をELISA法で定量した。その結果、いずれも6時間後に最大濃度に達し、その後徐々に減少し、2日後ではいずれも検知できないレベルに達した。各種G-CSF投与法について、G-CSFの血中への漏出の程度を比較すると、皮下投与群が最もG-CSFの血中への漏出程度が大きく、その一方で、アテロコラーゲン・アルギン酸併用群、アテロコラーゲン単独使用群、アルギン酸単独使用群はその程度が小さかった。また、G-CSFの血漿内からの減少性を見ると、皮下投与群は急峻に低下するのに対し、アテロコラーゲン・アルギン酸併用群やアテロコラーゲン単独使用群ではその低下は緩徐であった（図16）。以上の結果から、アテロコラーゲンとアルギン酸の少なくともいずれかを基材として用いてG-CSFを塗布する方法は、G-CSFの徐放化や組織保持性を高める効果があると考えられた。
C57BL/6マウスを用いて作製した皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルに対し、皮膚創傷部に100μlのアテロコラーゲン溶液を塗布し、G-CSFを5または20μg皮下投与したもの（皮下投与群：G5sc,G20sc）、100μlのアテロコラーゲン溶液にG-CSFを5または20μg溶解したものを創傷部に塗布し、凝固させたもの（アテロコラーゲン単独使用群：C+G5,C+G20）、100μlのアルギン酸溶液（30mg/ml燐酸緩衝溶液：以下同じ）にG-CSFを5または20μg溶解したものを創傷部に塗布し、さらに100μlのアテロコラーゲン溶液を塗布し、凝固させたもの（アルギン酸単独使用群：A+G5,A+G20）、100μlのアテロコラーゲン溶液を創傷部に塗布後、100μlのアルギン酸溶液にG-CSFを5または20μg溶解したものを塗布し、さらに100μlのアテロコラーゲン溶液を塗布し、凝固させたもの（アテロコラーゲン・アルギン酸併用群：C+A+G5,C+A+G20）を用い、6時間後、12時間後、18時間後、1日後、2日後に眼窩採血を行い、得られた血漿を用いて投与したG-CSFのマウス血漿内への漏出の程度をELISA法で定量した。その結果、いずれも6時間後に最大濃度に達し、その後徐々に減少し、2日後ではいずれも検知できないレベルに達した。各種G-CSF投与法について、G-CSFの血中への漏出の程度を比較すると、皮下投与群が最もG-CSFの血中への漏出程度が大きく、その一方で、アテロコラーゲン・アルギン酸併用群、アテロコラーゲン単独使用群、アルギン酸単独使用群はその程度が小さかった。また、G-CSFの血漿内からの減少性を見ると、皮下投与群は急峻に低下するのに対し、アテロコラーゲン・アルギン酸併用群やアテロコラーゲン単独使用群ではその低下は緩徐であった（図16）。以上の結果から、アテロコラーゲンとアルギン酸の少なくともいずれかを基材として用いてG-CSFを塗布する方法は、G-CSFの徐放化や組織保持性を高める効果があると考えられた。
（14）皮膚剥離とエタノール暴露後の肉芽形成に対するG-CSF、コラーゲン、アルギン酸の影響
C57BL/6マウスを用いて作製した皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルに対し、創傷部に100μlのアテロコラーゲン溶液を塗布し、G-CSFを5μg皮下投与したもの（皮下投与群：G5sc）、100μlのアテロコラーゲン溶液にG-CSFを5μg溶解したものを創傷部に塗布し、凝固させたもの（アテロコラーゲン単独使用群：C+G5）、100μlのアルギン酸溶液にG-CSFを5μg溶解したものを創傷部に塗布し、さらに100μlのアテロコラーゲン溶液を塗布し、凝固させたもの（アルギン酸単独使用群：A+G5）、100μlのアテロコラーゲン溶液を創傷部に塗布後、100μlのアルギン酸溶液にG-CSFを5μg溶解したものを塗布し、さらに100μlのアテロコラーゲン溶液を塗布し、凝固させたもの（アテロコラーゲン・アルギン酸併用群：C+A+G5）を用い、実験開始から7日後の創傷周囲部位の上皮再生部位と創傷部中央の肉芽形成部位を組織学的に検討した。