JP5001592B2 - 育毛剤 - Google Patents
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Description
本発明は、例えば、バチルス(Bacillus)属に属する微生物の培養抽出物を含有する育毛剤に関する。
毛髪用化粧品原料として、例えば、毛髪用化粧料組成物(特許文献１）及び毛髪処理用剤組成物（特許文献２）が知られている。
特許文献１記載の毛髪用化粧料組成物は、果実や野菜等をカタラーゼ陽性微生物(例えば、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans))で発酵させた発酵物を含有するものである。果実や野菜として、育毛活性があることが知られているジャガイモ(特開2000-154123号公報)、小松菜(特開2002-332218号公報)及びオレンジ(特開平7-126129号公報)が使用されている。
一方、特許文献２記載の毛髪処理用剤組成物は、米糠類や大豆類を含む培地に納豆菌又は枯草菌(Bacillus subtilis)を接種し、発酵培養して得られた発酵抽出物を含有するものである。ここで、用いられる米糠(特開平9-241132号公報)や大豆（特開平9-059166号公報）等の培地成分は育毛活性があることが知られている。
このように、特許文献１又は２記載の組成物では、発酵に使用する微生物以外の原料(培地)が育毛活性を有する。
一方、バチルス属に属する微生物の培養抽出物自体に育毛活性があることは、これまで知られていなかった。
本発明は、上述した実情に鑑み、バチルス属に属する微生物の培養抽出物を含有する育毛剤を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、バチルス属に属する微生物の培養抽出物が育毛活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は以下を包含する。
（１）バチルス属に属する微生物の培養抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、育毛剤。
（１）バチルス属に属する微生物の培養抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、育毛剤。
（２）上記バチルス属に属する微生物が受託番号FERM P-20835で特定される微生物又は枯草菌IFO 13719株であることを特徴とする、（１）記載の育毛剤。
（３）上記培養抽出物は有機溶媒抽出物であることを特徴とする、（１）又は（２）記載の育毛剤。
（４）バチルス属に属する微生物の培養上清を分離する工程と、上記培養上清を有機溶媒抽出に供する工程と、有機溶媒相を分離する工程とを含む、育毛剤の製造方法。
（５）上記バチルス属に属する微生物が受託番号FERM P-20835で特定される微生物又は枯草菌IFO 13719株であることを特徴とする、（４）記載の育毛剤の製造方法。
（６）上記有機溶媒が酢酸エチルであることを特徴とする、（４）又は（５）記載の育毛剤の製造方法。
（７）上記有機溶媒相をメタノール/ヘキサンで分画し、ヘキサン相を分離する工程をさらに含むことを特徴とする、（６）記載の育毛剤の製造方法。
本発明により、優れた育毛活性を有する育毛剤が提供される。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る育毛剤は、バチルス属に属する微生物の培養抽出物を有効成分として含有するものである。本発明に係る育毛剤は、優れた育毛活性を有する。ここで、「育毛活性」とは、毛乳頭細胞及び/若しくはケラチノサイト(角化細胞)に対する増殖促進活性並びに/又は毛包に対する毛伸長促進活性を意味する。また、ここで、バチルス属に属する微生物としては、例えば、受託番号FERM P-20835で特定される微生物及び枯草菌IFO 13719株が挙げられる。
本発明に係る育毛剤は、バチルス属に属する微生物の培養抽出物を有効成分として含有するものである。本発明に係る育毛剤は、優れた育毛活性を有する。ここで、「育毛活性」とは、毛乳頭細胞及び/若しくはケラチノサイト(角化細胞)に対する増殖促進活性並びに/又は毛包に対する毛伸長促進活性を意味する。また、ここで、バチルス属に属する微生物としては、例えば、受託番号FERM P-20835で特定される微生物及び枯草菌IFO 13719株が挙げられる。
以下では、受託番号FERM P-20835で特定される微生物を「KSM 6-10株」と呼ぶ。また、枯草菌IFO 13719株を「IFO 13719株」と呼ぶ。
既存のバチルス属細菌について、培養抽出物の育毛活性を検討したところ、IFO 13719株の培養抽出物が育毛活性を有することを見出した。
IFO 13719株は、枯草菌に属する菌株であり、独立行政法人 製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門（NBRC）から入手することができる。
