JP4974042B2 - スペクトル補正方法 - Google Patents

Description

本発明は、近赤外線分光分析計の検量線補正方法に関し、バイアル瓶に採取したサンプルから得たスペクトルを使用して検量線を作成し、次にバイアル瓶に採取した未知サンプルの濃度または性状値を予測するに際し、バイアル瓶の個体差によるスペクトルのばらつきにより検量線を用いた予測値のばらつきを補正する方法に関するものである。

近年、化学、石油、生化学又は製薬、さらには食品分野など多岐にわたりその製造プロセス管理や品質管理を従来の化学分析法に代り近赤外分光分析方式に導入又は移行するための検討がなされている。
従来、製造プロセス管理や品質管理は分析室内での化学分析（滴定法）によるオフライン管理により行われてきた。

しかし、滴定法による定量分析は前処理に時間がかかり、また要求精度が高いことから滴定者には熟練と経験が要求され、更に分析に試薬を使用するので環境汚染につながるという問題がある。

使い捨てのバイアル瓶を使用した近赤外分光分析計のサンプル測定は、簡便、安価であり、サンプルを搬送することも容易であるため、サンプル測定の主流となる可能性を有している。
図１６はバイアル瓶に採取したサンプルを近赤外分光分析計を用いてサンプルのスペクトルを測定するための一例を示す図である。

図において、１は測定用ホルダであり、このホルダの中央付近にはバイアル（ここでは測定サンプルを入れる小型のガラス瓶を意味している。以下単にバイアルという）を挿入するバイアル挿入孔１ａが形成され、この孔にサンプルを入れたバイアルを挿入して測定を行う。なお、この孔１ａの周囲には複数個（図では６個）の予熱用バイアルを挿入するための予熱用バイアル挿入孔１ｂが形成されている。

２はホルダ１を所定の温度に維持するための温調器である。また、このホルダ１の側面には近赤外光（以下、単に光という）を透過するための光透過孔１ｃが形成されており、この孔１ｃから入射した光はバイアルの中央部を貫通して検出器３に達するように構成されている。

検出器３で光電変換された信号は信号変換器４に送られてＡ／Ｄ変換され、Ethenet等によりデータ処理部（パソコン）５に送られてスペクトル表示される。
図１６（ｂ）は上記バイアル挿入孔１ａに挿入されるバイアル１０の形状を示すもので、パイレックス（登録商標）ガラスにより外径（Ｄ）８，内径（ｄ）約６，高さ４０（mm）に形成されたポリプロピレン製蓋１３付きのバイアルである。

このようなバイアルは試料１１を少量採取してサンプルテストを行うためのもので、取り扱いが簡単であり、図１６ａに示すバイアル瓶挿入孔に挿入するだけでよいので、手分析の場合に比較して迅速、正確に測定できるという特徴がある。

ところで、このような測定装置においては、サンプルの測定に際し多数のバイアルを使用する。そのためバイアル瓶のばらつきにより、検量線出力が変動するという問題がある。図１６ｃはバイアルの実効光路長を説明するための断面図である。先に示したバイアルの外径は８ｍｍ、内径は約６ｍｍであるが実際に透過する光は所定の太さの径を有しており、６ｍｍの実効光路長を有しているとはいえない。しかし、バイアルの実効長を機械的に測定することは困難である。

本発明ではバイアルのばらつきによって生じる検量線の変動を、基準スペクトルを固定することでサンプルスペクトルから光路長を予測し、その予測光路長を使用してスペクトルを補正することでバイアルの個体差による変動を無視できる検量線の補正方法を提供することを目的とする。

