JP4887495B2

JP4887495B2 - 超音波画像生成方法、生体組織の選択的造影方法、及び脳組織の選択的造影方法

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Publication number: JP4887495B2
Application number: JP2006194459A
Authority: JP
Inventors: 祥子吉田; 寿貴森島; 和人小林
Original assignee: Honda Electronics Co Ltd; Toyohashi University of Technology NUC
Current assignee: Honda Electronics Co Ltd; Toyohashi University of Technology NUC
Priority date: 2006-07-14
Filing date: 2006-07-14
Publication date: 2012-02-29
Anticipated expiration: 2026-07-14
Also published as: JP2008020410A

Description

本発明は、超音波を利用して生体組織を可視化するための超音波画像生成方法、生体組織の選択的造影方法、及び脳組織の選択的造影方法に関するものである。

従来、生体組織の観察は、光学顕微鏡や電子顕微鏡を用いて行われてきた。近年では、光学顕微鏡と同等レベルの解像度を有する超音波顕微鏡が実用化されており、超音波顕微鏡を用いることにより、生体組織を細胞レベルで観察することができるようになってきている。超音波顕微鏡を用いる場合、測定した音響パラメータ（組織音速や音響インピーダンスなど）に基づいてカラー変調処理を行うことにより、パラメータ値に応じて色分けされたカラー画像として超音波像（音速像や音響インピーダンス像など）が表示される。その結果、光学顕微鏡で観察する場合のように、染色剤を用いて生体組織を染色しなくても生体組織の構造を観察することができる。

本発明者らは、パルス励起型の超音波顕微鏡を用いて生体組織の組織音速を算出し、その組織音速に応じた音速像を表示する装置をすでに提案している（例えば、特許文献１や非特許文献１参照）。さらに、本発明者らはパルス励起型の超音波顕微鏡を利用して生体組織の音響インピーダンス像を表示する装置も提案している（例えば、特許文献２参照）。
特開２００５−２９１８２７号公報特開２００６−７８４０８号公報「医用超音波：パルス励起型超音波音速顕微鏡」（「超音波TECHNO」VOL.15 No.6(2003.11〜12)（１０１〜１０５頁）日本工業出版社発行）

ところで、超音波顕微鏡を用いて生体組織における微細な構造（例えば、神経細胞の層構造など）を観察する際には、測定される音響パラメータの差が小さく、鮮明な音響インピーダンス像を得ることが困難となる場合がある。しかしながら、従来の超音波顕微鏡は、染色剤を用いなくてもそのままの状態で観察できることをメリットとして、製品開発が進められてきた。そのため、超音波顕微鏡を用いた観察方法において、染色剤に相当する何らかの薬剤を処理して生体組織における微細構造を見やすくするといった技術は、従来全く検討されてこなかった。ましてや、このような薬剤処理を選択的に行って生体組織における特定部位の微細構造を見やすくするといった発想は、従来全くなかった。

因みに、光学顕微鏡以外に、透過型電子顕微鏡などにおいても、生体組織を染色して観察する手法が採用されている。この手法は、一般的に生体組織の全体を染色するものであって、生体組織の所定部位を選択的に染色しうるものではない。よって、超音波顕微鏡で観察する場合に仮にその染色方法を採用したとしても、生体組織全体の音響パラメータが一律に変化するだけであり、生体組織における微細な構造を鮮明に表示させることはできない。

また、超音波診断装置を用いてＢモード画像（断層画像）を表示することで生体内の胎児や臓器などを観察する手法が知られている。この方法においては、生体内の血管に微小気泡（マイクロバブル）を投与して、超音波像の造影を図る技術が実用化されている。これは、生体組織よりも軽いマイクロバブルを超音波造影剤として用い、比較的広範囲の領域を造影するものである。そのため、その技術を用いた場合でも、生体組織の微細な構造を的確に造影することはできず、組織構造を正確に観察することはできない。

本発明は上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、超音波像を造影して、生体組織の構造をより正確に観察することができる超音波画像生成方法、生体組織の選択的造影方法、及び脳組織の選択的造影方法を提供することにある。

上記課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、カドミウムイオンを含む超音波造影剤を用い、生体組織の表面に分布するＬ型カルシウムチャネルに前記カドミウムイオンを選択的に付着させる選択的造影ステップと、前記生体組織に超音波を照射し、得られた反射波に基づいて、前記生体組織の音響パラメータを算出する算出ステップと、前記音響パラメータに基づいて、前記生体組織の超音波像を生成するための画像処理を行う画像生成ステップとを含むことを特徴とする超音波画像生成方法をその要旨とする。

請求項１に記載の発明によれば、生体組織の所定領域に重金属イオンの一種であるカドミウムイオンが選択的に付着することにより、その所定領域の音響パラメータを他の領域と異ならせることができる。具体的には、生体組織は、水を多く含みその比重が１に近く、比重が大きな重金属イオンをほとんど含まない。そのため、生体組織の所定領域に選択的にカドミウムイオンを付着させることにより、その所定領域は、密度が大きくなるとともに硬くなる。その結果、所定領域の音響パラメータが変化して超音波の反射強度が強くなる。従って、超音波の反射波に基づいてその生体組織の超音波像を生成することにより、カドミウムイオンが付着した所定領域を他の領域よりも造影した状態で表示させることができるため、生体組織の構造をより正確に観察することができる。

なお、本発明における生体組織としては、ヒトを除く動物の体内にある生きた生体組織またはヒトを含む動物から採取された生体組織を挙げることができる。

請求項２に記載の発明は、請求項１において、前記算出ステップでは、超音波顕微鏡を利用して超音波を二次元走査しながら前記生体組織に照射し、その生体組織表面からの反射波の強度に基づいて音響インピーダンスを算出することをその要旨とする。