一方、KSM 6-10株は、栃木県内で市販されている白菜漬けから、培養液の有機溶媒抽出物が示す育毛活性を指標として、単離し、選抜されたものである。
以下、KSM 6-10株の分類学的性質を説明する。
A．形態学的性質
(1)形態：
SCD寒天平板培地を用いて、30℃で48時間の好気培養後の結果を示す。
形状：桿菌、大きさ：0.8-1×2-3μm、稀に連鎖する
(2)グラム染色性：陽性
(3)コロニー形態：
形状：不規則状、周縁：波状、大きさ：直径2-4mm、色調：白色〜薄茶、表面：皺状で粘性あり
(4)胞子形成：陽性(中心に卵円形の胞子を形成し、胞子嚢は膨潤しない）
(5)運動性：あり
A．形態学的性質
(1)形態：
SCD寒天平板培地を用いて、30℃で48時間の好気培養後の結果を示す。
形状：桿菌、大きさ：0.8-1×2-3μm、稀に連鎖する
(2)グラム染色性：陽性
(3)コロニー形態：
形状：不規則状、周縁：波状、大きさ：直径2-4mm、色調：白色〜薄茶、表面：皺状で粘性あり
(4)胞子形成：陽性(中心に卵円形の胞子を形成し、胞子嚢は膨潤しない）
(5)運動性：あり
B．生理学的・化学分類学的性質
(1)生育温度(SCD培地)：15〜45℃(最適30〜37℃)
(2)酸素要求性：好気性(液体培養では、液面に被膜形成し、液中は薄く混濁する)
(3)ゼラチン液化性：液化
(4)インドール産生：なし
(5)硝酸塩還元性：陽性
(6)MR反応：陰性
(7)VP反応：陽性
(8)カタラーゼ活性：陽性
(9)食塩濃度：10％まで生育
(10)リゾチーム感受性(0.001％SCD培地)：無し(生育あり)
(11)糖の発酵性：
市販の細菌同定用キットAPI 50 CHB(bioMerieux社)にて糖の発酵性を検討した結果を以下に記載する(＋は「発酵性有り」を示し、−は「発酵性なし」を示す）。
(1)生育温度(SCD培地)：15〜45℃(最適30〜37℃)
(2)酸素要求性：好気性(液体培養では、液面に被膜形成し、液中は薄く混濁する)
(3)ゼラチン液化性：液化
(4)インドール産生：なし
(5)硝酸塩還元性：陽性
(6)MR反応：陰性
(7)VP反応：陽性
(8)カタラーゼ活性：陽性
(9)食塩濃度：10％まで生育
(10)リゾチーム感受性(0.001％SCD培地)：無し(生育あり)
(11)糖の発酵性：
市販の細菌同定用キットAPI 50 CHB(bioMerieux社)にて糖の発酵性を検討した結果を以下に記載する(＋は「発酵性有り」を示し、−は「発酵性なし」を示す）。
糖の種類 発酵性
グリセロール ＋
エリスリトール −
D-アラビノース −
L-アラビノース ＋
リボース ＋
D-キシロース ＋
L-キシロース −
アドニトール −
β-メチル-D-キシロシド −
ガラクトース ＋
D-グルコース ＋
L-フルクトース ＋
D-マンノース ＋
L-ソルボース −
ラムノース −
ダルシトール −
イノシトール ＋
マンニトール ＋
ソルビトール ＋
α-メチル-D-マンノシド −
α-メチル-D-グルコシド ＋
N-アセチル-グルコサミン −
アミグダリン ＋
アルブチン ＋
エスクリン ＋
サリシン ＋
セロビオース ＋
マルトース ＋
ラクトース ＋
メリビオース ＋
サッカロース ＋
トレハロース ＋
イヌリン −
メレジトース −
D-ラフィノース ＋
スターチ −
グリコーゲン −
キシリトール −
β-ゲンチオビオース −
D-ツラノース ＋
D-リキソース −
D-タガトース −
D-フコース −
L-フコース −
D-アラビトール −
L-アラビトール −
グルコネート −
2-ケト-グルコネート −
5-ケト-グルコネート −
グリセロール ＋
エリスリトール −
D-アラビノース −
L-アラビノース ＋
リボース ＋
D-キシロース ＋
L-キシロース −
アドニトール −
β-メチル-D-キシロシド −
ガラクトース ＋
D-グルコース ＋
L-フルクトース ＋
D-マンノース ＋
L-ソルボース −
ラムノース −
ダルシトール −
イノシトール ＋
マンニトール ＋
ソルビトール ＋
α-メチル-D-マンノシド −
α-メチル-D-グルコシド ＋
N-アセチル-グルコサミン −
アミグダリン ＋
アルブチン ＋
エスクリン ＋
サリシン ＋
セロビオース ＋
マルトース ＋
ラクトース ＋
メリビオース ＋
サッカロース ＋
トレハロース ＋
イヌリン −
メレジトース −
D-ラフィノース ＋
スターチ −
グリコーゲン −
キシリトール −
β-ゲンチオビオース −
D-ツラノース ＋
D-リキソース −
D-タガトース −
D-フコース −
L-フコース −
D-アラビトール −
L-アラビトール −
グルコネート −
2-ケト-グルコネート −
5-ケト-グルコネート −
(12)16S rDNA-Full塩基配列に基づく相同性分析
