JP4857088B2 - 電気泳動装置 - Google Patents

Description

本発明は、キャピラリ電気泳動装置に関する。例えば、キャピラリ、又はキャピラリアレイの交換や取り付けが必要であり、交換や取り付けの際に、キャピラリ、又はキャピラリアレイと電気泳動装置との接続部、若しくは電気泳動路となる流路から空気を除去する必要がある電気泳動装置に関する。

キャピラリ電気泳動は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）をはじめ、多くの生体試料を分離分析する技術として広く普及している。その技術的な利点の一つは、キャピラリの表面積対体積率から生まれる、優れた放熱特性である。この放熱特性が、高電圧を用いた電気泳動による、高速で高分解能な試料分離を実現している。

さらに、キャピラリ電気泳動では、多数本のキャピラリを同時に使用して分析を行うマルチ化が容易であるという特徴も有している。マルチキャピラリ方式による高スループット電気泳動装置が実用化されている。

特開２００１−２８１２２１号公報，特開２００１−２８１２２１号、及び特開2001−３２４４７５号公報においては、１６本のキャピラリからなるキャピラリアレイを使用した電気泳動装置を開示している。

キャピラリは、内径数十〜数百ミクロンの細管であり、主な材料は石英であり、石英の外側を厚さ数十ミクロン程度のポリイミドでコーティングして機械的強度を付与している。電気泳動の際には、キャピラリに、試料分離媒体となる成分を充填して使用する。

試料分離媒体としては、非流動性の架橋型ポリマーが使用されたこともあったが、近年は、生産性や性能安定性の点で優れた、非架橋型の流動性ポリマー溶液が主流になっている。特開２００１−２８１２２１号公報においては、試料分離媒体であるゲルをキャピラリに充填するためのポンプ機構を開示している。ポンプ機構としては、ガラスシリンジを開示しているが、ガラスシリンジ以外にも、サファイヤプランジャを駆動するポンプ機構を備えた電気泳動装置も存在する。

また、特開２００１−３２４４７３号公報においては、分析の種類や、ユーザが必要とするスループットに応じて、キャピラリの長さ、あるいは本数を変えることが開示されている。例えば、ＤＮＡの一塩基長の違いを、数百から一千塩基長程度まで見分けるような高分解能を要するアプリケーションにおいては、比較的長めのキャピラリが使用される。また、分離能を多少落としてでも、高速で分析を行いたい場合には、比較的短めのキャピラリが使用される。大規模な遺伝子解析センターなど、多数の試料を同時に扱うところにおいては、高いスループットが要求され、研究室レベルの小規模なユーザは低いスループットでも良いことが多い。

また、特開２００１−３２４４７５号公報においては、ユーザが交換できる形態のキャピラリアレイを開示されている。キャピラリアレイは、試料導入側端部，光学検出部，ポリマー溶液供給端部の３ヶ所で抑えられる構造となっている。キャピラリアレイのポリマー溶液供給端部は、電気泳動装置のポンプ機構に接続される。

特許文献１〜３開示の電気泳動装置において、より具体的には、ポリマー溶液供給端部は、１６本のキャピラリが直径３.５mm 程度の束状になっており、アクリル製のブロックに水平方向に挿入され、スリーブと押ネジにより密封接続される構造になっている。ブロックにはポリマー溶液を貯蔵するためのリザーバ用シリンジとキャピラリにポリマー溶液を高圧注入するための注入用シリンジが取り付けられている。両シリンジとも、ブロック内の流路を介して、キャピラリアレイと連通している。さらに、バッファ液を収容する容器を取り付け可能な第２ブロックが備えられている。キャピラリアレイが取り付けられる第１ブロックと、上述の第２ブロックの間は、チューブで繋がれている。キャピラリアレイと、第２ブロックに供えられたバッファ液とは、第１ブロックに形成された流路、前記チューブ、第２ブロックに形成された流路を介して連通している。また、第２のブロックに備えられたバッファ液には、陽極側となる電極が挿入されるので、キャピラリアレイからバッファ液に通じる流路は電気泳動路となり、電気泳動の際には電圧が印加される。