請求項２に記載の発明によれば、超音波顕微鏡を利用して生体組織表面を観察することで、分解能が高い音響インピーダンス像を生成することができる。また、音響インピーダンスは、生体組織を凍結切片にすることなく塊の状態で測定できる。従って、生体組織を生かした状態でその組織構造を迅速に確認することができる。

重金属イオンとは、比重が４以上の金属のイオンのことを意味し、具体的には、チタン（Ｔｉ、比重＝４．５４）、バナジウム（Ｖ、比重＝５．８）、クロム（Ｃｒ、比重＝７．２）、マンガン（Ｍｎ、比重＝７．４２）、鉄（Ｆｅ、比重＝７．８６）、コバルト（Ｃｏ、比重＝８．８）、ニッケル（Ｎｉ、比重＝８．８５）、銅（Ｃｕ、比重＝８．９３）、亜鉛（Ｚｎ、比重＝７．１２）、イットリウム（Ｙ、比重＝５．５１）、ジルコニウム（Ｚｒ、比重＝６．５３）、ニオブ（Ｎｂ、比重＝８．５６）、モリブデン（Ｍｏ、比重＝１０．２）、ルテニウム（Ｒｕ、比重＝１２．０６）、ロジウム（Ｒｈ、比重＝１２．４４）、パラジウム（Ｐｄ、比重＝１２．１６）、銀（Ａｇ、比重＝１０．５）、カドミウム（Ｃｄ、比重＝８．６４）、ハフニウム（Ｈｆ、比重＝１３．３）、タンタル（Ｔａ、比重＝１６．６）、タングステン（Ｗ、比重＝１９．３）、レニウム（Ｒｅ、比重＝２１．２）、オスミウム（Ｏｓ、比重＝２２．５）、イリジウム（Ｉｒ、比重＝２２．５）、白金（Ｐｔ、比重＝２１．３７）、金（Ａｕ、比重＝１９．３）、水銀（Ｈｇ、比重＝１３．５９）のイオンなどを挙げることができる。特に、第１２族元素（亜鉛族元素）である亜鉛（Ｚｎ）やカドミウム（Ｃｄ）のイオンを用いることがよい。亜鉛イオンは、例えば特定の癌組織に集まりやすい性質があるからである。また、カドミウムイオンは、例えば神経細胞膜に分布するイオンチャネルに付着しやすい性質があるからである。

重金属イオンを含む超音波造影剤は、通常、水溶液の形態を採る。超音波造影剤は、上記重金属の塩化物、水酸化物、硫化物などの金属化合物を水に溶かすことにより調製可能である。そして、その水溶液で生体組織を処理することにより所定領域に選択的に重金属イオンを付着させることができる。

また、比重が４よりも小さい軽金属、例えば、ナトリウム（Ｎａ、比重＝０．９７）、マグネシウム（Ｍｇ、比重＝１．７４）、カリウム（Ｋ、比重＝０．８６）、カルシウム（Ｃａ、比重＝１．５４）は、生体組織とほぼ同じ密度となり、金属イオンとして生体内に比較的多く存在する。従って、軽金属イオンを生体組織に付着できたとしても、超音波像の造影効果を得ることはできない。そのため、軽金属イオンを超音波造影剤として用いることは適切ではない。

さらに、ランタン（Ｌａ、比重＝６．１５）、セリウム（Ｃｅ、比重＝６．８）などのランタノイドや、トリウム（Ｔｈ、比重＝１１．７）、ウラン（Ｕ、比重＝１８．７）などのアクチノイドは、レアメタルであり、コスト高になる。特に、アクチノイドは、安定同位体が存在しないことから、崩壊が起こりやすく不安定な金属であるため、取り扱い難く保管が困難である。そのため、ランタノイドやアクチノイドのイオンを超音波造影剤として用いることは好ましくない。

請求項４に記載の発明は、生体組織に超音波を照射して超音波像を得る前になされる造影方法であって、カドミウムイオンを含む超音波造影剤を用い、前記生体組織の表面に分布するＬ型カルシウムチャネルに前記カドミウムイオンを選択的に付着させる生体組織の選択的造影方法をその要旨とする。

請求項４に記載の発明によれば、生体組織の所定領域に重金属イオンの一種であるカドミウムイオンが選択的に付着されることにより、その所定領域の音響パラメータを他の領域と異ならせることができる。従って、生体組織の超音波像を生成する場合、カドミウムイオンが付着した所定領域を他の領域よりも造影した状態で表示させることができるため、生体組織の構造をより正確に観察することができる。

請求項５に記載の発明は、脳組織に超音波を照射して超音波像を得る前になされる造影方法であって、カドミウムイオンを含む超音波造影剤を用い、前記脳組織の表面に分布するＬ型カルシウムチャネルに前記カドミウムイオンを選択的に付着させる脳組織の選択的造影方法法をその要旨とする。

図１４は発達した小脳１０１の神経回路を示し、図１５は未発達の小脳１０２の神経回路を示している。図１４に示されるように、小脳１０１の神経回路は、外部から入力を受ける顆粒細胞ＩＧＬ、小脳からの出力神経であるプルキンエ細胞ＰＬ、顆粒細胞ＩＧＬの出力ケーブルである平行線維ＭＬが層状に積み重なって構成されている。また、図１５に示されるように、生まれたばかりの小脳１０２の神経回路では、出力ケーブルである平行線維ＭＬは形成されておらず、顆粒細胞ＩＧＬも脳表面に分布している。そして、小脳の発達（歩行、首の坐り、視線の安定など）に伴って平行線維ＭＬが形成され、小脳神経回路が完成する。

