JP4971571B2 - インビボ高処理毒性学的スクリーニング法 - Google Patents
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Description
【０００１】
緒言
発明の分野
本発明の分野は毒性学試験、特に医薬品の研究開発における毒性学試験である。
【０００２】
発明の背景
薬剤の開発プロセスにおいて、潜在的な治療的作用物質または薬剤候補は、少なくとも米国においては、FDAの認可を得、引き続き商業化する以前に、意図された使用についての安全性および有効性の両方を示されなければならない。薬剤の開発プロセスにおいて、潜在的な薬剤候補は、安全性を示す試みにおいて変異原性評価および毒性学評価を受ける。変異原性分析は、微生物（エイムス試験）、ショウジョウバエ（ミュラー5 試験）、および哺乳動物細胞の培養において行われる。しかし、毒性学的分析は哺乳動物細胞培養および動物モデル研究に限られる。この計画においては、候補薬剤の毒性を分析するため、著しい時間および費用の投資が必要とされる。このように、毒性学試験は典型的には、薬剤候補についての有効性評価が好結果であった後に実施される。
【０００３】
高処理薬剤探索法の出現と共に、製薬業界および関連業界においては、薬剤の開発プロセスの毒性学試験の部分を合理化することについて、非常に関心が高まっている。薬剤候補数は年間数十から年間数千へと急増したため、毒性学評価プログラムは薬剤開発プロセスにおける厳しい障害となってきている。
【０００４】
したがって、多くの異なる化合物についての毒性データを迅速に提供できる、新規の高処理スクリーニングアッセイ法の開発には非常に関心が高い。関心対象となるものは、インビボの高処理毒性スクリーニングアッセイ法の開発である。
【０００５】
関連文献
高処理毒性スクリーニングアッセイ法は：ケリー（Kelly）、「HTS毒性学における進歩（Advances in HTS Toxicology）」、 Genetic Engineering News、March 1、1999: 14）」；およびサンソム（Sansome）、Drug Discovery Today(1999) 4:199〜201において議論されている。
【０００６】
発明の概要
高処理毒性学的スクリーニングアッセイ法が提供される。本方法においては、多数の異なる化合物の組成物、通常少なくとも10個の異なる化合物の組成物を同時に、毒性の活性があればそれについてアッセイする。各化合物の組成物の多数を多細胞生物の集団と接触させ、多細胞生物に対する化合物の組成物の影響を測定することにより、毒性についてアッセイする。本高処理スクリーニング（HTS）アッセイ法において使用を見出される多細胞生物は小さく、分化した組織および器官をもち、短い世代時間を有し、多産のものである。本HTS法は様々な適用において使用を見出され、特に、組合わせて作製された化合物ライブラリーのような、多数の化合物の毒性学的スクリーニングにおける使用に適している。
【０００７】
特定の態様の説明
高処理毒性学的スクリーニング法が提供される。本方法においては、少なくとも10個の異なる化合物の組成物が同時に試験される。多数の非哺乳動物多細胞生物、例えば約10から1,000個体と接触させ、その生物に対する化合物の組成物の影響を測定することにより、各化合物の組成物が試験される。本方法において使用される多細胞生物は小さく、分化した組織および器官をもち、短い世代時間を有し、多産のものである。本高処理スクリーニング法は様々な適用において使用を見出され、特に、組合わせて作製された化合物ライブラリーのような化合物ライブラリーの毒性学的スクリーニングにおける使用に適している。
【０００８】
本発明をさらに説明する前に、本発明は以下に説明される発明の特定の態様に限定されるものではなく、特定の態様の多様化は可能であり、なおも添付される請求項の範囲内であると理解されるべきである。使用される用語は特定の態様を説明するためのものであり、限定を意図するものではないこともまた理解されるべきである。代わりに、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲により確立される。
【０００９】
本明細書および添付される特許請求の範囲において、単数形の「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈中明らかに他の指示がない限り、複数形の指示物をも含む。他に定義されない限り、本明細書にて使用される全ての技術用語および科学的用語は、本発明の属する当技術分野における当業者に一般的に理解されているものと同じ意味をもつ。
【００１０】
上記に要約されるように、本発明は、異なる化合物の組成物の多数を毒性学的に同時に試験するための、高処理スクリーニング（HTS）法を提供する。本HTSアッセイ法はインビボの毒性学的アッセイ法であり、生きた多細胞生物に対する化合物の影響を測定することを意味するものである。このように、本HTSアッセイ法は、細胞培養を使用するインビトロアッセイ法とは区別される。
【００１１】
本HTSアッセイ法においては、多数の異なる化合物を同時に試験する。より特定的には、多数の異なる化合物の組成物を同時に試験する。異なる化合物の組成物は、少なくとも以下の特性のうち1つにおいて互いに異なる：(a)分子式によって異なる化合物からなる；または(b)同じ分子式の化合物からなるが、化合物が異なる濃度にて存在する。言い換えれば、分子式により異なる化合物からなる、または同じ種類の化合物からなるがこの化合物の濃度に関して異なる、いずれかの場合、任意の2つの与えられた化合物の組成物は異なる。例えば、ある多数の異なる化合物の組成物は、化合物の特定の種類が各々3つの異なる濃度にて存在するため、その多数が12個の異なる化合物の組成物からなるように、分子式によって異なる4つの種類の化合物を含み得る。
【００１２】
同時に試験するということは、多数の各化合物の組成物が実質的に同時に試験されることを意味する。ゆえに、全ての多数の化合物の組成物はそれらの毒性学的影響について並行してアッセイされる。多数の化合物の組成物における、同時に試験される化合物の組成物の数は、典型的には少なくとも約10、ある態様においてはその数は少なくとも約100または少なくとも約1,000となり、試験される化合物の組成物の数はより多くなる可能性がある。一般に、本HTS法において同時に試験される化合物の組成物の数は、約10から10,000、通常約100から10,000および多くの態様においては約1,000から5,000の範囲に渡る。
【００１３】
本方法においては、各個別の化合物の組成物の多数を、毒性について各々アッセイする。多数の非哺乳動物多細胞生物に化合物の組成物を接触させ、多数の生物に対する化合物の組成物（またはその欠乏）の影響を測定することにより、各化合物の組成物をその毒性について個別にアッセイする。本方法において使用される生物は多細胞であるため、分化した組織および器官を含む。それらは比較的小さいことによりさらに特徴付けられ、小さいとは少なくとも約0.001 g、通常少なくとも約0.01 gおよびより一般的には少なくとも約0.1 gであり、各生物の多数の平均質量は、10 gまたはそれ以上であるが、概して約100 gを超えず、通常約1,000 gを超えないことを意味する。本HTS法において使用される多細胞生物はまた、短い世代時間をもつことによっても特徴付けられる。短い世代時間は、生殖コロニーを維持するのに、および、高処理スクリーニングの最低要件である、少なくとも1日当たり平均約100個体の子孫を生産するために、十分多産な、十分量の生物を供給するのに重要である。ショウジョウバエについては、このハエの最小集団は、10〜300個体、通常50〜150個体の範囲に渡る可能性がある。
【００１４】
本方法においては、多くの異なる種類の非哺乳動物多細胞生物が使用でき、これらの生物種は昆虫、両生類、魚類等を含む。関心対象である特定の生物は：アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、線虫、ショウジョウバエ等を含む。多くの態様において関心対象となるものは、無脊椎動物、特に節足動物門の一員、とりわけ昆虫網の一員である。多くの態様において関心対象となるものはハエである。多くの好ましい態様において、ハエはショウジョウバエ（Drosophilidae)）族の一員であり、それはしばしばキイロショウジョウバエ（Drosophila melangaster）である。本発明において使用される多細胞生物は、その一生の任意のステージ、例えば幼虫期、成虫期等にあることが可能である。