KSM 6-10株の16S rDNA-Full塩基配列を決定し、既存株の16S rDNA-Full塩基配列と比較した。相同性検索は、BLASTを用いてDNA塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL）に対して行った。
16S rDNA-Full塩基配列に基づく相同性分析の結果、相同性が100％の既存株は存在しなかった。KSM 6-10株は、枯草菌の既存株と99.8％の相同性、バチルス・アミロリクファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)の既存株と99.7％の相同性を示した。
KSM 6-10株の16S rDNA-Full塩基配列を決定し、既存株の16S rDNA-Full塩基配列と比較した。相同性検索は、BLASTを用いてDNA塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL）に対して行った。
16S rDNA-Full塩基配列に基づく相同性分析の結果、相同性が100％の既存株は存在しなかった。KSM 6-10株は、枯草菌の既存株と99.8％の相同性、バチルス・アミロリクファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)の既存株と99.7％の相同性を示した。
(13)糖発酵性に基づく相同性分析
上記(11)の糖の発酵性の結果に基づいて、KSM 6-10株と既存株との糖発酵性に基づく相同性を分析した。相同性検索は、試験結果に基づき、アピラボソフト（API LAB Software）を用いて、既存のデータベースに対して行った。その結果、KSM 6-10株は、枯草菌と0.4％、バチルス・リヘニフォルミス(Bacillus licheniformis)と98.9％の相同性を示した。
上記(11)の糖の発酵性の結果に基づいて、KSM 6-10株と既存株との糖発酵性に基づく相同性を分析した。相同性検索は、試験結果に基づき、アピラボソフト（API LAB Software）を用いて、既存のデータベースに対して行った。その結果、KSM 6-10株は、枯草菌と0.4％、バチルス・リヘニフォルミス(Bacillus licheniformis)と98.9％の相同性を示した。
上記(12)の16S rDNA-Full塩基配列に基づく相同性分析の結果、KSM 6-10株は、100％一致する既存株は無かったものの、枯草菌の既存株及びバチルス・アミロリクファシエンスの既存株と高い相同性を示したので、両種に近縁のバチルス属に属する新菌株であると推定した。一方、上記(13)の糖発酵性に基づく相同性分析の結果、KSM 6-10株は、枯草菌とは相同性が低く、バチルス・アミロリクファシエンスとは相同性を示さなかった。また、KSM 6-10株はラクトースやガラクトースを発酵する点で典型的な枯草菌と異なる性状を示した。
さらに、KSM 6-10株は糖発酵性の点でバチルス・リヘニフォルミスと高い相同性を示したものの、嫌気条件下や55℃で生育できないことから、KSM 6-10株は典型的なバチルス・リヘニフォルミスと異なる菌株であると推定した。
以上のように、KSM 6-10株は、既存の枯草菌、バチルス・アミロリクファシエンス又はバチルス・リヘニフォルミスとは異なる性質を有しており、当該菌株をバチルス・エスピー(Bacillus sp.)KSM 6-10と命名した。
KSM 6-10株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1つくばセンター中央第6)に2006年3月8日付で寄託されており、その受託番号はFERM P-20835である。
本発明に係る育毛剤の製造方法(以下、「本方法」という)では、先ずバチルス属に属する微生物を培養し、培養上清を分離する。培養に使用する培地としては、例えば、K培地(以下の表１に示す組成から成る培地)、SCD寒天培地「ダイゴ」(日本製薬(株)製）やMRS培地（Oxoid製）等の市販培地が挙げられる。培養温度は、例えば、15〜45℃、好ましくは30〜37℃とする。培養方法は、静置培養又は振盪培養のいずれであってもよい。培養時間は、例えば1〜5日間、好ましくは2〜4日間とする。
培養後、培養上清を分離すべく、例えば2000〜10000rpm(好ましくは4000〜9000rpm)で5〜60分間(好ましくは10〜30分間)遠心分離を行う。このようにして培養上清を得ることができる。
次いで、得られた培養上清を有機溶媒抽出に供する。ここで使用する有機溶媒としては、例えば、ヘキサンやオクタン等の炭化水素、アセトン、酢酸エチル及びこれら有機溶媒の混合物が挙げられる。特に、酢酸エチル、ヘキサン及びこれらの混合物が好ましい。培養上清に対する有機溶媒の割合は、容量比で10：1〜1：10(培養上清：有機溶媒)、好ましくは2：1〜1：4とする。分離し、得られた有機溶媒相自体を、本発明に係る育毛剤の成分である培養抽出物とすることができる。あるいは、必要に応じて、得られた有機溶媒相を、希釈、濃縮、乾固等に供してもよい。例えば、濃縮及び乾固に供した後、エタノール等の有機溶媒に溶解したものを培養抽出物とすることができる。さらに、この有機溶媒抽出工程は、同じか又は異なる種類の有機溶媒を用いて繰り返してもよい。
