JP4942908B2 - 組織再生組成物 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
（関連出願の相互参照）
本願は、１９９９年１２月２２日に出願した米国特許仮出願番号６０／１７１，７３３に基づき、そしてこれに対して優先権を主張する。
（連邦政府の委託研究に関する記載）
本発明は、国立衛生研究所助成金、１−Ｒ４３−ＨＬ８５７６１−０１、１−Ｒ４３−ＤＣ−０４３８７−０１、および１−Ｒ４３−ＤＣ−４３８７−０２のもとで支援された。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、失活（ｄｅｖｉｔａｌｉｚｅｄ）無細胞組織再生組成物、生成方法、および使用方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
（発明の背景）
温血脊椎動物の粘膜下組織は、組織移植材料において有用である。例えば、小腸由来の粘膜下組織移植片組成物は、米国特許第４，９０２，５０８号（本明細書中にて以後、‘５０８特許）および米国特許第４，９５６，１７８号（本明細書中にて以後、‘１７８特許）に記載されており、そして膀胱由来の粘膜下組織移植片組成物は、米国特許第５，５５４，３８９号（本明細書中にて以後、‘３８９特許）に記載されている。これらの組成物は全て、本質的に同じ組織層からなり、そして同じ方法によって調製される（これらの違いは、開始材料が、一方では小腸であり、他方では膀胱であることである）。‘５０８特許に詳述される手順、‘３８９特許において参考として援用される手順、および‘１７８特許に詳述される手順は、少なくとも腸または膀胱の粘膜の管腔部分（すなわち、‘１７８特許において詳述されるような、薄層上皮粘膜（上皮）および固有層）を含む、組織の内層を取り出す機械的な擦過工程を含む。粘膜の剥離、皮膚剥脱、または切屑は、上皮細胞およびそれらに付随する基底膜、ならびに、ほとんどの固有層を（少なくとも、器質化濃密（ｄｅｎｓｅ）結合組織の層（緻密層）のレベルまで）離層する。従って、軟部組織の置換材料としてすでに認識されている組織移植片材料は、上皮基底膜を欠いており、そして粘膜下組織および緻密層からなる。
【０００４】
上皮基底膜とは、上皮細胞の基底面と隣接する細胞外材料の薄いシートである。類似型の凝集された上皮細胞のシートは、上皮を形成する。上皮細胞およびそれらに付随する上皮基底膜は、粘膜の管腔部分に位置し、身体の管状および中空の器官ならびに組織の内面を構成する。上皮細胞およびそれらに付随する上皮基底膜はまた、身体（すなわち、皮膚）の外面上に位置する。基底膜を有する代表的な上皮組織の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：皮膚、腸、膀胱、食道、胃、角膜、および肝臓の上皮。
【０００５】
上皮細胞は、上皮基底膜の管腔側、すなわち皮相側（結合組織に対して反対）に位置する。結合組織（粘膜下組織）は、例えば、基底膜の遠管腔（ａｂｌｕｍｉｎａｌ）側、すなわち深側に位置する。上皮基底膜の遠管腔側に位置する結合組織の例としては、腸および膀胱の粘膜下組織、ならびに真皮および皮膚の粘膜下組織がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、哺乳動物組織欠損の修復および温血脊椎動物上皮組織由来のインビトロでの細胞増殖を誘導するための、上皮基底膜を含む基質を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
１つの局面において、本発明は、哺乳動物における組織欠損の修復を誘導するための失活基質であって、単離された失活哺乳動物上皮基底膜およびこの基底膜の直下にある固有層を含む基質に関する。
【０００８】
１つの実施形態において、上記基底膜は膀胱由来であり得る。
【０００９】
別の実施形態において、上記基底膜は小腸由来であり得る。
【００１０】
別の実施形態において、上記基質は上記組織欠損で縫合され得る。
【００１１】
別の実施形態において、上記基質は上記組織欠損に注射され得る。
【００１２】
別の実施形態において、上記基質は組織欠損固定デバイスに適用され得る。
【００１３】
別の実施形態において、上記基質は薬学的因子と混合され得る。
【００１４】
別の局面において、本発明は、哺乳動物における組織欠損の修復を誘導するための組成物であって、哺乳動物上皮基底膜およびこの基底膜の直下にある固有層を含む失活基質を含む組成物に関する。
【００１５】
１つの実施形態において、修復は、上記組織欠損部位での結合組織の修復および上皮組織の修復の誘導を包含し得る。
【００１６】
別の局面において、本発明は、哺乳動物の上皮基底膜およびこの上皮基底膜の直下にある固有層を含む失活組成物であって、ここで、基底膜および固有層は、哺乳動物上皮組織の上皮細胞および固有層の遠管腔部分の細胞から離層される失活組成物に関する。
【００１７】
別の局面において、本発明は、哺乳動物の上皮基底膜、固有層、および筋層の平滑筋細胞を含む失活組成物であって、ここで、上皮基底膜、固有層、および平滑筋細胞は、哺乳動物上皮の上皮細胞から離層される失活組成物に関する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、哺乳動物の上皮基底膜および粘膜下組織を含む失活組成物であって、ここで、上皮基底膜および粘膜下組織は、哺乳動物上皮組織の上皮細胞および筋層から離層される失活組成物に関する。
【００１９】
別の局面において、本発明は、失活組織移植片組成物の製造方法に関する。この方法は、以下：
哺乳動物の上皮組織を上皮分離溶液に浸して、上皮基底膜を有する上皮分離された組織を形成する工程；および