【００１５】
ある特定の関心対象の多細胞生物は、例えばその開示が参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第60/125,586号にて説明される、トランスジェニックキイロショウジョウバエのような、成体発症神経変性の表現型をもつ、非哺乳動物のトランスジェニック動物である。その他の特に関心対象の多細胞生物は、細胞増殖性疾患のための、非哺乳動物トランスジェニック動物、例えば、その開示が参照として本明細書に組み入れられる、1999年8月4日に提出された米国特許出願第60/147,433号にて説明されるような、腫瘍性の表現型をもつトランスジェニックキイロショウジョウバエである。その他の関心対象は、非トランスジェニック非哺乳動物である。
【００１６】
本アッセイ法においては、各化合物の組成物は、化合物の組成物の活性作用物質が、集団の個々の生物の全てではなくとも、少なくとも実質的な一部分に対する活性を実行できるような方法で多細胞生物集団と接触させられる。実質的な一部分とは、少なくとも40個体数％、通常少なくとも50個体数％およびより一般には少なくとも60個体数％を意味し、個体数％は実質的により高く、多くの態様においては80、90または95個体数％またはそれ以上であることが可能である。一般に、各化合物の作用物質は、組成物の活性作用物質が生物によって吸収されるような方法にて、集団の一員と接触させられる。典型的には吸収は、各化合物の組成物が一般に、栄養培地、例えば水、付加的な栄養物質の水溶液中の化合物の組成物の生物への取り込みにより、多数の生物と接触するように、摂取、即ち、経口により行われる。例えば、多細胞生物がハエの場合、ハエが培地にて給餌されるように、作用物質をハエ栄養培地に混合し、該培地をハエ（幼虫または成虫ハエのいずれか、通常は幼虫）の存在下に置くことにより、候補作用物質は一般にハエに経口投与させる。
【００１７】
そのように、化合物の組成物は、その生物の生活環における任意の好都合なステージにおいて多細胞生物集団と接触することができる。ゆえに、使用される特定の生物に依存して、例えば幼虫期のような未熟な生活環ステージ、成虫期等において、化合物の組成物を生物と接触する。
【００１８】
本発明に従い、多数の異なる種類の化合物がアッセイできる。本HTS法に従ってアッセイできる化合物は、典型的には有機分子、好ましくは50ダルトンより大きいかつ約2,500ダルトン未満の分子量をもつ小有機化合物であるが、多数の化学物質のクラスを包含する。化合物は一般に、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には少なくとも1つのアミノ基、カルボニル基、水酸基またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも2つの化学的官能基を含む。化合物はしばしば、1つまたはそれ以上の上記の官能基と置換された、炭素環状もしくは複素環状構造および／または芳香族もしくはポリ芳香族構造を含む。関心対象の化合物はまた：ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的類似体またはそれらの組合わせを含む生体分子にも認められるが、これに限定されるものではない。
【００１９】
関心対象の化合物は、合成または天然の化合物ライブラリーを含む、広範な種類の供給源から得られる。例えば、オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの無作為的な発現を含む、広範な種類の有機化合物および生体分子の無作為的および作為的な合成には、多数の手段が使用可能である。または、微生物、真菌類、植物および動物の抽出物の形態における天然化合物のライブラリーが使用可能である、または容易に作製できる。さらに、天然のまたは合成により作製されたライブラリーおよび化合物は、従来的な化学的、物理的、および生化学的手段により容易に改変でき、組合わせライブラリーの作製に使用できる。既知の薬理学的作用物質は、構造的類似体を作製するため、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等のような、作為的または無作為的な化学修飾を受けることができる。新規の、潜在性のある治療的作用物質は、合理的薬剤設計またはコンピューターモデリングのような方法を使用して作製することもできる。
【００２０】
スクリーニングは、既知の薬理学的に活性のある化合物およびその化学的類似体を、または合理的薬剤設計によって作製されるもののような未知の特性をもつ新規の作用物質を目指すことができる。
【００２１】
化合物の組成物と集団との接触に続き、その集団のメンバーに対する化合物の影響を測定する。集団のメンバーに対する化合物の影響は一般に、多くの異なる表現型パラメータの1つまたはそれ以上の評価により測定される。本発明の与えられたHTSアッセイ法において評価される表現型パラメータは、少なくとも部分的には、使用される多細胞生物の性質に依存して大きく変化する可能性がある。典型的には、任意の与えられたアッセイ法において評価される表現型パラメータは、以下の1つまたはそれ以上を含む：(1)生存率；(2)形態学的欠損；および(3)生殖能。評価できる特定のパラメータは以下の1つまたはそれ以上を含む：(1)致死量、例えばLD50、LD10等；(2)成長欠損；(3)生殖不能効果投与量；(4)発生欠損；(5)神経学的障害；(6)寿命の変化、例えば寿命の増長または短縮；等。
【００２２】
本方法において評価できる上記のパラメータに加え、試験生物の遺伝子発現レベルをアッセイできる。例えば処理された幼虫、さなぎ、および／またはハエにおける遺伝子発現レベルを評価できる。遺伝子は基礎的な代謝情報を提供する「ハウスキーピング」遺伝子から、どの種類の組織または細胞が影響され、かつそれはいつかを評価するための、発生のおよび組織特異的な遺伝子までが可能である。アレイに基づくプロトコールを含む、様々な異なる遺伝子発現プロトコールが、以下にて説明されるものを含み、当業者には知られている：その開示が参照として本明細書に組み入れられる、欧州特許第0 328 829 B1号および米国特許第5,468,613号；同5,580,726号；同5,599,672号；同5,512,462号；同5,162,209号および同5,162,209号。差異のある遺伝子発現を解析する方法はまた、マニアティス（Maniatis）ら、「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」、（Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NY）（1989）；「核酸ハイブリダイゼーション、実用アプローチ（Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach）」、（Hames、B.D.、およびHiggins、S.J.編、IRL Press、Oxford）（1985）；国際公開公報第95/21944号；チャリフォー（Chalifour）ら、Anal.Biochem.(1994)216:299〜304；ギュエン（Nguyen）ら、Genomics(1995)29:207〜216；ピエトゥ（Pietu）ら、Genome Res.(1996)6:492〜503；およびジャオ（Zhao）ら、Gene(1995)166:207〜213にも説明されている。
【００２３】
評価される特定の物理的パラメータに対する化合物の影響は、多くの態様において、生物に対する化合物の影響の測定が自動化手順を介して達成されるように、手作業でまたは機械的に測定できる。
【００２４】
表現型パラメータに対する化合物の影響はその後、化合物の毒性に関係づけられる。そのため、毒性プロフィールが与えられた化合物の毒性の活性、即ち、1つまたはそれ以上の、死亡率、生殖不能原因作用活性等のような毒性活性の集積を指すように、アッセイされる化合物についての毒性プロフィールを引き出すために、表現型パラメータに対する影響が使用される。
【００２５】
本方法は、多数の化合物が毒性について同時にアッセイされるHTS法であるため、本発明に係る任意の与えられたHTSスクリーニングは、多数の化合物についての毒性プロフィールを迅速に提供する。本発明に従い、任意の与えられたHTSアッセイ法において毒性プロフィールが迅速に提供される化合物の数は、約20から50,000、通常は約50から10,000、およびより一般には約500から5,000に渡る。毒性プロフィールは迅速に決定されるため、一般に約14日未満で、通常約10日未満で決定される。多くの態様においては、約7日未満またはより短い期間で決定できる。