バイアルを用いた器差補正方法に関する先行技術として、例えば下記のようなものがある。

特開２００１−４１８７９号公報

このような課題を達成するために、本発明のうち請求項１記載の発明は、
光路長が既知のバイアル又はセルに入った濃度が既知のサンプルのスペクトルを基準スペクトルとして測定し、
前記基準スペクトルと検量線作成用のサンプルを測定した測定スペクトルの吸光度比を最小自乗法により濃度を含む性状の変化によるスペクトル変化が少ない波長範囲で求めて測定光路長を決定し、測定スペクトルを基準スペクトルと同じ光路長で測定したスペクトルに変換した後、測定対象の検量線を作成し、濃度を含む性状が未知のサンプルから得られた未知サンプルのスペクトルと基準スペクトルの濃度を含む性状の変化によるスペクトル変化が少ない波長範囲の比を最小自乗法で求めて光路長を推定し、基準光路長のスペクトルに変換した後、予め作成した検量線を使用してサンプルの濃度を含む性状を推定することを特徴とする。

請求項２においては、請求項１記載のスペクトル補正方法において、
前記基準スペクトルを採用し基準スペクトルと濃度を含む性状が未知のサンプルから得られた測定スペクトルの比から求めた測定光路長を推定し、測定光路長と予測した濃度を含む性状を表示および出力するようにしたことを特徴とする。

本発明によれば次のような効果がある。
請求項１，２に記載の発明によれば、
光路長が既知のバイアル又はセルに入った濃度が既知のサンプルのスペクトルを基準スペクトルとして測定し、
前記基準スペクトルと検量線作成用のサンプルを測定した測定スペクトルの吸光度比を最小自乗法により濃度を含む性状の変化によるスペクトル変化が少ない波長範囲で求めて測定光路長を決定し、測定スペクトルを基準スペクトルと同じ光路長で測定したスペクトルに変換した後、測定対象の検量線を作成し、濃度を含む性状が未知のサンプルから得られた未知サンプルのスペクトルと基準スペクトルの濃度を含む性状の変化によるスペクトル変化が少ない波長範囲の比を最小自乗法で求めて光路長を推定し、基準光路長のスペクトルに変換した後、予め作成した検量線を使用してサンプルの濃度を含む性状を推定するので、バイアル瓶の個体差による検量線の予測誤差のばらつきを補正し、再現性がよく安定した予測が可能である。

図１は本発明の実施形態の一例を示す検量線補正方法のフローチャートである。
はじめに工程ａにおいてサンプルのスペクトル測定を行う（測定結果はメモリに格納する）。
次に、工程ｂにおいて、標準光路長を持つバイアルに入れたサンプルのスペクトルと比較し、特定波数範囲で標準スペクトルと相関を取る。

次に工程ｃにおいて、工程２で求めた相関から実効光路長を計算する。
次に工程ｄにおいて、計算した実効光路長と予め定めていた所定の光路長と比較して正常／異常を判定する（一定の閾値より外れている場合は異常と判断し表示する）。
次に工程ｅにおいてスペクトルの光路長を補正する。
次に工程ｆにおいて、検量線の計算を行う。
次に工程ｇにおいて工程ｆで求めた検量線を用いて成分／性状の予測値を出力する。

図２は図１６に示したような近赤外線分光分析装置を用い、光路長の異なる３種類（２,５，１０ｍｍ）のキュベットおよび外径８ｍｍ，内径約６ｍｍ，長さ４０ｍｍのバイアルを用いて１００％トルエンの吸光度を測定したものである。図において横軸は波数、縦軸は吸光度を示している。なお、図２（ｂ）はキュベットの形状を示すもので、光路長としての厚さｍを２,５，１０ｍｍと変化させたものを使用する。

図２において、５６５０ｃｍ^−１の波数に注目すると２ｍｍのキュベットの吸光度はおよそ０．２８となっており、５ｍｍのキュベットの吸光度は２ｍｍのキュベットの２．５倍のおよそ０．７となっている。また、１０ｍｍのキュベットの吸光度は２ｍｍのキュベットの５倍のおよそ１．４となっており、直線的な比例関係にあることがわかる。そして、ここで用いた内径約６ｍｍのバイアルの吸光度はおよそ０．８であることが分かる。
これらキュベットの吸光度の比例関係とバイアルの吸光度からバイアルの実効光路長を推定することができる。