その結果、皮下投与群では好中球を主体とする炎症細胞浸潤が創傷周辺部位で著明で、上皮再生は良好ではなかった。一方、アテロコラーゲン単独使用群、アルギン酸単独使用群、アテロコラーゲン・アルギン酸併用群では、いずれも肉芽形成は良好であった。特に、アテロコラーゲン・アルギン酸併用群では、線維芽細胞による細胞配列が極めて良かった。創傷部中央の肉芽形成部位でも同様に、皮下投与群に比べ、アテロコラーゲン単独使用群、アルギン酸単独使用群、アテロコラーゲン・アルギン酸併用群では、好中球を主体とする炎症細胞浸潤が少ない一方で、肉芽形成が良好であり、特に良好性に優れていたのは、アテロコラーゲン・アルギン酸併用群であった（図17）。以上の結果から、G-CSFは、コラーゲンやアルギン酸などの親水性高分子に混和して創傷部に塗布されることで、血中への漏出が少なくなり、創傷部における組織に保持されることで、優れた効果を示すことがわかった。
C57BL/6マウスを用いて作製した皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルに対し、創傷部に100μlのアテロコラーゲン溶液を塗布し、G-CSFを5μg皮下投与したもの（皮下投与群：G5sc）、100μlのアテロコラーゲン溶液にG-CSFを5μg溶解したものを創傷部に塗布し、凝固させたもの（アテロコラーゲン単独使用群：C+G5）、100μlのアルギン酸溶液にG-CSFを5μg溶解したものを創傷部に塗布し、さらに100μlのアテロコラーゲン溶液を塗布し、凝固させたもの（アルギン酸単独使用群：A+G5）、100μlのアテロコラーゲン溶液を創傷部に塗布後、100μlのアルギン酸溶液にG-CSFを5μg溶解したものを塗布し、さらに100μlのアテロコラーゲン溶液を塗布し、凝固させたもの（アテロコラーゲン・アルギン酸併用群：C+A+G5）を用い、実験開始から7日後の創傷周囲部位の上皮再生部位と創傷部中央の肉芽形成部位を組織学的に検討した。その結果、皮下投与群では好中球を主体とする炎症細胞浸潤が創傷周辺部位で著明で、上皮再生は良好ではなかった。一方、アテロコラーゲン単独使用群、アルギン酸単独使用群、アテロコラーゲン・アルギン酸併用群では、いずれも肉芽形成は良好であった。特に、アテロコラーゲン・アルギン酸併用群では、線維芽細胞による細胞配列が極めて良かった。創傷部中央の肉芽形成部位でも同様に、皮下投与群に比べ、アテロコラーゲン単独使用群、アルギン酸単独使用群、アテロコラーゲン・アルギン酸併用群では、好中球を主体とする炎症細胞浸潤が少ない一方で、肉芽形成が良好であり、特に良好性に優れていたのは、アテロコラーゲン・アルギン酸併用群であった（図17）。以上の結果から、G-CSFは、コラーゲンやアルギン酸などの親水性高分子に混和して創傷部に塗布されることで、血中への漏出が少なくなり、創傷部における組織に保持されることで、優れた効果を示すことがわかった。
（15）糖尿病性難治性皮膚潰瘍モデルを用いたG-CSF外用剤の皮膚潰瘍治療効果
C57BL/6マウスを用いて作製した糖尿病性難治性皮膚潰瘍モデルを用い、G-CSFの局所投与（皮下注射と外用塗布）の効果を以下のようにして検討した。G-CSF塗布群は、150μlのアテロコラーゲン溶液にG-CSFを30μg溶解したものを創傷部に塗布し、凝固させた。G-CSF皮下投与群は、生理食塩水にG-CSFを濃度5μg/100μlで溶解した溶液を朝と夕の2回投与を3日間投与した（G-CSFの全投与量は30μg）。なお、G-CSF非投与群とG-CSF皮下投与群は、アテロコラーゲン溶液のみを創傷部に150μl塗布し、凝固させた。その結果、実験開始から7日後、赤血球数、白血球数、血小板数には3者間に有意な差はなかった。7日後の相対創傷部面積は3者とも約90%で正常マウスを用いた皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデル（約50%）に比べ明らかに悪かったが、肉芽の厚さは、G-CSF非投与群に比べG-CSF塗布群では約2倍に増加し、有意な肉芽形成促進作用を示していた（図18）。