図１６（ａ）には、正常な小脳の神経回路１０３を示し、図１６（ｂ），（ｃ）には回路異常のある小脳の神経回路１０４，１０５を示している。なお、図１６（ｂ）は、スタッガーと呼ばれるミュータントの神経回路１０４であり、図１６（ｃ）は、ウイーバーと呼ばれるミュータントの神経回路１０５である。図１６（ａ）に示されるように、正常な神経回路１０３では、顆粒細胞ＩＧＬとプルキンエ細胞ＰＬとの間に接続部（シナプス）が形成され、神経回路１０３が十分に発達している。一方、図１６（ｂ）の神経回路１０４では、分子層にある平行線維ＭＬの発達が不十分であり、図１６（ｃ）の神経回路１０５では、平行線維ＭＬがほとんど発達していない。

小脳において神経細胞の発達に伴い平行線維ＭＬが形成されると、神経細胞膜にＬ型カルシウムチャネルが数多く分布した状態となる。そのため、請求項５に記載の発明のように、脳組織の表面に分布するＬ型カルシウムチャネルにカドミウムイオンを選択的に付着させることにより、その平行線維ＭＬの音響パラメータを他の領域と異ならせることができる。従って、脳組織における平行線維ＭＬを他の部位よりも造影した状態で表示させることができるため、脳細胞の発達状況をより正確に観察することができる。また、脳組織における平行線維ＭＬの発達状況を確認することにより、図１６（ａ）のような正常な脳組織か、図１６（ｂ），（ｃ）のような回路異常のある脳組織か、を容易に判別することができる。

以上詳述したように、請求項１〜５に記載の発明によると、超音波像を造影して、生体組織の構造をより正確に観察することができる超音波画像生成方法、生体組織の選択的造影方法、及び脳組織の選択的造影方法を提供することができる。

［第１の実施の形態］

以下、本発明を具体化した第１の実施の形態を図面に基づき詳細に説明する。図１は超音波画像生成装置を示す概略構成図である。図１に示されるように、本実施の形態の超音波画像生成装置１は、パルス励起型超音波顕微鏡２と、パーソナルコンピュータ（パソコン）３とを備える。

パルス励起型超音波顕微鏡２は、試料ステージ４を有する顕微鏡本体５と、試料ステージ４の下方に設置された超音波プローブ６とを備える。そのパルス励起型超音波顕微鏡２の超音波プローブ６がパソコン３と電気的に接続されている。

本実施の形態の試料ステージ４は、ユーザの手動操作により、水平方向（即ちＸ方向及びＹ方向）に移動できるように構成されている。この試料ステージ４には、生体組織８を載置した樹脂プレート９が固定されている。なお、生体組織８は、例えば、ラットの小脳から切り出した脳組織であり、３００μｍ〜４００μｍの厚さを有する。また、樹脂プレート９としては、超音波を透過する部材（透過部材）であるアクリル板などが用いられる。この樹脂プレート９の上面において生体組織８のセット部の周縁にリファレンス部材１０が設けられている。

超音波プローブ６は、水などの超音波伝達媒体Ｗ１を貯留可能な貯留部１１をその先端部に有するプローブ本体１２と、プローブ本体１２の略中心部に配置される超音波トランスデューサ１３と、プローブ本体１２を前記試料ステージ４の面方向に沿って二次元的に走査するためのＸ−Ｙステージ１４とを備える。プローブ本体１２の貯留部１１は上部が開口しており、その貯留部１１の開口側を上向きにした状態で超音波プローブ６が試料ステージ４の下方に設置されている。

超音波トランスデューサ１３は、酸化亜鉛の薄膜圧電素子１６とサファイアロッドの音響レンズ１７とからなり、パルス励起されることで樹脂プレート９の下面側から生体組織８に対して超音波を照射する。超音波トランスデューサ１３が照射する超音波は、貯留部１１の超音波伝達媒体Ｗ１を介して円錐状に収束されて樹脂プレート９の上面（生体組織８の表面）で焦点を結ぶようになっている。なお、超音波トランスデューサ１３としては、口径１．２ｍｍ、焦点距離１．５ｍｍ、中心周波数８０ＭＨｚ、帯域幅５０〜１０５ＭＨｚ（−６ｄＢ）の仕様のものを用いている。

図２は、超音波画像生成装置１の電気的な構成を示すブロック図である。

図２に示されるように、超音波プローブ６は、超音波トランスデューサ１３と、Ｘ−Ｙステージ１４と、パルス発生回路２１と、受信回路２２と、送受波分離回路２３と、検波回路２４と、Ａ／Ｄ変換回路２５と、エンコーダ２６と、コントローラ２７とを備える。

Ｘ−Ｙステージ１４は、超音波の照射点を二次元的に走査させるためのＸステージ１４Ｘ及びＹステージ１４Ｙを備えるとともに、それぞれのステージ１４Ｘ，１４Ｙを駆動するモータ２８Ｘ，２８Ｙを備えている。これらのモータ２８Ｘ，２８Ｙとしては、ステッピングモータやリニアモータが使用される。

各モータ２８Ｘ，２８Ｙにはコントローラ２７が接続されており、該コントローラ２７の駆動信号に応答してモータ２８Ｘ，２８Ｙが駆動される。これらモータ２８Ｘ，２８Ｙの駆動により、Ｘステージ１４Ｘを連続走査（連続送り）するとともに、Ｙステージ１４Ｙを間欠送りとなるよう制御することで、Ｘ−Ｙステージ１４の高速走査が可能となっている。