【００２６】
つまり、上記に説明されるような本発明は、多数の化合物および／またはその異なる濃度についての毒性スクリーニングのための高処理法を提供する。本HTS毒性スクリーニングは、多くの化合物について短期間で毒性データを得ることが望ましい、様々な異なる適用において使用を見出される。多くの態様において特に関心対象となるものは、組合わせ作製された化合物ライブラリーを含む、化合物のライブラリーまたは集積の個々の化合物メンバーについて、インビボの毒性プロフィールを提供するための本方法の使用である。そのように、本HTS毒性学的スクリーニングアッセイ法は、薬剤の探索および開発における適用を含む、多くの適用において使用が見出される。
【００２７】
本HTS法は、候補の治療的作用物質を疾患状態の治療におけるその有効性（および安全性）について評価する、多段階のスクリーニングプロセスの一部となり得る。本発明の多段階のスクリーニングプロセスにおいては、化合物のライブラリーは、本HTSアッセイ法を介したスクリーニングに続き、第二のインビボモデル、例えばマウスモデルにおいて、スクリーニングを受ける。本発明のHTS法を使用するライブラリーの最初のスクリーニングに続き、スクリーニングにより同定された陽性化合物（即ち、許容できない毒性プロフィールをもたない化合物）はその後、トランスジェニック非ヒト哺乳動物モデルを含む、非ヒト哺乳動物モデルにおいてスクリーニングされる。その哺乳動物モデルは一般に特定の標的疾患状態と相関する。さらに、化合物ライブラリーが最初に、特定の疾患状態の治療における治療的作用物質としてのその潜在性についてインビトロスクリーニングアッセイ法を受ける、前インビボスクリーニング段階を使用できる。任意の好都合なインビトロスクリーニングアッセイ法が使用でき、様々な適したインビトロスクリーニングアッセイ法が、例えばHTS細胞培養アッセイ法のように、当業者に既知である。
【００２８】
本HTS毒性スクリーニングアッセイ法はまた、多数の別個の化合物の毒性プロフィールを含む情報のデータベースの作製において使用が見出される。そのように、本発明は、様々な化合物についての毒性プロフィールのデータベースを作製するために使用できる。そのような毒性プロフィールデータベースは典型的に、多くの関連化合物についての、上記に説明されるような毒性プロフィール情報を含む。データベース中の関心対象の化合物は、様々な基準：試験される分子の種類、例えばステロイド、抗生物質、抗腫瘍性作用物質等；化合物の供給源、例えば環境トキシン、特定の動物または細胞、合成または天然の化合物ライブラリーに由来する生物学的に活性のある抽出物等に従って選択および配列できる。
【００２９】
毒性プロフィールおよびそのデータベースは、それらの使用を容易にする様々な媒体において提供できる。「媒体」は本発明の毒性プロフィール情報を含む製品を指す。本発明のデータベースはコンピューター解読可能な媒体、例えばコンピューターにより直接解読およびアクセスできる任意の媒体に記録できる。そのような媒体は、以下を含むが、これに限定されるものではない：フロッピーディスク、ハードディスク保存媒体、および磁気テープのような磁気保存媒体、；CD-ROMのような光学的保存媒体；RAMやROMのような電気的保存媒体；および磁気／光学的保存媒体のような、これらの範疇の混成物。現在知られているコンピューター解読可能な任意の媒体を、本データベース情報の記録を含む製品を作製するためにいかに使用できるかということは、当業者は容易に理解できる。「記録される」は、当技術分野にて知られるような任意の方法を使用して、コンピューター解読可能な媒体上に情報を保存する過程を指す。保存された情報へのアクセスに使用される手段に基づき、任意の好都合なデータ保存構造物を選択できる。保存には、例えばワードプロセッシングテキストファイル、データベースフォーマット等のような、様々なデータプロセッサープログラムおよびフォーマットを使用できる。
【００３０】
本明細書にて使用されるような、「コンピューターに基づくシステム」は、本発明の情報を分析するために使用される、ハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ保存手段を指す。本発明のコンピューターに基づくシステムの最小ハードウェアは、中央処理装置（CPU）、入力手段、出力手段、およびデータ保存手段を含む。近年使用可能なコンピューターに基づくシステムの任意のものが、本発明の使用に適していることは、当業者には容易に理解できる。データ保存手段は、上記にて説明されるような本情報の記録を含む任意の製品、またはそのような製品にアクセスできるメモリーアクセス手段を含み得る。
【００３１】
本発明のコンピューターに基づくシステムにおいて情報を入力および出力するため、入力および出力手段のための様々な構造フォーマットを使用できる。出力手段のためのあるフォーマットは、参照毒性プロフィールに対して様々な程度の類似性をもつ毒性プロフィールを等級付けする。そのような提示は当業者に類似性の等級付けを提供し、および試験毒性プロフィールに含まれる類似性の程度を同定する。
【００３２】
本毒性プロフィールデータベースは多くの異なる適用において使用を見出される。例えば、関心対象の化合物がある場合、その化合物がデータベース中に存在するかどうかを決定するためにデータベースを探索でき、もしあれば、その化合物の毒性プロフィールを容易に同定できる。または、そのプロフィールがデータベース中に存在しない、新規の化合物があるが、その化合物の構造は分かっている場合、同様の構造をもつ同様の化合物についてデータベースを探索でき、外挿法によって関心対象の化合物の毒性に関する情報を得ることができる。また関心対象の化合物と同様の毒性をもつ化合物を同定するため、データベース中にない、ある化合物の新規の毒性プロフィールを、データベース中に存在するプロフィールと比較することもできる。
【００３３】
試験化合物から得られる毒性プロフィールとデータベース中に存在する毒性プロフィール；即ち、参照毒性プロフィールとの比較は、任意の適した演繹プロトコール、AIシステム、統計的比較等により達成される。データベースの探索法は当技術分野においては公知である。例えば、候補データを並行して、標的データを早期の不適合検出メカニズムと連続的に比較して用いる有効性の高い記号列探索アルゴリズムおよび回路を開示する、米国特許第5,060,143号を参照のこと。その他の例としては、その開示が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,720,009号および同5,752,019号を参照のこと。
【００３４】
本発明により提供されるのはまた、化合物ライブラリーをその抗毒性の効果についてスクリーニングする方法、即ち、抗毒素化合物の同定のための高処理法である。そのような方法においては、試験動物集団、例えばハエを、それに対する抗毒素が探索されるようなトキシンにあらかじめ接触させ、または付随的にトキシンと接触させるような、上記に説明される方法に従い、候補抗毒素化合物のライブラリーを活性についてスクリーニングする。多くの態様において特に関心対象となるトキシンは、ヒトおよび例えばハエのような試験動物の両方において毒性であるものである。動物集団は、任意の好都合な方法、例えば、集団に接触させるトキシンの投与量が致死量、例えばLD95である、栄養培地にトキシンを含む方法を用いて、関心対象のトキシンと接触させる。候補抗毒素の試験ライブラリーと動物集団との接触に続いて、生き残る動物個体は、望ましい抗毒素活性をもつ作用物質を内在させた試験化合物を与えられた動物個体を示す。ゆえに、本発明により、抗毒素活性をもつ化合物についての、高処理スクリーニング法もまた提供される。
【００３５】
以下の実施例は、実例を挙げるために提供されるものであり、限定するためのものではない。
【００３６】
実験
I．毒性学のためのハエモデルの確証
ハエモデルが毒性学評価研究に有効である範囲を決定するため、既知の毒性学的プロフィールおよび標的をもつ化学物質を、ハエを用いて評価する。選択される化学物質は実質的な毒性レベルを有さないもの（例えば、食用色素、糖類等）から、非常に毒性が高いものまである。非常に毒性が高いものは3つのクラスに分類できる。一般的に毒性があるもの、細胞、組織、または器官の、ヒトとハエに共通であることが知られる種類に対して毒性があるもの、および細胞、組織、または器官のヒトに特異的な種類に対して毒性があるものである。
