JP4943336B2 - キメラのコイルドコイル(二重コイル)分子を使用する方法 - Google Patents
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Description
Yancopoulos et al.2000年、Nature 407;242-248 Koh et al.2002年、Exp MoI Med.34;1-11 Kim et al., Oncogene, 2000 14;4549-4552 Lee et al., FASEB J.18;1200-1208 Saharinen et al., 2005, J Cell Biol. 169;239-243 Suri et al., 1998, Science. 282;468-471 Thurston et al., 1999, Science. 286:251 1-2514 Shyu et al., 1998, Circulation. 98:2081-2087 Chae et al., 2000, Arterioscler Thromb Vase Biol. 20:2573-2578 Zhou et al., 2004, J Am Coll Cardiol. 44:897-903 Cho et al., PNAS 101:5547-5552, 2004 Cho et al., PNAS 101:5553-5558,2004
キメラの構成GCN-Ang1、MAT-Ang1またはCOMP-Ang1が作られたことにふれる時、Ang1部分は、Ang1のフィブリノーゲン領域であることを示す。さらに、MAT-Ang1も、また時として、図におけるCMP-Ang1、CMP-Ang1/FD、またはCMP/CC-Ang1/FDを指す。出願人は、Ang1、COMP-Ang1のキメラの形態を発見し、天然タンパク質以上の可能性のある長所を持つことを見出した。天然のAng1生成は困難であり、および精製されたタンパク質の活性は、恐らく多量体形成するその傾向により様々である。ロータリーシャドウイングTEMにより、自然のAnglの我々の構造分析によると、自然のAng1は変わりやすい大きさの多量体として存在することが示された。マトリックス・タンパク質の短いコイルドコイル領域を使用して、我々は、最初に三量体および五量体Ang1を生成するつもりだったが、興味深いことに、MAT-Ang1およびCOMP-Ang1は、追加のオリゴマーを産出した。しかしながらMAT-Ang1およびCOMP-Ang1は精製するのが簡単で、天然のAng1に比べより可溶である。顕著に、COMP-Ang1は天然のAng1より、およそ3-5倍強力である。理論によって制限されることなく、なぜCOMP-Ang1が、Tie2およびAkt燐酸化に対する最も強力な効果を生んだかには、2つの可能な理由がある。先ず最初に、COMP-Ang1は、その迅速な会合および解離割合のため、変異体の中で、最も生物学的に活性となりえる。二番目に、COMP-Ang1は、内皮の小窩のTie2クラスタリングを他の組換えAng1タンパク質に比べ、より効率的に誘導する。我々のデータは、Tie2分子が内皮の小窩に局地化されることを示す。したがって、小窩(caveolae)のクラスタリング(clustering)Tie2に一層よく適したオリゴマーの構造を持つ工学的に作られたAng1タンパク質は、よりよくTie2多量体化および燐酸化を促進する。
COMP-Ang1は、生成の効率、性能、生体内でのTie2活性化、血管形成、および生体内の内皮損傷に対する保護を含むいくつかの様式で、天然のAng1より優れている(Cho et al., PNAS 101 : 5547-5552, 2004 ; Cho et al., PNAS 101 : 5553-5558, 2004 ; 米国特許出願No.10/273,180およびPCT/IB03/03814)。血管漏出の予防、敗血症誘導の内皮細胞傷に対する保護、血管形成術後の再内皮化の増強、およびTie2陽性の内皮の前駆幹細胞の生体外の増幅への応用は可能性があるように思える。結論として、我々は可溶で、凝集せず、強力で、安定しているキメラのAngl変異体、COMP-Ang1を設計し創製した (Cho et al., PNAS 101 : 5547-5552, 2004 ; Cho et al., PNAS 101 : 5553-5558, 2004 ; 米国特許出願No.10/273,180およびPCT/IB03/03814、WO03/106501) 。それは、治療的な血管形成および内皮細胞保護を含む臨床治療に役立てることができる。
αらせんのコイルドコイルは、恐らくタンパク質で見つかった最も広範囲のサブユニット・オリゴマー化モチーフである。従って、コイルドコイルは様々な異なる機能を果たす。転写活性化因子のいくつかのファミリーでは、例えば、短いロイシンジッパーは、DNAのDNA結合領域の位置取りにおいて重要な役割を果たす(Ellenberger et al., 1992, Cell 71 : 1223-1237)。 コイルドコイルは、また、中間的フィラメントタンパク質のオリゴマーを形成するために使用される。コイルドコイル・タンパク質は、更に、小胞およびウイルスの膜融合の両方に重要な役割を果たすように見える(Skehel and Wiley, 1998, Cell 95 : 871-874) 。両方の場合は、融合される薄膜に埋め込まれていた疎水性のシーケンスは、長いαらせんの束からできている棒形の複合体の同様な端に位置している。この分子配列は、複合体が膜融合のために会合されるとともに、接近している薄膜の同格関係を引き起こすと考えられる。
酵母の転写活性化因子GCN4は、酸性領域ロイシンジッパー(bZIP)DNA結合モチーフを含んでいる、30以上の識別された真核生物タンパク質のうちの1つである(Ellenberger et al., 1992, Cell 71 : 1223-1237)。bZIP二量体は、それらのカルボキシ端34残基以上の並列のコイルドコイルを形成し、DNA結合部位の主要な溝を通り抜けるためにそれらのアミノ末端の方へ徐々に分岐する、1対の連続的なα・ヘリックスである。そのコイルドコイル二量体化接触面は、DNA軸芯に垂直であり、該コンプレックスに、文字Tの外観を与える。bZIPは、並列のアルファヘリックスのコイルドコイルの中でともにパックする、疎水性で無極性の残基の4-3 7個一組の繰り返し(4-3 heptad repeat)を含んでいる。(エレンバーガーら、1992年、細胞71: 1223-1237)
CMP(matrilin-1)は、Mr 52,000(PaulssonおよびHeinegard、1981年、Biochem J.197:367-375)のサブユニットのhomotrimerとして牛の気管(tracheal)の軟骨から分離された。そこでは、サブユニットはそれぞれ、5つの7個単位にまたがる、vWFAlモジュール、一つのEGF領域、vWFA2モジュールおよびコイルドコイル領域から成る(Kissら、1989年、J.B.C.264:8126-8134;ハウザーおよびPaulsson、1994年、J.B.C. 269:25747-25753)。 浄化されたCMPの電子顕微鏡検査は、サブユニットがそれぞれコイルドコイルに対応する共通点から出現する楕円体を形成する花束状の三量体構造を示した(ハウザーおよびPaulsson、1994年、J.B.C.269:25747-25753)。 matrilin-1の中のコイルドコイル領域は広範囲に研究された。trimericな構造は、本性を奪わない条件下のインターチェーンのジスルフィド結合の完全な縮小の後に保持される(ハウザーおよびPaulsson、1994年、J.B.C.269:25747-25753)。