また、本実施の形態においては、Ｘステージ１４Ｘに対応してエンコーダ２６が設けられ、エンコーダ２６によりＸステージ１４Ｘの走査位置が検出される。具体的に、走査範囲（例えば、縦横２ｍｍの走査範囲）を３００×３００個の測定点（ピクセル）に分割した場合、１回のＸ方向（水平方向）の走査が３００分割される。そして、各測定点の位置がエンコーダ２６によって検出されパソコン３に取り込まれる。パソコン３はそのエンコーダ２６の出力に同期して駆動制御信号を生成して、その駆動制御信号をコントローラ２７に供給する。コントローラ２７は、この駆動制御信号に基づいてモータ２８Ｘを駆動する。また、コントローラ２７は、エンコーダ２６の出力信号に基づきＸ方向の１ラインの走査が終了した時点でモータ２８Ｙを駆動して、Ｙステージ１４ＹをＹ方向に１ピクセル分移動させる。

さらに、コントローラ２７は、駆動制御信号に同期してトリガ信号を生成してパルス発生回路２１に供給する。これにより、パルス発生回路２１において、そのトリガ信号に同期したタイミングで励起パルスが生成される。その励起パルスが送受波分離回路２３を介して超音波トランスデューサ１３に供給される結果、超音波トランスデューサ１３から超音波が照射される。

図３には、Ｘ−Ｙステージ１４の移動に伴う超音波の走査範囲Ｒ１の一例を示している。この例では、走査範囲Ｒ１の左上の隅にリファレンス部材１０が配置されるようになっており、その位置から走査が開始される。そして、矢印で示すように、生体組織８の表面に沿ってＸ方向及びＹ方向に二次元的に走査が順次行われる。

超音波トランスデューサ１３の薄膜圧電素子１６は、送受波兼用の超音波振動子であり、生体組織８で反射した超音波（反射波）を電気信号に変換する。そして、その反射波の信号は、送受波分離回路２３を介して受信回路２２に供給される。受信回路２２は、信号増幅回路を含んで構成されていて、反射波の信号を増幅して検波回路２４に出力する。

検波回路２４は、生体組織８からの反射波信号を検出するための回路であり、図示しないゲート回路を含む。本実施の形態の検波回路２４は、超音波トランスデューサ１３で受信した反射波信号のなかから生体組織８やリファレンス部材１０の反射波信号を抽出する。そして、検波回路２４で抽出された反射波信号は、Ａ／Ｄ変換回路２５に供給されてＡ／Ｄ変換された後、パソコン３に転送される。

パソコン３は、ＣＰＵ３１、Ｉ／Ｆ回路３２、メモリ３３、記憶装置３４、入力装置３５、及び表示装置３６を備え、それらはバス３７を介して相互に接続されている。

ＣＰＵ３１は、メモリ３３を利用して制御プログラムを実行し、システム全体を統括的に制御する。制御プログラムとしては、Ｘ−Ｙステージ１４による二次元走査を制御するためのプログラム、音響インピーダンスを算出するためのプログラム、音響インピーダンス像を表示するためのプログラムなどを含む。

Ｉ／Ｆ回路３２は、超音波プローブ６との間で信号の授受を行うためのインターフェース（具体的には、ＵＳＢインターフェース）である。Ｉ／Ｆ回路３２は、超音波プローブ６に制御信号（コントローラ２７への駆動制御信号）を出力したり、超音波プローブ６からの転送データ（Ａ／Ｄ変換回路２５から転送されるデータなど）を入力したりする。

表示装置３６は、例えば、ＬＣＤやＣＲＴなどのカラーディスプレイであり、生体組織８の画像（音響インピーダンス像）や各種設定の入力画面を表示するために用いられる。入力装置３５は、キーボードやマウス装置などであり、ユーザからの要求や指示、パラメータの入力に用いられる。

記憶装置３４は、磁気ディスク装置や光ディスク装置などであり、制御プログラム及び各種のデータを記憶している。ＣＰＵ３１は、入力装置３５による指示に従い、プログラムやデータを記憶装置３４からメモリ３３へ転送し、それを逐次実行する。なお、ＣＰＵ３１が実行するプログラムとしては、メモリカード、フレキシブルディスク、光ディスクなどの記憶媒体に記憶されたプログラムや、通信媒体を介してダウンロードしたプログラムでもよく、その実行時には記憶装置３４にインストールして利用する。

次に、生体組織８の音響インピーダンスを算出する方法について説明する。

先ず、図４に示すように、樹脂プレート９を介してリファレンス部材１０に超音波Ｓ_ｏを照射し、リファレンス部材１０での反射波Ｓ_ｒを測定する。この超音波（入射波）Ｓ_ｏと反射波Ｓ_ｒとは次式（１）の関係が成り立つ。

ただし、Ｚ_ｓは樹脂プレート９の音響インピーダンスであり、Ｚ_ｒはリファレンス部材１０の音響インピーダンスである。本実施形態において、Ｚ_ｓ，Ｚ_ｒの値は既知であり、それぞれ３．２１×１０^６Ｎｓ／ｍ^３，１．６７×１０^６Ｎｓ／ｍ^３である。

また、図４に示すように、生体組織８に超音波Ｓ_ｏを照射し、生体組織８での反射波Ｓ_ｔを測定する。この超音波Ｓ_oと反射波Ｓ_ｔとは次式（２）の関係が成り立つ。

ただし、Ｚ_ｔは生体組織８の音響インピーダンスである。

従って、上記式（１），（２）から生体組織８の音響インピーダンスＺ_ｔは、次式（３）により求められる。

なお、樹脂プレート９の音響インピーダンスＺ_ｓやリファレンス部材１０の音響インピーダンスＺ_ｒは、既知の値であるため、制御プログラムのデータとして記憶装置３４に予め記憶されている。また、上記の式（２）で示されるように、樹脂プレート９の音響インピーダンスＺ_ｓが生体組織８の音響インピーダンスＺ_ｔと等しい場合、生体組織８表面で超音波が反射しなくなる。そのため、樹脂プレート９としては、生体組織８の音響インピーダンスＺ_ｔを考慮してその材料を選択するとよい。そこで、例えば、音響インピーダンスＺ_ｓが生体組織８の３倍程度の大きさの材料を用いる。また、水などの超音波伝達媒体Ｗ１との界面となる樹脂プレート９の上面側でも超音波の反射が起こるため、超音波伝達媒体Ｗ１の音響インピーダンスも考慮して樹脂プレート９の材料を選択することが好ましい。

