JP4834208B2 - Method for producing (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid ester - Google Patents

Description

【０００９】
（式中、Ｒ¹はメチル基またはｎ−ブチル基を示す）で表わされるｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物を加水分解反応により光学分割することを特徴とする（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの製造法に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の製造法によれば、プロテアーゼを用い、一般式（Ｉ）：
【００１１】
【化３】

【００１２】
（式中、Ｒ¹はハロゲン原子もしくは芳香族置換基で置換されていてもよい直鎖状または分岐鎖状の炭素数１〜１８のアルキル基、またはハロゲン原子もしくは芳香族置換基で置換されていてもよい直鎖状または分岐鎖状の炭素数１〜１８のアルケニル基を示す）で表わされるｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物を加水分解反応にて光学分割させて、（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルを容易に効率よく得ることができる。すなわち、一般式（Ｉ）で表わされるｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物を原料とし、これにプロテアーゼを作用させることにより立体選択的にエステルの加水分解を行なわせ、ついで分離、精製して（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルを得るものである。
【００１３】
本発明に用いられるｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルは、一般式（Ｉ）で表わされるものであり、たとえばクロトン酸エステルの酸化により容易に得ることができる（特開平３−１９６５１９号公報）。
【００１４】
前記一般式（Ｉ）において、Ｒ¹で示されるアルキル基としては、たとえばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基などの好ましくは炭素数１〜８のアルキル基や、たとえば２−クロロエチル基、２−ブロモエチル基、２−クロロプロピル基、２−ブロモプロピル基などの、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などのハロゲン原子で置換されたアルキル基、たとえばベンジル基、１−フェニルエチル基、２−フェニルエチル基、３−フェニルプロピル基などの芳香族置換基で置換されたアルキル基などがあげられ、またＲ¹で示されるアルケニル基としては、たとえばイソプロペニル基、アリル基、３−ブテニル基や、たとえば２−クロロアリル基、２−ブロモアリル基、３−クロロ−３−ブテニル基、３−ブロモ−３−ブテニル基などの、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などのハロゲン原子で置換されたアルケニル基、たとえば３−フェニル−２−プロペニル基、４−フェニル−２−ブテニル基などの芳香族置換基で置換されたアルケニル基などがあげられる。
【００１５】
前記ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルは、エナンチオマー混合物であり、その混合比率が１：１のもの、すなわちラセミ体が実用的価値の面で好ましいが、本発明にはとくに限定がなく、いかなる混合比率のエナンチオマー混合物をも用いることができる。
【００１６】
本発明に用いることができるプロテアーゼとしては、たとえばバチルス（Bacillus）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、リゾプス（Rhizopus）属、クロストリジウム（Clostridium）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、ペニシリウム（Penicillium）属に属する微生物などが生産するプロテアーゼ；パパイン、ブロメライン、フィシンなどの植物より産生されるプロテアーゼ；トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パンクレアチンなどの動物より産生されるプロテアーゼなどが例示されるが、ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物のエステル基を立体選択的に加水分解し、目的とする（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルを回収することができるものであればプロテアーゼの種類にとくに限定がない。前記例示のなかでは、たとえばバチルス・エスピー（Bacillus sp.）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・メレウス（Aspergillus melleus)などに由来のものが立体選択性によりすぐれる点でとくに好ましい。
【００１７】
前記プロテアーゼの市販品としては、たとえばバチルス・エスピー由来のプロレザー（登録商標）およびプロテアーゼＳ「アマノ」（天野製薬（株）製、商品名）、アスペルギルス・オリザエ由来のプロテアーゼＡ「アマノ」（天野製薬（株）製、商品名）、アスペルギルス・メレウス由来のプロテアーゼＰ「アマノ」６（天野製薬（株）製、商品名）などがあげられる。
【００１８】
前記プロテアーゼの使用量は、プロテアーゼの種類に応じ、その単位重量あたりの酵素活性によって異なるので一概に決定されるものではないが、反応速度や得られる（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの光学純度が低下しないようにするためには、ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのラセミ体１００重量部（以下、部という）に対して０．１部以上、好ましくは１部以上となるように調整することが望ましく、また経済性や（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの収率が低下しないようにするためには、ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのラセミ体１００部に対して１００部以下、好ましくは５０部以下となるように調整することが望ましい。
【００１９】
なお、反応に用いるｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物が、混合比率が１：１でないラセミ体以外の混合物である場合、前記プロテアーゼの使用量は、該エナンチオマー混合物の混合比率に応じて適宜前記範囲外の量に変更してもよい。
【００２０】
前記プロテアーゼはそれぞれ単独で用いてもよく、また必要に応じて２種以上を混合して用いることもできる。これらプロテアーゼのうち、微生物が生産するものは、微生物を培養することによって得られるが、その使用形態は、菌体培養液をそのまま、粗酵素、精製酵素として、または常法によりこれを固定化して用いるなど、いかなる形態であってもよく、とくに限定されるものではない。また動植物より産生されるプロテアーゼにおいても、動植物組織細胞もしくは動植物培養細胞をそのまま、粗酵素、精製酵素として、または常法によりこれを固定化して用いるなど、いかなる形態であってもよく、とくに限定されるものではない。
【００２１】
ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物より、プロテアーゼを用いて立体選択的に目的とする（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルを回収する加水分解反応は、基質となるｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物およびプロテアーゼを、通常水または緩衝液中で撹拌することによって行なうことができるが、緩衝液を用いた場合には、プロテアーゼの至適ｐＨ内で、プロテアーゼの酵素活性が保持されたまま加水分解反応が進行するので、プロテアーゼの使用量を減らすことができるといった利点がある。
【００２２】
前記緩衝液としては、たとえばリン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどの無機酸塩の緩衝液、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどの有機酸塩の緩衝液などの通常用いられるものが例示される。これらの緩衝液を用い、反応液のｐＨを用いるプロテアーゼの最適ｐＨに合わせて加水分解反応させることが好ましい。
【００２３】
緩衝液の使用量は、用いる緩衝液の種類および濃度により異なるので一概に決定されるものではないが、反応速度や得られる（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの光学純度が低下しないようにするためには、ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのラセミ体１００部に対して２００部以上、好ましくは５００部以上となるように調整することが望ましく、また経済性や（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの収率が低下しないようにするためには、ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのラセミ体１００部に対して２００００部以下、好ましくは５０００部以下となるように調整することが望ましい。
【００２４】
なお、反応に用いるｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物が、混合比率が１：１でないラセミ体以外の混合物である場合、前記緩衝液の使用量は、該エナンチオマー混合物の混合比率に応じて適宜前記範囲外の量に変更してもよい。
【００２５】
さらに、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの水溶液を用い、ｐＨスタットにて反応液のｐＨをコントロールすると、前記緩衝液を用いた場合と同様の効果を得ることができる。
【００２６】
なお、前記加水分解反応時には、水または緩衝液とともに有機溶媒を用いてもよく、かかる有機溶媒には、基質となるｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物を溶解し、プロテアーゼの酵素活性を阻害しないかぎりとくに限定がない。
【００２７】
加水分解反応の反応温度は通常０〜５０℃程度であることが好ましく、また反応時間は１〜４０時間程度であることが一般的であるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
加水分解反応の経時および終点は、高速液体クロマトグラフィ（以下、ＨＰＬＣという）などにより確認することができる。反応終了後、反応液に適切な有機溶媒、たとえばｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、トルエン、ジイソプロピルエーテル、酢酸エチル、ジクロロエタンなどを加えて抽出を行ない、必要に応じて抽出により混入する不純物を水にて洗浄し、除去することもできる。抽出物は、減圧濃縮後、蒸留やカラムクロマトグラフィなどの通常の精製方法を適用することにより、目的とする（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルを得ることができる。
【００２９】
なお、分液後も水層中のプロテアーゼはｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルを加水分解させる活性を有しているので、そのまま連続反応が可能である。
【００３０】
【実施例】
つぎに、本発明の（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの製造法を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【００３１】
実施例１〜４
精製水４６６．４ｇ、リン酸二水素カリウム６８．２ｇおよび水酸化ナトリウム１５．４ｇより調製したリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）に、ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルのラセミ体２５．０ｇおよび表１に示すプロテアーゼ２．５ｇを添加し、２５℃で８時間撹拌して反応させ、ＨＰＬＣにて反応の経時および終点を確認した。
【００３２】
反応終了後、反応液を２００ｍｌのｎ−ヘキサンにて２回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させたのち、ｎ−ヘキサンを減圧留去させ、得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開液：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝４／１（体積比））で精製し、（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルを得た。
【００３３】
得られた（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルについて、光学分割カラムを用いたＨＰＬＣ（カラム：ダイセル化学工業（株）製、キラルセルＯＤ、溶媒：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝２０／１（体積比））により光学純度を求めた。また、（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルの収量をｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルの仕込み量で除して収率を求めた。これら収量、収率および光学純度を表１に示す。
【００３４】
【表１】

【００３５】
表１に示された結果から、実施例１〜４のごとき本発明の製造法によれば、高光学純度の（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルを、容易かつ経済的に得ることができることがわかる。
【００３６】
実施例５
精製水１８６６ｇ、リン酸二水素カリウム２７２．７ｇおよび水酸化ナトリウム６３．３ｇより調製したリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）に、ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルのラセミ体１００．０ｇおよびプロレザー（天野製薬（株）製、登録商標）３０．０ｇを添加し、２５℃で１４．５時間撹拌して反応させ、ＨＰＬＣにて反応の経時および終点を確認した。
【００３７】
反応終了後、反応液を６００ｍｌのｎ−ヘキサンにて２回抽出した。抽出液からｎ−ヘキサンを減圧留去させ、得られた油状物を蒸留して精製し、（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルを得た。
【００３８】
得られた（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルについて、実施例１〜４と同様にして光学純度および収率を求めた。これらの結果を収量とあわせて以下に示す。また、以下の条件で沸点および比旋光度を測定した。その結果もあわせて以下に示す。
【００３９】
収量：３３．３ｇ
収率：３３．３％
光学純度：９７．７％ｅ.ｅ.
