JP5030265B2 - フラップエンドヌクレーゼ活性増強因子 - Google Patents
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Description
中村祐輔編、SNP−遺伝子多形の戦略、2001年、第4刷、中山書店、東京。 Cookseyら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy、2000年、第 44巻、第5号、第1296〜1301頁 Collinsら、Acta Crystallograhica sectionD, Biological Crystallography. 2004年、第60巻、第1674〜1678頁
1)FenAfs1、FenAfs2ならびにFenAfs3の調製
特許文献1の実施例の記載の通りの操作を行い、ApePCNA−1、ApePCNA−2LならびにApePCNA−3、すなわちFenAfs1、FenAfs2ならびにFenAfs3を単離、精製した(図1)。
1)で単離精製したFenAfs1〜3をそれぞれ等モルとなるように混合し、1)と同様に分子篩クロマトグラフィーに供した(図3)。この結果、FenAfs1、FenAsf2、FenAsf3を混合した場合、ヘテロ三量体に相当する109kDaの位置にタンパク質の溶出が見られた。このとき、単量体や二量体に相当する分子量の位置にはなんらピークが見られなかったことから、この三量体はFenAfs1、FenAsf2、FenAsf3それぞれ一分子が会合してなるヘテロ三量体(FenAsf123、本発明のFENAF)であることが確認された。FenAfs2およびFenAsf3の混合によってもヘテロ三量体をとるが、分子篩いクロマトグラフィーによる分子量の解析とSDS−PAGEの結果から、FenAfs1、FenAsf2、FenAsf3を混合した場合には、ほぼ全てがFenAfs1−2−3ヘテロ三量体として構成されていると考えられる。
1)基本反応プロトコル
10×バッファ(100mM Tris−HCl, pH7.4, 75mM MgCl2, 0.5% Tween20)1μl、シグナルプローブ2μl、ターゲットDNA 0.5μl、蒸留水2.5μlを混合し、95℃で5分間保持する。氷冷後、さらにU1プローブ2μl(100nM)、AP−FEN(200ng/μl)1μl、FENAF1μl (AP−FENに対しモル比2倍)を加え、63℃で15分または60分保持する。所定時間インキュベートした後、等量(10μl)のローディングバッファ(95%ホルムアミド、10mM EDTA、0.03%ブロモフェノールブルー)を加え、95℃、5分加熱し、2.4%尿素を含む20%アクリルアミドゲルで電気泳動した。泳動後のゲルをUV照射下で観察し、FITCの蛍光によりU0またはU1プローブの切断/非切断を確認する。
ターゲットDNA 5’−GTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACG −3’(配列番号5)
U1プローブ 5’−CAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGC−3’(配列番号6)
シグナルプローブは、切断の検出のために5’末端側にFITCを標識した。下線はフラップ部分を示す。U1プローブは、ターゲットDNA、シグナルプローブとの間に3重鎖を形成することができ、その結果シグナルプローブがFENによる切断を受ける。
基本反応プロトコルの条件でAP−FENのフラップ切断活性を測定した(15分間反応/図5左、60分間反応/図5右)。左右いずれの図においても、レーン1はbufferAを加えたコントロール、レーン2はFenAfs1の添加を、レーン3はFenAsf2の添加を、レーン4はFenAsf3の添加を、レーン5はFENAFの添加をそれぞれ示す。
下記の塩基配列からなるU0プローブを用意した。
U0プローブはターゲットDNAとシグナルプローブとの間に3重鎖部分を形成しないため、AP−FENはU0プローブ存在下でシグナルプローブを切断することはない。上記基本反応プロトコールにおけるU1プローブに換えてこのU0プローブを用い、FENAの各存在下でAP−FENの活性を測定した(15分間反応/図6左、60分間反応/図6右)。左右いずれの図においても、レーン1はbufferAを加えたコントロール、レーン2はFenAfs1の添加を、レーン3はFenAsf2の添加を、レーン4はFenAsf3の添加を、レーン5はFENAFの添加をそれぞれ示す。。
1)の基本反応プロトコルにおけるターゲットDNAの濃度を、1nM、2nM、4nM、6nM、8nM、10nM、50nM、100nMとして反応を行い、同プロトコル条件下での基質濃度に関する反応検出限界を確認した。反応限界は、蛍光強度をY軸に、ターゲット濃度をX軸にとって検量線を引いた後、濃度0(コントロール)のときの値にSD値を3倍したものを加えた値が検量線と交わる濃度とした。
1)の基本反応プロトコルにおけるFENAFの添加量を、AP−FEN(200ng/μl)に対してモル比で10、5、2、1、0.1倍と変化させて、AP−FENのフラップ切断活性に対する影響を測定した(図8)。
1)STL−FENの調製