【００３７】
A．毒性試験
化学物質をその飽和点に、または飽和点近くになるよう水に溶解する。即時ハエ培地（Fisher Scientific）を再水和する、このストック溶液の連続した希釈を用いる。特定的に、ある毒性アッセイ法は、ある化学物質の純粋なストック溶液で再水和した即時ハエ培地を含み、一方、その他は化学物質の10％（水）溶液で戻す。このフォーマットは、試験される各化学物質について投与量の対数が4〜5の範囲に渡るデータを作成するに使用される。
【００３８】
既知の胚の量、典型的に40〜50個が、入力として使用される。特定的に、40〜50個の胚を計測し、試験される培地／化学物質の混合物を含む容器に配置する。胚は手作業により、または自動的に計測できる（例えば、胚の懸濁液をダイオードを通して流す）。培地／化学物質の混合物上にて幼虫を給餌する。幼虫期から成虫期への成長の全ての局面は、化学物質の存在下で正常に進行しなければならない。幼虫およびハエに使用可能な餌および水の唯一の供給源は、化学物質を含む。容易にアッセイできる化学物質を幼虫に与えることにより、本プロトコールを用いて、摂取量の変動性が予測できることが示される。特定的に、鉄、銅、および亜鉛が選択された。これらの化学物質を100万分の1の濃度まで分析する、感受性の高い、および正確なキットが市販されている。これにより、試験容器中の幼虫間と、異なる容器中の幼虫間の変動性を決定するための定量的解析が行われる。
【００３９】
B．毒性学評価
成長する幼虫およびさなぎを、正常な成長および発達について試験する。その後成虫ハエを死亡率、生殖不能、発達欠損、および寿命の変化について解析する。死亡率は、羽化した成虫ハエ数を容器内に配置した胚の総数で割ることにより決定する。生殖不能は、それらを正常なハエと交配することにより、オスおよびメスの両方について試験する。成虫の身体的検査により、四肢欠損、組織形成欠損、異常共調等のような、目に見える任意の欠損が明らかになる。最終的に、ハエの平均寿命を短くまたは長くする影響が生じたかどうか決定するため、ハエはそれらの自然の寿命で生かされる。
【００４０】
II．アッセイ法
A．毒性スクリーニング
ハエへの投与のための、上記にて説明されたものを含む標準プロトコールを使用して、様々な作用物質を異なる投与量にてマウス、ラットおよびハエに投与し、各作用物質についてのLDを比較した。結果は表1にて提供される。
【表１】
哺乳動物とハエの間で致死量毒性傾向は同様である。
【００４１】
毒性のより低い作用物質から毒性のより高い作用物質への傾向は、ハエと哺乳動物において同様である。毒性の低い作用物質は、マウスおよびラットにおいてはLD50＞1,500 mg/kgを有することにより分類され、これらは0.4 mg（ポリビニルピロリドールについての0.4 mgの投与量が、ハエに投与できる最大投与量であり、このレベルにおいては毒性は認められなかった）より大きな投与量に相応するものであった。一方、中等度の範囲は、マウスまたはラットにおける投与量で150 mg/kg〜1,400 mg/kgのものと定義された。これはハエについての0.15〜0.4のLD50 投与量範囲に相応した。最後に、マウスおよびラットにおける毒性の高い物質は150 mg/kg未満の経口LD50を有した。これはハエにおいて経口投与LD50を誘導する、0.1 mg 投与量またはそれ以下の範囲に相応した。ある孤立値（例外）はメトリホナートであった。この化学物質はマウスおよびラットにおいては中等度の毒性をもつ一方、ハエについては明らかに高い毒性域に属する。最初の高処理スクリーニングとして、このパイロット試験は、マウスおよびラットとの＞90％の毒性評価の一致があることを示唆する。これは未知の化合物の毒性を迅速および正確に評価する潜在性を明らかに表す。
【００４２】
B．抗毒性スクリーニング
ハエにトキシンをEDTAと組合わせて、または組合わせないで与えることにより、抗毒素としてのEDTAの活性を評価した。 結果は表2にて提供される。
【表２】
EDTAはショウジョウバエにおける有効なインビボ抗毒素である。
【００４３】
化学物質EDTAは銅および亜鉛を含む重金属に結合する。この結合はインビトロまたはインビボにて生じ得る。インビボ結合により、重金属の動物に対する毒性の中和を導くことが可能である。しかし、EDTAはカルシウムに結合するため、それ単独である程度の毒性がある。上記の結果は、既知の重金属抗毒素は、動物の抗毒素系において対象物を用いて同定できることを示す。表2において示されるのは亜鉛、銅、およびEDTAのショウジョウバエに対する毒性影響である。表2のデータはまた、ハエは重金属（例えば銅または亜鉛）およびEDTAの両方の存在下で生存できることをも示す。インビボにおいてEDTAからの抗毒素影響が生じるかどうかを確証するため、重金属およびEDTAを2つの、物理的に隔離した餌供給源に加えた。ハエは、毒性影響を中和し、生き残るために、ハエ餌および酵母ペーストから適切な量を摂らなければならなかった。
【００４４】
上記の結果および議論から、本発明が価値のある新規の高処理スクリーニング法を提供することは明らかである。本方法は多細胞生物を使用するため、しばしばヒトにおける活性により高い相関のある、価値のあるインビボ毒性データを提供する。さらに、化合物の、多くの異なる種類の細胞に対する毒性影響を実質的に同時に測定できる。加えて、本HTSアッセイ法は迅速である。したがって、本発明は当技術分野への著しい貢献を表す。
【００４５】
本明細書において引用される全ての刊行物および特許出願は、各個別の刊行物または特許出願が特定的および各々参照として組み入れられると示された如くに、参照として本明細書に組み入れられる。あらゆる刊行物の引用は、出願日に優先したその開示のためであり、先行発明によって本発明がそのような刊行物の日時を先行させる権利を与えられないものであることを承認するものと解釈されるべきではない。
【００４６】
前述の発明は、明らかに理解されるために、その詳細のいくらかを図表や実施例によって説明されているが、当業者には、本発明の開示に照らして、添付する請求項の意図または範囲を逸脱することなく、ある程度の変化や改変が可能であることは明白である。
緒言
発明の分野
本発明の分野は毒性学試験、特に医薬品の研究開発における毒性学試験である。
【０００２】
発明の背景
薬剤の開発プロセスにおいて、潜在的な治療的作用物質または薬剤候補は、少なくとも米国においては、FDAの認可を得、引き続き商業化する以前に、意図された使用についての安全性および有効性の両方を示されなければならない。薬剤の開発プロセスにおいて、潜在的な薬剤候補は、安全性を示す試みにおいて変異原性評価および毒性学評価を受ける。変異原性分析は、微生物（エイムス試験）、ショウジョウバエ（ミュラー5 試験）、および哺乳動物細胞の培養において行われる。しかし、毒性学的分析は哺乳動物細胞培養および動物モデル研究に限られる。この計画においては、候補薬剤の毒性を分析するため、著しい時間および費用の投資が必要とされる。このように、毒性学試験は典型的には、薬剤候補についての有効性評価が好結果であった後に実施される。
【０００３】
高処理薬剤探索法の出現と共に、製薬業界および関連業界においては、薬剤の開発プロセスの毒性学試験の部分を合理化することについて、非常に関心が高まっている。薬剤候補数は年間数十から年間数千へと急増したため、毒性学評価プログラムは薬剤開発プロセスにおける厳しい障害となってきている。
【０００４】
したがって、多くの異なる化合物についての毒性データを迅速に提供できる、新規の高処理スクリーニングアッセイ法の開発には非常に関心が高い。関心対象となるものは、インビボの高処理毒性スクリーニングアッセイ法の開発である。
【０００５】
関連文献
高処理毒性スクリーニングアッセイ法は：ケリー（Kelly）、「HTS毒性学における進歩（Advances in HTS Toxicology）」、 Genetic Engineering News、March 1、1999: 14）」；およびサンソム（Sansome）、Drug Discovery Today(1999) 4:199〜201において議論されている。
【０００６】
発明の概要