C57BL/6マウスを用いて作製した糖尿病性難治性皮膚潰瘍モデルを用い、G-CSFの局所投与（皮下注射と外用塗布）の効果を以下のようにして検討した。G-CSF塗布群は、150μlのアテロコラーゲン溶液にG-CSFを30μg溶解したものを創傷部に塗布し、凝固させた。G-CSF皮下投与群は、生理食塩水にG-CSFを濃度5μg/100μlで溶解した溶液を朝と夕の2回投与を3日間投与した（G-CSFの全投与量は30μg）。なお、G-CSF非投与群とG-CSF皮下投与群は、アテロコラーゲン溶液のみを創傷部に150μl塗布し、凝固させた。その結果、実験開始から7日後、赤血球数、白血球数、血小板数には3者間に有意な差はなかった。7日後の相対創傷部面積は3者とも約90%で正常マウスを用いた皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデル（約50%）に比べ明らかに悪かったが、肉芽の厚さは、G-CSF非投与群に比べG-CSF塗布群では約2倍に増加し、有意な肉芽形成促進作用を示していた（図18）。
（16）比較例としてのGM-CSF外用剤の創傷治癒に対する効果について
GM-CSFは、骨髄細胞由来の顆粒球マクロファージ動員因子として知られている。GM-CSFの創傷治癒促進効果について、皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルを用いて検討した。GM-CSFとしてマウス由来の組換体（R&D System社）を用い、これをアテロコラーゲン溶液に濃度20μg/100μlで溶解したものを、C57BL/6マウスを用いて作製した皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルの創傷部に塗布し、凝固させ、7日間の治癒過程で検討した（SPC+GMCSF）。対照としてアテロコラーゲン溶液のみを塗布し、凝固させたものを用いた（SPC）。その結果、実験開始前、体重、白血球数、赤血球数、血小板数は両群間に差はなかった。実験開始から7日後、皮膚剥離とエタノール暴露によるストレスで全マウスに1〜2gの体重減少を認めたが、両群間に差はなかった。赤血球数、血小板数には両群間に差はなく、白血球数はSPC+GMCSF群はやや低下したものの有意差はなかった。7日間の実験期間を通じ、SPC群に比べSPC+GMCSF群では創傷部は浮腫状を呈し所謂“腫れ”が目立った。7日後の創傷部の収縮を見ると、相対創傷部面積はSPC群に比べSPC+GMCSF群では約15%広く、創傷部の自然治癒による収縮作用は阻害され、創傷部が増悪していた。肉芽の厚さを検討すると、SPC+GMCSF群はSPC群よりやや厚いものの、組織学的には、SPC群での肉芽は血管の増生、炎症細胞の浸潤に加え紡錘型線維芽細胞の増殖が顕著に見られるのに対し、SPC+GMCSF群では浮腫が目立った（図19）。以上の結果から、皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルにおいては、GM-CSF外用剤には創傷治癒促進効果がなく、むしろ炎症による浮腫が強調される形となり、創傷治癒には逆効果を示すことがわかった。このことから、皮膚潰瘍の治療には複数の骨髄由来細胞を動員することが可能なG-CSFが骨髄細胞動員因子や創傷治癒促進因子として最適であると考えられた。
GM-CSFは、骨髄細胞由来の顆粒球マクロファージ動員因子として知られている。GM-CSFの創傷治癒促進効果について、皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルを用いて検討した。GM-CSFとしてマウス由来の組換体（R&D System社）を用い、これをアテロコラーゲン溶液に濃度20μg/100μlで溶解したものを、C57BL/6マウスを用いて作製した皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルの創傷部に塗布し、凝固させ、7日間の治癒過程で検討した（SPC+GMCSF）。対照としてアテロコラーゲン溶液のみを塗布し、凝固させたものを用いた（SPC）。その結果、実験開始前、体重、白血球数、赤血球数、血小板数は両群間に差はなかった。