特に、有機溶媒抽出で酢酸エチルを用いた場合には、さらにメタノール/ヘキサンを用いて、再度有機溶媒抽出を行うことが好ましい。ここで使用するメタノールの濃度は、例えば10〜90％、好ましくは20〜70％である。一方、ヘキサンの濃度は例えば1〜89％、好ましくは23〜78％である。この場合には、分離したヘキサン相を培養抽出物として用いる。あるいは、上述と同様に、分離したヘキサン相を希釈、濃縮、乾固等に供してもよい。
このようにして得られた培養抽出物を、本発明に係る育毛剤の有効成分とする。本発明に係る育毛剤は、医薬、医薬部外品又は化粧料として使用することができる。また、上述のバチルス属に属する微生物の培養抽出物を、医薬、医薬部外品又は化粧料の製造のために使用することもできる。
さらに、本発明に係る育毛剤を医薬、医薬部外品又は化粧料として利用する場合には、その取扱い説明書又はパッケージに、バチルス属に属する微生物の培養抽出物を含有し、育毛活性を有することを特徴とする旨を表示することができる。
本発明に係る育毛剤を、医薬又は医薬部外品として使用する場合には、剤形としては、特に限定されるものではないが、例えば、錠剤及びカプセル剤等の内服剤、軟膏、水剤、エキス剤、ローション剤及び乳剤等の外用剤並びに注射剤が挙げられる。当該医薬又は医薬部外品には、培養抽出物の他に、助剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、吸収促進剤及び界面活性剤等の薬学的に許容される担体を任意に組合せて配合することができる。
一方、本発明に係る育毛剤を化粧料として使用する場合には、剤形としては、特に限定されるものではないが、例えば、油中水型又は水中油型の乳化化粧料、クリーム、ローション、ジェル、フォーム、エッセンス、ファンデーション、パック、スティック及びパウダー等が挙げられる。当該化粧料には、培養抽出物の他に、化粧料成分として一般に使用されている油分、界面活性剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート剤、pH調整剤、防腐剤、増粘剤、色素類、香料及び各種皮膚栄養剤等を任意に組合せて配合することができる。
本発明に係る育毛剤を医薬、医薬部外品又は化粧料として使用する場合、培養抽出物の配合量は、乾燥物として計算して、通常、医薬、医薬部外品又は化粧料の全組成の0.0005〜0.5重量％、特に0.001〜0.1重量％とすることが好ましい。
本発明に係る育毛剤の育毛活性の評価は、以下のように行うことができる。
育毛活性の評価方法としては、例えば、ヒト毛乳頭細胞及び/若しくはヒトケラチノサイト又は髭毛包器官培養を用いた方法が挙げられる。
育毛活性の評価方法としては、例えば、ヒト毛乳頭細胞及び/若しくはヒトケラチノサイト又は髭毛包器官培養を用いた方法が挙げられる。
ヒト毛乳頭細胞及び/又はヒトケラチノサイトを用いた方法では、先ず、ヒト毛乳頭細胞、ヒトケラチノサイト又はこれらの混合培養物に、本発明に係る育毛剤を作用又は接触させる。次いで、作用又は接触させた細胞を培養し、培養後、ヒト毛乳頭細胞及び/又はヒトケラチノサイトの増殖能を定量する。このようにして、定量したヒト毛乳頭細胞及び/又はヒトケラチノサイトの増殖能が、陰性対照と比較して統計上有意差で増加した場合には、本発明に係る育毛剤は育毛活性を有すると判断することができる。特に、本発明に係る育毛剤を作用又は接触させたヒト毛乳頭細胞及び/又はヒトケラチノサイトの増殖能が、陰性対照と比較して1.2倍以上増加した場合には、本発明に係る育毛剤の育毛活性は良好であると判断することができる。
一方、髭毛包器官培養を用いた方法では、先ず、単離した毛包に、本発明に係る育毛剤を作用又は接触させる。次いで、作用又は接触させた毛包を培養し、培養後、毛包の伸長を測定する。このようにして、測定した毛包の伸長率が、陰性対照と比較して統計上有意差で増加した場合には、本発明に係る育毛剤は育毛活性を有すると判断することができる。特に、本発明に係る育毛剤を作用又は接触させた毛包の伸長率が、陰性対照と比較して1.2倍以上増加した場合には、本発明に係る育毛剤の育毛活性は良好であると判断することができる。
以上に説明した本発明に係る育毛剤を、ヒトを含めた動物に適用することで、育毛を促進することができる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕KSM 6-10株の分離
栃木県内で市販されている白菜漬けを入手し、その滲出液1mLを80℃で30分間加熱した。
加熱後の滲出液を、滅菌生理食塩水で10-1〜10-7まで段階的に希釈した後、各希釈液0.1mLをSCD寒天培地「ダイゴ」(日本製薬(株)製)に接種し、30℃で72時間好気培養した。生じたコロニーを滅菌生理食塩水に懸濁し、この懸濁液を、SCD寒天培地での好気培養を繰り返すことによって分離菌株を純化した。