この組織の遠管腔表面上の上皮分離された組織を擦過して離層された組織を形成する工程であって、ここで、この組織を擦過した後の残りの離層された組織が、この上皮基底膜の少なくとも一部を含み、そしてこの基底膜を含む離層された組織が、内在性組織修復を誘導する、工程、
を包含する。
【００２０】
１つの実施形態において、上記上皮分離溶液は、１．０Ｎの生理食塩水を含み得る。
【００２１】
別の実施形態において、上記遠管腔表面は、上記上皮基底膜よりも深部の組織表面を含み得る。
【００２２】
別の実施形態において、上記上皮組織は膀胱を含み得る。
【００２３】
別の実施形態において、上記上皮組織は小腸を含み得る。
【００２４】
別の局面において、本発明は、哺乳動物上皮基底膜およびこの基底膜の直下にある固有層を含む失活基質に関する。ここで、この基質は、病的心臓組織、欠損心臓組織、または欠けている心臓組織と接触下に配置された場合、この病的心臓組織、欠損心臓組織、または欠けている心臓組織の修復を誘導する。
【００２５】
１つの実施形態において、上記基質はあつらえて成形されて、上記病的心臓組織または欠損心臓組織に適合され得る。
【００２６】
別の実施形態において、上記上皮基底膜は、哺乳動物の膀胱由来であり得る。
【００２７】
別の実施形態において、上記上皮基底膜は、哺乳動物の腸由来であり得る。
【００２８】
別の実施形態において、上記基質は、注射可能な形態の基質を含み得る。
【００２９】
別の実施形態において、上記基質はさらに、薬学的因子を含み得る。
【００３０】
別の実施形態において、上記心臓組織は、心臓弁の少なくとも一部であり得る。
【００３１】
別の実施形態において、上記基質は、心房中隔の少なくとも一部で修復または置換し得る。
【００３２】
別の実施形態において、上記心臓組織は、心室中隔の少なくとも一部であり得る。
【００３３】
別の実施形態において、上記心臓組織は、心筋の少なくとも一部であり得る。
【００３４】
別の局面において、本発明は、哺乳動物上皮基底膜およびこの基底膜の直下にある固有層の少なくとも一部を含む失活基質を含む失活組成物であって、ここで、病的心臓組織、欠損心臓組織、または欠けている心臓組織と接触下に配置された場合に、この病的心臓組織、欠損心臓組織、または欠けている心臓組織の修復を誘導する、失活組成物に関する。
【００３５】
１つの実施形態において、上記病的心臓組織または欠損心臓組織の修復はさらに、内在性上皮の修復を誘導することを含み得る。
【００３６】
別の局面において、本発明は、哺乳動物上皮組織の細胞から離層されそして病的心臓組織または欠損心臓組織に適合するために成形された、上皮基底膜の少なくとも一部を含む組成物に関する。
【００３７】
１つの実施形態において、上記組成物は、哺乳動物上皮の細胞から離層された固有層をさらに含み得る。
【００３８】
好ましい実施形態において、上記組成物は、哺乳動物上皮組織の細胞から離層された筋層の筋細胞をさらに含み得る。
【００３９】
別の実施形態において、上記哺乳動物上皮組織は膀胱を含み得る。
【００４０】
別の実施形態において、上記哺乳動物上皮組織は腸を含み得る。
【００４１】
別の実施形態において、上記病的心臓組織または欠損心臓組織は、心臓弁の少なくとも一部を含み得る。
【００４２】
好ましい実施形態において、上記心臓弁は、肺動脈弁、大動脈弁、右房室弁、または左房室弁からなる群より選択され得る。
【００４３】
別の実施形態において、上記病的心臓組織または欠損心臓組織は心筋を含み得る。
【００４４】
【発明の実施の形態】
（発明の要旨）
本発明は、組織の修復または再生のための基質または足場の一部として上皮基底膜を含む失活させた組織再生組成物を提供する。失活哺乳動物組織再生組成物における上皮基底膜の包含は、上皮基底膜を含まない上記の粘膜下基質と比較して、インビボでの内在性細胞の増殖および組織の回復を向上を生じる。本発明の意図に関して、失活とは、無細胞または実質的に無細胞を意味する。本発明の意図に関して、上皮基底膜とは、インタクトな上皮基底膜の少なくとも一部を意味する。
【００４５】
本発明に従って、哺乳動物組織の修復または再生のための好ましい失活基質は、哺乳動物の上皮基底膜の少なくとも一部、好ましくは全ての上皮基底膜、および基底膜の直下にある固有層を含む。本発明の失活基質は、宿主組織と接触下に配置された場合、病的組織、欠損組織、または欠けている組織を回復または置換する。好ましい実施形態において、本発明は、病的組織または欠損組織に適合するようあつらえて成形（ｃｕｓｔｏｍ−ｓｈａｐｅｄ）される失活基質を含む。特定の実施形態において、基質としては、膀胱、腸、または任意の他の哺乳動物上皮組織由来の基質のシートが挙げられる。別の実施形態において、基質は、微細粒状、乳剤、ゲル、または抽出物に変換されることによって注射可能になる。本発明の基質は、薬学的因子のためのキャリアとして作用し得る。本発明の基質の好ましい適用は、心臓組織の修復または回復である。詳細には、本発明の基質または組成物は、心臓弁、心房中隔、心室中隔、または心筋層の少なくとも一部を回復または置換するのに有用である。本発明の意図に関して、基質と組成物は、交換可能な用語である。
【００４６】
１つの実施形態において、本発明は、上皮基底膜および基底膜の直下にある固有層を含む失活組成物を特徴とする。上皮基底膜および基底膜直下にある固有層は、哺乳動物の上皮および固有層の遠管腔部位の細胞から離層される。本発明のこの局面において使用される哺乳動物の上皮組織は、好ましくは、膀胱、腸、または任意の他の哺乳動物上皮組織由来である。さらなる実施形態は、病的心臓弁あるいは欠損心臓弁（例えば、肺動脈弁、大動脈弁、右房室弁もしくは左房室弁、または心筋層の少なくとも一部）に適合するように成形された組成物を特徴とする。