実験開始から7日後、皮膚剥離とエタノール暴露によるストレスで全マウスに1〜2gの体重減少を認めたが、両群間に差はなかった。赤血球数、血小板数には両群間に差はなく、白血球数はSPC+GMCSF群はやや低下したものの有意差はなかった。7日間の実験期間を通じ、SPC群に比べSPC+GMCSF群では創傷部は浮腫状を呈し所謂“腫れ”が目立った。7日後の創傷部の収縮を見ると、相対創傷部面積はSPC群に比べSPC+GMCSF群では約15%広く、創傷部の自然治癒による収縮作用は阻害され、創傷部が増悪していた。肉芽の厚さを検討すると、SPC+GMCSF群はSPC群よりやや厚いものの、組織学的には、SPC群での肉芽は血管の増生、炎症細胞の浸潤に加え紡錘型線維芽細胞の増殖が顕著に見られるのに対し、SPC+GMCSF群では浮腫が目立った（図19）。以上の結果から、皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルにおいては、GM-CSF外用剤には創傷治癒促進効果がなく、むしろ炎症による浮腫が強調される形となり、創傷治癒には逆効果を示すことがわかった。このことから、皮膚潰瘍の治療には複数の骨髄由来細胞を動員することが可能なG-CSFが骨髄細胞動員因子や創傷治癒促進因子として最適であると考えられた。
（17）骨髄内巨核球のCXCR4発現
GFP-Tg骨髄移植成立C57BL/6マウスを用い、投与量250μg/kgのG-CSFを1日1回連続7日間皮下投与した後の骨髄内および脾臓内CXCR4発現を免疫組織化学的に検討した。その結果、骨髄内では、他の細胞に比べ、GFP陽性の巨核球および間質細胞に特異的にCXCR4発現が見られた。
GFP-Tg骨髄移植成立C57BL/6マウスを用い、投与量250μg/kgのG-CSFを1日1回連続7日間皮下投与した後の骨髄内および脾臓内CXCR4発現を免疫組織化学的に検討した。その結果、骨髄内では、他の細胞に比べ、GFP陽性の巨核球および間質細胞に特異的にCXCR4発現が見られた。
（18）皮膚障害部位でのSDF-1発現
C57BL/6マウスの正常部皮膚組織にはSDF-1発現は全く見られない。皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルの作製方法に従って行った背部皮膚剥離とエタノール暴露に伴い、周辺組織での肉芽形成反応は表皮断端部で顕著であった。皮膚剥離とエタノール暴露から7日後の、表皮断端再生部位でのCXCR4のリガンドであるSDF-1発現を免疫組織化学的に検討すると、表皮細胞内にSDF-1が強く発現していた。また、断端部周囲の毛根細胞にもSDF-1発現が見られた。
C57BL/6マウスの正常部皮膚組織にはSDF-1発現は全く見られない。皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルの作製方法に従って行った背部皮膚剥離とエタノール暴露に伴い、周辺組織での肉芽形成反応は表皮断端部で顕著であった。皮膚剥離とエタノール暴露から7日後の、表皮断端再生部位でのCXCR4のリガンドであるSDF-1発現を免疫組織化学的に検討すると、表皮細胞内にSDF-1が強く発現していた。また、断端部周囲の毛根細胞にもSDF-1発現が見られた。
（19）SDF-1による創傷部治療実験
マウスのリコンビナントSDF-1α/CXCL12（TECHNE Co, MN, USA）を用い、治療実験を行った。アテロコラーゲン溶液のみ、またはアテロコラーゲン溶液にSDF-1を濃度1μg/200μlで溶解したものを、C57BL/6マウスを用いて作製した皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルの創傷部に塗布し、凝固させた。皮膚剥離とエタノール暴露直後および3日後、7日後の創傷部面積を測定し、3日後と7日後の相対創傷部面積を調べた。その結果、3日後、アテロコラーゲン溶液塗布群（C）に比べアテロコラーゲン溶液・SDF-1塗布群では相対創傷部面積は減少傾向を示し（C:77.1±4.3%，SDF-1:65.0±8.4%；p=0.06）、7日後ではアテロコラーゲン溶液・SDF-1群で有意な減少を示した（C:37.2±3.3%，SDF-1:29.4±4.5%；p<0.05）（図20）。よって、SDF-1は外用皮膚潰瘍治療剤の有効成分として有用であることがわかった。