栃木県内で市販されている白菜漬けを入手し、その滲出液1mLを80℃で30分間加熱した。
加熱後の滲出液を、滅菌生理食塩水で10-1〜10-7まで段階的に希釈した後、各希釈液0.1mLをSCD寒天培地「ダイゴ」(日本製薬(株)製)に接種し、30℃で72時間好気培養した。生じたコロニーを滅菌生理食塩水に懸濁し、この懸濁液を、SCD寒天培地での好気培養を繰り返すことによって分離菌株を純化した。
純化した各々の分離菌株に関し、グラム染色性陽性、胞子形成あり、運動性あり及びカタラーゼ陽性等の確認を行い、枯草菌の近縁菌として保存した。このようにして得られた菌株の中から、下記の実施例３の方法によって培養し、得られた培養液の有機溶媒抽出物が高い育毛活性を示す株を選抜した。
以上のようにして分離し、選抜された株をKSM 6-10株と呼ぶ。
〔実施例２〕KSM 6-10株の系統分析
1．ゲノムDNAの単離
InstaGene Matrix（BIO RAD(CA, USA)製）を使用し、BIO RAD社のプロトコールに従って、KSM 6-10株からゲノムDNAを単離した。
〔実施例２〕KSM 6-10株の系統分析
1．ゲノムDNAの単離
InstaGene Matrix（BIO RAD(CA, USA)製）を使用し、BIO RAD社のプロトコールに従って、KSM 6-10株からゲノムDNAを単離した。
2．16S rDNAの単離及び配列決定分析
上記第1節で単離したゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、16S Ribosomal RNA遺伝子（16S rDNA）の全塩基配列1500〜1600bpの領域を増幅した。次いで、増幅した16S rDNAをシーケンシングし、KSM 6-10株の16S rDNA塩基配列を決定した。
尚、PCRにはReady-To-Go PCR Beads（Amersham Pharmacia Biotech(NJ, USA)製）とプライマー9F及び1510Rを使用した。また、シーケンシング(サイクルシークエンス)には、ABI Prism BigDye Terminator v3.1 Kit（Applied Biosystems(CA, USA)製）とシークエンスプライマー8種を使用した。さらに、PCRに使用するサーマルサイクラーにはGeneAmp PCR System 9600（Applied Biosystems(CA, USA)製）を使用し、一方、シーケンシングに使用するDNAシーケンサーにはABI PRISM 3100 DNA Sequencer（Applied Biosystems(CA, USA)製）を使用した。得られた塩基配列断片の結合にはAutoAssembler 2.1（Applied Biosystems(CA, USA)製）を使用した。
上記第1節で単離したゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、16S Ribosomal RNA遺伝子（16S rDNA）の全塩基配列1500〜1600bpの領域を増幅した。次いで、増幅した16S rDNAをシーケンシングし、KSM 6-10株の16S rDNA塩基配列を決定した。
尚、PCRにはReady-To-Go PCR Beads（Amersham Pharmacia Biotech(NJ, USA)製）とプライマー9F及び1510Rを使用した。また、シーケンシング(サイクルシークエンス)には、ABI Prism BigDye Terminator v3.1 Kit（Applied Biosystems(CA, USA)製）とシークエンスプライマー8種を使用した。さらに、PCRに使用するサーマルサイクラーにはGeneAmp PCR System 9600（Applied Biosystems(CA, USA)製）を使用し、一方、シーケンシングに使用するDNAシーケンサーにはABI PRISM 3100 DNA Sequencer（Applied Biosystems(CA, USA)製）を使用した。得られた塩基配列断片の結合にはAutoAssembler 2.1（Applied Biosystems(CA, USA)製）を使用した。
3．16S rDNA-Full塩基配列に基づく相同性分析
上記第2節で配列決定したKSM 6-10株の16S rDNA-Full塩基配列の相同性検索は、BLASTを用いてDNA塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL）に対して行った。
上記第2節で配列決定したKSM 6-10株の16S rDNA-Full塩基配列の相同性検索は、BLASTを用いてDNA塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL）に対して行った。
4．糖発酵性に基づく相同性分析