このように光路長が既知の一個のキュベット又はバイアルを用いてあるサンプルのスペクトルを測定し、特定波数あるいは特定波数範囲の吸光度から検量線を作成し、この検量線に基づいてサンプルの特性を測定すれば正確な分析結果を得ることができる。
しかしながら、実際のサンプル測定では数十から百を超えるサンプルを採取して検量線を作成するのでサンプルの出し入れに手間がかかり、また、コンタミが起きやすいという問題があった。

そのため価格の安いバイアルを用いて使い捨てでスペクトルを測定し検量線を作成できればよいが、バイアルの光路長には製作ロット毎のばらつきや同じロットでも個体差があり、同じサンプルを異なるバイアルで測定すると予測結果がばらつくという問題があった。

図３は図１６に示す赤外線分光分析装置と、図２で用いた波数と吸光度の関係を用い、ロットの異なる５種類（Ａ〜Ｅ）のバイアルの中からそれぞれ１個のバイアルを抜き取って、図３（ｂ）に示すように４方からそれぞれ３回測定し光路長を推定する工程を２度行い相関を調べた結果である。２度の推定に相関があり、光路長の推定が再現されていることがわかる。
ロットや個体差によりばらつきがあるが点線で示す直線イに対して相関関係があることが分かる。

図４はロットＡ〜Ｅのそれぞれから８０個をランダムに抽出して３回ずつ測定し、光路長のばらつきがどれほどあるかの頻度を調べたものである。図によれば６．４８ｍｍに中心があり、±約０．２ｍｍのばらつきがあることが分かる。

図５はトルエン中に７％のイソプロピルアルコールをいれて図１５に示す近赤外線分光分析装置を用いてスペクトル変化を測定したもので、イ，ロで示す部分はスペクトルの変化の大きなイ’，ロ’部分を拡大したものである。イソプロピルアルコールの濃度に応じてスペクトルの吸光度が変化していることがわかる（図５は図１で示すフローチャートの工程（ａ）のスペクトル測定に相当する）。

図６はロットＡを使用してそれぞれのバイアルを３回ずつ測定し検量線を作成した一例を示すもので、横軸はリファレンスＩＰＡ濃度、縦軸は予測ＩＰＡ濃度である。
なお、リファレンスＩＰＡ濃度は重量％で、溶媒（トルエン）とＩＰＡの重量比より算出したものである。
図７は図６に示す検量線を使用した他のロットを含むバイアル中のＩＰＡ濃度の予測結果を示すものである。図６と比較するとバイアル個体差による予測結果のばらつきがあることが分かる。

図８(ａ〜ｄ)は検量線作成に際し、前処理を施した場合と前処理を施さない場合の検量線予測結果とロット間のばらつきを示す図である。なお、検量線作成に使用したバイアルはロットＡを用いた。

図８（ａ）は前処理なしでＳＥＰが０．０９２９の場合のばらつきの度合いを示す図である。横軸はイソプロピルアルコール濃度（％）のラボ値に対する検量線を使用した予測値のばらつき、縦軸は頻度（測定された回数）を示している。ここで、ＳＥＰ（Standard Erroｒ Prediction）とは予測したサンプル濃度とラボ値の標準偏差である。

図８（ａ）によれば、ばらつきが大きく標準偏差は０．０７８３であった。ここで標準偏差とは、各サンプルの予測値の平均値を取り、それを各予測値から引いたデータの標準偏差を取ったものである。

図８（ｂ）は前処理として２次微分を施したもので、ＳＥＰが０．０９２９の場合のばらつきの度合いを示す図である。この場合の標準偏差は０．０７２７であった。
図８（ｃ）は前処理としてＭＳＣ（Ｍｕｌｔｉ-Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ−Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ・・・多重散乱補正・・・以下、単にＭＳＣという）を施したもので、ＳＥＰが０．１１４３の場合のばらつきの度合いを示す図である。この場合の標準偏差は０．０３１７であった。

