JP4940456B2 - 標的に対して高い親和性で結合する核酸を選択する方法 - Google Patents
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Description
(技術分野)
本発明は、標的に対して高い親和性で結合する核酸を選択するための方法に関する。
ここで核酸の混合物は、1または数個の所定の標的分子に接触され、この標的分子に結合している核酸は、固定され、そしてこの標的分子に結合した核酸は、結合していない核酸の除去後に、この標的分子によって脱離される。
【0002】
核酸は、5〜200、詳細には20〜200のヌクレオチド総数を有する、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドである。これらは、DNA、RNA、またはPNAであってもよい。
詳細には、核酸は、例えば、2’置換、および/もしくは5置換によって化学的に誘導体化され得るか、そして/またはレポーター分子(従来の検出方法を用いた検出を可能にする分子)を提供され得る。この核酸は、一本鎖であっても、または二本鎖であってもよい。標的分子は、標的分子が、それと接触された核酸とのクリック/ワトソン塩基対結合に入るような核酸でない限り、原則的には任意のタイプであり得る。
標的分子の例は以下である:ペプチド、タンパク質、酵素、オリゴ糖類、ポリ多糖類、核酸(クリック/ワトソン結合に入らない)、脂質、それらだけでなく、ホルモン、および他の有機化合物(フェロモン)。標的はまた、細胞の部分および完全な細胞、ならびに完全なウイルスおよび細菌であり得る。非核酸に結合している核酸は、アプタマーと命名されるが、これはまた他の核酸との非クリック/ワトソン結合に入る核酸である。最後に述べたアプタマーは、例えば、遺伝子における特定の遺伝子の欠陥および/または欠失の検出のために用いられ得る。結合(bond)という用語は、本発明において、非共有結合を意味する。親和性(affinity)(アフィニティー)という用語は、本発明において、抗原/抗体型の複合体の内部の結合力に関する。この結合力は、質量作用の法則のもとで規定される、親和性定数によって定量可能である。しかし、本発明において、親和性という用語は、結合部位を有する複合体に関するだけでなく、いくつかの結合部位を有する複合体にも関しており、すなわち、結合活性(アビディティー)(avidity)という用語も包含する。結合活性は、多価の抗体/抗原複合体のあらゆる結合部位の数および結合力から生じる。増幅とは、あらゆる酵素媒介反応が核酸の複製のために働くこと、例えば、PCRであると理解される。
【0003】
(背景技術)
核酸は、細胞などの中で発現されるべきタンパク質をコードするために天然の生物体において主に機能する。これは核酸の一次構造、すなわち配列によって決定される。しかし、これとは独立して、抗体/抗原複合体はまた、細胞中に存在する非核酸との結合に、または特別な場合には他の核酸との非クリック/ワトソン結合に入り得る。このような結合が生じるか否かは、一次構造だけでなく、所定の配列について溶液中で生成された二次構造、三次構造、および四次構造(三次元構造)にも依存する。標的分子に対する核酸の親和性は、少なくともこの核酸が、(純粋に化学的な結合能力に加えて)、古典的な抗体/抗原複合体についての条件に対応する標的分子の結合部位の領域または結合部位に関して、立体的に「マッチ(match)」しているか否かに依存する。
従って、マッチする核酸は、抗体または抗原の機能を発揮し得る。このようなアプタマーは通常は、非天然の核酸であり、そのため標的分子について、いわば「仕立てられ(tailored)」得る。仕立てること(tailoring)については、原則的に2つのアプローチが存在する。第一のアプローチは、標的分子の結合部位および三次構造を含む、以前に公知の構造に従う、核酸についての適切な配列および/または誘導体化の算出である。
これは、非常にコスト(費用)がかさむだけでなく、標的分子の構造が十分に公知でない場合には、このアプローチは不可能でさえある。第二のアプローチは、標的分子の単離、および予測される核酸の混合物と、この単離された(そしてほとんどの場合は固定された)標的分子との接触からなり、ここで高い親和性で結合する核酸は、低い親和性で結合するか、または全く結合しない核酸から分離される。
この核酸の混合物は、代表的には、例えば、コンビナトリアル化学によって確立された、核酸ライブラリーである。核酸ライブラリーは、複数の異なる核酸を含み、少なくとも部分的な配列領域において無作為化(天然のヌクレオチド、および/または天然でないヌクレオチド)が提供される。保存された配列領域が提供されてもよいが、これは必須ではない。m個の異なるヌクレオチドを有するn位置での無作為化によって、nm個のエレメント(要素)を有するライブラリーがもたらされる。選択された高い親和性の核酸は多数の適用に適切である。
【0004】