非コラーゲン糖タンパク質、COMPは、軟骨で最初に同定された(Hedbom et al., 1992, J. Biol. Chem. 267 : 6132-6136)。本タンパク質は、N-末端7個繰り返し領域(cc)から成る、5つのサブユニットの524kDaのホモ五量体で、4つの上皮成長因子(EGF)様領域(EF)、7つのカルシウム結合領域(T3)、およびC-末端球状領域(TC)が続いている。この領域構成によれば、COMPはスロンボスポンジンのファミリーに属している。7個の繰り返し(abcdefg)nのaおよびdの位置に優先的に疎水性残基を備えたものは、らせんのコイルドコイル領域を形成する(Cohen and Parry, 1994, Science 263 : 488-489)。 最近、COMP(COMPcc)の組換え5らせん構造のコイルドコイル領域が結晶化されて、また、その構造は0.2nm解像度で解析された(Malashkevich et al., 1996, Science 274 : 761-765)。
本発明は、融合ポリペプチドがリガンド(多量体化する要素のC端末に融合される最初のサブユニット)の受容体結合領域の少なくとも1つのコピーを含む、最初のサブユニットからなることを特徴とする融合ポリペプチドをコード化する核酸をさらに供給する。
あるいは、本発明は、融合ポリペプチドがリガンド(多量体化する要素のN端末に融合される最初のサブユニット)の受容体結合領域の少なくとも1つのコピーを含む、最初のサブユニットからなることを特徴とする融合ポリペプチドをコード化する核酸を、さらに供給する。特に、多量体化する要素は、コイルドコイル領域でよい。
組換え遺伝子が発現され、さらに、ポリペプチドは幾通りかの方法を使用し、精製される。遺伝子は、細菌の発現ベクターへサブクローンされてもよく、例としては pZErO が挙げられるが、これに限定されるものではない。
具体的な実施例の中で、キメラのAng1ポリペプチドをコードするシーケンスを含む核酸は、血管の漏出を防ぐために投与され、治療的脈管形成のためで、そして遺伝子治療により行われる。遺伝子治療は、発現されたか発現できる核酸の被験者への投与により遂行される治療を指す。本発明のこの実施例では、核酸は、治療効果を媒介するコード化されたタンパク質を生産する。
1つの実施例において、本発明は、治療的血管形成によって治療可能なことにより特徴づけられる様々な疾病の治療に関し、例えば、血管の漏出または血管形成の欠損のような疾病を対象とするが、これに限定されるものではない。この方向において、本発明の治療的化合物は、Tie2を活性化する化合物の提供による疾病に苦しみがちな患者、または苦しんでいる患者に投与されてもよい。
様々な送達システムは知られており、本発明の化合物の投与に用いることができ、例えば、リポソーム中のカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現することができる組換え細胞、受容体を媒介としたエンドシトーシス、レトロウイルス他のベクターなどの一部としての核酸の構築などが挙げられる。導入方法は、次の皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、また経口経路などが挙げられるが、これに限るものではない。化合物または組成物は、上皮の裏あるいは皮膚と粘膜の裏、例えば口腔粘膜、直腸および腸粘膜など、による吸収によって、注入か大型丸薬注入によって任意の便利なルートによって、そして、他の生物学的に活性な薬剤とともに投与されてもよい。投与は、全身性または局所性が可能である。さらに、脳室内・髄腔内の注入を含む任意の適切なルートによって中枢神経系へ本発明の薬学的化合物あるいは組成物を導入することは望ましい; 脳室内注射は、例えば、Ommaya reservoirのようなreservoirへ繋げられた、脳室内のカテーテルによって促進されてもよい。経肺投与も使用することができる、例えば、吸入器かネビュライザーの使用およびアエロゾル化する製剤の剤形で行える。
本発明に従って、液体またはパウダーの形をしているキメラのコイルドコイル分子は、傷の上に直接適用することができ、つまり、傷部位にふりかけられた。シートに塗布されたキメラのコイルドコイル分子は、傷部位上に適用されてもよい。その後、それは、傷を保護し、かつ有効成分の治癒効果が減少するのを防ぐために適切に修飾される。どんような市販の既知の傷包帯も本発明の中で使用されてもよい。市販の傷包帯の例は以下があるがこれに限られない;COMPEEL(R)、DUODERM(TM)、TAGADERM(TM)およびOPSITE(R)が挙げられる。
適切な酵素ラベルは、例えば、酸化酵素グループからのものを含んでいる。それは、基質と反応することにより過酸化水素の生産を触媒する。それがよい安定を持っており、その基質(グルコース)が容易に利用可能であるので、ブドウ糖酸化酵素は特に好まれる。酸化酵素ラベルの活性は、酵素標識抗体/基質反応によって形成された過酸化水素の濃度の測定により分析される。酵素に加えて、他の適切なラベルは、ヨウ素(125I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(112In)およびテクネチウム(99mTc)のようなアイソトープ、およびフルオレスセインとローダミンのような蛍光性のラベルを含んでいる、さらにビオチンを含む。
COMP-Ang1の全身的の影響を検討するために、COMP-Ang1(CA 1-2; 生産速度、〜30 mg/L)を生産する安定したチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系が作られた。また、アデノウイルスのベクターエンコーディングCOMP-Ang1は標準方法によって作られた。
COMP-Angl組換え型タンパク質の治療の2-3週間後に、皮膚は100%の頻度で髪の毛がない、マウスが顔、手、底部、腺陰茎および尾で赤色を示した。一方、コントロールのマウスは正常な皮膚色を示した。Ade-COMP-Anglの投与を受けたマウスは、我々が検査した12か月まで、維持的な皮膚赤色を示した (図25A、25B、25Cおよび25D)。
COMP-Ang1処理した全身性の治療は、時間依存的にマウス陰茎において、フォン・ヴィルブランド因子誘導を伴い海綿静脈洞(corpora cavernosa sinus)のスペースを拡張させた。一方、コントロールは、マウス陰茎の変化を示さなかった。(図10) この現象は高倍の拡大分析(図11)に、より明らかである。さらに、PECAM-1発現は、COMP-1治療されたマウスの海綿体(corpora cavernosum)(コルポラ カベルノサム)の内皮細胞の周辺で増加した。(図12)
Ang1受容体、Tie2、が、成人の肺の内皮細胞で十分に発現されているので、我々は、肺でCOMP-Ang1の影響を検討した。組織学的分析は、COMP-Ang1が、FITCレクチンでの潅流染色 (図18A、18D)およびHE染色(図17)によって証拠づけられるような、肺の健康および漏出しない毛細血管網を増加させるようであることを示唆する。さらに、PECAM-1は、コントロールに比べ、COMP-Ang1投与されたマウスの肺内皮細胞の中で著しく増加された (図18B、18E)。