マウスのリコンビナントSDF-1α/CXCL12（TECHNE Co, MN, USA）を用い、治療実験を行った。アテロコラーゲン溶液のみ、またはアテロコラーゲン溶液にSDF-1を濃度1μg/200μlで溶解したものを、C57BL/6マウスを用いて作製した皮膚創傷治癒遅延型潰瘍モデルの創傷部に塗布し、凝固させた。皮膚剥離とエタノール暴露直後および3日後、7日後の創傷部面積を測定し、3日後と7日後の相対創傷部面積を調べた。その結果、3日後、アテロコラーゲン溶液塗布群（C）に比べアテロコラーゲン溶液・SDF-1塗布群では相対創傷部面積は減少傾向を示し（C:77.1±4.3%，SDF-1:65.0±8.4%；p=0.06）、7日後ではアテロコラーゲン溶液・SDF-1群で有意な減少を示した（C:37.2±3.3%，SDF-1:29.4±4.5%；p<0.05）（図20）。よって、SDF-1は外用皮膚潰瘍治療剤の有効成分として有用であることがわかった。
（20）CD41陽性細胞による血管・組織増生作用
ミリポアリング（外径14mm，内径10mm，厚さ2mm）上面に細胞不透過性のポアサイズ0.45μmの膜を貼り、中に厚さが約2mmで重量が約27mgの合成コラーゲンスポンジ（微線維性コラーゲン塩酸塩，NOVACOL，Bioplex Co., NJ, USA）を入れ、底面には細胞透過性のポアサイズ100μmのポリエチレンメッシュ膜を貼り付け、組織新生評価用デバイスとした（図21）。
この合成コラーゲンスポンジ内に、GFP-Tgより採取した骨髄細胞からCD41陽性細胞およびCD41陰性細胞のそれぞれを磁気細胞分離装置で分離・採取し、培養液で分散後、細胞数を一致（2×106/200μl=1×107/ml）させた後、注入した。また、骨髄内と同じ割合でCD41陽性細胞とCD41陰性細胞とを混和したもの（CD41陰性細胞に3.75%の割合でCD41陽性を混和）も注入した（BMC）。次に、正常なC57BL/6マウスの背部皮下にミリポアリングを細胞透過性膜がマウスの背部に当接するように挿入し、7日間留置後、これを取り出し、コラーゲン基質内の組織増生の程度を検討した。
その結果、合成コラーゲンスポンジの周囲は、赤血球を含む未熟な毛細血管とコラーゲン基質内に浸潤した線維芽細胞により構成される新生した組織により赤色を呈していた。
合成コラーゲンスポンジ上のその赤色面積を形態計測したところ、無細胞群ではコラーゲンスポンジの組織化はほとんど見られなかった。一方、CD41陽性細胞群はCD41陰性細胞群およびBMC群に比べ、約2倍組織化が進んでいた（図22）。よって、CD41陽性細胞は外用皮膚潰瘍治療剤の有効成分として有用であることがわかった。
以上のように、血管新生は肉芽形成の重要な過程であるものの、これまで血管新生の程度を客観的にin vivoで評価する手技手法は知られていなかったが、図21に示す組織新生評価用デバイスを用いることで、生体組織からの細胞移動により合成コラーゲンスポンジ内に血管新生が起こるかどうかをモニタすることで血管新生の程度を評価することができた。この組織新生評価用デバイスは、皮膚創傷治癒過程の評価のみならず、種々の生体組織における増殖活性などを評価する際に用いることができる。本実施例では合成コラーゲンスポンジを細胞外マトリックスシートとして用いたが、細胞外マトリックスシートは合成コラーゲンスポンジに限定されるものではなく、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニンなどの細胞外マトリックス成分を少なくとも1種類以上含有するスポンジ状シートやゲル状シートなどであってもよい。また、細胞外マトリックスシートには、CD41陽性細胞などのようなマトリックス成分中での組織新生を促進させることができる成分や、マトリックス成分中での組織新生を制御（促進や阻害）することができるかどうかを調べるための被験成分を含ませてもよい。細胞膜透過性膜や細胞不透過性膜としては、生体膜、生体膜を化学修飾した膜、合成膜などが挙げられる。これらは上記のような細胞外マトリックス成分でコーティングされていてもよい。