高処理毒性学的スクリーニングアッセイ法が提供される。本方法においては、多数の異なる化合物の組成物、通常少なくとも10個の異なる化合物の組成物を同時に、毒性の活性があればそれについてアッセイする。各化合物の組成物の多数を多細胞生物の集団と接触させ、多細胞生物に対する化合物の組成物の影響を測定することにより、毒性についてアッセイする。本高処理スクリーニング（HTS）アッセイ法において使用を見出される多細胞生物は小さく、分化した組織および器官をもち、短い世代時間を有し、多産のものである。本HTS法は様々な適用において使用を見出され、特に、組合わせて作製された化合物ライブラリーのような、多数の化合物の毒性学的スクリーニングにおける使用に適している。
【０００７】
特定の態様の説明
高処理毒性学的スクリーニング法が提供される。本方法においては、少なくとも10個の異なる化合物の組成物が同時に試験される。多数の非哺乳動物多細胞生物、例えば約10から1,000個体と接触させ、その生物に対する化合物の組成物の影響を測定することにより、各化合物の組成物が試験される。本方法において使用される多細胞生物は小さく、分化した組織および器官をもち、短い世代時間を有し、多産のものである。本高処理スクリーニング法は様々な適用において使用を見出され、特に、組合わせて作製された化合物ライブラリーのような化合物ライブラリーの毒性学的スクリーニングにおける使用に適している。
【０００８】
本発明をさらに説明する前に、本発明は以下に説明される発明の特定の態様に限定されるものではなく、特定の態様の多様化は可能であり、なおも添付される請求項の範囲内であると理解されるべきである。使用される用語は特定の態様を説明するためのものであり、限定を意図するものではないこともまた理解されるべきである。代わりに、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲により確立される。
【０００９】
本明細書および添付される特許請求の範囲において、単数形の「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈中明らかに他の指示がない限り、複数形の指示物をも含む。他に定義されない限り、本明細書にて使用される全ての技術用語および科学的用語は、本発明の属する当技術分野における当業者に一般的に理解されているものと同じ意味をもつ。
【００１０】
上記に要約されるように、本発明は、異なる化合物の組成物の多数を毒性学的に同時に試験するための、高処理スクリーニング（HTS）法を提供する。本HTSアッセイ法はインビボの毒性学的アッセイ法であり、生きた多細胞生物に対する化合物の影響を測定することを意味するものである。このように、本HTSアッセイ法は、細胞培養を使用するインビトロアッセイ法とは区別される。
【００１１】
本HTSアッセイ法においては、多数の異なる化合物を同時に試験する。より特定的には、多数の異なる化合物の組成物を同時に試験する。異なる化合物の組成物は、少なくとも以下の特性のうち1つにおいて互いに異なる：(a)分子式によって異なる化合物からなる；または(b)同じ分子式の化合物からなるが、化合物が異なる濃度にて存在する。言い換えれば、分子式により異なる化合物からなる、または同じ種類の化合物からなるがこの化合物の濃度に関して異なる、いずれかの場合、任意の2つの与えられた化合物の組成物は異なる。例えば、ある多数の異なる化合物の組成物は、化合物の特定の種類が各々3つの異なる濃度にて存在するため、その多数が12個の異なる化合物の組成物からなるように、分子式によって異なる4つの種類の化合物を含み得る。
【００１２】
同時に試験するということは、多数の各化合物の組成物が実質的に同時に試験されることを意味する。ゆえに、全ての多数の化合物の組成物はそれらの毒性学的影響について並行してアッセイされる。多数の化合物の組成物における、同時に試験される化合物の組成物の数は、典型的には少なくとも約10、ある態様においてはその数は少なくとも約100または少なくとも約1,000となり、試験される化合物の組成物の数はより多くなる可能性がある。一般に、本HTS法において同時に試験される化合物の組成物の数は、約10から10,000、通常約100から10,000および多くの態様においては約1,000から5,000の範囲に渡る。
【００１３】
本方法においては、各個別の化合物の組成物の多数を、毒性について各々アッセイする。多数の非哺乳動物多細胞生物に化合物の組成物を接触させ、多数の生物に対する化合物の組成物（またはその欠乏）の影響を測定することにより、各化合物の組成物をその毒性について個別にアッセイする。本方法において使用される生物は多細胞であるため、分化した組織および器官を含む。それらは比較的小さいことによりさらに特徴付けられ、小さいとは少なくとも約0.001 g、通常少なくとも約0.01 gおよびより一般的には少なくとも約0.1 gであり、各生物の多数の平均質量は、10 gまたはそれ以上であるが、概して約100 gを超えず、通常約1,000 gを超えないことを意味する。本HTS法において使用される多細胞生物はまた、短い世代時間をもつことによっても特徴付けられる。短い世代時間は、生殖コロニーを維持するのに、および、高処理スクリーニングの最低要件である、少なくとも1日当たり平均約100個体の子孫を生産するために、十分多産な、十分量の生物を供給するのに重要である。ショウジョウバエについては、このハエの最小集団は、10〜300個体、通常50〜150個体の範囲に渡る可能性がある。
【００１４】
本方法においては、多くの異なる種類の非哺乳動物多細胞生物が使用でき、これらの生物種は昆虫、両生類、魚類等を含む。関心対象である特定の生物は：アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、線虫、ショウジョウバエ等を含む。多くの態様において関心対象となるものは、無脊椎動物、特に節足動物門の一員、とりわけ昆虫網の一員である。多くの態様において関心対象となるものはハエである。多くの好ましい態様において、ハエはショウジョウバエ（Drosophilidae)）族の一員であり、それはしばしばキイロショウジョウバエ（Drosophila melangaster）である。本発明において使用される多細胞生物は、その一生の任意のステージ、例えば幼虫期、成虫期等にあることが可能である。
【００１５】
ある特定の関心対象の多細胞生物は、例えばその開示が参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第60/125,586号にて説明される、トランスジェニックキイロショウジョウバエのような、成体発症神経変性の表現型をもつ、非哺乳動物のトランスジェニック動物である。その他の特に関心対象の多細胞生物は、細胞増殖性疾患のための、非哺乳動物トランスジェニック動物、例えば、その開示が参照として本明細書に組み入れられる、1999年8月4日に提出された米国特許出願第60/147,433号にて説明されるような、腫瘍性の表現型をもつトランスジェニックキイロショウジョウバエである。その他の関心対象は、非トランスジェニック非哺乳動物である。
【００１６】
本アッセイ法においては、各化合物の組成物は、化合物の組成物の活性作用物質が、集団の個々の生物の全てではなくとも、少なくとも実質的な一部分に対する活性を実行できるような方法で多細胞生物集団と接触させられる。実質的な一部分とは、少なくとも40個体数％、通常少なくとも50個体数％およびより一般には少なくとも60個体数％を意味し、個体数％は実質的により高く、多くの態様においては80、90または95個体数％またはそれ以上であることが可能である。一般に、各化合物の作用物質は、組成物の活性作用物質が生物によって吸収されるような方法にて、集団の一員と接触させられる。典型的には吸収は、各化合物の組成物が一般に、栄養培地、例えば水、付加的な栄養物質の水溶液中の化合物の組成物の生物への取り込みにより、多数の生物と接触するように、摂取、即ち、経口により行われる。例えば、多細胞生物がハエの場合、ハエが培地にて給餌されるように、作用物質をハエ栄養培地に混合し、該培地をハエ（幼虫または成虫ハエのいずれか、通常は幼虫）の存在下に置くことにより、候補作用物質は一般にハエに経口投与させる。
【００１７】
そのように、化合物の組成物は、その生物の生活環における任意の好都合なステージにおいて多細胞生物集団と接触することができる。ゆえに、使用される特定の生物に依存して、例えば幼虫期のような未熟な生活環ステージ、成虫期等において、化合物の組成物を生物と接触する。
【００１８】