ラットなどの動物において小脳の神経回路が発達すると、顆粒細胞とプルキンエ細胞との間に接続部（シナプス）が形成され、神経回路における情報伝達の際にその接続部に特定の金属イオンが吸着される。従って、本実施の形態では、小脳の神経回路発達期に分布するＬ型カルシウムチャネルにカドミウムイオン（Ｃｄ^２＋）を付着させ、その音響インピーダンス像を観察することで小脳における神経回路の発達状況を確認した。具体的には、所定量の塩化カドミウム（ＣｄＣｌ_２）を水に溶かして、所定濃度のカドミウムイオンを含む超音波造影剤を調製する。この場合におけるカドミウムイオンの濃度は、１００μmol/L〜１０mmol/Lであればよく、好ましくは１０mmol/Lにすることがよい。そして、ラットの小脳から切り出した生体組織（脳組織）８を超音波造影剤に浸漬することにより、生体組織８の所定領域、すなわち、細胞膜に数多く分布するＬ型カルシウムチャネルにカドミウムイオンを選択的に付着させる（選択的造影ステップ）。浸漬時間は特に限定されず、０．５分以上であればよく、好ましくは１分〜１０分である。処理温度は特に限定されないが、好ましくは２０℃〜３５℃であり、特に好ましくは約３２℃である。なお、超音波造影剤は、例えば、塗布、噴霧等の手法によって生体組織８に処理されてもよい。つまり、ここで行われる超音波造影剤の処理は、超音波造影剤を生体組織８の深部にまで浸透させることを目的としていないからである。
その後、生体組織８を超音波顕微鏡２の試料ステージ４上に固定して生体組織８の音響インピーダンス像を観察した。

ここで、生体組織８の音響インピーダンス像を生成するためにＣＰＵ３１が実行する処理例について、図５のフローチャートを用いて説明する。

まず、超音波プローブ６の初期動作として、ＣＰＵ３１からの指示に基づいてコントローラ２７によりモータ２８Ｘ，２８Ｙが駆動され、走査位置がリファレンス部材１０に位置するようにＸ−Ｙステージ１４が移動される。またこのとき、励起パルスがトランスデューサ１３に供給されると、図４に示すように、リファレンス部材１０に超音波Ｓ_ｏが照射され、その反射波Ｓ_ｒが検波回路２４で検出される。そして、ＣＰＵ３１は、Ａ／Ｄ変換回路２５で変換されたデジタルデータをＩ／Ｆ回路３２を介して取得し、そのデータをリファレンス部材１０の反射波のデータとしてメモリ３３に記憶する（ステップ１００）。

その後、ＣＰＵ３１からの指示に基づいてコントローラ２７によりモータ２８Ｘ，２８Ｙが駆動され、Ｘ−Ｙステージ１４による二次元走査が開始される。ＣＰＵ３１は、エンコーダ２６の出力に基づいて測定点の座標データを取得する（ステップ１１０）。そして、図４に示すように、生体組織８に超音波Ｓ_ｏが照射され、その反射波Ｓ_ｔが検波回路２４で検出される。ＣＰＵ３１は、Ａ／Ｄ変換回路２５で変換されたデジタルデータをＩ／Ｆ回路３２を介して取得し、そのデータを生体組織８の反射波のデータとして座標データに関連付けてメモリ３３に記憶する（ステップ１２０）。

その後、ＣＰＵ３１は、得られたリファレンス部材１０及び生体組織８での反射波Ｓ_ｒ，Ｓ_ｔの強度と、リファレンス部材１０及び樹脂プレート９の音響インピーダンスＺ_ｒ，Ｚ_ｓとを用いて、上記の式（３）に対応した演算処理を行い測定点での音響インピーダンスＺ_ｔを算出する（算出ステップ）。そして、ＣＰＵ３１は、算出された音響インピーダンスＺ_ｔを測定点の座標データに関連付けてメモリ３３に記憶する（ステップ１３０）。

その後、ＣＰＵ３１は、算出した音響インピーダンスＺ_ｔに基づいて音響インピーダンス像を生成するための画像処理を行う（画像生成ステップ）。詳しくは、ＣＰＵ３１は、音響インピーダンスＺ_ｔを用いてカラー変調処理を行い、音響インピーダンスＺ_ｔの大きさに応じた画像データを生成し、該画像データをメモリ３３に記憶する（ステップ１４０）。これの具体例を挙げると、音響インピーダンスＺ_ｔの値が大きくなるほど赤色系の色調を強くし、音響インピーダンスＺ_ｔの値が小さくなるほど青色系の色調を強くするような画像処理を行う。

ＣＰＵ３１は、全ての測定点での処理が終了し、１画面分の画像データが取得されたか否かを判断する（ステップ１５０）。ここで、全データが取得されていない場合、ＣＰＵ３１は、ステップ１１０に戻って、ステップ１１０〜１５０の処理を繰り返し実行する。そして、全データが取得された場合には、該データを表示装置３６に転送して、図６に示すような音響インピーダンス像４１を表示させた後、図５の処理を終了する。なお、図６の音響インピーダンス像４１では、生体組織８における音響インピーダンスの違いを色の濃淡で示しているが、実際には、音響インピーダンスの値に応じて色分けされたカラー画像として表示される。