市販の細菌同定用キットAPI 50 CHB(bioMerieux社製)を用いて、KSM 6-10株の糖の発酵性を検討した。
次いで、得られたKSM 6-10株の糖発酵性の試験結果に基づき、アピラボソフト（API LAB Software）を用いて、既存のデータベースに対して相同性検索を行った。
市販の細菌同定用キットAPI 50 CHB(bioMerieux社製)を用いて、KSM 6-10株の糖の発酵性を検討した。
次いで、得られたKSM 6-10株の糖発酵性の試験結果に基づき、アピラボソフト（API LAB Software）を用いて、既存のデータベースに対して相同性検索を行った。
5．結果
上記第3節の16S rDNA-Full塩基配列に基づく相同性分析の結果、KSM 6-10株は、100％一致する既存株は無かったものの、枯草菌の既存株及びバチルス・アミロリクファシエンスの既存株と高い相同性(それぞれ、99.8％、99.7％)を示したので、両種に近縁のバチルス属に属する新菌株であると推定した。一方、上記第4節の糖発酵性に基づく相同性分析の結果、KSM 6-10株は、枯草菌と0.4％の相同性を示し、バチルス・アミロリクファシエンスとは相同性を示さなかった。また、KSM 6-10株はラクトースやガラクトースを発酵する点で典型的な枯草菌と異なる性状を示した。
上記第3節の16S rDNA-Full塩基配列に基づく相同性分析の結果、KSM 6-10株は、100％一致する既存株は無かったものの、枯草菌の既存株及びバチルス・アミロリクファシエンスの既存株と高い相同性(それぞれ、99.8％、99.7％)を示したので、両種に近縁のバチルス属に属する新菌株であると推定した。一方、上記第4節の糖発酵性に基づく相同性分析の結果、KSM 6-10株は、枯草菌と0.4％の相同性を示し、バチルス・アミロリクファシエンスとは相同性を示さなかった。また、KSM 6-10株はラクトースやガラクトースを発酵する点で典型的な枯草菌と異なる性状を示した。
さらに、KSM 6-10株は糖発酵性の点でバチルス・リヘニフォルミスと高い相同性(98.9％)を示したものの、嫌気条件下や55℃で生育できないことから、KSM 6-10株は典型的なバチルス・リヘニフォルミスと異なる菌株であると推定した。
以上のように、KSM 6-10株は、既存の枯草菌、バチルス・アミロリクファシエンス又はバチルス・リヘニフォルミスとは異なる性質を有しており、当該菌株をバチルス・エスピーKSM 6-10と命名した。
〔実施例３〕各種分離菌培養液の有機溶媒抽出物の調製
市販の枯草菌のうち、枯草菌ATCC 6051株及びIFO 13719株の2株を供試菌株として用いた。
SCD寒天培地で生育させた新鮮なバチルス・エスピーKSM 6-10株並びに枯草菌ATCC 6051株及びIFO 13719株を、105個の菌体/mlの濃度でそれぞれ200mLのK培地(表１)に接種して、30℃で3日間振盪培養した。
市販の枯草菌のうち、枯草菌ATCC 6051株及びIFO 13719株の2株を供試菌株として用いた。
SCD寒天培地で生育させた新鮮なバチルス・エスピーKSM 6-10株並びに枯草菌ATCC 6051株及びIFO 13719株を、105個の菌体/mlの濃度でそれぞれ200mLのK培地(表１)に接種して、30℃で3日間振盪培養した。
次いで、振盪培養後、各菌株の培養液を8000rpmで10分間遠心分離し、得られた培養上清に等量の酢酸エチルを添加して、100回/分の速度で10分間攪拌し、酢酸エチル相を得た。得られた酢酸エチル相を濃縮乾固した後、90％メタノール/ヘキサン(10mL/10mL)で分画した。
得られたヘキサン相を乾固し、これを溶媒抽出物とした。さらに、この溶媒抽出物を5mLのエタノールに溶解したものを培養エキス(「培養抽出物」に相当する)とした。
なお、K培地200mLから得られた各菌株の溶媒抽出物の乾燥重量を表２に示す。対照は、未使用の培地から抽出した溶媒抽出物の乾燥重量である。
〔実施例４〕育毛活性の評価(1)：ヒト毛乳頭細胞とヒトケラチノサイトとの混合培養系に対する増殖活性
東洋紡績(株)から購入したヒト毛乳頭細胞を、PCGM培地(東洋紡績(株)製)で培養した。サブコンフルエントに達した時点で、トリプシン・EDTA(東洋紡績(株)製)を1mL添加して2〜3分間放置した。
東洋紡績(株)から購入したヒト毛乳頭細胞を、PCGM培地(東洋紡績(株)製)で培養した。サブコンフルエントに達した時点で、トリプシン・EDTA(東洋紡績(株)製)を1mL添加して2〜3分間放置した。
放置後、トリプシン中和液(東洋紡績(株)製)を1mL添加し、酵素反応を停止させた。次いで、この混合物を1000rpmで5分間遠心分離することによって、ヒト毛乳頭細胞を回収した。
回収したヒト毛乳頭細胞を、PCGM培地(この培地はサプリメントフリーである)に懸濁し、血球計測板を用いて細胞数を計測した。次いで、計測結果に基づき、1500〜4000細胞数/ウエルになるように、ヒト毛乳頭細胞を96ウエルプレートに播種した。