本発明に従い、多数の異なる種類の化合物がアッセイできる。本HTS法に従ってアッセイできる化合物は、典型的には有機分子、好ましくは50ダルトンより大きいかつ約2,500ダルトン未満の分子量をもつ小有機化合物であるが、多数の化学物質のクラスを包含する。化合物は一般に、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には少なくとも1つのアミノ基、カルボニル基、水酸基またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも2つの化学的官能基を含む。化合物はしばしば、1つまたはそれ以上の上記の官能基と置換された、炭素環状もしくは複素環状構造および／または芳香族もしくはポリ芳香族構造を含む。関心対象の化合物はまた：ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的類似体またはそれらの組合わせを含む生体分子にも認められるが、これに限定されるものではない。
【００１９】
関心対象の化合物は、合成または天然の化合物ライブラリーを含む、広範な種類の供給源から得られる。例えば、オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの無作為的な発現を含む、広範な種類の有機化合物および生体分子の無作為的および作為的な合成には、多数の手段が使用可能である。または、微生物、真菌類、植物および動物の抽出物の形態における天然化合物のライブラリーが使用可能である、または容易に作製できる。さらに、天然のまたは合成により作製されたライブラリーおよび化合物は、従来的な化学的、物理的、および生化学的手段により容易に改変でき、組合わせライブラリーの作製に使用できる。既知の薬理学的作用物質は、構造的類似体を作製するため、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等のような、作為的または無作為的な化学修飾を受けることができる。新規の、潜在性のある治療的作用物質は、合理的薬剤設計またはコンピューターモデリングのような方法を使用して作製することもできる。
【００２０】
スクリーニングは、既知の薬理学的に活性のある化合物およびその化学的類似体を、または合理的薬剤設計によって作製されるもののような未知の特性をもつ新規の作用物質を目指すことができる。
【００２１】
化合物の組成物と集団との接触に続き、その集団のメンバーに対する化合物の影響を測定する。集団のメンバーに対する化合物の影響は一般に、多くの異なる表現型パラメータの1つまたはそれ以上の評価により測定される。本発明の与えられたHTSアッセイ法において評価される表現型パラメータは、少なくとも部分的には、使用される多細胞生物の性質に依存して大きく変化する可能性がある。典型的には、任意の与えられたアッセイ法において評価される表現型パラメータは、以下の1つまたはそれ以上を含む：(1)生存率；(2)形態学的欠損；および(3)生殖能。評価できる特定のパラメータは以下の1つまたはそれ以上を含む：(1)致死量、例えばLD50、LD10等；(2)成長欠損；(3)生殖不能効果投与量；(4)発生欠損；(5)神経学的障害；(6)寿命の変化、例えば寿命の増長または短縮；等。
【００２２】
本方法において評価できる上記のパラメータに加え、試験生物の遺伝子発現レベルをアッセイできる。例えば処理された幼虫、さなぎ、および／またはハエにおける遺伝子発現レベルを評価できる。遺伝子は基礎的な代謝情報を提供する「ハウスキーピング」遺伝子から、どの種類の組織または細胞が影響され、かつそれはいつかを評価するための、発生のおよび組織特異的な遺伝子までが可能である。アレイに基づくプロトコールを含む、様々な異なる遺伝子発現プロトコールが、以下にて説明されるものを含み、当業者には知られている：その開示が参照として本明細書に組み入れられる、欧州特許第0 328 829 B1号および米国特許第5,468,613号；同5,580,726号；同5,599,672号；同5,512,462号；同5,162,209号および同5,162,209号。差異のある遺伝子発現を解析する方法はまた、マニアティス（Maniatis）ら、「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」、（Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NY）（1989）；「核酸ハイブリダイゼーション、実用アプローチ（Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach）」、（Hames、B.D.、およびHiggins、S.J.編、IRL Press、Oxford）（1985）；国際公開公報第95/21944号；チャリフォー（Chalifour）ら、Anal.Biochem.(1994)216:299〜304；ギュエン（Nguyen）ら、Genomics(1995)29:207〜216；ピエトゥ（Pietu）ら、Genome Res.(1996)6:492〜503；およびジャオ（Zhao）ら、Gene(1995)166:207〜213にも説明されている。
【００２３】
評価される特定の物理的パラメータに対する化合物の影響は、多くの態様において、生物に対する化合物の影響の測定が自動化手順を介して達成されるように、手作業でまたは機械的に測定できる。
【００２４】
表現型パラメータに対する化合物の影響はその後、化合物の毒性に関係づけられる。そのため、毒性プロフィールが与えられた化合物の毒性の活性、即ち、1つまたはそれ以上の、死亡率、生殖不能原因作用活性等のような毒性活性の集積を指すように、アッセイされる化合物についての毒性プロフィールを引き出すために、表現型パラメータに対する影響が使用される。
【００２５】
本方法は、多数の化合物が毒性について同時にアッセイされるHTS法であるため、本発明に係る任意の与えられたHTSスクリーニングは、多数の化合物についての毒性プロフィールを迅速に提供する。本発明に従い、任意の与えられたHTSアッセイ法において毒性プロフィールが迅速に提供される化合物の数は、約20から50,000、通常は約50から10,000、およびより一般には約500から5,000に渡る。毒性プロフィールは迅速に決定されるため、一般に約14日未満で、通常約10日未満で決定される。多くの態様においては、約7日未満またはより短い期間で決定できる。
【００２６】
つまり、上記に説明されるような本発明は、多数の化合物および／またはその異なる濃度についての毒性スクリーニングのための高処理法を提供する。本HTS毒性スクリーニングは、多くの化合物について短期間で毒性データを得ることが望ましい、様々な異なる適用において使用を見出される。多くの態様において特に関心対象となるものは、組合わせ作製された化合物ライブラリーを含む、化合物のライブラリーまたは集積の個々の化合物メンバーについて、インビボの毒性プロフィールを提供するための本方法の使用である。そのように、本HTS毒性学的スクリーニングアッセイ法は、薬剤の探索および開発における適用を含む、多くの適用において使用が見出される。
【００２７】
本HTS法は、候補の治療的作用物質を疾患状態の治療におけるその有効性（および安全性）について評価する、多段階のスクリーニングプロセスの一部となり得る。本発明の多段階のスクリーニングプロセスにおいては、化合物のライブラリーは、本HTSアッセイ法を介したスクリーニングに続き、第二のインビボモデル、例えばマウスモデルにおいて、スクリーニングを受ける。本発明のHTS法を使用するライブラリーの最初のスクリーニングに続き、スクリーニングにより同定された陽性化合物（即ち、許容できない毒性プロフィールをもたない化合物）はその後、トランスジェニック非ヒト哺乳動物モデルを含む、非ヒト哺乳動物モデルにおいてスクリーニングされる。その哺乳動物モデルは一般に特定の標的疾患状態と相関する。さらに、化合物ライブラリーが最初に、特定の疾患状態の治療における治療的作用物質としてのその潜在性についてインビトロスクリーニングアッセイ法を受ける、前インビボスクリーニング段階を使用できる。任意の好都合なインビトロスクリーニングアッセイ法が使用でき、様々な適したインビトロスクリーニングアッセイ法が、例えばHTS細胞培養アッセイ法のように、当業者に既知である。
【００２８】