ミリポアリング（外径14mm，内径10mm，厚さ2mm）上面に細胞不透過性のポアサイズ0.45μmの膜を貼り、中に厚さが約2mmで重量が約27mgの合成コラーゲンスポンジ（微線維性コラーゲン塩酸塩，NOVACOL，Bioplex Co., NJ, USA）を入れ、底面には細胞透過性のポアサイズ100μmのポリエチレンメッシュ膜を貼り付け、組織新生評価用デバイスとした（図21）。
この合成コラーゲンスポンジ内に、GFP-Tgより採取した骨髄細胞からCD41陽性細胞およびCD41陰性細胞のそれぞれを磁気細胞分離装置で分離・採取し、培養液で分散後、細胞数を一致（2×106/200μl=1×107/ml）させた後、注入した。また、骨髄内と同じ割合でCD41陽性細胞とCD41陰性細胞とを混和したもの（CD41陰性細胞に3.75%の割合でCD41陽性を混和）も注入した（BMC）。次に、正常なC57BL/6マウスの背部皮下にミリポアリングを細胞透過性膜がマウスの背部に当接するように挿入し、7日間留置後、これを取り出し、コラーゲン基質内の組織増生の程度を検討した。
その結果、合成コラーゲンスポンジの周囲は、赤血球を含む未熟な毛細血管とコラーゲン基質内に浸潤した線維芽細胞により構成される新生した組織により赤色を呈していた。
合成コラーゲンスポンジ上のその赤色面積を形態計測したところ、無細胞群ではコラーゲンスポンジの組織化はほとんど見られなかった。一方、CD41陽性細胞群はCD41陰性細胞群およびBMC群に比べ、約2倍組織化が進んでいた（図22）。よって、CD41陽性細胞は外用皮膚潰瘍治療剤の有効成分として有用であることがわかった。
以上のように、血管新生は肉芽形成の重要な過程であるものの、これまで血管新生の程度を客観的にin vivoで評価する手技手法は知られていなかったが、図21に示す組織新生評価用デバイスを用いることで、生体組織からの細胞移動により合成コラーゲンスポンジ内に血管新生が起こるかどうかをモニタすることで血管新生の程度を評価することができた。この組織新生評価用デバイスは、皮膚創傷治癒過程の評価のみならず、種々の生体組織における増殖活性などを評価する際に用いることができる。本実施例では合成コラーゲンスポンジを細胞外マトリックスシートとして用いたが、細胞外マトリックスシートは合成コラーゲンスポンジに限定されるものではなく、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニンなどの細胞外マトリックス成分を少なくとも1種類以上含有するスポンジ状シートやゲル状シートなどであってもよい。また、細胞外マトリックスシートには、CD41陽性細胞などのようなマトリックス成分中での組織新生を促進させることができる成分や、マトリックス成分中での組織新生を制御（促進や阻害）することができるかどうかを調べるための被験成分を含ませてもよい。細胞膜透過性膜や細胞不透過性膜としては、生体膜、生体膜を化学修飾した膜、合成膜などが挙げられる。これらは上記のような細胞外マトリックス成分でコーティングされていてもよい。
製剤例1：ローション（その1）
（g/100ml）
グリセリン １０
エタノール １０
１，３−ブチレングリコール ５
ヒドロキシエチルセルロース １
セタノール １
ＳＤＦ−１ ０．０００５
コラーゲン ０．３
クエン酸一水和物 ０．６６
クエン酸三ナトリウム二水和物 ０．２７
パラオキシ安息香酸メチル ０．１
精製水 ７１．６６９５
自体公知のローションの製造工程において、以上の成分組成を有するSDF-1の最終濃度が0.5mg/100ml（0.0005%）の皮膚潰瘍治療用ローションを得た。なお、SDF-1の最終濃度は、0.0005〜1.5%程度で、コラーゲンの最終濃度は、0.1〜3%程度で適宜設定することが望ましい。
（g/100ml）
グリセリン １０
エタノール １０
１，３−ブチレングリコール ５