次いで、角化細胞用無血清培地（サプリメント含有；GIBCO BRL 製）でヒトケラチノサイト(倉敷紡績(株)製)を培養し、サブコンフルエントに達した時点で、プロナーゼ(極東製薬(株)製)を5mL添加して、37℃で2〜3分間放置した。放置後、角化細胞用無血清培地（サプリメント含有；GIBCO BRL 製）を5mL添加し、酵素反応を停止させた。次いで、この混合物を1000rpmで5分間遠心分離することによって、ヒトケラチノサイトを回収した。回収したヒトケラチノサイトを、角化細胞用無血清培地(この培地はサプリメントフリーである)に懸濁し、血球計測板を用いて細胞数を計測した。次いで、計測結果に基づき、1500〜4000細胞数/ウエルになるように、先にヒト毛乳頭細胞を播種した96ウエルプレートに播種して、一昼夜培養した。
次いで、これら2種類のヒト由来細胞を含有する各ウエルに、実施例３で得られた各菌株の培養エキスを終濃度0.01〜1％になるように添加し、さらに一昼夜培養した。
培養後、Cell proliferation ELISA BrdUキット(ロッシュ社製)を用いて、ヒト毛乳頭細胞及びヒトケラチノサイトの増殖能を定量した。なお、各培養エキスの代わりに、終濃度1％のエタノールを補った角化細胞用無血清培地(この培地はサプリメントフリーである)を添加した2種類のヒト由来細胞(ヒト毛乳頭細胞及びヒトケラチノサイト)の増殖能を対照とした。結果を表３に示す。
表３は、評価した各培養エキス(0.01〜1％の濃度)のヒト毛乳頭細胞及びヒトケラチノサイトに対する増殖促進効果を示す。各培養エキス存在下でのこれら2種類のヒト由来細胞の増殖能を、終濃度1％のエタノールを補った角化細胞用無血清培地(この培地はサプリメントフリーである)を添加した同じ2種類のヒト由来細胞の増殖能に対する百分率(％)で示した。さらに、表３には、比較として未使用のK培地の溶媒抽出物をエタノールに溶解したものの存在下でのヒト毛乳頭細胞及びヒトケラチノサイトの増殖能を示した(表３では、「K培地のみ」)。
表３から判るように、枯草菌IFO 13719株及びバチルス・エスピーKSM 6-10株由来の培養エキスにヒト毛乳頭細胞及びヒトケラチノサイトに対する増殖促進効果が認められた。特に、バチルス・エスピーKSM 6-10株由来の培養エキスの効果が最も大きかった。なお、後述する比較例とは異なり、培地成分そのもの(K培地)には育毛活性は見られなかった。
〔実施例５〕育毛活性の評価(2)：髭毛包器官培養での伸長効果
形成外科でフェイスリフトを行った53歳女性の前方側頭部から毛包を単離し、実施例３で得られたバチルス・エスピーKSM 6-10株の培養エキスを添加し、実態顕微鏡下で伸長量を測定することによって、当該培養エキスの育毛活性を評価した。
形成外科でフェイスリフトを行った53歳女性の前方側頭部から毛包を単離し、実施例３で得られたバチルス・エスピーKSM 6-10株の培養エキスを添加し、実態顕微鏡下で伸長量を測定することによって、当該培養エキスの育毛活性を評価した。
毛包を単離してから18時間後に、0.2mm以上伸びた毛包のみを選抜して、24ウエルプレートに3本/ウエルで毛包を置き、500μL/ウエルで培地(添加物(2 mM L-glutamine、10 ng/ml Hydrocortison、10 μg/ml Insulin、100 U/ml penicillin及び100μg/ml streptomycin)を補ったWiliam's E 培地)を添加して毛包を浸漬した。次いで、実施例３で得られたバチルス・エスピーKSM 6-10株の培養エキスを終濃度0.1％又は1.0％になるように添加し、37℃にてCO2インキュベーター（CO2濃度5％）で培養し、経日的に伸長量を測定した。なお、溶媒（終濃度1％のエタノール）のみの存在下で培養した毛包を溶媒対照とした。
各群12本の毛包の長さを測定して、各群の平均値を算出し、培養開始時点に対する毛伸長率(％)の平均値と標準誤差を算出した結果を表４及び図１に示す。
表４及び図１から明らかなように、溶媒対照と比較して、実施例３で得られたバチルス・エスピーKSM 6-10株の培養エキスは、濃度依存的に毛幹伸長促進効果が認められた。
〔比較例〕特許文献１(特開2005-15415号公報)又は２(特開2000-327538号公報)記載の培地を用いて培養した各菌株の培養上清の育毛活性
特許文献１又は２記載の培地を用いて培養した各菌株の培養上清の育毛活性を調べた。
特許文献１又は２記載の培地を用いて培養した各菌株の培養上清の育毛活性を調べた。
1．特許文献１記載の培地を用いて培養した各菌株の培養上清の調製
特許文献１の実施例１の記載に準じて、培地を調製した。
ジャガイモ20g、小松菜10g及びオレンジ2gをジューサーミキサーで粉砕し、この粉砕物に95℃の熱水1Lを加えて攪拌し、30分間熱水抽出を行った。
得られた熱水抽出物を、8000rpmで15分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清のpHを6.5に調整し、500mL容三角フラスコに100mLずつ添加し、加熱滅菌した。これを培地に用いた。