Ang1は、内皮細胞上で発現されたTie2チロシン・キナーゼ受容体のリガンドであることが知られている(Davis et al.,1996, Cell 87 : 1, 161-1169)。Ang1/Tie2シグナリングは、発生の間に原始的な血管のネットワークを分岐し改装すること、および壁細胞のリクルートメント(漸増:recruitment)に関係すると、考えられる(Dumont et al., 1994,Genes Dev. 8 : 1897-1909 ; Suri et al., 1996, Cell 87 : 1171-1180)。皮膚に特有のケラチン- 14プロモーターを用いたAng1の遺伝子組換えの過剰発現は、皮膚の内皮細胞の数の増加を伴って、耐漏出性で拡張した血管をもたらす(Suri et al., 1998, Science 282 : 468-471 ; Thurston et al., 、1999, Science 286 : 2511-2514)。 虚血の組織の中へのAng1の遺伝子導入は顕著に拡張した血管を生産する(Shyu et al., 1998, Circulation 98 : 2081-2087 ; Chae et al., 2000, Arterioscler Thromb Vase Biol. 20 : 2573-2578)。 Baffertらは、最近、Ang1で引き起こされた血管の拡張が気管粘膜中の内皮の増殖の結果かもしれないと同定した(Baffert et al.,2004, Circ Res. 94 : 984-992)。したがってAng1誘導血管リモデリングの基本的な特徴は、成熟した動物の内皮細胞増殖に起因する血管の拡張である(Suri et al., 1998, Science 282 : 468-471 ; Thurston et al., 、1999, Science 286 : 2511-2514 ; Shyu et al., 1998, Circulation 98 : 2081-2087 ; Chae et al., 2000, Arterioscler Thromb Vase Biol. 20 : 2573-2578 ; Baffert et al.,2004, Circ Res. 94 : 984-992)。
大人の皮膚の(皮膚)傷が直るのは、異なる組織および細胞系統活動を統合する複雑なプロセスである(Martin, 1997, Science 276:75-81)。寄与する細胞タイプは、どのように、増殖、遊走、マトリックス合成および収縮中に振舞うのかを、正常で病理学の状態の傷部位で成長因子およびマトリックスシグナルが提供するのと同様に、広範囲に検討された。これらのうち、血管形成とリンパ管形成は、創傷治癒プロセスに重大である(Tonnesen et al., 2000, J Dermatol Symp Proc. 5 :40-46 ; Hirakawa et al., 2004, J Dermatol Sci. 35 : 1-8)。血管内皮成長因子(VEGF)およびアンジオポイエチンによって媒介した信号は、血管形成およびリンパ管形成のコントロールおよび規則に関連している(Yancopoulos et al., 2000, Nature 407 : 242-248 ; Tammela et al.,2005, Trends Cell Biol. 15 : 434-441 )。
本発明者は、COMP-Ang1が、心筋梗塞のネズミ・モデル中の残された心室のリモデリングを著しく減ずることをさらに実証した。これらの発見は、COMP-Anglが、虚血心の治療的血管形成の有効な物質であることを示す。実施例4を参照。
COMP-Ang1組換え型タンパク質およびAde-COMP-Ang1の生成
COMP-Ang1を発現する組換えチャイニーズハムスター卵巣(rCHO)細胞(CA 1-2; 生産速度、〜30mg/L)は、記述されたように確立されている(Hwang et al., 2005, Protein Express Purif. 39 : 175-183)。COMP-Ang1あるいはLacZを発現する組換えアデノウイルスは、pAdEasy(TM)ベクター・システム(Qbiogene)を使用して構築された。
動物、処置及び血圧と心拍数の測定
特定病原体未感染のFVB/NマウスおよびTie2-GFPの遺伝子組み換えのマウス(FVB/N)(Schlaeger et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 94 :3058-3063 )が、ジャクソン研究所より購入され、そして我々の病原体なしの動物設備の中で飼育した。8-10週令の雄性マウスが、この研究に使用された。動物の世話および実験の手続きは、KAISTの動物ケア委員会から承認の下で行なわれた。タンパク質治療については、無菌の0.9%のNaClの50μLで溶かされた、COMP-Angl組み換え型タンパク質あるいはBSAの200μgが、2週間尾部静脈に毎日注入された。アデノウイルス治療については、無菌の0.9%のNaClの50μLで希釈された、表示の量のAde-COMP-Ang1、Ade-LacZあるいはAde-sTie2-Fc(可溶のTie2受容体アデノウイルス構成物)(リジェネロン・ファーマシューティカルズのガヴィン・サーストン博士およびエラIoffe博士からの寛大なる提供物)は、尾部静脈から静脈内に注入された。全身血圧と心拍数は麻酔の下で測定された。
酵素免疫吸着法(ELISA)
血液のおよそ50μLが、表示の時に、ヘパリン処理された毛細管へ、尾部静脈から回収された。ELISAは、血漿中のCOMP-Ang1の正確な検知のために採用された。
免疫組織化学的染色
マウスは、麻酔され、1%のパラホルムアルデヒド含有PBS中で、灌流された。また、気管を含むいくつかの器官が除去された。気管と耳の皮膚が全体が免疫染色され、一方、他の器官は切片として免疫染色された。シグナルは視覚化され、また、デジタル像は、Zeiss Apotome顕微鏡およびZeiss LSM 510共焦点顕微鏡で得られた。
気管組織の血流測定
マウスは麻酔をかけられた後、タイプNフロープローブ(Transonic System社、Ithaca(ニューヨーク、アメリカ)が、管を塞ぎ、所望部位における灌流を減少するように、圧をかけることなく、第2、第3、第4の軟骨リングにそって、気管壁に設置された。フロープローブは、微調整装置によって高感度の位置上で適所に維持されレーザー-ドップラー流量計(モデルBLF21; トランソニック・システムズ社)に接続された。それは、灌流のリアルタイム評価のために組織の1mm3で微小循環系を測定することができる(組織のml/min/100g)。
形態測定の測定および統計
以前に記述された(Baluk et al., 2004, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287 : L307-L317)ように、マウス気管中の血管径および面密度の形態測定の測定がなされた。 各気管については、PH3の免疫陽性内皮細胞、PECAM-1免疫陽性な血管およびデスミン/NG2免疫陽性な周皮細胞の数が、5つの領域、各0.21mm2で測定された。値は、mm2につき表わされた。表示の値は平均値±標準偏差(SD)。 平均の違いの重要性は、スチューデント-ニューマン-クールズテストにより、偏差の分析によってテストされた。統計的有意性はP<0.05で設定した。
全身性のアデノウイルスのCOMP-Ang1は、マウスの気管の粘膜中の血管の異なる拡大を生じる。