ヒドロキシエチルセルロース １
セタノール １
ＳＤＦ−１ ０．０００５
コラーゲン ０．３
クエン酸一水和物 ０．６６
クエン酸三ナトリウム二水和物 ０．２７
パラオキシ安息香酸メチル ０．１
精製水 ７１．６６９５
自体公知のローションの製造工程において、以上の成分組成を有するSDF-1の最終濃度が0.5mg/100ml（0.0005%）の皮膚潰瘍治療用ローションを得た。なお、SDF-1の最終濃度は、0.0005〜1.5%程度で、コラーゲンの最終濃度は、0.1〜3%程度で適宜設定することが望ましい。
製剤例2：ローション（その2）
（g/100ml）
グリセリン １０
エタノール １０
１，３−ブチレングリコール ５
ヒドロキシエチルセルロース １
セタノール １
Ｇ−ＣＳＦ ０．０２
コラーゲン ０．３
アルギン酸ナトリウム ５
クエン酸一水和物 ０．６６
クエン酸三ナトリウム二水和物 ０．２７
パラオキシ安息香酸メチル ０．１
燐酸二水素ナトリウム ３
精製水 ６３．６５
自体公知のローションの製造工程において、以上の成分組成を有するG-CSFの最終濃度が20mg/100ml（0.02%）の皮膚潰瘍治療用ローションを得た。なお、G-CSFの最終濃度は、0.002〜1.5%程度で、アルギン酸の最終濃度は、0.1〜10%程度で適宜設定することが望ましい。
（g/100ml）
グリセリン １０
エタノール １０
１，３−ブチレングリコール ５
ヒドロキシエチルセルロース １
セタノール １
Ｇ−ＣＳＦ ０．０２
コラーゲン ０．３
アルギン酸ナトリウム ５
クエン酸一水和物 ０．６６
クエン酸三ナトリウム二水和物 ０．２７
パラオキシ安息香酸メチル ０．１
燐酸二水素ナトリウム ３
精製水 ６３．６５
自体公知のローションの製造工程において、以上の成分組成を有するG-CSFの最終濃度が20mg/100ml（0.02%）の皮膚潰瘍治療用ローションを得た。なお、G-CSFの最終濃度は、0.002〜1.5%程度で、アルギン酸の最終濃度は、0.1〜10%程度で適宜設定することが望ましい。
製剤例3：ローション（その3）
（g/100ml）
グリセリン １０
エタノール １０
１，３−ブチレングリコール ５
ヒドロキシエチルセルロース １
セタノール １
ＳＤＦ−１ ０．０００５
Ｇ−ＣＳＦ ０．０２
コラーゲン ０．３
アルギン酸ナトリウム ５
クエン酸一水和物 ０．６６
クエン酸三ナトリウム二水和物 ０．２７
パラオキシ安息香酸メチル ０．１
燐酸二水素ナトリウム ３
精製水 ６３．６４９５
自体公知のローションの製造工程において、以上の成分組成を有するSDF-1とG-CSFの最終濃度がそれぞれ0.5mg/100ml（0.0005%）、20mg/100ml（0.02%）の皮膚潰瘍治療用ローションを得た。
（g/100ml）
グリセリン １０
エタノール １０
１，３−ブチレングリコール ５
ヒドロキシエチルセルロース １
セタノール １
ＳＤＦ−１ ０．０００５
Ｇ−ＣＳＦ ０．０２
コラーゲン ０．３
アルギン酸ナトリウム ５
クエン酸一水和物 ０．６６
クエン酸三ナトリウム二水和物 ０．２７
パラオキシ安息香酸メチル ０．１
燐酸二水素ナトリウム ３
精製水 ６３．６４９５
自体公知のローションの製造工程において、以上の成分組成を有するSDF-1とG-CSFの最終濃度がそれぞれ0.5mg/100ml（0.0005%）、20mg/100ml（0.02%）の皮膚潰瘍治療用ローションを得た。
製剤例4：ローション（その4）
製剤例1におけるSDF-1のかわりにCD41陽性細胞を細胞数1×109個/100mlで分散するように用いること以外は製剤例1と同様にして皮膚潰瘍治療用ローションを得た。
製剤例1におけるSDF-1のかわりにCD41陽性細胞を細胞数1×109個/100mlで分散するように用いること以外は製剤例1と同様にして皮膚潰瘍治療用ローションを得た。
製剤例5：パップ剤（その1）
（g/100ml）
グリセリン ７
１，３−ブチレングリコール ３
ペンチレングリコール ５
フェノキシエタノール ０．５
メチルパラベン ０．１
Ｇ−ＣＳＦ ０．０２