図６の音響インピーダンス像４１においては、小脳の各細胞層を構成する顆粒細胞ＩＧＬ、プルキンエ細胞ＰＬ、分子層の平行線維ＭＬを確認することができる。また、図７には、カドミウムイオンを付着させていない生体組織８の音響インピーダンス像４２を比較例として示す。この音響インピーダンス像４２においては、平行線維ＭＬが途切れ途切れの状態で確認されている。これに対して、図６の音響インピーダンス像４１では、カドミウムイオンが平行線維ＭＬに付着しているため、その平行線維ＭＬが連続的につながった状態で確認されている。

なお、図６の音響インピーダンス像４１は、生後２２日目のラットから切り出した生体組織８を観察したものであり、生後７日目、生後１４日目、生後３６日目のラットからそれぞれ切り出した生体組織８の音響インピーダンス像４３，４４，４５を図８、図９、及び図１０に示す。なお、図８〜図１０においてもカドミウムイオンを付着させた状態の生体組織８を観察した。

図８に示されるように、生後７日目では神経細胞が未発達であり、その音響インピーダンス像４３では、平行線維ＭＬをほとんど確認することができない。一方、図９に示されるように、ラットが自立歩行を始める生後１４日目では小脳の発達が顕著になり、その音響インピーダンス像４４では、平行線維ＭＬを他の細胞層と区別して確認することができる。さらに、図６及び図１０に示されるように、生後２２日目や３６日目では、小脳の神経回路が十分に発達するため、その音響インピーダンス像４１，４５では、太くはっきりした平行線維ＭＬを観察することができる。なお、図示しないが生後７日目、１４日目、３６日目の生体組織８についても、カドミウムイオンを付着させない状態で音響インピーダンス像を確認した。それら音響インピーダンス像と比較して、カドミウムイオンを付着させた状態の各音響インピーダンス像４３〜４５では、平行線維ＭＬの部分が造影され鮮明に表示されることを確認することができた。

また、本発明者らは、生体組織８に他の金属イオンを付着させて音響インピーダンス像を確認した。図１１は、重金属イオンの範疇に属するニッケルイオンを付着させた生体組織８の音響インピーダンス像４６を示している。図１２は、ニッケルイオンを付着させていない生体組織８の音響インピーダンス像４７を示している。なお、図１１及び図１２で観察した生体組織８は、生後１４日目のラットの小脳組織である。図１１及び図１２に示されるように、神経細胞表面にニッケルイオンを付着させることにより、造影効果を確認することができた。ただし、ニッケルイオンによる造影効果に比べてカドミウムイオンによる造影効果のほうが顕著であった。

また、軽金属イオンの範疇に属するカルシウムイオン及びマグネシウムイオンについても、同様に生体組織８に付着させて音響インピーダンス像（図示略）を確認した。カルシウムやマグネシウムは、比較的軽く、生体組織８に多く存在する金属であるため、イオン付着による造影効果はほとんど見られなかった。

従って、本実施の形態によれば以下の効果を得ることができる。

（１）本実施の形態の場合、小脳の生体組織８において、分子層の平行線維ＭＬに重金属イオンとしてのカドミウムイオンを付着させることにより、平行線維ＭＬの音響インピーダンスが大きくなり、超音波の反射強度が強くなる。そのため、音響インピーダンス像４１，４３〜４５において平行線維ＭＬの領域を選択的に造影することができる。従って、平行線維ＭＬを他の細胞層と区別して観察することができ、成長に伴う平行線維ＭＬの発達を確認することができる。

（２）本実施の形態の場合、パルス励起型超音波顕微鏡２を利用して生体組織８の表面を観察することにより、分解能が高い音響インピーダンス像４１〜４７を取得することができる。この超音波顕微鏡２において、音響インピーダンスＺ_ｔは、生体組織８を凍結切片にすることなく、ある程度厚みを持った塊の状態で測定できる。また、パルス励起型超音波顕微鏡２は、生体組織８の下方から超音波Ｓ_ｏを照射してその組織下面の画像を可視化するよう構成された倒立型の顕微鏡である。この場合、試料ホルダなどの特別な固定部材を設ける必要がなく、樹脂プレート９上面に生体組織８を載せるだけで、その音響インピーダンスＺ_ｔを容易に測定することができる。従って、生体組織８を生かした状態でその組織構造を迅速に確認することができる。言い換えると、生体組織８のありのままの様子を観察することが可能となる。

（３）本実施の形態の場合、脳組織の神経回路を構成する平行線維ＭＬを確認できることから、正常な脳組織か回路異常のある脳組織か否かを容易に判別することができる。

（４）本実施の形態の場合、神経細胞膜表面に分布するＬ型カルシウムチャネルにカドミウムイオンを付着させているが、Ｌ型カルシウムチャネルに対するカドミウムイオンの結合力はそれほど強固なものではない。従って、所定の条件を与えれば、カドミウムイオンは比較的容易にＬ型カルシウムチャネルから脱離しうる。即ち、観察後において細胞表面を傷つけることなくカドミウムイオンを洗い流すことができる。なおここでは、カドミウムイオンを含まない洗浄液、好ましくは、カルシウムイオンを含んだ洗浄液を用いることにより、カドミウムイオンを効率よく洗い流すことができ、生体組織８の再利用が可能となる。
［第２の実施の形態］

次に、本発明を具体化した第２の実施の形態を図１３に基づき説明する。

本実施の形態の超音波画像生成装置５１は、超音波プローブユニット５２とパソコン３とを備える。この超音波プローブユニット５２は、第１の実施の形態におけるパルス励起型超音波顕微鏡２と同等の機能を有する。但し、パルス励起型超音波顕微鏡２が据え置き型の機器であるのに対し、本実施の形態の超音波プローブユニット５２は、携帯が可能なハンディタイプの機器である。また、超音波画像生成装置５１を構成するパソコン３は、第１の実施の形態と同じ構成である。