例えば、核酸は、試験溶液中、および/または細胞もしくは組織中における、この核酸に特異的な標的分子の有無についての試験に用いられ得る。測定による容易な識別可能性のためには、核酸中に従来の構造のレポーター分子が存在することが推奨される。このような試験は、診断に、例えば、発癌性(腫瘍形成性)変異体または特定の生理学的機能不全から生じるマーカー物質についての診断に用いられ得る。各々の核酸は発癌性変異体を選択的に「検出」することが必要なだけでなく、天然の改変体に結合してはならず、すなわち、発癌性発現産物と天然の発現産物との間を識別すべきである。これは、発癌性発現産物と結合している核酸の選択後に、すなわち、前に選択した核酸からの、天然の発現産物に結合していない核酸の引き続く選択によって、容易に実施され得る。
【0005】
選択された核酸はまた、溶液からの標的分子の分離のために、例えば、従来のカラムまたはゲル分離の方法において、用いられ得る。分離方法においては、固定可能な核酸を有すること、およびその核酸を固定することが推奨される。
【0006】
しかし、選択された核酸は、生理学的な機能を調節する(すなわち、阻害、誘導、または強化する)ためにも用いられ得る。従って、このような核酸はまた、薬学的組成物中でも用いられる。さらに選択された核酸は、副作用を回避するために、当然ながら生理学的に受容可能でなければならない。例えばペプチドの代わりに核酸を用いることの利点は、タンパク質またはペプチドのライブラリーに関する比較的容易な再現性のおかげで、適切な核酸の同定または選択が、ペプチドまたはタンパク質の場合よりもかなり簡単であることである。
【0007】
標的分子に高い親和性で結合する核酸を選択するための公知の方法は、SELEX法(指数関数的な濃縮によるリガンドの体系的評価)として公知である。種々のバリエーションが例えば、以下の文書に記載されている:US−A−5,712,375、US−A−5,864,026、US−A−5,789,157、US−A−5,475,096、US−A−5,861,254、US−A−5,595,877、US−A−5,817,785。
公知である範囲の方法では、原則的に、高い親和性またはより高い親和性で結合するこのような核酸は、ほとんど多数のサイクルで分離される。あらゆるサイクルにおいて、選択された群は、核酸を用いて増幅されるべきである。あらゆるサイクルにおいて標的からの、結合している核酸の分離は、特定の排斥(driving−out)によって起こる。この方法は、いくつかの欠点を有する。まず第一に、必要なサイクル数に起因して、かなり大量の核酸、および標的分子が必要であるということが不利である。
さらに、排斥工程において、より低い親和性のより多くの(結合した)核酸が、より高い親和性の核酸の結合から排斥され、従って相違の量は、増幅工程において、より高い親和性の核酸を犠牲にして増大する。相違の量はより高い親和性のせいで、分離に用いたリガンドに対する、分離した核酸の結合が比較的強力であることによって、さらに増大し、従って、より高い親和性の核酸は、増幅に到達できる程度が低い。核酸の漸増する親和性のせいで、分離のために用いたリガンドの対数的に漸増する濃度が必要であることはさらに不利な点である。従って、獲得可能な親和性は、用いたリガンドの溶解積によって制限される。最終的に、反復される分離のために数回のサイクルで操作しなければならないこと、またはプレサイクルにおいて選択された核酸の選択が不利な点である。
【0008】
非核酸の分離の分野では、アフィニティークロマトグラフィーが、詳細には、カラムクロマトグラフィー(固相/液相)として、周知である。これは、例えばタンパク質の単離または(105倍以上までの)濃縮(富化)のための方法である。濃縮されるべき配列のリガンドは、クロマトグラフィーのマトリックスに固定される。高度に親和性の化合物が、まず第一に(すなわち、カラムの入り口で)結合される。
下流は、親和性の化合物(各々の特異的な化合物と呼ばれる)の量が、カラム中のリガンドの量より少ない限り、親和性の低い化合物が結合する。親和性が弱い化合物または親和性でない化合物は、通過し、従って親和性の化合物から分離される。次いで、結合した、すなわち、親和性の化合物を、溶出して、さらに用いる。非特異的な脱離方法、例えば、物理化学的方法または熱的方法を用いて、示差的により高い親和性の(結合した)化合物の混合物が得られる。結合した化合物のリガンドを用いた脱離(排斥脱離)(driving−out desorption)において、非常に高いモル量のリガンドが、詳細にはより高い親和性の化合物の分離に必要である。
【0009】
(本発明の技術的な目的)
本発明は、標的分子に高い親和性で結合する核酸を選択するための方法を提供する技術的目的に基づく。この方法は、選択された核酸において非常に低い多様性を有する、安い費用の高度に親和性の核酸を提供する。
【0010】
(本発明の基礎)