COMP-Ang1による生体内の治療については、我々は、〜30mg/LでCOMP-Ang1を生産する安定した中国のハムスター卵巣(CHO)細胞系(CAl-2)を開発した。CAl-2から生産した、COMP-Ang1の性能、可溶性、オリゴマー化ステータスおよび安定性は、COMP-Ang1遺伝子を含んでいるプラスミドベクターで一時的にトランスフェクトされたCOS-7細胞から生産したCOMP-Anglのものに似ている(Cho et al.,2004, Proc Natl Acad Sci U S A 101:5547-52)(データは示さず)。 成体マウスは、2週間、COMP-Ang1組換え型タンパク質あるいはウシ血清アルブミン(BSA)の200μgを、後肢部静脈から、毎日静脈注射で処理された。次に、気管の粘膜中の血管が、血小板/内皮細胞接着分子-1(PECAM-1)免疫染色で視覚化された(図22)。微小血管系の6つのセグメントが、内皮細胞形態で管の階層中のそれらの位置および違いによって識別された。(McDonald et al., 1994, Am J Physiol. 266 : L61-L83)。気管の血管の拡大は、効力の次の減少順にCOMP-Ang1を受けたマウスで見られた : 後毛細血管細静脈>毛細管>集合(collecting)小静脈>小静脈>ターミナルの小動脈(図22B)。 重要な変更は分節の小動脈では示されなかった。これらの現象は、研究されたいくつかのマウス系統(FVB/N、C57BL/6、BALB/c、BALB/c-nu、C3H/HeJ)のすべての固体に観察された。気管の血管のサイズか形の変化は、BSA投与を受けたマウスで見つからなかった。
短期・断続的な循環COMP-Ang1は、気管の後毛細血管細静脈および小動脈の可逆的な拡大を引き起こす。
COMP-Ang1組換え型タンパク質の200μgが、オスの成体マウスに静脈内で注入された時、循環するCOMP-Ang1レベル、注入(〜3.75min)の後に直ちにピークに達し、その後、下降した、治療後の3-4時間で、またコントロールレベルにほとんど戻った(図23A)。循環COMP-Ang1の半減期(tl/2)は、11.8分だった。1週間、COMP-Ang1の200μgの毎日の静脈注射は、マウスの後毛細血管細静脈のおおよそ2.0倍の拡大、および気管中の末端小動脈におおよそ1.4倍の拡大をもたらした(図23)。 COMP-Ang1で引き起こされた、後毛細血管細静脈、集合小静脈、毛細管の末端静脈、小静脈および末端小動脈の拡大は、2週までの間、COMP-Ang1の毎日の投与の継続で、さらに、2週まで増加した。しかしながら、COMP-Anglで引き起こした拡大した血管をは、COMP-Ang1治療の停止の後に徐々に正常となった(図23)。COMP-Ang1治療の停止の1か月後に、2週間の、COMP-Ang1の200μgの毎日の静脈注射による治療の第2ラウンドは、可逆的な状態(データ示さず)で気管の同様の拡大を再び引き起こした。それに比べて、BSA(データ示さず)で処理されたマウスの気管の直径は、コントロールと実験期間の間で判別不能だった。これらの結果は、循環COMP-Anglの短いスパイクは、いくつかの気管の血管(tracheal vessels)の可逆的な拡大を引き起こす。
長期的で持続された循環COMP-Ang1は、気管の血管(tracheal vessels)の後毛細血管細静脈および末端小動脈の長期持続的な拡大を引き起こす。
COMP-Ang1での全身的治療のための代替方法として、COMP-Ang1遺伝子(Ade-COMP-Ang1)をコードするアデノウイルスのベクターも開発された。 コントロールとして、LacZ遺伝子(Ade-LacZ)をコードするアデノウイルスのベクターが開発された。Ade-COMP-Anglで形質転換されたHEK293細胞から生産した、COMP-Ang1の 性能、可溶性、オリゴマー化ステータスおよび安定性は、COMP-Ang1遺伝子(データ示さず)を含んでいるプラスミドベクターで一時的にトランスフェクトされたCOS-7細胞から生産したCOMP-Ang1(Cho et al., 2004, Proc Natl Acad Sci U S A. 101 : 5547-52)のそれに似ている。成体マウスは、1x109pfu Ade-COMP-Ang1あるいはAde-LacZで処理された。16週の期間にわたる多数の回に、循環血漿COMP-Ang1レベルは測定された。また、気管の粘膜中の血管は、PECAM-1免疫染色で視覚化された(図24)。循環COMP-Ang1は、治療の後は、早くも12時間で増加し、1-2週でピークとなり、徐々にその後下降し、そして、治療6週でコントロールレベルに返った(図24A)。循環COMP-Ang1のピーク濃度は、ほぼ3.5-4.5μgだった。分節小動脈ではなく末端小動脈、後毛細血管細静脈、毛細管(特徴的に、毛細管の静脈の末端だけが拡大した)、集合小静脈の著しい拡大は、Ade-COMP-Angl治療の後に1週で顕著だった(図24B)。Ade-COMP-Ang1によって引き起こされた管の拡大は、6週以内の間さらに増加し、次に、プラトーに達した(図24Aおよび24B)。例えば、後毛細血管細静脈の直径は、2週で4.3倍、4週で6.0倍および6週で6.8倍に増加した(図24A)。さらに、末端小動脈の拡大は、治療の後1週で明確に始まって、時間依存的に増加した。しかしながら、末端小動脈中の直径の増加は、後毛細血管細静脈におけるより少なかった(図24Aおよび24B)。重要なことには、Ade-COMP-Ang1誘導で拡大した血管のサイズは、循環COMP-Ang1は治療後6週でコントロールレベルにもどったが、治療後16週の間著しくは減少しなかった(図24A)。 それに比べて、Ade-LacZで扱われたマウスの気管の血管(tracheal vessels)の直径はコントロールと実験期間(データは示されない)の間で判別不能だった。レーザードップラー流量計を使用して、気管組織の血流が、Ade-LacZあるいはAde-COMP-Ang1処置後2週(循環COMP-Ang1のピーク・レベル)と16週(循環COMP-Ang1の検出できないレベル)で測定された。2週では、気管の組織血流は、Ade-LacZで処置されたマウスと比較して、Ade-COMP-Ang1で処置されたマウスでおよそ25%増加した(図24Cおよび24D)。16週では、重要なことには、Ade-COMP-Ang1による増加した気管の組織血流は著しく変更されなかった(図24Cおよび24D)。 これらの結果は、長期持続的な循環COMP-Ang1処置が、成体マウスの組織血流の長期持続的な増強を伴い、気管の血管の長期持続的な拡大を引き起こすことを示す。
Tie2活性化は、COMP-Ang1で引き起こされた血管リモデリングに関係する。
COMP-Ang1で引き起こされた血管リモデリングへのTie2活性化の関与を決定するために、マウスは、1x108pfuのAde-COMP-Ang1治療に先立って24時間前に、1x108pfu 又は5x108pfuのAde-sTie2-Fcで前処理された。2週間後に、後毛細血管細静脈および末端小動脈の直径が測定された。1x108pfuあるいは5x108pfu のAde-sTie2-Fcでの前処理は、COMP Anglで引き起こされた血管リモデリングを次の程度に抑制した:後毛細血管細静脈での各46.5±7.7%あるいは93.5±6.4%および末端小動脈での各59.7±6.6%或いは95.1±5.7%、 (図24Eおよび24F)。これらのデータは次のことを示す、COMP-Ang1で引き起こされた血管リモデリングは、主として、成人の気管の血管(tracheal vessels)におけるTie2活性化を通じて媒介される。