アルギン酸ナトリウム ５
燐酸二水素ナトリウム ３
精製水 ７６．３８
自体公知のパップ剤の製造工程において、以上の成分組成を有するG-CSFの最終濃度が20mg/100ml（0.02%）の薬用原液を不織布に浸潤させることで、皮膚潰瘍治療用パップ剤を得た。
（g/100ml）
グリセリン ７
１，３−ブチレングリコール ３
ペンチレングリコール ５
フェノキシエタノール ０．５
メチルパラベン ０．１
Ｇ−ＣＳＦ ０．０２
アルギン酸ナトリウム ５
燐酸二水素ナトリウム ３
精製水 ７６．３８
自体公知のパップ剤の製造工程において、以上の成分組成を有するG-CSFの最終濃度が20mg/100ml（0.02%）の薬用原液を不織布に浸潤させることで、皮膚潰瘍治療用パップ剤を得た。
製剤例6：パップ剤（その2）
（g/100ml）
グリセリン ７
１，３−ブチレングリコール ３
ペンチレングリコール ５
フェノキシエタノール ０．５
メチルパラベン ０．１
Ｇ−ＣＳＦ ０．０２
コラーゲン ０．３
アルギン酸ナトリウム ５
燐酸二水素ナトリウム ３
精製水 ７６．０８
自体公知のパップ剤の製造工程において、以上の成分組成を有するG-CSFの最終濃度が20mg/100ml（0.02%）の薬用原液を不織布に浸潤させることで、皮膚潰瘍治療用パップ剤を得た。
（g/100ml）
グリセリン ７
１，３−ブチレングリコール ３
ペンチレングリコール ５
フェノキシエタノール ０．５
メチルパラベン ０．１
Ｇ−ＣＳＦ ０．０２
コラーゲン ０．３
アルギン酸ナトリウム ５
燐酸二水素ナトリウム ３
精製水 ７６．０８
自体公知のパップ剤の製造工程において、以上の成分組成を有するG-CSFの最終濃度が20mg/100ml（0.02%）の薬用原液を不織布に浸潤させることで、皮膚潰瘍治療用パップ剤を得た。
製剤例7：創傷被覆材
製剤例5における薬用原液を、創傷被覆材用のポリウレタンフィルムからなるドレッシング材に塗布することで、皮膚潰瘍治療用創傷被覆材を得た。
製剤例5における薬用原液を、創傷被覆材用のポリウレタンフィルムからなるドレッシング材に塗布することで、皮膚潰瘍治療用創傷被覆材を得た。
本発明は、褥瘡、糖尿病性皮膚潰瘍、虚血性皮膚潰瘍などの難治性皮膚潰瘍に対して治癒効果に優れる新規な外用皮膚潰瘍治療剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
Claims (1)
- 顆粒球コロニー形成刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）と親水性高分子としてのコラーゲン、アルギン酸またはその塩から選ばれる少なくとも１つとを含む組成物からなることを特徴とする外用難治性皮膚潰瘍治療剤。
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|---|---|---|---|
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004271996 | 2004-09-17 | ||
| JP2004271996 | 2004-09-17 | ||
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| JP2005140301 | 2005-05-12 | ||
| JP2005239189 | 2005-08-19 | ||
| JP2005239189 | 2005-08-19 | ||
| PCT/JP2005/017121 WO2006030887A1 (ja) | 2004-09-17 | 2005-09-16 | 外用皮膚潰瘍治療剤 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP2006535219A Active JP5031370B2 (ja) | 2004-09-17 | 2005-09-16 | 外用皮膚潰瘍治療剤 |
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