電気泳動装置では、電気泳動路の両端間に数キロから数十キロボルトの高電圧を印加するため、電気泳動路への空気の混入は放電等を引き起こす可能性がある。キャピラリアレイと電気泳動装置との接続部は、電気泳動路の一部であるので、キャピラリアレイを電気泳動装置に取り付ける際は、確実に、接続部から気泡を除去しなければならない。

上述の装置においては、ユーザが、キャピラリアレイを電気泳動装置に取り付け、その際に、ユーザが気泡を除去している。気泡の除去は、通常、どちらかのガラスシリンジのプランジャを動かして、流路にポリマー溶液を供給し、第２ブロックに備えられた排出口からポリマー溶液と一緒に気泡を排出することで行われている。

特開２００１−２８１２２１号公報 特開２００１−３２４４７３号公報 特開２００１−３２４４７５号公報

本願発明者が鋭意検討した結果、キャピラリアレイの交換の容易性が、電気泳動装置の操作性をユーザが評価する際の重要なポイントであることが判明してきた。特に、キャピラリアレイ取り付け時に、流路に混入してしまう空気の除去の容易性が、キャピラリアレイ交換の容易性に大きな影響を及ぼすことが解ってきた。

上述の装置における第１ブロック，第２ブロック、及びチューブにおける流路径は１mm程度と小さくなっており、気泡の除去が容易に行えるサイズである。しかし、キャピラリアレイと電気泳動装置を接続する接続部は、キャピラリアレイの束の径（３.５mm 程度）を収容するために、比較的広い空間となっている。この部分においては、ポリマー溶液が上から下へ流れている。ポリマー溶液中の気泡が浮かび上がる方向と、逆の方向にポリマー溶液が流れる。この為、プランジャを動かして流路にポリマー溶液を供給しただけでは、気泡がなかなか抜けない。キャピラリアレイ接続部に残留する気泡により、貴重なポリマー溶液を大量に消費してしまうこともある。

本願発明の目的は、電気泳動路からの気泡の除去が容易な電気泳動装置に関する。

本発明は、電気泳動媒体が充填されるキャピラリと、電気泳動媒体を充填するポンプ機構と、が接続する接続部において、電気移動媒体が下方から上方に向かって流れるようにしたことに関する。

また、好ましくは、キャピラリアレイとバッファ液間の流路を、高耐圧特性を有するロータリー式バルブを使用して制御し、流路構成を簡素化することに関する。流路のデットボリュームを少なくでき、高価な電気泳動媒体を効率的に使用できる。気泡除去に要する電気泳動媒体の使用量も低減できる。

また、好ましくは、バッファから、ある頂点となる位置まで流路を伸ばし、その流路の途中に弁を配置した流路構成に関する。頂点より下の流路が、電気泳動媒体より軽いバッファ液で置換えされていることにより、流路途中の弁においても、電気泳動媒体がバッファ液で置換えされる。電気泳動媒体に弁が触れる時間が短くなり、弁の寿命や信頼性が向上する。

本発明により、キャピラリアレイを電気泳動装置に取り付ける際に、電気泳動路から気泡を容易に除去でき、電気泳動装置の操作性が向上する。

図１は、キャピラリ電気泳動装置の基本的構成を示す概略図である。キャピラリ電気泳動装置は、電気泳動媒体である高粘性ポリマー溶液（以下、ポリマーと称す）が充填されるキャピラリ（内径数十〜数百μｍの細管）を含むキャピラリ電気泳動部、電気泳動分離された試料を検出する光学検出部を有する。また、キャピラリと接続できる接続流路を構成する流路ブロック１０４と、接続流路と連通し、キャピラリに電気泳動媒体を充填できるポンプであるポリマー注入機構を備える。ポリマー注入機構は、ポンプ１０３の操作により、ポリマーを収容しているボトル（以下、ポリマーボトルと称す）１０１からポリマーを吸入し、そのポリマーを例えば１６本のキャピラリから成るキャピラリアレイに注入する動作を行う。また、ポリマー注入機構は、流路ブロック１０４内の気泡を除去する際にも使用される。