独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門より、S. tokodaiiゲノムのクローンを入手した。Kawarabayashiら(DNA Research、20018巻、第4号、123−140)によって決定され、PubMed Accession No.:NC_003106で公開されているS.tokodaiiのゲノム配列情報から、フラップエンドヌクレアーゼ遺伝子(ID:1458101)とそのアミノ酸配列(ID:NP_376062)を特定した。このアミノ酸配列はN末端にメチオニンを持たないため、ORFが始まる最初のアミノ酸コドンをメチオニンコドンに変換することのできるフォワードプライマーとORFのC末端にHisタグを付加することのできるリバースプライマーとを用いてPCRを行い、増幅された約1065bpのDNA断片をpET−22bベクター上にクローニングした。このDNA断片をpET−22bベクターに組み込み、組換えプラスミドpET−STLfenを得た。該プラスミド中の増幅部分の塩基配列に変化がないことを確認した後、該プラスミドで大腸菌RosettaTM(DE)を形質転換し、Escherichia coli Rosetta / pET−STLfenを得た。
2)−1に示した基本反応プロトコルにおいて、AP−FENを上記1)で調製したSTL−FEN(200ng/μl)に代えて、FENAFのSTL−FENに対するフラップ切断活性の増強効果を調べた(図9)。
200mlのマイクロチューブに、プライマリープローブ 250nM、インベーダーオリゴ 50nM、FAM−DTBTA標識FRETプローブ125nM、インベーダーオリゴ 50nM、 ターゲットDNA、tRNA 5ng/μl、AP−FENまたはSTL−FEN 10ng/μl、FENAF 20ng/μlを含むバッファ(10mM Tris−HCl、pH7.4、7.5mM MgCl2、0.05% Tween20)20μlを加えた。これを63℃で2時間保持した後、384穴マイクロプレートのウェルに添加し、プレート カメレオンII(HIDEX製)を用いて、励起波長340nm、測定波長616nm、delay time 100μsec.、window tome 1500μsec.の条件で測定した。
TTTCTTTG−3’(配列番号8)
FAM-DTBTA FRET プローブ
5’−GC(T)TGTCTCGGTTTTTCCGAGACAAGCGTGCGCCTCGTT−3’(配列番号9)
プライマリープローブ 5’−AACGAGGCGCACACTCCCGCAGACAC−3’(配列番号10)
インベーダープローブ 5’−CAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGC−3’(配列番号11)
FAM−DTBTA FRETプローブについては、5’末端にFAMを標識し、(T)の位置に消光剤を付加した。
45、60、90、120、240及び360分後の点でフラップ切断をプレート カメレオンII(HIDEX製)を用いて、励起波長485nm、測定波長535nm、delay time 100μsec.、window tome 1500μsec.の条件で測定したところ、FENAFを加えないものでは60分の時点でFAM蛍光強度が約7,000であったが、FENAFを添加した場合は約22,000であり、添加しない場合よりも3.1倍高かった。FENAFを添加したものでは、FAM蛍光強度は60分で平衡に達したが、 添加しないものでは4時間(240分)程度を要した。FENの特異性に対するPCNA添加の影響は、6時間の時点でコントロールでもやや信号の増加が見られたが、通常の測定に影響するような増加は無かった。
Claims (6)
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、及び配列番号3で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなるヘテロ3量体蛋白質の存在下で、フラップエンドヌクレアーゼを作用させる、一塩基多形のタイピング方法。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異体蛋白質、配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異体蛋白質、及び配列番号3で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異体蛋白質からなり、かつフラップエンドヌクレアーゼ活性を増強する活性を有するヘテロ3量体蛋白質の存在下で、フラップエンドヌクレアーゼを作用させる、一塩基多形のタイピング方法。
- フラップエンドヌクレアーゼがアエロピラム(Aeropyrum)属細菌もしくはスルホロバス(Sulfolobus)属細菌由来のフラップエンドヌクレアーゼである、請求項1又は2に記載の一塩基多形のタイピング方法。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、及び配列番号3で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなるヘテロ3量体蛋白質及びフラップエンドヌクレアーゼを含む、一塩基多形のタイピング用キット。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異体蛋白質、配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異体蛋白質、及び配列番号3で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異体蛋白質からなり、かつフラップエンドヌクレアーゼ活性を増強する活性を有するヘテロ3量体蛋白質及びフラップエンドヌクレアーゼを含む、一塩基多形のタイピング用キット。
- フラップエンドヌクレアーゼがアエロピラム(Aeropyrum)属細菌もしくはスルホロバス(Sulfolobus)属細菌由来のフラップエンドヌクレアーゼである、請求項4又は5に記載の一塩基多形のタイピング用キット。
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