技術的な目的を達成するために、本発明は、標的分子に親和性により結合する核酸を、核酸の混合物から選択するための方法を教示する。この方法は、以下の工程を包含する:a)標的分子をカラムの内部に充填し、そしてこの標的分子をこのカラムに固定する工程、b)核酸の混合物を、このカラムの第一の末端に供給し、このカラムを通じた媒体の所定の流量を作成し、このカラムのこの第一の末端から第二の末端へ流す工程、c)このカラムを通じた媒体のこの流量を、カラムの設計及び流速によって決定される期間後に停止する工程、d)このカラムを複数のカラムセグメントに切断し、各セグメントに座標を割り当てる工程、e)固定された核酸を、少なくとも1つのセグメントから非特異的な様式で脱離することにより、標的分子に親和性により結合する核酸を特定及び採取し、抽出する工程であって、前記工程d)において各セグメントに対して割り当てられたルーティング座標の割り当てを用いる工程。
【0011】
また、本発明は以下の方法を含むこととする。
上記に記載の方法であって、ここで前記工程d)において、各セグメント由来の前記固定された核酸を別々に脱離させて、それから得た該核酸に対する各セグメントの前記座標の各々の割り当てのもとで得る工程。上記に記載のいずれかの方法であって、ここで前記非特異的な脱離が、物理化学的方法、または熱的方法を用いて実施される方法。
上記に記載のいずれかの方法であって、PCR、またはRT−PCRからなる増幅の、拡大された高温相において、前記非特異的な脱離を熱的脱離によって実施する方法。
上記に記載のいずれかの方法であって、ここで前記非特異的脱離は、前記標的分子の化学的改変によって、またはキレート剤を用いた前記標的分子の非特異的キレート化によって、実施または促進される方法。
上記に記載のいずれかの方法であって、前記工程c)とd)との間で少なくとも1回の洗浄工程が実施される方法。上記に記載のいずれかの方法であって、ここで標的分子を用いた前記カラムの内側の充填剤が、二官能性スペーサー化合物からなる共有結合によって実施される方法。
上記に記載のいずれかの方法であって、ここで各々のカラムセグメントが、統計的平均として0.1〜103個、好ましくは1〜102個、最も好ましくは1〜10個の標的分子を含む方法。
上記に記載のいずれかの方法であって、ここで前記カラムの構造上の材料として、誘導体化されるか、またはプラズマ励起されたシリカゲル、またはポリエチレンが用いられる方法。上記に記載のいずれかの方法であって、前記カラムセグメントの前記長さが、0.1μm〜1mm、好ましくは0.1〜100μm、最も好ましくは0.5〜10μmの範囲である方法。
【0012】
前記したカラムの内部という用語は、一般論全てにおいて管腔の内側を意味する。カラムという用語は、本発明の目的のために、全ての種類の固体キャリアシステムを含み、すなわち、完全に閉鎖されていないキャリアシステムも可能である。本発明の目的のために、極端な場合、1つのカラムセグメントのみが提供され得る。
標的分子の固定は、カラムクロマトグラフィーの従来の方法に従って実施され得る。1種の標的分子が用いられ得るが、均質な分配中の、またはルーティング座標に分類されたいくつかの異なる規定された種がこのカラム内で用いられてもよい。固定の種類は、個々の場合によって、標的分子の構造および/または特性に依存し、当業者によって先行技術から容易に選択され得る。
カラムは、2つの末端を備える管腔を有する、あらゆる技術的構築物である。構造上の材料は、カラムに有用な全ての材料(例えば、金属、ガラス、および/またはプラスチック材料)が用いられ得る。カラムの内部は、標的分子に結合するマトリックスを提供され得、そして/またはこの構造上の材料は、標的分子の直接結合のために適切であるか、もしくはそのために調製され得る。
【0013】
核酸の混合物とは、多数の、代表的には106〜1022/モル、詳細には、1011〜1021/モルの異なる核酸種を有する核酸ライブラリーを意味する。カラム上に適用されたライブラリーにおいて、各核酸種は統計上、例えば、10〜1017モル、詳細には100〜1013モルで存在する。この媒体は通常は、液体であり、ここでこの核酸ライブラリーは、可溶性でかつ安定である。
この目的のために、核酸ライブラリーなどに有用な全ての緩衝液が用いられ得る。媒体の流量は、核酸ライブラリーの適用の前に調整され得る。次いで、核酸ライブラリーは、カラムの入り口で媒体の流れに添加される。しかし、この核酸ライブラリーはまた、直ちに適用されてもよい。カラムの設計および流速によって決定される期間後、核酸ライブラリーによって適用された「クロット(clot)」は、カラムの出口に配置され(拡散を伴う折りたたみによって拡大される)、結合した核酸は、この「クロット」から分離されて、このカラムに固定されている。適切には、このカラムを通じた流量は、低混乱または混乱なしに、好ましくは層に調整される(このカラム容積を超える、詳細にはカラムの断面を超える媒体の加速ベクトルの合計は、最小限であり、理想的には0である)。
【0014】