【００４７】
なお別の実施形態において、本発明は、上皮基底膜、固有層、および粘膜下組織を含む組成物を特徴とする。上皮基底膜および固有層は、上皮の細胞から、および哺乳動物の上皮組織の筋層から離層される。
【００４８】
なお別の実施形態において、本発明は、上皮基底膜、固有層、および筋層の平滑筋細胞を含む組成物を特徴とする。これらの細胞は全て、哺乳動物上皮の上皮細胞から全て離層される。
【００４９】
本発明に従う組成物は、包含されるこれらの実施形態だけに限定されない。むしろ、本発明に従う組成物は、インタクトな上皮基底膜の少なくとも一部、好ましくはその全体との組合せた上皮組織の１つ以上の層を含む。
【００５０】
別の局面において、本発明は、病的心臓組織または欠損心臓組織の回復または修復を誘導するための方法を提供する。本発明の好ましい方法は、宿主組織と哺乳動物由来の失活基質とを接触させる工程を含む。失活基質は、少なくとも上皮基底膜および基底膜直下にある固有層の一部を含む。好ましい実施形態において、本発明の方法は、本発明の組織再生組成物を用いて内在性上皮の修復を誘導する工程を含む。
【００５１】
（発明の詳細な説明）
本発明に従う失活組織再生組成物は、哺乳動物上皮組織から収集した上皮基底膜または上皮基底膜の少なくとも一部、および固有層の少なくとも下部を含む。
本発明の使用のための好ましい上皮組織としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：膀胱、ならびに尿−生殖管の他の組織、小腸、食道および胃腸管の他の組織、皮膚、肝臓、および動脈（例えば、大動脈）、ならびに心臓血管系の他の組織。好ましい実施形態において、本発明は、上皮基底膜の少なくとも一部および下にある固有層（管腔上皮細胞、遠管腔外膜、漿膜（ｓｅｒｏｓａｌ）、および平滑筋層、から分離される）を含む組織移植片組成物を提供し、そして、本発明に従う粘膜下組織層の組織分離または組織離層の技術は、実質的に細胞を含まない上皮基底膜または上皮基底膜の少なくとも一部、を含む失活細胞外基質材料の層を提供する。任意の残りの細胞エレメントは、次いで、高張生理食塩水、過酢酸または滅菌水中でリンスするようなさらなるプロセシング工程によって取り出される。
【００５２】
従って、図１Ａおよび図１Ｂを参照して、本発明の好ましい実施形態は、上皮基底膜Ｂ、ならびに図１Ａに図解されている腸または図１Ｂに図解されている膀胱の上皮基底膜Ｂの直下にあり、かつ上皮基底膜Ｂの遠管腔側上に位置する固有層Ｃとして公知の生物内向性結合組織、あるいは任意の他の上皮組織を含む。本発明のこの実施形態は、上皮基底膜Ｂおよび上皮基底膜Ｂに隣接する固有層Ｃの一部を特徴とする。上皮基底膜Ｂおよび固有層Ｃは、上皮細胞Ａ、粘膜下組織Ｄ、筋層Ｅ、および漿膜Ｆから離層される。従って、本発明のこの実施形態において、管腔Ｌに隣接する粘膜Ｈの部分（すなわち、粘膜の管腔部分）は、好ましい組織基質組成物を形成する。
【００５３】
別の好ましい実施形態において、再び図１Ａおよび図１Ｂを参照して、本発明の組成物は、上皮基底膜Ｂ、固有層Ｃ、および粘膜下組織Ｄを含む。上皮基底膜Ｂ、固有層Ｃ、および粘膜下組織Ｄは、上皮細胞Ａ，筋層Ｅ，および漿膜Ｆから離層される。この実施形態において、上皮基底膜、および粘膜下組織を含む粘膜Ｈの一部は、好ましい組織基質組成物を形成する。
【００５４】
なお別の組成物において、本発明の好ましい実施形態は、上皮基底膜Ｂ、上皮基底膜Ｂに隣接して位置する固有層Ｃ、粘膜下組織Ｄ、および筋層Ｅの少なくとも一部を含む。
【００５５】
（上皮組織の供給源）
本発明の組織再生組成物のための材料は、代表的にブタ、ウシ、およびヒツジを含むがこれらに限定されない、食肉生産のために飼育されている動物から収集された組織から調製される。他の温血脊椎動物はまた、組織の供給源として有用であるが、食肉生産のために使用される動物由来のこのような組織のより卓越した有用性は、このような組織をより望ましいものにする。従って、本発明に従う組織組成物の調製における使用のための組織の市販の安価な供給源がある。組織供給源として使用される特定の種の特別に繁殖された系統または遺伝的に操作された系統が存在し得る。例えば、ガラカトシル，α１，３ガラクトース（ＧＡＬエピトープ）を含まないよう遺伝的に操作されているブタは、この組成物を産生するための組織の供給源として使用され得る。あるいは、特定の病原体を有さないよう飼育されているブタの群は、組織供給源として使用され得る。本発明の組成物の産生のための組織供給源として使用される哺乳動物組織は、任意の年齢群（胚組織、市場重量、性別、または性的成熟の段階を含む）の動物から収集され得る。
【００５６】
（上皮基底膜の組織供給源）
（膀胱）
上皮基底膜の好ましい供給源は、ブタのような温血脊椎動物の図１Ｂに図解された膀胱である。性質を再構築する優れた生物学的組織は、侵襲なしに細胞増殖を支持して促進する上皮基底膜の構成成分由来であり、そして内在性細胞の接着、侵襲、増殖、および分化を可能にして、これらを促進する下にある固有層基質材料由来である。膀胱基質（ＵＢＭ）として本明細書において以後に引用される基質としては、膀胱上皮の基底膜Ｂおよび下にある固有層Ｃが挙げられる。この実施形態において、上皮基底膜Ｂおよび下にある固有層Ｃは、上皮細胞Ａおよび粘膜組織Ｄの細胞外基質、筋層Ｅ、ならびに漿膜Ｆから離層される。ＵＢＭは、任意の温血脊椎動物から収集されるが、最も好ましいのは、ブタからの収集である。ＵＢＭは、身体組織ならびに器官（例えば、筋骨格および心臓血管構造体、皮膚科学的組織および胃腸組織、尿生殖組織および生殖組織、神経学的組織、肝臓、腎臓、ならびに、頭部組織および頸部組織）の修復または回復のための生物骨格として使用される。