図８（ｄ）は前処理として２次微分およびＭＳＣを施したもので、ＳＥＰが０．０６０２の場合のばらつきの度合いを示す図である。この場合の標準偏差は０．０３３１であった。これらの図から、前処理として２次微分およびＭＳＣを施したものがばらつきが小さくなることがわかる。

図９,図１０は２次微分検量線による他のロットのバイアルを含む予測結果の効果を示すもので、図９は図８（ｂ）の２次微分を施した状態、図１０は２次微分およびＭＳＣを施した状態を示している。なお、横軸はリファレンスＩＰＡ濃度、縦軸は予測ＩＰＡ濃度である。これらの図によれば、ＭＳＣを施したもの（図１０）がばらつきが小さいことがわかる。

図１１（ａ）は標準スペクトルの吸光度と各サンプルの吸光度比の関係を示すもので、図１１（ｂ）に示すようなＩＰＡの濃度により大きく変化する波数範囲を用いたものである。図１１（ｂ）において横軸は波数、縦軸は吸光度を示している。

図１２（ａ）は図１１と同様標準スペクトルの吸光度と各サンプルスペクトルの吸光度比の関係を示す図である。
図１１と図１２を比較すると図１２の方がばらつきも少なく、相関もよいことがわかる。
図１１に示す直線の式
ｙ＝０．９９０２ｘ＋０．００４３
ｒ（相関係数）＝０．９９９４
および図１２に示す直線の式
ｙ＝０．９９８６ｘ＋０．００３３
ｒ（相関係数）＝０．９９９８
は最小自乗法を用いて求めたサンプルスペクトルと標準スペクトルの相関で、ｙ＝ａｘ＋ｂのａに相当する値は標準スペクトルとサンプルスペクトルの光路比を示している。

図１２（ｂ）に示すように、ここではＩＰＡの濃度による変化が少ない波数範囲を使用した。図１１に比較してばらつきが小さく相関も良好であることがわかる（図１２は図１で示すフローチャートの工程（ｂ）の標準スペクトル測定と相関を取る工程に相当する）。

図１１と図１２の比較からＭＳＣを使って光路長を予測する場合、サンプル濃度の影響を受けないスペクトル範囲を使用したほうが予測の安定性がよい。ＭＳＣでは標準のスペクトルとして検量線作成時のサンプルスペクトルの平均を使用する。

そのため、検量線作成毎に平均スペクトルは変化して推定光路長に継続性がないという欠点があった。
そこで、予めパス長の既知のサンプルスペクトルを基準としてパス長補正量を計算する変形ＭＳＣ法を提案する。

図１３は既知光路長６．５２６ｍｍのバイアルに入ったトルエン中にＩＰＡ３．２８３％が入ったサンプルスペクトルを基準にして予測した光路長と図２に示す純トルエンスペクトルから推定した光路長の相関を示すものである。

図１３は２つの方法で求めた光路長の相関を示すもので、横軸はＩＰＡ濃度により変化するスペクトルから求めた予測光路長（ｍｍ）、縦軸はトルエンスペクトルから求めた予測光路長（ｍｍ）である。
図１３は最小自乗法を用いて求めたＩＰＡ濃度が変化するサンプルスペクトルから求めた光路長とトルエンスペクトルから求めた光路長の相関を示すもので、ｒ＝０．９１２は相関係数を示している。
図１３の結果は、トルエンを使用せずにサンプルスペクトルから光路長の予測が可能なことを示している。

図１４はサンプルスペクトルから求めた光路長を使用してスペクトルを補正し、予測した結果を示すもので、光路長補正後のスペクトルを使用し２次微分検量線を作成し、他のロットバイアルを含む光路長補正スペクトルを予測した結果である。ＳＥＰ（予測誤差）が０．０５６とロットによるばらつきが大きく減少していることが分かる。