このカラム中の標的分子の(標的分子種の)総数は、代表的には、適用された核酸ライブラリー中の単一の種の核酸分子の数の102〜1016倍、詳細には、103〜1015倍である。標的分子に対する核酸の結合は、好ましくは核酸の後の用途に対応する条件下で(すなわち、例えば、温度、イオン強度、pH値、および緩衝液の条件に関して対応して調節されている緩衝液または媒体中で)生じる。
次いで、核酸ライブラリーの媒体および溶媒はその成分に従って対応して選択されなければならない。複数のカラムセグメントへのカラムの分割は、例えば、カラムを小片に切断することによってなされ得、この切断は、好ましくは、流量ベクトルに対して直交性になされる。しかし、このカラムはまた、前もってカラムセグメントから構成されていてもよく、カラムセグメントは、好ましくは流量ベクトルの方向に次のカラムセグメントと密着して並んでいる(流量ベクトルに対して断面を直交性に連結する)。
次いで、この分割は、カラムセグメントの以前に形成されたアセンブリの解離によって達成され得る。標的分子の排斥、キレート化、改変(修飾)、および/または破壊による、十分に強力なリガンドを用いた溶出によって、物理化学的な様式または熱的な様式で、非特異的な脱離が実施され得る。機械的な方法、例えば、超音波方法が脱離のために、または脱離の増大のために用いられ得る。上記の脱離方法の組み合わせがまた用いられ得る。この核酸は、適用された脱離方法によって分解されてはならないことが理解される。
【0015】
本発明は、核酸ライブラリーが、標的分子に対する親和性に従って、アフィニティークロマトグラフィーによって、タンパク質混合物のように別々に分離され得るという知見に基づく。本発明は、非特異的脱離の前に、そのカラム内に結合した核酸を有するカラムを、いわゆる親和性(アフィニティー)セクションに分割することによって、異なる親和性の脱離する核酸の混合物(この混合物は非特異的な脱離によって生じる)が、回避され得、これによって、得られた親和性セクションまたはカラムセグメントに結合した核酸を、例えば、PCRまたはRT−PCRの非特異的な様式によって、容易に、かつリガンド結合の邪魔なしに脱離し、そして非特異的と同等に増幅し得るという知見にさらに基づく。
より高い親和性の核酸の消費によって、その後の選択の人為的結果が回避される。リガンド、詳細には高濃度のリガンドは、脱離には必要がない。最終的に、事実上全ての結合し、次いで脱離された核酸分子が、増幅に利用可能である。これによって、低い核酸濃度を使用することが可能になる。各々の種が、統計的な平均として1分子ずつ核酸ライブラリーに存在する場合、原則的に、これで既に十分である。あるカラムセグメント中の標的分子の数が、統計上1である場合、標的分子に対する核酸種の親和性に従って、個々の核酸種でさえ分離され得る。
【0016】
本発明の特別な利点を、以下に説明する。親和性による核酸の分離によって、カラムセグメント中の核酸が、異なる特異性の類似の親和性を有する(標的の異なる領域が結合されるか、または核酸の結合部位である)ことがもたらされる。従って、得られた核酸混合物は、少クローン性の抗血清に対して今日まで留保されている適用において用いられ得る。
例えば、結合キット中の核酸混合物を用いることによって、標的分子の定量的決定が可能である。1つのカラムセグメントの核酸混合物は、特定の標的分子の特定の固定のために(捕獲特性)、および/または固定された標的分子の特定の検出のために用いられ得る。
【0017】
本発明による方法を用いて単離された核酸または生成された核酸混合物(簡略に言えば、核酸)は、種々の方法で用いられ得る。各々の特定の適用のためには、この適用に従って選択された標的分子を、カラム中に固定することのみが必要である。
例えば、疾患について特徴付けられるマーカー物質を同定すること、それに対して高い親和性で結合した核酸を、本発明による方法を用いて決定すること、およびマーカー物質について、または疾患の存在もしくは危険性についての検討のために、試験キットの主な成分としてこのように選択された核酸を使用することが可能である。このような試験キットはまた、当然ながら、治療の管理に用いられ得る。この核酸はまた、例えば、マーカー物質の阻害が症状の減弱または予防をもたらす場合、薬学的組成物を調製するために用いられ得る。
標的物質の選択によって、核酸を選択し、そしてそれらの核酸を、生物体において疾患の場合に消失している物質の生成を刺激する薬学的組成物として用いることがまた可能である。適切な標的分子の選択によって、例えば、単離された細胞(例えば、T細胞、顆粒球、単球、または血小板のような血球)の分化、および/または刺激もしくは抑制に対して有効な物質として影響する核酸がまた見出され得る。組織工学の分野で、凝集体(組織)などにおける細胞について、同じことが達成され得る。結局、本発明によって選択された核酸は、例えば、固定された相としてアフィニティー(親和性)マトリックス中に用いられてもよいし(例えば、フェレーシス技術)、またはアフィニティーマトリックスの物質の特異的な脱離のために用いられてもよい。