本HTS毒性スクリーニングアッセイ法はまた、多数の別個の化合物の毒性プロフィールを含む情報のデータベースの作製において使用が見出される。そのように、本発明は、様々な化合物についての毒性プロフィールのデータベースを作製するために使用できる。そのような毒性プロフィールデータベースは典型的に、多くの関連化合物についての、上記に説明されるような毒性プロフィール情報を含む。データベース中の関心対象の化合物は、様々な基準：試験される分子の種類、例えばステロイド、抗生物質、抗腫瘍性作用物質等；化合物の供給源、例えば環境トキシン、特定の動物または細胞、合成または天然の化合物ライブラリーに由来する生物学的に活性のある抽出物等に従って選択および配列できる。
【００２９】
毒性プロフィールおよびそのデータベースは、それらの使用を容易にする様々な媒体において提供できる。「媒体」は本発明の毒性プロフィール情報を含む製品を指す。本発明のデータベースはコンピューター解読可能な媒体、例えばコンピューターにより直接解読およびアクセスできる任意の媒体に記録できる。そのような媒体は、以下を含むが、これに限定されるものではない：フロッピーディスク、ハードディスク保存媒体、および磁気テープのような磁気保存媒体、；CD-ROMのような光学的保存媒体；RAMやROMのような電気的保存媒体；および磁気／光学的保存媒体のような、これらの範疇の混成物。現在知られているコンピューター解読可能な任意の媒体を、本データベース情報の記録を含む製品を作製するためにいかに使用できるかということは、当業者は容易に理解できる。「記録される」は、当技術分野にて知られるような任意の方法を使用して、コンピューター解読可能な媒体上に情報を保存する過程を指す。保存された情報へのアクセスに使用される手段に基づき、任意の好都合なデータ保存構造物を選択できる。保存には、例えばワードプロセッシングテキストファイル、データベースフォーマット等のような、様々なデータプロセッサープログラムおよびフォーマットを使用できる。
【００３０】
本明細書にて使用されるような、「コンピューターに基づくシステム」は、本発明の情報を分析するために使用される、ハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ保存手段を指す。本発明のコンピューターに基づくシステムの最小ハードウェアは、中央処理装置（CPU）、入力手段、出力手段、およびデータ保存手段を含む。近年使用可能なコンピューターに基づくシステムの任意のものが、本発明の使用に適していることは、当業者には容易に理解できる。データ保存手段は、上記にて説明されるような本情報の記録を含む任意の製品、またはそのような製品にアクセスできるメモリーアクセス手段を含み得る。
【００３１】
本発明のコンピューターに基づくシステムにおいて情報を入力および出力するため、入力および出力手段のための様々な構造フォーマットを使用できる。出力手段のためのあるフォーマットは、参照毒性プロフィールに対して様々な程度の類似性をもつ毒性プロフィールを等級付けする。そのような提示は当業者に類似性の等級付けを提供し、および試験毒性プロフィールに含まれる類似性の程度を同定する。
【００３２】
本毒性プロフィールデータベースは多くの異なる適用において使用を見出される。例えば、関心対象の化合物がある場合、その化合物がデータベース中に存在するかどうかを決定するためにデータベースを探索でき、もしあれば、その化合物の毒性プロフィールを容易に同定できる。または、そのプロフィールがデータベース中に存在しない、新規の化合物があるが、その化合物の構造は分かっている場合、同様の構造をもつ同様の化合物についてデータベースを探索でき、外挿法によって関心対象の化合物の毒性に関する情報を得ることができる。また関心対象の化合物と同様の毒性をもつ化合物を同定するため、データベース中にない、ある化合物の新規の毒性プロフィールを、データベース中に存在するプロフィールと比較することもできる。
【００３３】
試験化合物から得られる毒性プロフィールとデータベース中に存在する毒性プロフィール；即ち、参照毒性プロフィールとの比較は、任意の適した演繹プロトコール、AIシステム、統計的比較等により達成される。データベースの探索法は当技術分野においては公知である。例えば、候補データを並行して、標的データを早期の不適合検出メカニズムと連続的に比較して用いる有効性の高い記号列探索アルゴリズムおよび回路を開示する、米国特許第5,060,143号を参照のこと。その他の例としては、その開示が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,720,009号および同5,752,019号を参照のこと。
【００３４】
本発明により提供されるのはまた、化合物ライブラリーをその抗毒性の効果についてスクリーニングする方法、即ち、抗毒素化合物の同定のための高処理法である。そのような方法においては、試験動物集団、例えばハエを、それに対する抗毒素が探索されるようなトキシンにあらかじめ接触させ、または付随的にトキシンと接触させるような、上記に説明される方法に従い、候補抗毒素化合物のライブラリーを活性についてスクリーニングする。多くの態様において特に関心対象となるトキシンは、ヒトおよび例えばハエのような試験動物の両方において毒性であるものである。動物集団は、任意の好都合な方法、例えば、集団に接触させるトキシンの投与量が致死量、例えばLD95である、栄養培地にトキシンを含む方法を用いて、関心対象のトキシンと接触させる。候補抗毒素の試験ライブラリーと動物集団との接触に続いて、生き残る動物個体は、望ましい抗毒素活性をもつ作用物質を内在させた試験化合物を与えられた動物個体を示す。ゆえに、本発明により、抗毒素活性をもつ化合物についての、高処理スクリーニング法もまた提供される。
【００３５】
以下の実施例は、実例を挙げるために提供されるものであり、限定するためのものではない。
【００３６】
実験
I．毒性学のためのハエモデルの確証
ハエモデルが毒性学評価研究に有効である範囲を決定するため、既知の毒性学的プロフィールおよび標的をもつ化学物質を、ハエを用いて評価する。選択される化学物質は実質的な毒性レベルを有さないもの（例えば、食用色素、糖類等）から、非常に毒性が高いものまである。非常に毒性が高いものは3つのクラスに分類できる。一般的に毒性があるもの、細胞、組織、または器官の、ヒトとハエに共通であることが知られる種類に対して毒性があるもの、および細胞、組織、または器官のヒトに特異的な種類に対して毒性があるものである。
【００３７】
A．毒性試験
化学物質をその飽和点に、または飽和点近くになるよう水に溶解する。即時ハエ培地（Fisher Scientific）を再水和する、このストック溶液の連続した希釈を用いる。特定的に、ある毒性アッセイ法は、ある化学物質の純粋なストック溶液で再水和した即時ハエ培地を含み、一方、その他は化学物質の10％（水）溶液で戻す。このフォーマットは、試験される各化学物質について投与量の対数が4〜5の範囲に渡るデータを作成するに使用される。
【００３８】
既知の胚の量、典型的に40〜50個が、入力として使用される。特定的に、40〜50個の胚を計測し、試験される培地／化学物質の混合物を含む容器に配置する。胚は手作業により、または自動的に計測できる（例えば、胚の懸濁液をダイオードを通して流す）。培地／化学物質の混合物上にて幼虫を給餌する。幼虫期から成虫期への成長の全ての局面は、化学物質の存在下で正常に進行しなければならない。幼虫およびハエに使用可能な餌および水の唯一の供給源は、化学物質を含む。容易にアッセイできる化学物質を幼虫に与えることにより、本プロトコールを用いて、摂取量の変動性が予測できることが示される。特定的に、鉄、銅、および亜鉛が選択された。これらの化学物質を100万分の1の濃度まで分析する、感受性の高い、および正確なキットが市販されている。これにより、試験容器中の幼虫間と、異なる容器中の幼虫間の変動性を決定するための定量的解析が行われる。
【００３９】
B．毒性学評価
成長する幼虫およびさなぎを、正常な成長および発達について試験する。その後成虫ハエを死亡率、生殖不能、発達欠損、および寿命の変化について解析する。死亡率は、羽化した成虫ハエ数を容器内に配置した胚の総数で割ることにより決定する。生殖不能は、それらを正常なハエと交配することにより、オスおよびメスの両方について試験する。成虫の身体的検査により、四肢欠損、組織形成欠損、異常共調等のような、目に見える任意の欠損が明らかになる。最終的に、ハエの平均寿命を短くまたは長くする影響が生じたかどうか決定するため、ハエはそれらの自然の寿命で生かされる。
【００４０】
II．アッセイ法
A．毒性スクリーニング
ハエへの投与のための、上記にて説明されたものを含む標準プロトコールを使用して、様々な作用物質を異なる投与量にてマウス、ラットおよびハエに投与し、各作用物質についてのLDを比較した。結果は表1にて提供される。