以下、装置構成の概略について説明する。１６本のキャピラリを備えるキャピラリアレイ１１０は、一端(試料注入端)がバッファ容器１１２中のバッファに浸漬され、他端が流路ブロック１０４に接続されている。流路ブロック１０４には、キャピラリアレイ１１０の他にポンプ１０３，キャピラリに注入するポリマーが入ったポリマーボトル１０１、及びもう一つのバッファ容器１０７が接続され、内部にそれらを連通する流路が形成されている。流路ブロック１０４とポリマーボトル１０１の間には逆止弁１０２が配置され、ポンプ１０３からキャピラリアレイ１１０のキャピラリにポリマーを注入する際に、ポリマーボトル１０１への逆流を防いでいる。

ポリマーボトル１０１は連続運転に必要十分な容量のものが用いられる。また、ポリマーを吸入してもボトル内が負圧にならないように排気弁もしくはチューブ挿入口に十分な隙間を持たせた構造になっている。また、高低差による圧力でポリマーボトル１０１からバッファ容器１０７側にポリマーが逆流しないように、ポリマーボトル１０１はバッファ容器１０７よりも低い位置に配置されている。このとき、逆止弁１０２の作用でポリマーボトル１０１へのポリマーもしくはバッファ液の流入は防止される。

バッファ容器１０７と流路ブロック１０４の間には電動のバッファバルブ１０５が配置されており、キャピラリアレイ１１０のキャピラリにポリマーを注入する際にはバッファバルブ１０５を閉じて、キャピラリアレイとバッファ容器間の流路をクローズする。また、電気泳動のときはバッファバルブ１０５を開き、流路をオープンにしてキャピラリアレイとバッファ容器を連通させる。

図２は、キャピラリアレイ１１０の一例を示す概略図である。キャピラリアレイを構成する１本１本のキャピラリ２０１は、外径が０.１〜０.７mm、内径が０.０２〜０.５mm程度で、外被はポリイミド樹脂でコーティングされている。キャピラリ自体は石英パイプであり複数本（本例では１６本）のキャピラリを配列してキャピラリアレイを構成する。キャピラリアレイ１１０は、蛍光標識されたＤＮＡサンプル等が入った試料容器から電気的な作用でキャピラリにサンプルを取り込むロードヘッダ２０２，ロードヘッダ２０２のサンプル番号順にキャピラリ２０１を配列固定する検知部（ウインドウユニット）２０５，キャピラリを束ねて接着したキャピラリヘッド２０３を備える。ロードヘッダ２０２から突出する試料注入端には、キャピラリに泳動電圧を印加するための中空電極２０４が設けられている。検知部（ウインドウユニット）２０５は、整列保持したキャピラリアレイに側方から光照射するための開口２０６とキャピラリから発せられた発光を取り出すための開口２０７とを備える。

キャピラリアレイのキャピラリヘッド２０３の形状、すなわち流路ブロック１０４との接続部形状はキャピラリを一列に並べた平型と一束にまとめた丸型だが、この形状に限定されない。丸型の場合は、キャピラリヘッド２０３にスリーブを取り付けて後ろから押ねじを締め込み、スリーブを変形させて隙間を埋めることで流路ブロック１０４に取り付けることができる。

図２に示したキャピラリアレイ１１０は、ロードヘッダ２０２から突出した中空電極
２０４及びキャピラリ２０１の試料注入端が蛍光標識されたＤＮＡサンプルを入れたウェルを複数備えたサンプルトレイに浸漬され、他端のキャピラリヘッド２０３は緩衝液が入った流路ブロック１０４に耐圧気密で取り付けられる。流路ブロック１０４に接続されたバッファ容器１０７に浸漬された電極１０６とロードヘッダ２０２の中空電極２０４には高電圧電源１１４から数ｋＶ程度の高電圧印加され、試料容器中の試料がキャピラリアレイの各キャピラリに電界注入される。その後、キャピラリアレイ１１０の試料注入端は図１に示すようにバッファ容器１１２に浸漬され、各キャピラリに電界注入された試料が電気泳動されて分離する。

レーザ光源１１１から発せられたレーザ光は、励起光学系によって検知部（ウインドウユニット）２０５に誘導され、照射する。励起光照射によってキャピラリ中を泳動している試料から発せられる信号光である蛍光は、検出光学系を介して光検出器１０８で検出される。