【0018】
(発明を実施するための最良の形態)
原理的に、所望の親和性が割り当てられたセグメントが、(孤立して)処理されれば十分である。しかし、これには、第一(流量ベクトルに対していう)のカラムセグメントが処理されるときの最大の親和性を除いて、適用された核酸ライブラリーにおける親和性分布についてのアイデアが必要である。従って、各セグメントから固定された核酸を別々に脱離させて、それから得られた核酸に対する各セグメントのルーティング座標のそれぞれの割り当てのもとで、その核酸を得ることが通常には好ましい。
【0019】
原則的に、任意の種類の脱離が可能である。好ましくは、非特異的な脱離が、通常の物理化学的方法または熱的方法によって実施される。熱的脱離は、カラムセグメント、またはその中に含まれる溶液を加熱することによって達成される。加熱は、例えば、電気的加熱またはマイクロ波もしくはIRの照射によって、なされ得る。詳細には、PCR技術の加熱技術は適切である。
ポリメラーゼによる核酸またはアプタマーの増幅に加えて、例えば、リガーゼによる他の増幅方法がまた、当然ながら、用いられ得る。非特異的な脱離は、標的の化学修飾(例えば、過酸化ナトリウムなどによる酸化)によって、または例えば、炭化水素中のシス−トランスジオール結合をブロックするためのボラートなどによる非特異的な錯化剤によって、支持され得る。
【0020】
従って、非特異的な脱離は、PCRまたはRT−PCRの好ましくは拡大された高温相で、熱的脱離によって、実施されることが好ましい。これによって、相乗効果が達成される。なぜなら、通常、詳細には、低濃度の核酸種の核酸ライブラリーとともに作用する場合、いずれにしても増幅が必要であるからである。収率を増大するため、例えば、5〜60サイクル、好ましくは20〜60サイクル、最も好ましくは45〜55サイクルを用いる。増幅のために、少なくとも1つのマーキングされたプライマーを使用し得る。
このプライマーは、少なくとも1つのエンドヌクレアーゼ境界点(インターフェース)を含み得る。このような境界点は、例えば、プライマー配列のより大きい領域から増幅物を遊離させるために働く。プライマーまたは核酸中の選択されるべきヌクレオチド成分は、例えば、蛍光色素によってマーキングされ得る。
蛍光色素としては、例えば、以下が挙げられる:Alexa(登録商標)Fluor 488、FLUOR 532、Fluor 546、Fluor 568、Fluor 594、オレゴン グリーン 488(Oregon Green 488)、フルオレセイン(Fluorescein)、ローダミン(Rhodamine)6G、テトラメチルローダミン、ローダミンB、およびテキサスレッド(Texas Red)。
増幅物はまた、化学修飾によって導入された基が、異なる親和性マトリックスでそれぞれリガンドとして結合され得る場合、2つの異なる化学修飾によって、異なる末端でマーキングされ得る。
【0021】
非親和性の核酸および低親和性の核酸の安全な分離のためには、この方法の適切な工程の間に洗浄工程を包含させることが推奨される。詳細には、工程d)と工程e)との間に少なくとも1回の洗浄工程を実施することが好ましい。洗浄のためには、例えば、核酸ライブラリーの溶媒もしくは物質、またはカラムの媒体は適切である。
【0022】
標的分子によるカラムの内側の占有、および標的分子の固定は、好ましくは化学的に高い反応性の基(例えば、塩化トレシル、シアンブロマイド、および/または過ヨウ素酸塩)での活性化後に、共有結合によって、または化学的に反応性の低い基(例えば、アミン基、水酸基、ケト基、および/またはカルボキシル基)での修飾後に二官能性のスペーサー化合物によって、実施されることが好ましい。
適切なスペーサー化合物のスペーサー構造の例は以下である:置換されたC2−C10アルキル基、および置換されていないC2−C10アルキル基、置換されたC2−C10アルキレン基、および置換されていないC2−C10アルキレン基、置換されたC2−C10アルキニル基、および置換されていないC2−C10アルキニル基、置換されたC4−C7カルボキシルアルキル基、および置換されていないC4−C7カルボキシルアルキル基、置換されたC4−C7カルボキシルアルケニル基、および置換されていないC4−C7カルボキシルアルケニル基、置換されたC7−C14アラルキル基、および置換されていないC7−C14アラルキル基、複素環式分子(窒素、酸素、イオウから選択されたヘテロ原子を有する)。