Ade-LacZ(1x109pfu)で処理されたマウスおよびAde-COMP-Ang1(1x109pfu)で処理されたものの両方が、正常に体重を増したので、一般に健康に見えた。しかしながら、Ade-COMP-Ang1で処理されたマウスの皮膚は、Ade-LacZで扱われたハツカネズミの皮膚より著しく赤く見え、それは治療後に10-14日で始まった。Ade-COMP- Ang1で引き起こされた皮膚赤色は、処置後16週間持続した(図25)。処置後16週間、Ade-COMP-Ang1で処置されたマウスの顔面、手、底部、陰茎および尾のような毛希薄な部分の皮膚色は、Ade-LacZで処置されたマウスのものより明確に赤かった。
Ade-COMP-Ang1で処置されたマウスの耳の血管、および心臓、副腎皮質および肝臓の毛細管は拡大した(図25および26)。より多くのPECAM-1陽性の内皮細胞が、Ade-LacZで処置されたマウスと比較して、Ade-COMP-Ang1で処置されたマウスの肺、心臓、肝臓および腎髄質に存在した(図25および26)。しかしながら、Ade-COMP-Ang1で処置されたマウスとAde-LacZで処置されたマウスにおいて、糸球体を含む腎皮質の血管、及び、腸絨毛は判別不能だった。さらに、マウスの2つのグループの体重、全身血圧および心拍数は判別不能だった。これらの結果は、循環COMP-Anglの長期の持続的処置が、全身血圧および心拍数の顕著な変化なく、異なる血管の長期持続的な組織に特有の血管(vascular)リモデリングを引き起こすことを示す(テーブル1)。
コントロールおよびCOMP-Ang1処置マウス間の血行力学のパラメーターの比較
コントロール COMP-Ang1 兆候(significance)
体重(g) 30.5±1.9 29.0±1.1 NS
SBP(mmHg) 87.8±5.8 90.7±3.6 NS
DBP(mmHg) 51.7±4.9 59.2±4.2 NS
MAP(mmHg) 70.1±6.8 74.1±3.2 NS
心拍数(bpm) 1901±16 212±1.0 NS
Tie2の誘導は、COMP-Ang1で引き起こされた血管(vascular)リモデリングの恒久的変更に関係する。
これらの観察に基づいて、我々は、Tie2発現がマウス気管中の末端小動脈より後毛細血管細静脈においてより豊富かどうかを検討した。それゆえ、我々は、Tie2のプロモーター駆動緑色蛍光タンパク質(GFP)を担持する遺伝子組み換えマウスを使用して、Tie2発現の程度を検討した(Schlaeger、1997年ら、Proc Natl Acad Sci U S A.94:3058-、3063)。成体マウスの気管粘膜では、Tie2発現は、後毛細血管細静脈のほとんどの内皮細胞において検知できなかった。その一方で、それは、気管の血管(tracheal vessels)の末端および前毛細管小動脈の内皮細胞では、適度に発現された(図27)。したがってCOMP- Ang1刺激による、気管の血管(tracheal vessels)の拡大の差異は、Tie2発現の程度に依存しない。しかしながら、Tie2発現は、Ade-COMP-Ang1処置後2週で、集合小静脈(collecting venules)、小静脈、後毛細血管細静脈および毛細管の内皮細胞で著しく増加した(図27)。それはAde-Ang1の最近の報告書とほぼ一致している(Baffert et al., 2004, Circ Res. 94:984-992)。Tie2発現は、Ade-COMP-Ang1 処置後16週で、同じ管(vessels)の内皮細胞でさらに増加した(図27)。対照的に、Tie2発現は、組み換えCOMP-Ang1タンパク質での処置後2週で、拡大した気管の血管(tracheal vessel)のどんな内皮細胞の中でも変化がなかった(図27)。気管の粘膜(tracheal vessel)の細動脈、毛管(capillarie's)、および小静脈(venules)について、顕微鏡視野範囲 (0.22mm2)でのTie2発現の面積密度は、Ade-LacZ処置後(2週)で各々8.2±1.7、2.8±0.4および3.3±0.6% (4匹のマウスからの平均±SD)、COMP-Ang1タンパク質処置後(2週)でそれぞれ、7.6±1.9、3.1±0.5および3.7±0.6%、Ade-COMP処置後(2週)で各々11.3±2.2、10.3±1.7および28.1±5.4%、Ade-COMP処置後(16週)で、13.3±2.7、18.2±3.5および47.7±7.2であった。さらに、Tie2発現は、Ade-COMP-Anglで処置されたマウスの、腹部の皮膚の拡大した静脈及び肝臓中の洞様毛細血管において、該処置の後に16週で、Ade-LacZで処置されたマウスより、顕著により高かった。したがって、小静脈及び毛状の内皮細胞中のTie2発現は、Ade-COMP-Ang1によって引き起こされた長期的で保持されたTie2刺激で引き起こされる、しかし、組換えのCOMP-Ang1タンパク質によって引き起こされた、短期のスパイクTie2刺激ではおこらなかった。
COMP-Ang1で引き起こされた管(vascular)の拡大は、周辺の内皮細胞増殖に起因する。
内皮細胞がサイズで正常だった(図28Aおよび28B)ので、血液小静脈のCOMP-Ang1で引き起こされた拡大は、血管拡張か内皮細胞異常発達ではなく、内皮細胞増殖に起因するように見える。この可能性をテストするために、我々は、免疫染色によりホスホヒストンH3(diving細胞の核タンパク質)の陽性の内皮細胞の数を検査した。Ade-COMP-Ang1処置、あるいは組換えのCOMP-Ang1タンパク質処置(データ示さず)の後4日及び2週で、気管の血管(tracheal vessel)の後毛細血管細静脈、毛細管、集合小静脈、小静脈および末端小動脈を含む様々な部分に免疫染色されたホスホヒストンH3陽性の内皮細胞が検知された(図28D、28Fおよび28I)。 しかしながら、ホスホヒストンH3陽性の内皮細胞は、Ade-LacZ処置後4日、2及び16週で、及びAde-COMP-Angl処置後16週で、気管の血管(tracheal vessel)のどのような部分でも、検出されていない(図28C、28E、28Gおよび28I)。 これらの知見は、COMP-Ang1よって引き起こされた管(vascular)の拡大が、血管拡張か内皮細胞異常発達からよりも、循環COMP-Ang1の濃度に依存する内皮細胞増殖に起因するようである。
COMP-Ang1で引き起こされた後毛細血管細静脈拡大には、周皮細胞補充(recruitment)が伴わない。
Ang1は、生理学及び病理学の状態での血管形成の間の、発生期の内皮細胞に対して周皮細胞補充の強い成長因子であると知られている(Suri et al., 1996, Cell 87:1171-1180 ; Suri et al., 1998, Science 282 : 468-471 ; Thurston et al., 1999, Science 286 : 2511-2514)。したがって、我々は、Ade-LacZあるいはAde-COMP-Ang1処置後4週で、内皮細胞と周皮細胞のダブル免疫染色により、気管の拡大した血管での内皮細胞と周皮細胞の間の相互作用を検討した。Ade-COMP-Ang1処置されたマウスのほとんどの気管の血管(tracheal blood vessels)(後毛細血管細静脈以外の)の内皮細胞と周皮細胞の相互作用は、Ade-LacZ処置のマウスのそれに類似した (図29) 。 周皮細胞と内皮細胞のより少ない相互作用が、他のところより拡大した後毛細血管細静脈で見つかったが、拡大した後毛細血管細静脈の周皮細胞の数は、コントロールの後毛細血管細静脈に似ていた(図29)。したがって、COMP-Ang1は、気管のCOMP-Ang1で引き起こされた拡大した小静脈に対し、周皮細胞の補充を促進しなかった。
Ade-COMP-Ang1およびCOMP-Ang1組換え型タンパク質の生成