【表１】
哺乳動物とハエの間で致死量毒性傾向は同様である。
毒性のより低い作用物質から毒性のより高い作用物質への傾向は、ハエと哺乳動物において同様である。毒性の低い作用物質は、マウスおよびラットにおいてはLD50＞1,500 mg/kgを有することにより分類され、これらは0.4 mg（ポリビニルピロリドールについての0.4 mgの投与量が、ハエに投与できる最大投与量であり、このレベルにおいては毒性は認められなかった）より大きな投与量に相応するものであった。一方、中等度の範囲は、マウスまたはラットにおける投与量で150 mg/kg〜1,400 mg/kgのものと定義された。これはハエについての0.15〜0.4のLD50 投与量範囲に相応した。最後に、マウスおよびラットにおける毒性の高い物質は150 mg/kg未満の経口LD50を有した。これはハエにおいて経口投与LD50を誘導する、0.1 mg 投与量またはそれ以下の範囲に相応した。ある孤立値（例外）はメトリホナートであった。この化学物質はマウスおよびラットにおいては中等度の毒性をもつ一方、ハエについては明らかに高い毒性域に属する。最初の高処理スクリーニングとして、このパイロット試験は、マウスおよびラットとの＞90％の毒性評価の一致があることを示唆する。これは未知の化合物の毒性を迅速および正確に評価する潜在性を明らかに表す。
【００４２】
B．抗毒性スクリーニング
ハエにトキシンをEDTAと組合わせて、または組合わせないで与えることにより、抗毒素としてのEDTAの活性を評価した。 結果は表2にて提供される。
【表２】
EDTAはショウジョウバエにおける有効なインビボ抗毒素である。
化学物質EDTAは銅および亜鉛を含む重金属に結合する。この結合はインビトロまたはインビボにて生じ得る。インビボ結合により、重金属の動物に対する毒性の中和を導くことが可能である。しかし、EDTAはカルシウムに結合するため、それ単独である程度の毒性がある。上記の結果は、既知の重金属抗毒素は、動物の抗毒素系において対象物を用いて同定できることを示す。表2において示されるのは亜鉛、銅、およびEDTAのショウジョウバエに対する毒性影響である。表2のデータはまた、ハエは重金属（例えば銅または亜鉛）およびEDTAの両方の存在下で生存できることをも示す。インビボにおいてEDTAからの抗毒素影響が生じるかどうかを確証するため、重金属およびEDTAを2つの、物理的に隔離した餌供給源に加えた。ハエは、毒性影響を中和し、生き残るために、ハエ餌および酵母ペーストから適切な量を摂らなければならなかった。
【００４４】
上記の結果および議論から、本発明が価値のある新規の高処理スクリーニング法を提供することは明らかである。本方法は多細胞生物を使用するため、しばしばヒトにおける活性により高い相関のある、価値のあるインビボ毒性データを提供する。さらに、化合物の、多くの異なる種類の細胞に対する毒性影響を実質的に同時に測定できる。加えて、本HTSアッセイ法は迅速である。したがって、本発明は当技術分野への著しい貢献を表す。
【００４５】
本明細書において引用される全ての刊行物および特許出願は、各個別の刊行物または特許出願が特定的および各々参照として組み入れられると示された如くに、参照として本明細書に組み入れられる。あらゆる刊行物の引用は、出願日に優先したその開示のためであり、先行発明によって本発明がそのような刊行物の日時を先行させる権利を与えられないものであることを承認するものと解釈されるべきではない。
【００４６】
前述の発明は、明らかに理解されるために、その詳細のいくらかを図表や実施例によって説明されているが、当業者には、本発明の開示に照らして、添付する請求項の意図または範囲を逸脱することなく、ある程度の変化や改変が可能であることは明白である。
Claims (22)
- 少なくとも10個の異なる化合物の組成物が毒性について同時にアッセイされる、高処理毒性学的スクリーニング法であって、以下を含む方法：
少なくとも10個の異なる化合物の組成物を毒性について同時にアッセイし、以下により、少なくとも10個の異なる化合物の組成物の各々が毒性についてアッセイされる段階：
(a) 該化合物の組成物を多数の非哺乳動物多細胞生物に接触させる段階；および
(b) ラットまたはマウスから選択された哺乳動物生物に対する該化合物の組成物の影響を評価するために、非哺乳動物多細胞生物に対する該化合物の組成物の影響を測定する段階。 - 多数の非哺乳動物多細胞生物が10から1,000の範囲に渡る、請求項1記載のスクリーニング法。
- 多数の非哺乳動物多細胞生物のそれぞれの生物が、１日当たり平均少なくとも１００個体の子孫を生産する生物である、請求項1記載のスクリーニング法。
- 多数の非哺乳動物多細胞生物のそれぞれの生物の平均質量が1,000gを越えない、請求項1記載のスクリーニング法。
- 非哺乳動物多細胞生物が分化した器官および組織の存在により特徴付けられる、請求項1記載のスクリーニング法。
- 少なくとも10個の異なる化合物の組成物が毒性について同時にアッセイされる、高処理毒性学的スクリーニング法であって、以下を含む方法：
少なくとも10個の異なる化合物の組成物を毒性について同時にアッセイし、以下により、少なくとも10個の異なる化合物の組成物の各々が毒性についてアッセイされる段階：
(a) 化合物の組成物を、多数の非哺乳動物多細胞生物と接触させる段階；および
(b) 非哺乳動物多細胞生物に対する該化合物の組成物の影響を測定する段階であって、それぞれの該化合物の組成物は既知の薬理学的活性化合物、その化学的類似体、および新規候補薬理学的作用物質からなる群より選択される、段階。 - 少なくとも1日当たり100個体の子孫を生産することにより、集団が特徴付けられる、請求項6記載の方法。
- 少なくとも100個の化合物の組成物が同時に試験される、請求項6記載の方法。
- 少なくとも1,000個の化合物の組成物が同時に試験される、請求項6記載の方法。
- 多細胞生物が昆虫である、請求項6記載の方法。
- 昆虫がハエである、請求項10記載の方法。
- 少なくとも10個の異なる候補抗毒素化合物の組成物が同時に抗毒素活性についてアッセイされる、高処理抗毒素スクリーニング法であって、以下を含む方法：
少なくとも10個の異なる候補抗毒素化合物の組成物を同時に抗毒素活性についてアッセイする段階であって、ここで、該少なくとも10個の異なる候補抗毒素化合物の組成物は、これらが分子式によって異なる化合物で構成されるという点で互いに異なり、かつ、以下により、少なくとも10個の異なる候補抗毒素化合物の組成物の各々が抗毒素活性についてアッセイされる段階：
(a) 候補化合物の組成物を、トキシンに接触させた、１日当たり平均少なくとも１００個体の子孫を生産し、分化した器官および組織を有する、10〜1,000個体の平均質量が1,000gを越えない非哺乳動物多細胞生物からなる集団と接触させる段階；および
(b) 非哺乳動物多細胞生物に対する、化合物の組成物の影響を測定する段階。 - 少なくとも1日当たり100個体の子孫を生産することにより、集団が特徴付けられる、請求項12記載の方法。
- 少なくとも100個の候補化合物の組成物が同時に試験される、請求項12記載の方法。
- 少なくとも1,000個の候補化合物の組成物が同時に試験される、請求項12記載の方法。
- 多細胞生物が昆虫である、請求項12記載の方法。
- 毒性プロフィールのデータベースであって、多数の化合物についての多数の毒性プロフィールを含むデータベースを作成する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 多数の化合物についての多数の毒性プロフィールを含むデータベースを作成する段階をさらに含む、請求項12記載の方法。
- データベースがコンピューター解読可能な媒体上で作成される、請求項17記載の方法。
- データベースが少なくとも10個の異なる毒性プロフィールを含む、請求項17記載の方法。
- 該少なくとも10個の異なる化合物の組成物が最初に、特定の疾患状態の治療における治療的作用物質としての潜在的用途についてインビトロスクリーニングアッセイ法を受ける、前インビボスクリーニング段階をさらに含む、請求項1項記載の方法。
- 該多数の非哺乳動物多細胞生物が、１日当たり平均少なくとも100個体の子孫を生産し、分化した器官および組織をもつ、10〜1,000個体の平均質量が1,000gを越えない非哺乳動物多細胞生物からなる集団を含む、請求項6記載の方法。
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