この置換は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、チオール基、チオアルコキシ基、水酸基、アリール基、ベンジル基、フェニル基、ニトロ基、ハロゲン基、エーテル基(2〜10個の炭素原子、および1〜4個の酸素原子またはイオウ原子を有する)、ポリアルキル、グリコール、ハロゲン、水酸基、チオール、ケト、カルボキシル、アミド、エーテル化合物、チオエーテル、アルニジン誘導体類、グアニジン誘導体類、グルタミル誘導体類、硝酸エステル(ONO2)、ニトロ(NO2)、ニトリル、トリフルオロメチル(−CF3)、トリフルオロメトキシ(−OCF3)、Oアルキル、Sアルキル、NHアルキル、Nジアルキル、Oアラルキル、Sアラルキル、NHアラルキル、アミノ、アジド(N3)、ヒドラジノ(NHNH2)、ヒドロキシルアミノ(ONH2)、スルホキシド(SO)、スルホン(SO2)、スルフィド(S−)、ジスルフィド(S−S)、シリルからなる。
スペーサー化合物は代表的には、二官能性であり、ここでこの官能基は同じであっても異なってもよく、そして例えば、「N−ヒドロキシスクシンイミドおよびヒドラジド」からなる群より選択されてもよい。
【0023】
カラムセグメントから獲得可能な核酸内の多様性を減じるため、各々のカラムセグメントは、統計上の平均として0.1〜103個、好ましくは、1〜102個、最も好ましくは、1〜10個の標的分子を含むことが好ましい。
それに対して調整した核酸ライブラリーは、適用された場合、統計上の平均として1つの種について0.1〜103個、好ましくは1〜102個、最も好ましくは1〜10個の核酸分子を含み得る。
【0024】
このカラムの構造上の材料について、原則的には、例えば、アフィニティークロマトグラフィーから公知の全ての材料が、用いられ得る。化学的誘導体化またはプラズマ励起による活性化後、ポリエチレンのようなポリマー上のシリカゲルのカラムがこれに属する。
このカラムセグメントの長さは、0.1μm〜1mm、好ましくは0.1〜100μm、最も好ましくは0.5〜10μmの範囲が適切である。このようなセクションは、ミクロトームによって容易に作製され得る。このカラムの内径は、0.05〜1mm、好ましくは、0.1〜0.5mm、最も好ましくは0.2〜0.4mmの範囲が適切である。
【0025】
核酸の実際の分離(結合、または機械的解離)の前に、所望されない核酸を排除することが適切である。所望されない核酸は、例えば、カラムの標的分子のない内部表面に結合した核酸である。次いで標的分子のないカラムは、上流に配置され得、そしてこれを通して前にこの核酸ライブラリーが処理され得る。所望されない核酸とは、特定の別の(代替的な)標的分子に結合する、すなわち、識別することが意図されていない(例えば、発癌性変異体の天然の改変体に結合しない)ような核酸であり得る。
次いで、別の(代替的な)標的分子を含むカラムが、上流に配置され得る。所望されない核酸とはまた、標的分子のいくつかの結合ドメインのうちの1つのみに結合するような核酸であり得る。次いで、1または数個の結合ドメインがブロックされている標的分子を含むカラムが、上流に配置され得る。
【0026】
上記の方法において、連続して、すなわち、例えば、カラムを直列して配列することによって、または連続せずに、例えば、前のカラムからの溶出液の中間的収集によって、操作が実施され得る。
【0027】
親和性分離の別の改善を達成するために、原則的には種々の方法が使用され得る。例えば、1または数個のセグメントから脱離された核酸は、増幅後に適用可能である場合、本発明による方法に繰り返し供され得、そして/または脱離のためのエルトロピア(elutropia)の条件(温度、イオン強度、pH値、緩衝液条件)が増大され得る。あるいは、標的分子の空間的密度、従って結合した核酸の空間的密度、すなわちカラムセグメント中の標的分子の数は、減少してもよい。
【0028】
カラム中でいくつかの標的分子種の均質な分布が使用される場合、本発明は、種々の方法で改善され得る。等しいかまたは類似の親和性である核酸、すなわち、1つのカラムセグメントからの核酸を、種々の標的分子種に対する結合後の脱離および増幅の後に、標的分子種の分離(例えば、電気泳動またはクロマトグラフィーによる)によって、分離することが可能である。核酸の結合は、標的分子の分離の前後に生じ得る。
次いで、この再分離において結合した核酸は、他の関連において上記で説明した全ての方法で、標的分子から離されるかまたは脱離され得る。標的分子が、いくつかの異なる結合部位を含み、そして核酸が標的分子に対して小さい場合、対応するアプローチが選択され得る。
【0029】
(実施例1:カラムの感受性(感度)を決定する)
標的分子の長方形の寸法が100nm×10nm×10nmであること、および主な表面でのカラムの構造上の材料に対する結合を考慮すれば、標的分子は、10-16m2を占有する。1mmの直径でかつ1mmの長さの管腔は、3×10-6m2の内部表面を有する。カラムの技術において獲得可能なように0.0001〜0.001の占有程度を考慮すれば、カラム1mmあたり105〜106個の多数の標的分子が生じる。
従って、ミクロトームによってカラムを1μmのカラムセグメントに切断することによって、1つのカラムセグメントあたり約102〜103個の多数の標的分子が得られ、従って、通常の核酸ライブラリーの適用によって、非常に高い感受性の親和性(アフィニティー)分離が達成され得る。