超音波プローブユニット５２は、超音波プローブ５３と、先端部にその超音波プローブ５３を着脱可能なハンドピース部５４とを備える。この超音波プローブ５３は、超音波を二次元走査しながら生体組織に照射して、その生体組織からの反射波を電気信号に変換して出力する機能を有している。ハンドピース部５４はいわゆる把持部であって、手で把持可能な長さ及び直径を有している。使用者はハンドピース部５４を手で持ち、超音波プローブ５３をラット５６の小脳（インビボの脳組織）５７に直接当てるようにする。

本実施の形態の超音波プローブ５３は、プローブケース６１と、超音波トランスデューサ６２と、第１ロータ部６３及び第２ロータ部６４と、リファレンス部材６５とを備える。プローブケース６１は、生体組織とは異なる既知の音響インピーダンスを有し、超音波を透過しうる材料（例えば、アクリル樹脂）を用いて、先端部が略半球形状に形成されている。このプローブケース６１の内部には、超音波伝達媒体Ｗ１が充填されている。

また、プローブケース６１の内部には第１ロータ部６３及び第２ロータ部６４が収納されており、ケース先端側に設けられた第１ロータ部６３の外周面には、超音波トランスデューサ６２が設けられている。このトランスデューサ６２が照射する超音波は、超音波伝達媒体Ｗ１を介して円錐状に収束されてプローブケース６１の外表面で焦点を結ぶようになっている。

本実施の形態において、第１ロータ部６３は、超音波プローブユニット５２の短手方向と平行な回転軸６３ａを介してハウジング６７に回転可能に支持されている。また、第２ロータ部６４は、超音波プローブユニット５２の長手方向と平行な回転軸６４ａを介してハウジング６７を支持しており、そのハウジング６７とともに第１ロータ部６３を回転させる。これらロータ部６３，６４は、回転速度や回転位置が制御可能な周知の電動モータで構成される。

また、プローブケース６１の外表面において超音波の照射点が走査される範囲内には、リファレンス部材６５（例えば、エポキシ樹脂）が設けられている。本実施形態のリファレンス部材６５は、例えば、エポキシ樹脂により形成される。従って、リファレンス部材６５は、アクリル樹脂からなるプローブケース６１とは異なる既知の音響インピーダンスを有している。

超音波プローブユニット５２におけるハンドピース部５４内には、各ロータ部６３，６４を駆動制御するロータ制御回路７１、超音波を送受信するための信号処理回路７２、電気信号の入出力を行うためのＩ／Ｆ回路７３などが設けられている。Ｉ／Ｆ回路７３としては、パソコン等の標準インターフェースであるＵＳＢインターフェースが用いられる。

この超音波画像生成装置５１の超音波プローブ５３では、プローブケース６１を介してリファレンス部材６５に超音波Ｓ_ｏを照射し、リファレンス部材６５での反射波Ｓ_ｒを測定する。また、プローブケース６１を介して生体組織表面に超音波Ｓ_ｏを照射し、生体組織表面での反射波Ｓ_ｔを測定する。そして、各反射波Ｓ_ｒ，Ｓ_ｔの強度と、リファレンス部材６５及びプローブケース６１の音響インピーダンスＺ_ｒ，Ｚ_ｓとを用いて、上記の式（３）に対応した演算処理を行い生体組織の音響インピーダンスＺ_ｔを算出する。

本実施の形態の超音波画像生成装置５１を用いる場合、例えば、ラット５６の頭蓋骨を切開して小脳５７を露出させる。そして、その露出した小脳５７の組織表面に塩化カドミウムを含んだ超音波造影剤を塗りつけることで、平行線維ＭＬにカドミウムイオンを選択的に付着させる。その後、露出した小脳（生体組織）５７に超音波プローブ５３を直接接触させ、その状態で第１ロータ部６３及び第２ロータ部６４を駆動させることで、超音波を二次元走査しながら生体組織５７に照射する。このとき、生体組織５７からの反射波の強度に基づいて、各測定点での音響インピーダンスＺ_ｔを算出する。そして、画像処理を行うことにより各測定点での音響インピーダンスＺ_ｔに対応した画像データが生成され、その画像データに基づいて音響インピーダンス像が表示される。

このように、本実施の形態の超音波画像生成装置５１を用いれば、動物の体内にある生きた脳組織を直接観察することができ、成長に伴う平行線維ＭＬの発達を確認することができる。また、本実施の形態では、Ｂモード画像を表示させる場合のように生体組織８の深部に届くように超音波造影剤を投与するのではなく、組織表面に超音波造影剤を付着させているので、観察後において超音波造影剤を洗い流すことができる。この場合、超音波造影剤に含まれるカドミウムイオンが生体内に取り込まれるリスクも少なく、生体への影響を最小限に抑えることができる。

なお、本発明の各実施の形態は以下のように変更してもよい。

・上記第１の実施の形態では、生体組織８の下方から超音波を照射する倒立型の超音波顕微鏡２を用いるものであったが、生体組織８の上方から超音波を照射する超音波顕微鏡を用いてもよい。

・上記各実施の形態では、生体組織表面での音響インピーダンス像４１〜４７を生成する超音波画像生成装置１，５１に具体化したが、それ以外に生体組織８内部のＢモード画像（断層像）を表示する超音波画像生成装置に具体化してもよい。なおこの超音波画像生成装置を用いる場合、注射器などにより超音波造影剤を動物の体内に直接注入した後、その注入部位に超音波プローブを接触させることで内部のＢモード画像を取得する。このようにしても、生体組織の内部構造を正確に観察することができ、実用上好ましいものとなる。