図１５は変形ＭＳＣの効果を示す図である。即ち図１５（ａ）の上側の（イ）で示す線はサンプルスペクトルから予測した光路長を示し、図１５（ａ）の（ロ）、（ハ）で示す線は変形ＭＳＣを用いたものと用いない場合のＩＰＡ予測値のばらつきの比較を示している。（ロ）で示す線は光路長補正無のＩＰＡ濃度の予測値、（ハ）で示す線は実効光路長を使用してスペクトルの補正をした後、検量線に当てはめＩＰＡ（イソプロピルアルコール）の予測値を計算したときのばらつきを示すものである。ばらつきが少なくなっていることが分かる。

図１５（ｂ）は検量線予測値のばらつきの比較を頻度表（ヒストグラム）にしたもので、変形ＭＳＣを使用した場合には使用しない場合に比較してばらつきが半分以下（σ＝０.０５１→０．０２５）になっていることが分かる（図１５（ａ）は図１で示すフローチャートの工程（ｇ）に相当する）。

なお、以上の説明は、本発明の説明および例示を目的として特定の好適な実施例を示したに過ぎない。本実施例では従って本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形を含むものである。

本発明の検量線補正方法のフローチャートである。 異なる光路長によるトルエンスペクトルと光路長測定校正直線を示す図である。 ロットの異なるバイアルの中からそれぞれ１個のバイアルを抜き取って４方からそれぞれ各３回測定し光路長を推定する工程を２回行い推定光路長の相関を調べた結果を示す図である 実効光路長とばらつきの関係を示す図である。 トルエン中に７％のイソプロピルアルコールをいれてスペクトル変化を測定した結果を示す図である。 ロットＡを使用してバイアルの中のスペクトルを３回ずつ測定し検量線を作成した一例を示す図である。 図６に示す検量線を使用した他のロットを含むバイアル中のＩＰＡ濃度の予測結果を示す図である。 図８検量線作成に際し、前処理を施した場合と前処理を施さない場合の検量線予測結果を示す図である ２次微分検量線による他のロットのバイアルを含むサンプルの予測結果を示す図である。 ２次微分およびＭＳＣを施した状態を示す図である。 標準スペクトルの吸光度と各サンプルの吸光度比の関係を示す図である。 標準スペクトルの吸光度と各サンプルスペクトルの吸光度比の関係を示す図である。 ２つの方法で求めた光路長の相関を示す図である。 サンプルスペクトルから求めた光路長を使用してスペクトルを補正し、予測した結果を示す図である。 変形ＭＳＣ法を使用した光路長の推定値と変形ＭＳＣ法を使用して補正した場合としない場合の測定値のばらつきの比較結果を示す図である。 バイアル瓶に採取したサンプルを近赤外分光分析計を用いてサンプルのスペクトルを測定するための一例を示す図である。

符号の説明

１ 測定用ホルダ
２ 温調器
３ 検出器
４ 信号変換器
５ パソコン
１０ バイアル瓶
１１ 試料

Claims (2)

1. 光路長が既知のバイアル又はセルに入った濃度が既知のサンプルのスペクトルを基準スペクトルとして測定し、
   前記基準スペクトルと検量線作成用のサンプルを測定した測定スペクトルの吸光度比を最小自乗法により濃度を含む性状の変化によるスペクトル変化が少ない波長範囲で求めて測定光路長を決定し、測定スペクトルを基準スペクトルと同じ光路長で測定したスペクトルに変換した後、測定対象の検量線を作成し、濃度を含む性状が未知のサンプルから得られた未知サンプルのスペクトルと基準スペクトルの濃度を含む性状の変化によるスペクトル変化が少ない波長範囲の比を最小自乗法で求めて光路長を推定し、基準光路長のスペクトルに変換した後、予め作成した検量線を使用してサンプルの濃度を含む性状を推定することを特徴とするスペクトル補正方法。
2. 前記基準スペクトルを採用し基準スペクトルと濃度を含む性状が未知のサンプルから得られた測定スペクトルの比から求めた測定光路長を推定し、測定光路長と予測した濃度を含む性状を表示および出力するようにしたことを特徴とする請求項１記載のスペクトル補正方法。

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