【0030】
(実施例2:塩化トレシルを用いてシリカゲルカラムを活性化する)
カラムをアセトンでリンスする。活性化のために、カラムに、水なしの溶液(2ml アセトン、1ml 塩化トレシル、ピリジン数滴)を通過させ(カラム容積の10倍)、そして氷上で一晩インキュベートした。次いで、このカラムを、カラム容積の20倍の100%アセトン(水なし)でリンスした。活性化したカラムは、1mM HCl中で保持できる。
【0031】
(実施例3:ポリエチレンカラムを活性化する)
ポリエチレンのホースを、カラム容積の20倍の溶液(2%(w/v)過マンガン酸カリウム(KMnO4)を含有する濃硫酸(H2SO4))を用いて、次いで蒸留水を用いて室温でリンスする。カラム表面のさらなる結合のために、少なくとも1つの反応性アルデヒド基(例えば、1%グルタルアルデヒド)を有する架橋のために、二価の分子または多価の分子を用いてもよい。これらを、カラムに、4℃で1時間通過させた。その後、還元条件で(例えば、シアン化ナトリウム水酸化ホウ素(0.00025%(w/v)含有0.15M NaCl(pH3.9)によって)この反応物を安定にする。
【0032】
(実施例4:活性化されたシリカゲルカラムに対してタンパク質を結合させる)
塩化トレシルで活性化したカラムを、0.1M Na2CO3(pH8.5)でリンスする。結合のために、ペプチドまたはタンパク質(2mg/ml 0.1M Na2CO3、pH8.5)を、このカラムに37℃で2時間、次いで氷上で4時間、数回通過させる。このカラムの遊離の結合部位をブロックするために、次いでこのカラムに過剰の0.2M グリシン(pH8)を通過させる。
【0033】
(実施例5:活性化されたシリカゲルカラムに対してプロテオグリカンを結合させる)
塩化トレシルで活性化したカラムを0.1M Na2CO3(pH8.5)でリンスする。結合のために、ペプチドまたはタンパク質(2mg/ml 0.1M Na2CO3、pH8.5)を、このカラムに、室温で一晩、数回通過させる。このカラムの遊離の結合部位をブロックするために、次いでこのカラムに過剰の0.2M グリシン(pH8)を通過させる。
【0034】
(実施例6:活性化されたシリカゲルカラムに対して糖タンパク質を結合させる)
塩化トレシルで活性化したカラムを0.1M Na2CO3(pH8.5)でリンスする。結合のために、ペプチドまたはタンパク質(2mg/ml 0.1M Na2CO3、pH8.5)を、このカラムに、37℃で2時間、次いで氷上で4時間、数回通過させる。このカラムの遊離の結合部位をブロックするために、次いでこのカラムに過剰の0.2M グリシン(pH8)を通過させる。
【0035】
(実施例7:活性化されたポリエチレンカラムに対して糖タンパク質を結合させる)
活性化したカラムを0.1M Na2CO3(pH8.5)でリンスする。結合のために、このカラムに、ペプチドまたはタンパク質(2mg/ml 0.1M Na2CO3、pH8.5)を、37℃で2時間、次いで氷上で4時間、数回通過させる。このカラムの遊離の結合部位をブロックするために、次いでこのカラムに過剰の0.2M グリシン(pH8)を通過させる。反応を改善するために、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)5%(w/v)を添加してもよい。
【0036】
(実施例8:所望されない分子の排除のためのカラムの調製)
塩化トレシルで活性化したカラムを0.1M Na2CO3(pH8.5)でリンスする。1または数個の一級アミンまたは二級アミンを有する分子について排除を意図しない場合、この分子または混合物(2mg/ml 0.1M Na2CO3、pH8.5)を、このカラムに、室温で一晩、数回通過させる。このカラムの遊離の結合部位をブロックするために、次いでこのカラムに過剰の0.2M グリシン(pH8)を通過させる。1または数個の一級アミンまたは二級アミンを有する特定の分子について排除しないことが望ましい場合、このカラムの全ての結合部位をグリシンでブロックする。
【0037】
さらなる誘導体化方法が、例えば、以下の文書に見出され得る:
1) パターソン W.J.(Patterson,W.J.),National Aeronautics and Space Administration,technical Memorandum,NASA TM−73311,U.S.Government Printing Office,Washington,D.C.,1976,Ma,S.M.,Gregonis,D.E.,van Wagenen,R.M.、
2) アンドレード J.D.(Andrade,J.D),「Hydro gels for Medical and Related Applications」(J.D.Andrade編)、Amer.Chem.Soc.Symp.Series,第31巻、241頁(1976)、Harris J.M.、Struck E.C.、Case M.G.、Paley M.S.、Van Alstin,J.M.、