三共(株)から購入したラクリス(バチルス・コアグランス)を、上記培地に接種し、37℃で3日間静置培養した。一方、枯草菌ATCC 6051株及びIFO 3335株(納豆菌)を、それぞれ上記培地に接種し、30℃で2日間振盪培養した。
培養後、各菌株の培養物を、8000rpmで15分間遠心分離することによって培養上清を得た。
特許文献１の実施例１の記載に準じて、培地を調製した。
ジャガイモ20g、小松菜10g及びオレンジ2gをジューサーミキサーで粉砕し、この粉砕物に95℃の熱水1Lを加えて攪拌し、30分間熱水抽出を行った。
得られた熱水抽出物を、8000rpmで15分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清のpHを6.5に調整し、500mL容三角フラスコに100mLずつ添加し、加熱滅菌した。これを培地に用いた。
三共(株)から購入したラクリス(バチルス・コアグランス)を、上記培地に接種し、37℃で3日間静置培養した。一方、枯草菌ATCC 6051株及びIFO 3335株(納豆菌)を、それぞれ上記培地に接種し、30℃で2日間振盪培養した。
培養後、各菌株の培養物を、8000rpmで15分間遠心分離することによって培養上清を得た。
2．特許文献２記載の培地を用いて培養した各菌株の培養上清の調製
特許文献２の実施例の記載に準じて培地を調製した。
米糠60g、脱脂大豆10g、フィチン酸10g、グルコース30g、リン酸水素二ナトリウム20g、リン酸水素二アンモニウム5g及び炭酸水素ナトリウム9gを、1Lのイオン交換水に溶解して、pHを6.5に調整した。これを、500mL容三角フラスコに100mLずつ添加し、加熱滅菌した。これを培地に用いた。
特許文献２の実施例の記載に準じて培地を調製した。
米糠60g、脱脂大豆10g、フィチン酸10g、グルコース30g、リン酸水素二ナトリウム20g、リン酸水素二アンモニウム5g及び炭酸水素ナトリウム9gを、1Lのイオン交換水に溶解して、pHを6.5に調整した。これを、500mL容三角フラスコに100mLずつ添加し、加熱滅菌した。これを培地に用いた。
次いで、上記第1節と同様の方法で、各菌株を培養し、培養上清を調製した。
3．特許文献１又は２記載の培地を用いて培養した各菌株の培養上清の育毛活性
実施例４と同様の方法で、上記第1節及び第2節で得られた培養上清の2種類のヒト由来細胞(ヒト毛乳頭細胞及びヒトケラチノサイト)に対する増殖促進効果を測定することによって育毛活性を評価した。結果を表５に示す。なお、ヒト毛乳頭細胞及びヒトケラチノサイトに対する、上記第1節及び第2節で調製した未使用の培地の増殖促進効果をそれぞれ対照とし、表５に「培地のみ」と記した。
表５では、評価した各培養上清(0.01〜1％の濃度)のヒト毛乳頭細胞及びヒトケラチノサイトに対する増殖促進効果について、各培養上清存在下でのヒト毛乳頭細胞及びヒトケラチノサイトの増殖能を、終濃度1％のエタノールを補った角化細胞用無血清培地(この培地はサプリメントフリーである)を添加した同じ2種類のヒト由来細胞の増殖能に対する百分率(％)で示した。
実施例４と同様の方法で、上記第1節及び第2節で得られた培養上清の2種類のヒト由来細胞(ヒト毛乳頭細胞及びヒトケラチノサイト)に対する増殖促進効果を測定することによって育毛活性を評価した。結果を表５に示す。なお、ヒト毛乳頭細胞及びヒトケラチノサイトに対する、上記第1節及び第2節で調製した未使用の培地の増殖促進効果をそれぞれ対照とし、表５に「培地のみ」と記した。
表５では、評価した各培養上清(0.01〜1％の濃度)のヒト毛乳頭細胞及びヒトケラチノサイトに対する増殖促進効果について、各培養上清存在下でのヒト毛乳頭細胞及びヒトケラチノサイトの増殖能を、終濃度1％のエタノールを補った角化細胞用無血清培地(この培地はサプリメントフリーである)を添加した同じ2種類のヒト由来細胞の増殖能に対する百分率(％)で示した。
上記第1節及び第2節で調製した培地は、育毛活性があることが既に知られている原料を幾つか含有しており、培地自体に育毛活性があると予測された。
表５に示すように、何れも未使用の培地そのものに活性が検出され、バチルス属の細菌の培養上清は、未使用の培地を超える増殖促進活性を示さなかった。
Claims (3)
- 受託番号FERM P-20835で特定されたバチルス属に属する微生物又は枯草菌IFO 13719株の培養上清を分離する工程と、
上記培養上清を、酢酸エチルを用いた抽出に供し、酢酸エチル相を分離する工程と、
を含む、育毛剤の製造方法。 - 上記酢酸エチル相をメタノール/ヘキサンで分画し、ヘキサン相を分離する工程をさらに含む、請求項１記載の育毛剤の製造方法。
- 請求項１記載の方法により得られた酢酸エチル相又は請求項２記載の方法により得られたヘキサン相を有効成分として含有する育毛剤。
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