【００５７】
好ましいＵＢＭ組織再生組成物は、上皮基底膜、好ましくは膀胱基底膜、および温血脊椎動物の膀胱組織由来の上皮基底膜の直下に位置する生物内向性分子構造体を含む。この実施形態において、上皮基底膜は、管腔の上皮細胞、遠管腔外膜組織、漿膜組織、および平滑筋組織、なたびに粘膜下組織から離層される。本発明の組織移植片組成物は、傷害性、欠けている、または欠損（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）した組織または器官の修復または置換を引き起こすよう、脊椎動物の宿主中に移植されるかまたは注射される先に記載された粘膜下組織の移植片組成物と比較して、著しく優れた組織を増殖する特徴を有する。
【００５８】
本発明の方法は、上皮基底膜の完全な損失を回避し、そして上皮基底膜の少なくとも一部を含む組織再生組成物を生じる。好ましい実施形態において、従来の組織化学技術または免疫組織化学技術および光学顕微鏡法または電子顕微鏡法によって決定されるような上皮基底膜は、主として無傷である。本発明の方法によって得られた生じる失活材料は、上皮基底膜を除く粘膜下組織を含む移植片材料を生じる、‘５０８特許および‘３８９特許において記載される小腸および膀胱由来の組織移植片組成物を生成するための方法とは対照的である。膀胱組織由来のＵＢＭの調製のための工程は、‘５０８特許および‘３８９特許において記載されるような粘膜下組織移植片組成物の調製のための先に記載された工程とは異なる。‘５０８特許および‘３８９特許において記載される粘膜下組織の移植片組成物の調製のための方法において、粘膜は、擦過によって機械的に取り出される。
【００５９】
本発明に従って、ＵＢＭは、温血脊椎動物（例えば、ブタ）由来の膀胱組織を取り出すことによって、そして上皮分離（ｄｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚｉｎｇ）溶液（例えば、高張生理食塩水、最も好ましくは１．０Ｎの生理食塩水）に、１０分〜４時間の時間範囲で、組織をまず浸すことで組織を離層することによって調製される。高張生理食塩水に曝露することで、下にある基底膜から効果的に上皮細胞を取り出す。最初の離層する手順後の残りの組織としては、上皮基底膜および上皮基底膜に対して遠管腔な組織層が挙げられる。この組織は、上皮基底膜以外の、主な遠管腔組織を取り出すための次のさらなる処置に供される。外側の漿膜組織、外膜組織、平滑筋組織、粘膜下組織、および固有層の遠管腔部分は、機械的な擦過によってか、または酵素的処置、水和、および擦過の組合せによって、残りの上皮分離された組織から取り出される。これらの組織の機械的な取り出しは、例えば、Ａｄｓｏｎ−Ｂｒｏｗｎ摂子およびＭｅｔｚｅｎｂａｕｍ鋏を用いた腸間膜組織の取り出し、そしてメスの柄または湿らせたガーゼに包まれた他の堅い物を用い、縦方向の拭う動作で筋層および遠管腔固有層を拭うことによって達成される。これらの組織が取り出された後、生じた組織骨格は、上皮基底膜および下にある固有層からなる。この組織は、本発明における主としてインタクトな上皮基底膜の含有が、すでに公知の動物上皮組織由来の組織組成物とは異なる。この組織はさらに、高張生理食塩水、過酢酸または滅菌水中でのリンスによって処置され得る。組織層（ミクロトーム）を取り出す他の方法は、また、例えば、本発明の組織組成物を得るために使用され得る。
【００６０】
本発明に従う組織再生組成物の調製のための方法は、開始材料としての膀胱組織の使用に限定されない。本発明に従う方法はまた、他の開始組織（例えば、皮膚、食道、胃、および腸組織に対して適用性がある。
【００６１】
本発明の方法に従うＵＢＭの調製後、生じた組織骨格は、主に（すなわち、約９０％より多く）、上皮基底膜を含む細胞外基質（ＥＣＭ）からなる約１０〜１２０マイクロメートルの厚みの材料からなる。この材料は、本来の組織（例えば、毛細血管の内皮細胞または線維細胞）を含む細胞のエレメントのいくつかを保持していてもよいし、保持していなくてもよい。これらの細胞のエレメントは、生体材料の消毒の一部としての過酢酸への引き続く曝露によって除去される。この材料は、管腔表面を区分する平滑上皮基底膜、および、遠管腔表面を区分する密集した、部分的に組織化されたコラーゲンＥＣＭに起因して、その組織学的様子およびその構造が、粘膜下組織の移植片組成物とは異なる。ＥＣＭ材料は、Ｈ＆Ｅ染色でピンクに染まり、そしてマッソン三色染色で青く染まる。
【００６２】
（皮膚、食道）
同様に、膀胱に類似する組織層を有する他の上皮器官（例えば、皮膚、または食道）由来の組織再生組成物の調製において使用される工程は、ＵＢＭを調製するための上記の工程に対応する。膀胱基質のように、上皮細胞、漿膜、筋層、および遠管腔固有層を取り出した後に残っている材料は、上皮基底膜の少なくとも一部および隣接する固有層を含む。
【００６３】
（小腸）
本発明の組織再生組成物はまた、胃腸管（例えば、小腸）の上皮組織由来である。小腸の上皮基底膜の少なくとも一部およびＳＩＭと名付けられた下にある固有層を含む組織再生組成物の調製における工程は、ＵＢＭの形成のための上記の工程に類似する。１．０Ｎの生理食塩水を用いて、上皮基底膜由来の腸上皮細胞を取り出し得る。上皮細胞を取り出すための代替方法は、界面活性剤（例えば、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００））に、０．０２５〜１％の濃度で、５分間〜数時間、上皮組織を浸す方法である。
【００６４】