なお、ここに示した装置構成はひとつの具体例を示すものであって、本発明に条件や制限を与えるものではない。

キャピラリアレイ１１０は、交換可能な部品であり、ユーザの使用目的によりキャピラリ本数や長さが違うものが選ばれる。また、キャピラリアレイが汚染等により劣化すようなことがあっても交換する。キャピラリアレイの交換は、通常、ユーザが行う。キャピラリアレイを取り付けたら、流路ブロック１０４に混入した空気を取り除く必要がある。何故なら、流路ブロック中の流路の一部、特に、キャピラリアレイ１１０とバッファ容器
１０７間の流路は電気泳動路として、電圧が印加される部分なので、空気が気泡となって残留していると、放電等の弊害を発生する恐れがあるからである。初めて装置を使用する際、または流路ブロック１０４などの流路を構成している部品の洗浄，乾燥を行った後のキャピラリアレイの取り付け（以下、「インストール」と称す）では、キャピラリアレイを流路ブロックに取り付けた後、キャピラリアレイ接続部を含めた流路中をすべてポリマーで満たす。その際、ポンプ１０３を使ってポリマーを供給する。使用中の装置を一端止めて、キャピラリアレイの交換を行う際は、キャピラリアレイ交換後に、やはり、ポンプ１０３からポリマーを流し込むことで流路ブロック１０４に混入した気泡を排出する。部分的に気泡が残留する個所があれば、さらにポリマーを流し、気泡をポリマーで押し出そうとするので、結果的に大量の貴重なポリマーを消費してしまう場合もある。具体的に、図１に示す実施例のような構成では、気泡の排出を次のように行う。まず、キャピラリアレイ１１０を接続し、バッファバルブ１０５を開く。ポンプ１０３からポリマーを供給して、ポリマーと一緒に気泡をバッファ容器側から排出する。通常、流路ブロック１０４内の流路は気泡除去が容易に行われるように、流路の径を１mm程度と小さくし、流路内に均一な流れを生じるようにしている。一方で、キャピラリアレイを接続する部分は、キャピラリヘッド２０３を収容するスペースが必要なので、安易に小さくできない。また、図１に示すような、キャピラリアレイ接続部を流れるポリマーが上側から下側に向かって流れるような向きでは、空気はポリマーの中では上に浮かび上がるという性質から、空気を下方に押し込んでやることは難しい。この結果、流路ブロック１０４の中で、最も空気が残留しやすい部分の一つになっている。こうした、気泡の抜けにくい部分があると、結果的に、気泡除去のために大量のポリマーを使用してしまう場合がある。

図３に、本実施例の流路構成の概略図を示す。

図３の構成のポイントは、キャピラリアレイ１１０が斜め下を向くように接続し、さらに、キャピラリアレイ接続部に対して下側からポリマーを送液するような流路構成にしたことである。キャピラリと接続流路とが接続することにより形成される電気泳動媒体の流路が、キャピラリ側が上、接続流路側が下となるように構成されている。接続流路と接続するキャピラリの端面が下向きである。キャピラリの端面は、流路３０３と接続流路が連通する部分より下となっている。図では、ポンプ１０３がキャピラリの下に配置されているが、これは本発明を説明するための実施例の一つであり、本来は、装置設計の都合にあわせて配置を変えてもよい。例えば、キャピラリとポンプが同じ高さに並ぶような配置でも良い。流路３０３は、その途中にバッファバルブ１０５を備える流路３０２を経由して、バッファ容器１０７と連通している。

ここで、ポンプ３０１は図１のポンプ１０３と同じ役割を果たすものである。この配置にすることで、キャピラリアレイ接続部の気泡は、ポリマーにより下から押し上げられて、上方の流路３０３に排出されることになる。すなわち、前述した、気泡が、ポリマーの中では上に浮かび上がるという性質に習った挙動になり、キャピラリアレイ接続部からの空気の排出が容易に行えるようになる。結果的に、装置の使い勝手が良くなり、気泡除去に必要となるポリマーの消費量を減らすことができることから、装置の経済性が向上する。