3) ブルックス D.E.(Brooks D.E.),J.Polymer Sci.,Polymer Chem.第22版、341(1984)、RegnierおよびNoel,Regnier F.E.、
4) ノエル R.J.(Noel R.J.),J,Chromatog.Sci.,14(1976)、Yalpani,M.およびBrooks,D.E.,J.Polymer Sci.,Polymer Chem.,第23版、395(1985)。
【0038】
(実施例9:標的分子に対する核酸の接触を実行し、そしてカラムを分離する)
コーティングしたカラムを、一方の後方へもう一方(所望されない分子の排除のために第一のカラム、続いて標的分子を有するカラム)をおく、漏出のない様式で配列する。それぞれ異なる標的分子を有するカラムを、一方の後方にもう一方をおく、漏出のない様式で、連結することも可能である。
なぜなら、核酸混合物からの所望されない結合特性を有する核酸の除去、およびコンビナトリアル組成物に起因して1または数個の標的分子について結合特異性を有する核酸の除去後、多数のさらなる標的分子に対する核酸が存在するからである。平衡のために、適切な緩衝液、例えば、緩衝溶液、(10mM Tris−HCl、50mM KCl、1.5mM MgCl2、およびゼラチン0.001%(w/v)、pH8.3)を、氷上で1時間カラムに通過させる。コンビナトリアル核酸ライブラリーの核酸を、1mlの同じ緩衝液中に入れて、二本鎖を融解するために95℃に10分間加熱し、次いでカラムに数回(4〜30回)通過させる。
次いで、選択された緩衝液(上記を参照のこと)を用いて氷上で一晩、このカラムを分離して、洗浄する。流れの方向におけるカラムの分離は、適切な切断ツールで達成される。
Claims (11)
- 標的分子に対して親和性により結合する核酸を、核酸の混合物から選択する方法であって、該方法は以下の工程:
a)カラムに標的分子を充填し、該標的分子を該カラム内において固定する工程、
b)前記核酸混合物を、前記カラムの第一の末端に供給し、ここで該カラムを通じた媒体を層流となる所定の流量に調整し、該カラムの該第一の末端から第二の末端へ流す工程、
c)前記カラムを通じた媒体の該流量を、カラムの設計及び流速によって決定される期間後に停止する工程、
d)前記カラムを複数のカラムセグメントに切断し、各セグメントに座標を割り当てる工程、
e)前記固定された核酸を、少なくとも1つのセグメントから非特異的な様式で脱離することにより、標的分子に親和性により結合する核酸を特定及び採取し、抽出する工程であって、前記工程d)において各セグメントに対して割り当てられた前記座標を、該セグメントから脱離された核酸に割り当てる工程、
を包含する方法。 - 請求項1に記載の方法であって、ここで前記工程e)において、各セグメント由来の前記固定された核酸を別々に脱離させて、それから得た該核酸に対する各セグメントの前記座標の各々の割り当てのもとで得る工程。
- 請求項1または2に記載の方法であって、ここで前記非特異的な脱離が、物理化学的方法、または熱的方法を用いて実施される方法。
- 請求項1〜3のうちの1項に記載の方法であって、PCR、またはRT−PCRからなる増幅の、拡大された高温相において、前記非特異的な脱離を熱的脱離によって実施する方法。
- 請求項1〜4のうちの1項に記載の方法であって、ここで前記非特異的脱離は、前記標的分子の化学的改変によって、またはキレート剤を用いた前記標的分子の非特異的キレート化によって、実施または促進される方法。
- 請求項1〜5のうちの1項に記載の方法であって、前記工程c)とd)との間で少なくとも1回の洗浄工程が実施される方法。
- 請求項1〜6のうちの1項に記載の方法であって、ここで標的分子を用いた前記カラムの内側の充填剤が、二官能性スペーサー化合物からなる共有結合によって実施される方法。
- 請求項1〜7のうちの1項に記載の方法であって、ここで各々のカラムセグメントが、統計的平均として0.1〜103個、好ましくは1〜102個、最も好ましくは1〜10個の標的分子を含む方法。
- 請求項1〜8のうちの1項に記載の方法であって、ここで前記カラムの構造上の材料として、誘導体化されるか、またはプラズマ励起されたシリカゲル、またはポリエチレンが用いられる方法。
- 請求項1〜9のうちの1項に記載の方法であって、前記カラムセグメントの前記長さが、0.1μm〜1mm、好ましくは0.1〜100μm、最も好ましくは0.5〜10μmの範囲である方法。
- 請求項1〜10のうちの1項に記載の方法であって、前記カラムの内径が、0.05〜1mm、好ましくは0.1〜0.5mm、最も好ましくは0.2〜0.4mmの範囲である方法。
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