１つの実施形態において、上皮組織由来の離層された組織再生組成物は、凍結水和物状態で保存されるか、または室温で風乾されてから保存されるか、のいずれかである。あるいは、組織再生組成物は、凍結乾燥され、そして室温または冷凍でのいずれかにて脱水状態において保存される。なお別の実施形態において、組織再生組成物は、組織を可溶化して実質的に均質な溶液を形成するのに十分な時間の間、プロテアーゼ（例えば、ペプシンまたはトリプシン）中で材料を消化することによって細かくされ得、そして流動化され得る。可溶化材料の粘性は、ゲル、ゲル−ゾル、または完全な液体状態になるようｐＨを調整することによって、変化され得る。流動化された腸管粘膜下組織の調製は、例えば、米国特許第５，２７５，８２６号において記載される（本明細書において、参考として明確に援用される）。
【００６５】
なお別の実施形態において、本発明は、組織再生組成物の粉末形態の使用を考慮する。１つの実施形態において、組織再生組成物の粉末形態は、０．００５ｍｍ^２〜２．０ｍｍ^２のサイズの範囲にある粒子を生成するよう離層された材料を細かく刻むか、または粉砕することによって形成される。所望されない組織層から離層された材料は、粉砕手順を実施するために、例えば、液体窒素中で凍結される。あるいは、材料は、粉砕手順を実施するために脱水される。次いで、この粉砕された形態の材料は、実質的に無水の粒子組織再生組成物を形成するために凍結乾燥される。
【００６６】
本発明の組織組成物は、再建的な創傷治癒および組織再生を誘導する目的のための多数の外科的適用および非外科的適用に適切である。例えば、これらの組織組成物を用いて、傷害性、病的、または欠損した心臓弁、動脈、静脈、膀胱、肝臓、胃腸管の一部を置換するか、あるいはこれらの組織組成物は、頭部構造体および頸部構造体の修復または置換のための鋳型として使用され得る。多数固体または流動化形態のいずれかである材料は、真皮の修復または表皮の修復のための足場として使用され得るか、種々の体括約筋（例えば、尿括約筋または食道括約筋もしくは胃括約筋）に注射され得るか、神経組織の再生のための導管として管または一部の管中に折り畳まれ得るか、あるいは組織再生組成物として、この適用に適切な任意の形状に押出し成形され得るか、または鋳造され得る。本発明の組織再生組成物は、固体シート形態で配置されて縫合され得るか、ゲルの形態で創傷または身体の部位に置かれ得るか、あるいは液体または粒子形態で注射され得る。本発明の組織組成物は、インビボでの標的組織が、上皮基底膜の少なくとも一部を含む哺乳動物由来の失活組織組成物に接触して配置される場合、上皮組織および結合組織を含む内在性組織の増殖を誘導する。
【００６７】
（膀胱基質（ＵＢＭ））
ＵＢＭ組成物は、少なくともＩ型コラーゲンおよびＩＶ型コラーゲン、グリコサミノグリカン（ヒアルロン酸、硫酸コンドロイチンＡおよび硫酸コンドロイチンＢ、ヘパリンおよび硫酸ヘパリンを含む）を含む。さらに、１つ以上の塩基性線維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、およびＴＧＦβが、ＵＢＭ中に存在する。
【００６８】
ＵＢＭの物理学的性質は、部分的に特徴付けられている。ＵＢＭは、１．０ｃｍ幅の小片あたり約０．１〜２．０ポンドの単軸強度を有する（１インチ／分で牽引するＡｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｍａｔｅｒｉａｌｓを介した材料を試験するシステムマシンを用いて測定された）。この材料の縫合保持強度は、シート層あたり約１．０〜４．０ニュートン（Ｎ）、特に、４層基質について４〜１８Ｎ、そして３０層基質について３０〜１２０Ｎである。ボールバースト試験破損力（ｂａｌｌ ｂｕｒｓｔ ｔｅｓｔ ｆａｉｌｕｒｅ ｆｏｒｃｅ）は、各層あたり約４〜１０ポンド、特に、８層について３２〜８０Ｎ、４層について１６〜４０Ｎ、そして１２層について３６〜１２０Ｎである。
【００６９】
有孔性指標は、１２０ｍｍＨｇ圧で１ｃｍ^２／分あたり、材料を通って流れる水の量として定義される。水の有孔性は、流れる方向に依存して、ＵＢＭの一方の側と他方の側とで異なる。水は、基質の遠管腔側から上皮基底膜への水流の約２０％の速度で、上皮基底膜から遠管腔側へと流れる。ＵＢＭはまた、粘弾性質を有する。
【００７０】
ＵＢＭは、多数の標準方法のいずれかによって、内在性組織増殖を誘導する能力を欠損することなく滅菌され得る。例えば、生理食塩水および０．０５％〜１．０％の過酢酸でリンスした後、材料を、エチレンオキシド処理、γ照射処理（０．５〜２．５ｍＲａｄ）、ガスプラズマ（ｇａｓ ｐｌａｓｍａ）滅菌、または電子ビーム（ｅ−ｂｅａｍ）処理によって滅菌し得る。材料をまた、タンパク質材料に架橋を引き起こすグルタルアルデヒドを用いる処理によって滅菌し得るが、この処理は、この材料を実質的に変更し、その結果、この材料は、ゆっくりと吸収されるかまたは全く吸収されず、そして建設的な再構築よりむしろ瘢痕組織形成または被包により密接に類似する異なる型の宿主の再構築を誘発する。タンパク質材料の架橋はまた、カルボジミドを用いて誘発され得るか、またはデヒドロサーマル（ｄｅｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌ）法もしくは光酸化法を用いて誘発され得る。
【００７１】
本図面は、ものさしで測るためのものではなく、その代わり、一般に本発明の原理を図解することに重点を置いている。
【００７２】
【実施例】
以下の実施例は、本発明の首尾良い実施をより良く実証するために役立つ。
【００７３】
（実施例）