また、本実施例では、バッファバルブ１０５とキャピラリアレイ１１０の間に頂点となる頂点３０４を設けている。流路が、少なくとも一つの頂点を有するように湾曲しており、その頂点はバッファ液面より上方にあり、この頂点とバッファ液面と間に位置する部分に流路を開閉する弁が設けられている。

径が１mm程度で、内部にポリマーを充填された流路をバッファ液の中に浸漬させると、ポリマーとバッファ液の密度の違いにより（通常は、バッファ液の方が軽い）、前記流路内のポリマーとバッファ液の間で置換えが発生する。つまり、図３に示すような構成では、流路をすべてポリマーで満たした後に、バッファ容器１０７を取り付けると、流路302、および流路３０２中にあるバッファバルブ１０５の内部のポリマーがバッファ液で置換えされる。図４に示したようなロータリー式バルブを電気泳動装置に使用するときの心配事の一つは、結晶化したポリマーによってバルブの構成部品が損傷することである。前述したように、内部ロータ４０１および、ステータ４０２の交換が容易に行えることが本構成の特徴の一つであるが、損傷を受けずに、交換無で長く使えることに越したことはない。図３に示したような構成では、バルブの内部が結晶化しやすいポリマーではなく、結晶化しにくいバッファ液で満たされるので、構成部品が破損するリスクが激減する。つまり、構成部品の長寿命化，信頼性を高めることになる。ポリマーとバッファ液の置換えが進み、バッファ液がキャピラリアレイ１１０のところまで達してしまうと、キャピラリアレイにポリマーを注入する際に、ポリマーではなく、バッファ液が注入されてしまうので、これは避けなければならない。図３の流路構成では、ポリマーとバッファ液の置換えは頂点３０４のところで止まる。なぜなら、流路３０３は頂点３０４から低くなる方向なので、ポリマーよりバッファ液は流路３０３には進入しないからである。バッファバルブとキャピラリアレイの間に頂点となる位置を設けることで、バッファ液がキャピラリアレイに混入することを防ぎ、さらに、ロータリバルブの長寿命化を実現できる。

図４を参照して、本実施例のバッファバルブ１０５の構造について説明する。図４は、バッファバルブとして使用するロータリー式バルブの概略構成を表す図である。ロータリー式バルブは、ロータ４０１と、ロータ４０１をはさむステータ４０２と、ロータ４０１とステータ４０２を抑える押しねじ４０３を含む。内部のロータ４０１が回転することで、流路の開閉を切り替える。図中のステータ４０２は回転せずに、ロータ４０１と密着接触するステータである。一つのロータ４０１をはさむように２つのステータ４０２が支持体４０４に組み込まれ、押しねじ４０３によってそれぞれの部品が互いに押し付けられている。さらに、その押しねじ４０３の内部に、流路を構成するチューブ４０７，チューブをシールするスリーブ４０５，スリーブをつぶしてチューブを密着接合する押しねじ406が接続して流路を任意の長さ，個所まで延長できる。この構成のポイントは、押しねじ
４０３の締め付け具合によって、ロータ４０１とステータ４０２と支持体４０４の密着具合が調整できる点である。通常、電気泳動装置では、内径数〜数十ミクロンのキャピラリに高粘性ポリマー溶液を短時間で注入するためには数ＭＰａの高圧力が必要になる。その場合、バッファバルブの耐圧を注入圧力以上に高める必要がある。小型で、内部のロータが回転して流路の開閉を制御するようなロータリー式バルブは、流路中に挿入でき、流路構成の簡素化に有効であるが、キャピラリ電気泳動装置のバッファバルブとして使えるような数メガパスカル以上の耐圧を有するようなものはなかった。本実施例の構成では、前述したように、ロータを２つのステータではさみ、さらに、押ネジで押し付けることにより、構成部品の密着度を高め、高耐圧を実現する。さらに、好ましいことは、押しねじ
４０３を取り外すことで内部の構成部品にアクセスし、部品交換できることであり、万一、磨耗等により内部構成部品に損傷が生じた場合は、容易に交換可能である。

ポリマー注入機構を備えた電気泳動装置の基本的構成を示す概略図。 キャピラリアレイの基本的構成を示す概略図。 本実施例の流路構成の概略図。 本実施例のロータリー式バルブを示す概略図。