COMP-Ang1又はバクテリアβ-ガラクトシダーゼ(以下β-gal)を発現する組み換えアデノウイルスは、既知方法(Cho et al., 2005, Circ Res. 97 : 86-94)に準じて、pAdEasy(TM)ベクターシステム(Qbiogene、Carlsbad(CA))を使用して構築された。COMP-Ang1(CA 1-2)を発現する組み換えチャイニーズハムスター卵巣細胞は確立され、また、既知の方法(Cho et al., 2005, Circ Res. 97 : 86-94)で、組換えCOMP-Ang1タンパク質が調製された。
動物、創傷治癒および処置
特定病原体未感染のFVB/Nマウス、糖尿病のC57BLKS/J-m+/+Lepr db(db/db)マウス、C57BL/6J、およびeNOS(-/-)マウスおよびiNOS(-/-)(C57BL/6J遺伝的背景)は、ジャクソン研究所(ジャクソン研究所、バーハーバー(ME))から購入され、我々の病原体なしの動物施設で飼育した。8〜10週令雄性マウスが、この検討に使用された。動物飼育および実験方法はKAISTとKRICTの動物ケア委員会から承認の下で行なわれた。1.5mmの穴は、金属耳パンチ(ハーバード装置、ホリストン(MA))を使用して、FVB/Nマウスの両耳の中心に作られた。十分な厚さの損傷については、切除が、動物の身体へおよそ0.5〜1.0cm遠位(distal)で、尾の背の表面上でなされた(Falanga et al., 2004, Wound Repair Regen.12:320-326)。テンプレートは、マウス尾の背の表面で、10×3mmを描写するために使用された。テンプレート・エリアに相当する十分な厚さの損傷は、個々の無菌の#10ゲージ・メス(ベクトン・ディキンソン、フランクリンレイクス、NJ)を使い作成された。出血は傷への圧力の単純な適用によって止められた。また、傷はフィルム・スプレー包帯(Cavilon、3M、聖ポール、MN)で覆われていた。 手術後に、マウスは暖かくしておかれ、それらの温度が、手術後3日間モニターされた。 術後感染を防ぐために、トリメトプリム・サルファ剤(Sulfatrimの小児用懸濁液)が飲料水に5日間加えられた。傷閉鎖分析用の耳および尾の採取は麻酔を必要とした。それは、0(傷をつける直後)から損傷後8週まで、検討の期間中、麻酔薬のコンビネーション(80mg/kgのケタミンおよび12mg/kgのxylazine)筋肉注射によって行なわれた。アデノウイルスの処置については、無菌の0.9%のNaClの50μLに希釈された1x109pfu Ade-COMP-Ang1あるいはコントロールウィルスが、損傷の後に、尾部静脈から静脈内に12時間注入された。循環COMP-Ang1を検知するために、確立している酵素免疫吸着分析(ELISA)プロトコル(Cho et al., 2005, Circ. Res. 97:86-94)を使った。Ade-COMP-Ang1処置糖尿病(db/db)マウスで、循環COMP-Ang1レベルは、初期に、12時間で増加(355の±98ng/ml)し、1週でピーク(3,221±365ng/ml)となり、徐々に下降し、Ade-COMP-Ang1投与6週後にコントロールレベルに戻った。それは、Ade-COMP-Ang1処置FVB/Nマウスでの以前の知見(Cho et al., 2005, Circ. Res. 97:86-94) に似ている。タンパク質処置については、無菌の0.9%NaClの50μLに溶解された、COMP-Angl組換え型タンパク質あるいはBSAの100μgを、1日目に、フィルム・スプレー傷手当ての前に、損傷部位に直接投与し、及び、損傷の後次の4週間一日単位で、フィルム・スプレー傷手当てと非損傷部位の間の領界損傷部位を露出するため最初に投与した。投与されたタンパク質は、最初の週に、傷手当てフィルムのまわりの傷の端で主として分布され、残りの3週間で傷区域全体に平等に送達された。
傷閉鎖の形態測定分析
マウスは、麻酔薬(80mg/kgのケタミンおよび12mg/kgのxylazine)のコンビネーション筋肉注射によって麻酔をかけられ、暖パッド上に置かれた。尾と耳の傷はデジタル・カメラ〔Coolpix、ニコン、東京(日本)8400〕で撮影された。尾損傷部位のサイズ(mm2)は、ImageJソフトウェア(http://rsb.info.nih.gov/ii)で、写真の分析をして追跡した、損傷視野計から計算された。また、すべて尾損傷面積(area)は、損傷の週の日の0日面積を100%とした; その後の損傷部位は、0日面積から比率として表現された。
組織学・形態測定の分析
マウスは、PBSで1%のパラホルムアルデヒドの血管還流によって固定した。耳と尾は除去された。また、組織はパラフィン(ヘマトキシロンおよびエオシン染色用)あるいはクリオーフリージング メディア(免疫染色用)の中へ埋め込んだ。パラフィン切片(6μm厚)およびクリオ切片(20μm厚)が用意され、0.3%のトリトンX-100(PBST)含有PBSに5%の正常なヤギ血清(Jackson Immuno ResearchLaboratories社 West Gorve, PA)を含む、ブロッキング溶液と室温で1時間インキュベーションされた。切片は、1つ以上の一次抗体と室温で2時間インキュベートされた: (a)血管用、抗-PECAM-I抗体、ハムスター・クローン2H8、1:100(Chemiconインターナショナル社 Temecula,CA); (b)リンパ管用、抗マウスLYVE-1抗体、ネズミ単クローン抗体、1:100(Aprogen、Daejeon, Korea); 繊維芽細胞用、FITC結合抗-α-SMA抗体、マウス・クローン1A4、1:200(シグマ・オールドリッチ(セントルイス(MO))); (d)増殖細胞用、抗-Ki67抗体、ウサギポリクローン抗体、1:100(Novocastraラボラトリーズ株式会社、ニューカースル、英国); そして(e)神経細胞用、抗neurofilament抗体、ウサギポリクローン抗体、1:100(Chemiconインターナショナル社)。PBSTで数回の洗浄後、切片は1つ以上の二次抗体で室温で1時間でインキュベートされた: (a) Cy3結合抗-ハムスターIgG抗体、1:500(Jacson ImmunoResearchLaboratories社)i; (b) FITC結合抗ラット抗体あるいは抗ウサギ抗体、1:500(Jacson ImmunoResearchLaboratories社)。 対照実験については、一次抗体は省略するか前免疫血清で代用された。シグナルは、視覚化され、また、デジタル像は、アルゴンおよびヘリウム・ネオン・レーザー(カール・ツァイス、イェーナ、ドイツ)を装備したツァイスApotome顕微鏡およびツァイスLSM 510共焦点顕微鏡を使用して得られた。 耳(mm)の創傷治癒の程度は免疫蛍光検査法のイメージの写真の分析によって画像解析ソフトウェア(LSMイメージ ビュウアー、カール・ツァイス)で分析された。表皮・皮膚の再生のパラメーター、組織肉芽形成の厚さおよび表皮の厚さは、HE染色された切片で評価され得点化された。血液とリンパ管の面密度(組織エリアのパーセンテージ)は、PECAM-1-及びLYVE-1-免疫陽性血及びリンパ管によって、各々、5つの領域、切片当たり、各0.21mm2エリアで、x200の拡大で測定された。
損傷エリアの組織血流の測定