・上記各実施の形態では、小脳の神経細胞表面に分布するカルシウムチャネルにカドミウムイオンやニッケルイオンを付着させるものであったが、カルシウムチャネル以外のイオンチャネル（例えばナトリウムチャネルなど）に、他の重金属イオン（例えば亜鉛のイオンなど）を付着させてもよい。具体例を挙げると、例えば精巣癌組織などは亜鉛を多く取り込むことが知られている。従って、亜鉛イオンを含む超音波造影剤を用いて生体組織の音響インピーダンス像を造影することにより、精巣における癌組織の有無を容易に確認することができる。さらに、細胞膜に分布するイオンチャネル以外に、トランスポーターやレセプタ（受容体）などの微小器官に重金属イオンを付着させてもよい。

・上記各実施の形態において、ラット５６の小脳における生体組織８，５７を観察するものであったが、ラット５６以外の動物の生体組織を観察してもよい。また、小脳以外の脳（大脳、間脳、中脳など）の組織や、脳以外の神経組織や、神経組織以外の臓器（心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓など）の組織を観察してもよい。

・上記各実施の形態において、パソコン３を用いて超音波画像生成装置１，５１を構成したが、それ以外にワークステーションなどのコンピュータを用いてもよい。また、音響インピーダンス像を表示するための表示装置３６は、パソコン３に一体的に設けられるものであったが、パソコン３と別体で設けてもよい。

・上記実施の形態の超音波画像生成装置１では、カラー変調による画像を得るものであったが、それ以外に輝度変調した画像として可視化してもよい。

次に、特許請求の範囲に記載された技術的思想のほかに、前述した各実施の形態によって把握される技術的思想を以下に列挙する。

（１）請求項１乃至５のいずれか１項において、前記生体組織は、ヒトを除く動物の体内にある生きた生体組織またはヒトを含む動物から採取された生体組織であることを特徴とする超音波画像生成方法。

（２）請求項１乃至５のいずれか１項において、前記重金属イオンは、第１２族元素の金属イオンであることを特徴とする超音波画像生成方法。

（３）請求項１乃至５のいずれか１項において、前記超音波顕微鏡は、前記被検査物の下方から超音波を照射してその被検査物における下面の画像を可視化するよう構成された倒立型の顕微鏡であることを特徴とする超音波画像生成方法。

（４）請求項１乃至５のいずれか１項において、前記画像生成ステップでは、カラー変調して画像表示するための画像データを生成することを特徴とする超音波画像生成方法。

（５）請求項１において、超音波プローブを有する超音波生成装置を用いて前記被検査物の内部のＢモード画像を取得することを特徴とする超音波画像生成方法。

本発明を具体化した第１の実施の形態の超音波画像生成装置を示す概略構成図。超音波画像生成装置の電気的な構成を示すブロック図。超音波の走査範囲を示す説明図。リファレンス部材及び生体組織での超音波の反射波を示す説明図。音響インピーダンス像の生成処理を示すフローチャート。カドミウムイオンが付着した生体組織の音響インピーダンス像を示す説明図。カドミウムイオンが付着していない生体組織の音響インピーダンス像を示す説明図。カドミウムイオンが付着した生体組織の音響インピーダンス像を示す説明図。カドミウムイオンが付着した生体組織の音響インピーダンス像を示す説明図。カドミウムイオンが付着した生体組織の音響インピーダンス像を示す説明図。ニッケルイオンが付着した生体組織の音響インピーダンス像を示す説明図。ニッケルイオンが付着していない生体組織の音響インピーダンス像を示す説明図。本発明を具体化した第２の実施の形態の超音波画像生成装置を示す概略構成図。発達した小脳における神経回路を示す断面図。未発達の小脳における神経回路を示す断面図。（ａ）は正常な小脳の神経回路、（ｂ），（ｃ）は回路異常のある小脳の神経回路を示す説明図。

符号の説明

１，５１…超音波画像生成装置
２…パルス励起型超音波顕微鏡
８，５７…生体組織
４１，４３〜４６…超音波像としての音響インピーダンス像
Ｓ_ｏ…超音波
Ｓ_ｔ…反射波
Ｚ_ｔ…音響インピーダンス

Claims

カドミウムイオンを含む超音波造影剤を用い、生体組織の表面に分布するＬ型カルシウムチャネルに前記カドミウムイオンを選択的に付着させる選択的造影ステップと、
前記生体組織に超音波を照射し、得られた反射波に基づいて、前記生体組織の音響パラメータを算出する算出ステップと、
前記音響パラメータに基づいて、前記生体組織の超音波像を生成するための画像処理を行う画像生成ステップと
を含むことを特徴とする超音波画像生成方法。
前記算出ステップでは、超音波顕微鏡を利用して超音波を二次元走査しながら前記生体組織に照射し、その生体組織表面からの反射波の強度に基づいて音響インピーダンスを算出することを特徴とする請求項１に記載の超音波画像生成方法。
前記生体組織は脳組織であることを特徴とする請求項１または２に記載の超音波画像生成方法。
生体組織に超音波を照射して超音波像を得る前になされる造影方法であって、
カドミウムイオンを含む超音波造影剤を用い、前記生体組織の表面に分布するＬ型カルシウムチャネルに前記カドミウムイオンを選択的に付着させる生体組織の選択的造影方法。
脳組織に超音波を照射して超音波像を得る前になされる造影方法であって、
カドミウムイオンを含む超音波造影剤を用い、前記脳組織の表面に分布するＬ型カルシウムチャネルに前記カドミウムイオンを選択的に付着させる脳組織の選択的造影方法。