本発明の方法および組成物の有用性の実施例として、ＵＢＭを、心臓弁欠損に適用する。当業者によって認識されるように、本明細書において開示された方法および組成物は、膀胱以外の上皮組織の供給源由来の、ブタ以外の哺乳動物供給源由来の、および心臓弁以外の組織欠損に対する、他の組織再生組成物に適用可能である。さらに、本発明の組織再生組成物は、１シートまたは多層シートの材料以外の形態で適用され得る（例えば、ＵＢＭは、抽出物として、ゲル形態で、粉末化形態で、管状形態で、シート形態で、あるいは小片、コード（ｃｏｒｄ）または支柱（ｓｔｒｕｔ）として、あるいは他の薬学的因子（例えば、成長因子および遺伝子産物）との混合物として適用され得る）。ＵＢＭは、身体の特定の適用に適合するような形態中またはこの形態上で、押出し成形されるか、または鋳造され得る。流動形態の組織調製物は、米国特許第５，２７５，８２６号において記載され、この開示は、本明細書において参考として援用され、そして組織の固体シートおよび小片の調製物は、米国特許第５，７１１，９６９号において記載され、この開示は、本明細書において参考として援用される。
【００７４】
（適用１：心臓組織の修復）
本発明に従う、１つの実施形態は、心臓組織の修復または置換のための組織再生組成物である。心臓組織としては、以下を含む病的心臓組織、損傷心臓組織、または欠損心臓組織が挙げられるが、これらに限定されない：心筋層、心外膜、心内膜、心膜、心房中隔、および心室中隔、ならびに全ての心臓弁および付随する弁葉（肺動脈弁、大動脈弁、右房室弁および左房室弁、ならびに心臓の隣接する管（肺動脈、肺静脈、大動脈、下大静脈、および上大静脈を含む）の一部を含む）。
【００７５】
本明細書において開示された本発明のこの実施形態において、ＵＢＭを、上記のように、ブタの膀胱から調製し、そして５匹のブタと３匹のイヌにおいて自家および異種の肺動脈弁の前方心臓弁置換葉として用いた。
【００７６】
ＵＢＭ（単一シートの材料としてか、または２倍厚い材料として構成された）を、肺動脈弁前方葉に適合するように、手術時に鋏またはメスを用いて切り取った。ＵＢＭを、弁底（ｂａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｌｖｅ）の輪に直接縫合した。単一シートの実施形態において、ＵＢＭの上皮基底膜側を、その置換弁葉の右心室の管腔側上に置き、肺動脈弁の輪に直接縫合した。２倍厚いＵＢＭの実施形態において、ＵＢＭを折り畳み、その結果、上皮基底膜を置換肺動脈弁葉の両表面（すなわち、心室表面および動脈表面）上に置き、そして、直接肺動脈弁の輪に縫合した。
【００７７】
実験イヌおよび実験ブタの肺動脈弁を、弁置換後の６週間目および１２週間目で試験した。一匹のイヌを、弁葉置換後、５ヶ月目に試験した。標準的な組織固定技術および組織病理学技術を用いて、収集した弁葉を試験した。
【００７８】
弁葉置換後６週間目には、置換弁葉の上皮形成は、全ての弁葉表面にわたって存在した。弁葉表面全体にわたって移動する細胞は、フォン・ビルブラント因子で陽性に染色され、これらの細胞が内皮起源であることを示した。いくつかの弁葉において、内皮細胞のいくらかは、初期前駆体細胞の性質を有した。新生血管形成、内皮細胞浸潤、および細胞外基質の沈着が、肺動脈弁の輪の宿主組織から生じ、そしてこの置換弁葉中に広がっていることを観察した。
【００７９】
弁葉置換後１２週目および５ヶ月目には、元来のＵＢＭ組織組成物は、全く認められず、そして弁葉の回復は、完全であった。試験した全ての時点における予想外の知見としては、置換弁葉中への内皮の浸潤の欠如、血栓症の欠如、ならびに、この置換弁葉のカルシウム沈着または細胞媒介拒絶の欠如が挙げられる。さらに、この置換弁葉の形状は、試験した全ての時点において、元来の弁葉の形状から変化しなかった。
【００８０】
弁置換後８週間目、１２週間目、１６週間目、および２０週間目のブタにおける肺動脈弁の超音波研究は、完全な弁を実証した。
【００８１】
本発明のこの局面の別の実施形態において、流動化形態、粉末化形態または粉砕化形態のＵＢＭを、病的心臓組織または欠損心臓組織内にかまたはそれらの組織に隣接して適用するかあるいは注射して、内在性組織の修復を促進させる。例えば、流動化ＵＢＭを、先天性心室内中隔欠損、先天性心房内中隔欠損内にかまたはそれらに隣接して注射するか、あるいは動脈管の管腔内に注射して、これらの部位における組織の内在性増殖を促進させる。
【００８２】
心臓組織に対するＵＢＭの適用を、いくつかの異なる外科的アプローチの適用によって達成する。例えば、最小侵襲性手順を用いて、ラプロスコープ（ｌａｐｒｏｓｃｏｐｅ）の補助を用いて心臓の外科的部位にアプローチする。あるいは、開胸を実施する。ＵＢＭを、その調製された形態（例えば、シート、ループ、小片、または注射可能な粉末化形態もしくは粉砕状態）のいずれかで外科的部位に導入する。ＵＢＭのシートまたは小片を、外科的手順前または手術中の特定の心臓適用のためにあつらえ適合（ｃｕｓｔｏｍ−ｆｉｔ）する。ＵＢＭのシートまたは小片を、縫合、止め金、組織接着剤、または当業者に公知の任意の他の手段を用いて、欠損心臓組織または病的心臓組織に隣接接してかまたはその中に確保する。
【００８３】
（適用２：インビトロでの細胞増殖のための基質）
ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）は、内皮（上皮を模倣する様式においてインビボで基底膜上に組織化される細胞の単層）を形成する。研究を、以下の上にプレートした単離されたＨＭＶＥＣを用いてインビトロで行った：（ｉ）ＵＢＭのシートの上皮基底膜側、（ｉｉ）ＵＢＭの遠管腔表面、（ｉｉｉ）‘５０８特許および‘１７８特許において開示された方法に従って調製された小腸粘膜下組織の移植片組成物（ＳＩＳ）、および（ｉｖ）‘３８９特許において開示された方法に従って調製された膀胱粘膜下組織組成物（ＵＢＳ）。
【００８４】