マウスが、ケタミン(80mg/kg)およびxylazine(12mg/kg)の混合物の筋肉注射によって麻酔をかけられた後、37℃の体温を維持するために、それらは加熱テーブルに置かれた。タイプNフロープローブ(トランソニック・システムズ社、Ithaka、NY)は、圧力を加えずに、尾損傷の管及び静脈部分に置かれ、それは所望の部位で、管を閉塞し、灌流を減少する。フロープローブは、微調整装置によって高感度の部位で適所に維持され、レーザードップラー流量計(モデルBLF21;トランソニック・システムズ社) に接続され、それは灌流のリアルタイム評価のために組織の1mm3で微小循環系を測定することができるものである。 これらのアナログ信号は、100Hz(Digidata 1200、Axon Instrument、フォスターシティー(CA))でディジタル化され、データ収集プログラムによって連続的に呈示された。その後、平均組織灌流率(組織のml/min/100g)は、Axoscope 9.0ソフトウェア(Axon Instrument)を使用して分析された。
Tie1およびTie2燐酸化分析
人間の皮膚の微小血管の内皮細胞(HDMVEC)および基礎培地は、カスケード バイオロジーズ(Cascade biologies, Portland, OR)から購入された。HDMVECsを使用するTie1とTie2の燐酸化分析が、既知(Cho et al., 2005, Circ Res. 97:86-94; Cho et al., 2004, Proc Natl Acad Sci. USA 101:5547-5552)方法で行なわれた。 免疫ブロッテイングからの全てシグナルは、走査濃度計(LAS-1000、富士フィルム、東京(日本))により視覚化され分析された。
統計
値は、平均± 標準偏差(SD)で示される。平均間の著しい違いはスツーデント-ニューマン-クールズ・テストによる分散分析で決定された。統計的有意性は、P<0.05あるいはP<0.01で設定された。
COMP-Ang1は、正常なマウスの耳皮膚の血管形成、リンパ管形成および創傷治癒を促進する。
創傷治癒プロセスを生体内で検討するため、我々は、Ade-COMP-Ang1の1x109pfuあるいはAde-β-galの1x109pfuで、全身的に処置されたマウスの耳にパンチ傷を作り、それは、別段の定めがない限り、COMP-Ang1あるいはコントロールとして引用される。 損傷後の3及び7日では、多くの繊細な管が、コントロールで処置されたマウスと比較して、COMP-Ang1で処置されたマウスのパンチ穴傷のマージン周辺で観察された(図30および図31A)。さらに、傷部位に基底部から通じる耳の同側の血管は、顕著に拡大した(図3OAおよび図31B)。これらの状態は、処置の後28日までの間続いた(図30A)。さらに、我々は、COMP-Ang1で処置されたマウスの創傷治癒が、コントロールで処置されたマウスで見られたそれと比較して、加速されることを観察した(図3OA、3OBおよび30C)。血管内皮細胞マーカー、血小板内皮細胞接着分子(PECAM-1)、及び、傷つけられた耳の横断面でのリンパ管内皮細胞マーカー、リンパ管内皮ヒアルロナン受容体-1(LYVE-1)を使用する免疫蛍光染色によって、COMP-Ang1で処置されたマウスは、コントロールで処置されたマウスより、傷領域の血液およびリンパ管をさらに枝分かれさせて接続していることを明らかにした。(図30B)。創傷治癒の程度は、最初の組織病変の位置で、耳軟骨を越えて成長した皮膚の長さとして測定された。COMP-Ang1(n=5)対コントロール(n=5)では、その長さは、7日で、P<0.01で133±17mm対86±16mm; 14日で、P<0.01で286 ±53mm対184±32mm; また28日で、P<O.01で408±63mm対229±29mmであった(図30C)。これらの観察は、損傷部位の増強された血管形成およびリンパ管形成が、COMP-Ang1で処置されたマウスの耳のより効率的な創傷治癒の起因であることを示唆する。さらに、COMP-Ang1は、皮膚の血液およびリンパ管中で十分に発現される(Babaei et al.,2003, Am J Pathol.162:1927-1936)、その受容体、Tie2およびTie1の活性化を通じて、血管形成、リンパ管形成および血流を増強することができた。
スコア 表皮及び真皮の再生 グラニュレーション(granulation)の厚さ
0 very little thin organization
1 little moderate organization
2 moderate thick organization
3 complete very thick
これらの結果は、糖尿病のマウスの創傷治癒のCOMP-Ang1で引き起こされた加速は、COMP-Ang1によって引き起こされた増強された血流により、糖尿病の皮膚の乏血の救済によって、媒介するかもしれないことを示唆する。さらに、COMP-Ang1で処置されたマウスは、コントロールマウスに比較して、真皮の表皮の基底細胞およびより多くの神経線維(neurofilament)陽性細胞のより高い増殖活性を呈した(図34)。血管形成が、器官の成長(Thurston et al., 1999, Science 286:2511-2514 ; Davis et al.,1996, Cell 87:1161-1169 ; Suri et al., 1996, Cell 87:1171-1180)および修復(Cho et al., 2005, Circ Res. 97:86-94)に先んじ、血管が、栄養素のキャリアおよび組織の血液の受動のフィルタ以上のものであるので、我々の結果は、多数のメカニズムによって、COMP-Ang1が、糖尿病の傷の基底細胞および神経の再生を間接的に引き起こしているかもしれないことを示す。
COMP-Ang1は、eNOS(-/-)およびiNOS(-/-)マウスの尾皮膚の創傷治癒を加速する。
内皮の一酸化窒素シンターゼ(eNOS)で引き起こされた一酸化窒素は、正常な創傷治癒に不可欠な役割を果たす(Witte, Me and Barbul,A, 2002, Am J Surg. 183:406-412; Schwentker et al., 2002, Nitric Oxide 7:1-10)。 我々は、eNOS(-/-)マウスが、尾損傷の同じモデルのeNOS(+/+)マウスと比較して、およそ40%に害された傷閉鎖を呈することを観察し、これは以前の知見(Lee et al.,1999, Am. J. Physiol. 277 : H1600-H1608)と一致している。 具体的には、傷閉鎖は、3週で、最初の傷評価値から表皮の閉鎖(mm2)のエリアとして測定された。 eNOS(-/-)(n=4)対eNOS(+/+)(n=4)マウスの値は、11.6±2.2mm2対19.4±3.5mm2、P<0.01だった。対照的に、誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)(-/-)マウスは、iNOS(+/+)マウスと比較して、尾損傷の同じモデルの遅延創傷治癒を呈示しなかった(図35Cおよび35D)。さらに、Ang1に引き起こされた血管形成は、内皮の活性化されたeNOSによるNOの生成を必要とするように見える(Babaei et al., 2003, Am J Pathol. 162:1927-1936)。したがって、我々は、eNOSまたはiNOSが、9-10週令雄性のeNOS(-/-)およびiNOS(-/-)マウスにおいて、尾損傷を受けることによって、COMP-Ang1によってもたらされた加速された創傷治癒に関与するかどうかを検討した。時間的経過観察は、COMP-Ang1で処置されたeNOS(-/-)およびiNOS(-/-)マウスが、コントロールマウスに比較して、加速された傷閉鎖を呈することを示した(図35)。さらに、COMP-Ang1で処置されたeNOS(-/-)およびiNOS(-/-)マウスは、コントロール・ウィルスで処置されたマウスと比較して、増強された血管形成を示した。これらの観察は、尾皮膚の創傷治癒中にCOMP-Ang1によって媒介した、増強された血管形成が、eNOSとiNOSには、依存しないことを示す。