符号の説明

１０１ ポリマーボトル
１０２ 逆止弁
１０３ ポンプ
１０４ 流路ブロック
１０５ バッファバルブ
１０７，１１２ バッファ容器
１０８ 光検出器
１１０ キャピラリアレイ
１１４ 高電圧電源
２０１ キャピラリ
２０２ ロードヘッダ
２０３ キャピラリヘッド
２０４ 中空電極
２０５ 検知部
２０６，２０７ 開口
３０２，３０３ 流路
３０４ 頂点
４０１ 内部ロータ
４０２ ステータ
４０３，４０６ 押しねじ
４０４ 支持体
４０５ スリーブ
４０７ チューブ

Claims (10)

1. 電気泳動媒体が充填される一本以上のキャピラリと、
   前記キャピラリと接続できる接続流路と、
   前記接続流路と連通し、前記キャピラリに前記電気泳動媒体を充填できるポンプと、
   前記接続流路と連通する第２流路と、
   前記第２流路と連通し、電気泳動媒体に電圧を印加する電極が浸されるバッファ液を保持するバッファ容器と、
   を含むキャピラリ電気泳動装置において、
   前記接続流路と接続する前記キャピラリの端面が、前記第２流路と前記接続流路が連通する部分より下となっており、
   前記ポンプが前記キャピラリの端面より下方に配置されており、
   前記ポンプの駆動により、前記キャピラリの端面付近の気泡が、前記第２流路と前記接続流路が連通する部分及び前記第２流路を経てバッファ容器側へ排出されることを特徴とするキャピラリ電気泳動装置。
2. 請求項１記載の電気泳動装置において、
   当該第２流路において、ロータリー式バルブを備えていることを特徴とする電気泳動装置。
3. 請求項２記載の電気泳動装置において、
   前記ロータリー式バルブが、ロータと、前記ロータをはさむステータと、前記ロータと前記ステータを抑える押ネジを備えること特徴とする電気泳動装置。
4. 請求項１記載の電気泳動装置において、
   前記第２流路が、少なくとも一つの頂点を有するように湾曲しており、当該頂点はバッファ液面より上方にあり、
   前記第２流路における、当該頂点とバッファ液面との間に位置する部分に、前記第２流路を開閉する弁が設けられていることを特徴とする電気泳動装置。
5. 請求項４記載の電気泳動装置において、
   前記弁がロータリー式バルブであることを特徴とする電気泳動装置。
6. 電気泳動媒体が充填される一本以上のキャピラリと、
   前記キャピラリと接続できる接続流路と、
   前記接続流路と連通し、前記キャピラリに前記電気泳動媒体を充填できるポンプと、
   前記接続流路と連通する第２流路と、
   前記第２流路と連通し、電気泳動媒体に電圧を印加する電極が浸されるバッファ液を保持するバッファ容器と、
   を含むキャピラリ電気泳動装置において、
   前記接続流路と接続する前記キャピラリの端面が下向きであり、且つ、当該端面が前記第２流路と前記接続流路が連通する部分より下となっており、
   前記ポンプが前記キャピラリの端面より下方に配置されており、
   前記ポンプの駆動により、前記キャピラリの端面付近の気泡が、前記第２流路と前記接続流路が連通する部分及び前記第２流路を経てバッファ容器側へ排出されることを特徴とするキャピラリ電気泳動装置。
7. 請求項６記載の電気泳動装置において、
   当該第２流路において、ロータリー式バルブを備えていることを特徴とする電気泳動装置。
8. 請求項７記載の電気泳動装置において、
   前記ロータリー式バルブが、ロータと、前記ロータをはさむステータと、
   前記ロータと前記ステータを抑える押ネジを備えることを特徴とする電気泳動装置。
9. 請求項６記載の電気泳動装置において、
   前記第２流路が、少なくとも一つの頂点を有するように湾曲しており、当該頂点はバッファ液面より上方にあり、
   前記第２流路における、当該頂点とバッファ液面との間に位置する部分に、前記第２流路を開閉する弁が設けられていることを特徴とする電気泳動装置。
10. 請求項９記載の電気泳動装置において、
    前記弁がロータリー式バルブであることを特徴とする電気泳動装置。

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