ＨＭＶＥＣは、ＨＭＶＥＣがＳＩＳまたはＵＢＳの、管腔表面または遠管腔表面のいずれにプレートされたかにかかわらず、ＳＩＢまたはＵＢＳの表面上にプレートされた場合、その基質内に増殖し、そして、増殖３日後にコンフルエントな細胞層を形成しなかった。
【００８５】
ＵＢＭの遠管腔表面上にプレートされたＨＭＶＥＣは、その基質内へ増殖し、成熟内皮細胞へ増殖しそして分化した。ＳＩＳおよびＵＢＭの遠管腔表面上にプレートされたＨＭＶＥＣと同様にして、ＨＭＶＥＣのコンフルエントな層は、増殖３日後に、そのＵＢＭの遠管腔表面上に形成されなかった。
【００８６】
他のすでに公知の組織再生組成物（例えば、これらの研究における、ＳＩＳおよびＵＢＳ）と対照的に、ＵＢＭのシートの上皮基底膜側（管腔）上にプレートされたＨＭＶＥＣは、ＵＢＭに接着し、増殖し、分化し、そして増殖３日後にコンフルエントな単層を形成した。
【００８７】
（適用３：）
本発明の組織移植片組成物を用いて、インビボでの以下を含む組織の修復または置換を誘導し得ることが意図される：結合組織（例えば、靱帯、腱、軟骨、骨、関節、および筋肉）、上皮組織（例えば、膀胱）、および尿生殖管の他の組織、胃、食道、および胃腸管の他の組織、肝臓、神経組織、頭部の組織および頸部の組織、皮膚、ならびに米国特許第４，９０２，５０８号；米国特許第４，９５６，１７８号；米国特許第５，２８１，４２２号；米国特許第５，３５２，４６３号；米国特許第５，５５４，３８９号；米国特許第５，２７５，８２６号；米国特許第４，９０２，５０８号；米国特許第５，３７２，８２１号；米国特許第５，４４５，８３３号；米国特許第５，５１６，５３３号；米国特許第５，５７３，７８４号；米国特許第５，６４１，５１８号；米国特許第５，６９５，９９８号；米国特許第５，７１１，９６９号；米国特許第５，７５５，７９１号；米国特許第５，７６２，９６６号；および米国特許第５，８８５，６１９号（この開示は、本明細書において参考として援用される）に記載される同じ手順を用いる他の組織。本発明の組織移植片組成物はまた、組織の回復のために合成的ポリマーまたは非合成的ポリマーとともに使用され得る。
【００８８】
【発明の効果】
本発明により、哺乳動物組織欠損の修復および温血脊椎動物上皮組織由来のインビトロでの細胞増殖を誘導するための、上皮基底膜を含む基質が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１Ａは、小腸壁の断面図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、膀胱壁の断面図である。

Claims (53)

1. 哺乳動物における組織欠損の修復を誘導するための失活基質であって、該基質は、単離された失活哺乳動物上皮基底膜および該基底膜の直下にある固有層を含む、基質。
2. 前記基底膜が膀胱由来であることを特徴とする、請求項１に記載の基質。
3. 前記基底膜が小腸由来であることを特徴とする、請求項１に記載の基質。
4. 前記基質が前記組織欠損で縫合されることを特徴とする、請求項１に記載の基質。
5. 前記基質が前記組織欠損に注射されることを特徴とする、請求項１に記載の基質。
6. 前記基質が組織欠損固定デバイスに適用されることを特徴とする、請求項１に記載の基質。
7. 前記基質が薬学的因子と混合されることを特徴とする、請求項１に記載の基質。
8. 前記修復が、前記組織欠損部位での結合組織の修復および上皮組織の修復の誘導を包含することを特徴とする、請求項１に記載の基質。
9. 哺乳動物における組織欠損の修復を誘導するための薬学的組成物であって、該組成物は、哺乳動物上皮基底膜および該基底膜の直下にある固有層を含む失活基質を含むことを特徴とする、薬学的組成物。
10. 前記修復が、前記組織欠損部位での結合組織の修復および上皮組織の修復の誘導を包含することを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
11. 失活組成物であって、該組成物は、哺乳動物の上皮基底膜および該上皮基底膜の直下にある固有層を含み、ここで、該基底膜および固有層は、哺乳動物上皮組織の上皮細胞および固有層の遠管腔部分の細胞から離層されることを特徴とする、組成物。
12. 失活組成物であって、該組成物は、哺乳動物の上皮基底膜、固有層、および筋層の平滑筋細胞を含み、ここで、該上皮基底膜、固有層、および平滑筋細胞は、哺乳動物上皮の上皮細胞から離層されることを特徴とする、組成物。
13. 失活組成物であって、該組成物は、哺乳動物の上皮基底膜、固有層および粘膜下組織を含み、ここで、該上皮基底膜および粘膜下組織は、哺乳動物上皮組織の上皮細胞および筋層から離層されることを特徴とする、組成物。
14. 失活組織移植片組成物の製造方法であって、該方法は、以下：
    哺乳動物の上皮組織を上皮分離溶液に浸して、上皮基底膜および固有層を有する上皮分離された組織を形成する工程；および
    該組織の遠管腔表面上の該上皮分離された組織を擦過して離層された組織を形成する工程であって、ここで、該組織を擦過した後の残りの該離層された組織が、該上皮基底膜および固有層の少なくとも一部を含み、そして該基底膜を含む該離層された組織が、内在性組織修復を誘導する、工程、
    を包含する、方法。
15. 前記上皮分離溶液が１．０Ｎの生理食塩水を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
16. 前記遠管腔表面が前記上皮基底膜よりも深部の組織表面を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
17. 前記上皮組織が膀胱を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