局所的COMP-Ang1は、尾皮膚において、増強された血管形成および血流を伴って創傷治癒を促進する。
COMP-Ang1が糖尿病患者で見られる、遅延創傷治癒に拮抗するとすれば、我々はタンパク質の局所適用がそのような結果を促進するかもしれないかどうかを検討した。この目的のために、COMP-Ang1(CAl-2、生産速度、20-30mg/L)を生産する安定したチャイニーズハムスター卵巣細胞ラインが確立された(Cho et al.,2005, Circ Res. 97:86-94)。COMP-Ang1タンパク質の局所適用の有効性をテストするために、我々は、糖尿病のC57BLKS/J-m+/+Leprdb(db/db)マウスの尾の背の側に作成された十分な厚さの傷へ、一日単位で、COMP-Ang1タンパク質の100μgを含む50μL食塩水(0.9%のNaCl)を直接適用した。平行して、同腹の子の中で作られた傷は、ウシ血清アルブミン(BSA)をコントロールとして毎日処置された。COMP-Ang1タンパク質を投与された傷は、BSAを投与された傷より速く直った。COMP-Ang1(n=6)対BSA(n=6)では、最初の傷からの表皮閉鎖(mm2)への値は、2週で9.5±1.4mm2対3.5±0.6mm2 ,P<0.01 ; そして4週で17.0±4.4mm2対5.5±0.7mm2 , P<0.01 (図36Aおよび36B)。同様に、COMP-Ang1タンパク質を投与された傷は、BSAを投与された傷と比較して、増強された血管形成(14日で〜1.3倍、および4週で〜1.5倍)、リンパ管形成(14日で〜1.3倍、および4週で、〜1.4倍)(図36C、36Dおよび36E)、および血流(静脈部分、2週で1.15から1.28倍; 動脈部分、2週で1.14〜1.25倍)(図36 F)を呈した。
結論
全身的および局所的COMP-Ang1は、増強された血管形成およびリンパ管形成を伴って皮膚の傷閉鎖を加速する。また、正常及び糖尿病のマウスのこれらは、eNOSとiNOSに依存しない。したがって、COMP-Ang1は、糖尿病皮膚の創傷治癒を促進するための新しい治療物質として有用である。
ラット心筋梗塞モデル
雄性スピローグ・ドーリー・ラット(200-220gの体重)は、ケタミン塩酸塩(100mg/kg)およびxylazine塩酸塩(2.5mg/kg)で麻酔をかけられた。 麻酔をかけられたラットは、げっ歯動物通風装置(モデル、ハーバード装置、南ナティック(MA)、アメリカ683)を使用して、陽圧の下で換気された。左の胸部切除(thoractomy)が、4番目の肋間腔中で行なわれた。また、心膜を開いた。左冠状動脈は、曲がった針および6-0の絹縫合で、左の心房の付属器官と右心室流出管の間で、心筋内に囲まれ、閉塞され、そして、梗塞ゾーンの中へCOMP-Ang1あるいはウシ血清アルブミンの50μgを含んでいるバッファーの140μlが注入された。その後、胸は重ねられて閉鎖された。また、気胸は空にされた。5時間の後、縫合は解除された、これはいわゆる、「遅延灌流経壁心筋梗塞」(LMI)モデルと呼ばれる。動物の飼育および取り扱いはすべて、国立衛生研究所(NIH出版、改訂された1985年85-23)によって公表された実験動物の飼育および使用のためのガイドによって行なわれた。
経胸壁超音波心臓図検査は、梗塞エリアへのCOMP-Ang1注入後、2週まで、すべての動物について行なわれた。簡潔に、ラットは、50mg/kgのケタミンおよび10mg/kgのxylazineで麻酔をかけられた。胸の毛はそられ、ラットは、仰向けに置かれた。心エコー図は、7.5MHzのフェーズドアレイの変換器(ヒューレット・パッカード)を装備した市販の心エコー検査システムでえられた。下胸部の毛がそられた後、変換器は、胸の左の前方側に置かれた。心臓は、左心室(LV)の、両胸骨(parasternal)の長いおよび短い軸芯図(views)で2次元モードで最初にイメージされた。これらの図(views)の使用によって、M-モード・カーソルは、心室中隔および後壁に垂直に位置した; その後、M-モード・イメージは、乳頭筋のレベルに、僧帽弁葉状の器官の先端より下のレベルに得られた。 過度の圧力を回避ことに注意した。左心室の壁の肉厚(LVPW)および完全な心室中隔厚 (IVST)を含むLV内部寸法(dimension) は、米心エコー図学会の最先端方法によって測定された: 心収縮機能の測定として、最大LVエンド心拡張径(最大の窩寸法時に、LVdD)、最小のLVエンド収縮径(後壁の最大の前方運動時に、LVsD)および断片的なショートニング(FS)。 測定は、すべて、連続3つの心臓周期で平均され、処置グループについてブラインドにされた熟練技能者によってなされた。
組織学的・免疫組織化学的検査
心臓は、LVの中への、2M KClの2-3mlの直接注射によって心拡張を阻止した。 その後、摘出され、2つのブロックへ、梗塞を横切って横に切断された。組織ブロック(blocks)は10%のホルマリンだった。組織セクションの繊維増多組織はマソントリクロームの方法を使用して染色された。 血管形成の定量分析のために、免疫蛍光染色の分析が、4μm-厚セクションで、抗フォン・ヴィルブランド因子(vWF)抗体で行なわれた。
統計分析
データは1つのグループ当たり3匹の動物から得られ、平均±標準偏差として表現された。 統計分析は、対がないスチューデントのt検定を使用して行なわれた。p <0.05の値は、統計的に有意であると考えられた。
結果: 血管の構成は梗塞および境界ゾーンで増加された(図37)。 COMP-Ang1は、著しく、梗塞ゾーンの壁の肉厚(コントロール対COMP-Ang1、0.7±0.15対1.01±0.13mm、p<0.05)、IVST(1.43±0.12対1.62±0.12mm、p<0.05)、LVPW(1.51±0.13対1.76±0.31 mm、p<0.05)、LVdD(10.3±0.6対9.4±1.0mm、p<0.05、 LDsD(8.87±0.62対7.52±0.15mm、p<0.05) を減じ、またFS(14.0±3.7対20.0の±8.4%、p<0.05)を改善させた(図37および図38)。 注入されたCOMP-Ang1は、注入後30、120および240minで注入梗塞ゾーンで、大部分は、局在化された。注入されたCOMP-Anglは、注入後に330minで、処理されたエリアにおいてまだ検知できた。したがって、COMP-Ang1は、著しく心筋梗塞のラット・モデルの左心室リモデリングを減ずる。これらの検討結果は、COMP-Ang1が虚血心の治療的血管形成用の有効な分子(化合物)であることを示唆する。
Claims (4)
- 生物学的に活性な多量体を形成し、アンジオポイエチン-1のフィブリノーゲン様の領域であるTie2受容体結合ドメインにリンクされた軟骨オリゴマー化マトリックス・タンパク質(COMP)のコイルドコイルドメインを含むコイルドコイル・キメラ分子の有効な量を、必要のある人に投与することを含む陰茎の勃起障害の治療剤。
- 勃起障害は、高コレステロール症または血管疾患のタイプであることを特徴とする請求項1に記載の治療剤。
- 前記多量体はホモマーである請求項1に記載の治療剤。
- 前記多量体は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体又は十量体である請求項1に記載の治療剤。
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