18. 前記上皮組織が小腸を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
19. 失活基質であって、該基質は、哺乳動物上皮基底膜および該基底膜の直下にある固有層を含み、ここで、該基質は、病的心臓組織、欠損心臓組織、または欠けている心臓組織と接触下に配置された場合、該病的心臓組織、欠損心臓組織、または欠けている心臓組織の修復を誘導することを特徴とする、基質。
20. 前記基質があつらえて成形されて、前記病的心臓組織または欠損心臓組織に適合されることを特徴とする、請求項１９に記載の失活基質。
21. 前記上皮基底膜が哺乳動物の膀胱由来であることを特徴とする、請求項１９に記載の失活基質。
22. 前記上皮基底膜が哺乳動物の腸由来であることを特徴とする、請求項１９に記載の失活基質。
23. 前記基質が注射可能な形態の基質を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の失活基質。
24. 前記基質がさらに薬学的因子を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の失活基質。
25. 前記心臓組織が心臓弁の少なくとも一部であることを特徴とする、請求項１９に記載の失活基質。
26. 前記基質が心房中隔の少なくとも一部を修復または置換することを特徴とする、請求項１９に記載の失活基質。
27. 前記心臓組織が心室中隔の少なくとも一部であることを特徴とする、請求項１９に記載の失活基質。
28. 前記心臓組織が心筋の少なくとも一部であることを特徴とする、請求項１９に記載の失活基質。
29. 失活組成物であって、該組成物は、哺乳動物上皮基底膜および該基底膜の直下にある固有層の少なくとも一部を含む失活基質を含み、ここで、該組成物が、病的心臓組織、欠損心臓組織、または欠けている心臓組織と接触下に配置された場合に、該病的心臓組織、欠損心臓組織、または欠けている心臓組織の修復を誘導することを特徴とする、組成物。
30. 前記病的心臓組織または欠損心臓組織の修復がさらに、内在性上皮の修復を誘導することを含むことを特徴とする、請求項２９に記載の組成物。
31. 組成物であって、該組成物は、哺乳動物上皮組織の細胞から離層されそして病的心臓組織または欠損心臓組織に適合するために成形された、上皮基底膜および固有層の少なくとも一部を含むことを特徴とする、組成物。
32. 哺乳動物上皮組織の細胞から離層された筋層の筋細胞をさらに含むことを特徴とする、請求項３１に記載の組成物。
33. 前記哺乳動物上皮組織が膀胱を含むことを特徴とする、請求項３１に記載の組成物。
34. 前記哺乳動物上皮組織が腸を含むことを特徴とする、請求項３１に記載の組成物。
35. 前記病的心臓組織または欠損心臓組織が心臓弁の少なくとも一部を含むことを特徴とする、請求項３１に記載の組成物。
36. 前記心臓弁が、肺動脈弁、大動脈弁、右房室弁、または左房室弁からなる群より選択されることを特徴とする、請求項３５に記載の組成物。
37. 前記病的心臓組織または欠損心臓組織が心筋を含むことを特徴とする、請求項３１に記載の組成物。
38. 前記単離された失活上皮基底膜および固有層は、哺乳動物上皮の上皮細胞から離層され、そして、前記哺乳動物上皮基底膜は、該上皮細胞および該上皮細胞の細胞成分を含まないことを特徴とする、請求項１に記載の基質。
39. 粘膜下組織をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の基質。
40. 筋層をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の基質。
41. 前記基質の上皮側にプレートされた細胞をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の基質。
42. 前記基質の上皮側にプレートされた培養細胞株由来の細胞をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の基質。
43. 粘膜下組織をさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
44. 筋層をさらに含むことを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
45. 前記組成物が粘膜下組織をさらに含むことを特徴とする、請求項１４に記載の組成物。
46. 粘膜下組織をさらに含むことを特徴とする、請求項１９に記載の基質。
47. 前記失活基質が粘膜下組織をさらに含むことを特徴とする、請求項２９に記載の組成物。
48. 粘膜下組織をさらに含むことを特徴とする、請求項３１に記載の組成物。
49. 前記失活上皮基底膜および固有層は、哺乳動物上皮の上皮細胞から離層され、そして、前記哺乳動物上皮基底膜は、該上皮細胞および該上皮細胞の細胞成分を含まないことを特徴とする、請求項２９に記載の組成物。
50. 筋層をさらに含むことを特徴とする、請求項２９に記載の組成物。
51. 前記基質の上皮側にプレートされた細胞をさらに含むことを特徴とする、請求項２９に記載の組成物。
52. 前記基質の上皮側にプレートされた培養細胞株由来の細胞をさらに含むことを特徴とする、請求項２９に記載の組成物。
53. 前記哺乳動物上皮基底膜および固有層は、哺乳動物上皮の上皮細胞から離層され、そして、該哺乳動物上皮基底膜が、該上皮細胞および該上皮細胞の細胞成分を含まないことを特徴とする、請求項１９に記載の基質。

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