沸点（６Torr）：７７℃
比旋光度（Ｃ＝２、クロロホルム中、２５℃）：＋１７．３°
【００４０】
さらに、得られた（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよびＩＲスペクトルのデータを以下に示す。
【００４１】
¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃中、δ値（ｐｐｍ）、日本電子（株）製ＧＸ−５００にて測定）：０．９３（ｔ，３Ｈ）、１．３９（ｍ，２Ｈ）、１．６２（ｍ，２Ｈ）、３．１７（ｄ，１Ｈ）、３．２１（ｑｄ，２Ｈ）、４．１６（ｔｄ，２Ｈ）ＩＲ（ｎｅａｔ、ｃｍ^-1、（株）島津製作所製ＦＴＩＲ−４２００にて測定）：１７４４
【００４２】
実施例６
精製水１８６６ｇ、リン酸二水素カリウム２７２．７ｇおよび水酸化ナトリウム６３．３ｇより調製したリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）に、ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸メチルのラセミ体１００．０ｇおよびプロレザー（天野製薬（株）製、登録商標）３０．０ｇを添加し、２５℃で１２時間撹拌して反応させ、ＨＰＬＣにて反応の経時および終点を確認した。
【００４３】
反応終了後、反応液を６００ｍｌのｎ−ヘキサンにて２回抽出した。抽出液からｎ−ヘキサンを減圧留去させ、得られた油状物を蒸留して精製し、（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸メチルを得た。
【００４４】
得られた（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸メチルについて、実施例１〜４と同様にして光学純度および収率を求めた。これらの結果を収量とあわせて以下に示す。また、以下の条件で沸点および比旋光度を測定した。その結果もあわせて以下に示す。
【００４５】
収量：２９．１ｇ
収率：２９．１％
光学純度：９５．４％ｅ.ｅ.
沸点（２６Torr）：７２℃
比旋光度（Ｃ＝２、クロロホルム中、２４℃）：＋２１．９°
【００４６】
さらに、得られた（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸メチルの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよびＩＲスペクトルのデータを以下に示す。
【００４７】
¹Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃中、δ値（ｐｐｍ）、日本電子（株）製ＧＸ−５００にて測定）：１．４１（ｄ，３Ｈ）、３．２１（ｄ，１Ｈ）、３．２４（ｑｄ，１Ｈ）、３．７８（ｓ，３Ｈ）
ＩＲ（ｎｅａｔ、ｃｍ^-1、（株）島津製作所製ＦＴＩＲ−４２００にて測定）：１７５０
【００４８】
以上のごとき実施例５および６の結果から、本発明の製造法によれば、高光学純度の（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルおよび（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸メチルを、容易かつ経済的に得ることができることがわかる。
【００４９】
【発明の効果】
本発明の製造法によれば、生理活性物質をはじめとする種々の有機化学製品の中間体としてきわめて有用な（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルを、簡便かつ経済的に製造することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid ester. Specifically, the present invention relates to a process for producing (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid ester which is extremely useful as an intermediate for various organic chemical products including, for example, physiologically active substances.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, as a method for producing (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid, which is a precursor of (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid ester, or a method that can be produced, for example, (1) Chemical A method of optically resolving trans-2,3-epoxybutyric acid synthesized in 1) with an optically active amine (JP-A-60-13775),
(2) A method of reacting allothreonine, which is an optically active β-hydroxy-α-amino acid, with nitrosyl halide or sodium nitrite and epoxidizing with caustic alkali (Japanese Patent Publication No. 40-21766),
(3) Method for ruthenium oxidation of optically active hydroxymethylethylene oxide obtained by sharp pressing oxidation [Tetrahedron Lett., 31 (35), 5023 (1990)],
(4) A method in which trans-2,3-epoxybutyric acid ester is hydrolyzed with lipase or esterase, and (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid is recovered from the aqueous layer after the reaction (Japanese Patent Laid-Open No. 4-212881) No.)
Etc. are known.
[0003]
However, the methods (1) to (3) require an optically active raw material or an optical resolution agent, and the method (4) is a method for producing (2R, 3S) -2,3-epoxybutyric acid ester. Is useful, but (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid recovered from the aqueous layer has the disadvantage that the optical purity is low, and the methods (1) to (4) further include reaction conditions and The optical resolution conditions had to be selected, and it was neither a simple method nor an economical method.
[0004]
Furthermore, although oxidation of crotonic acid esters by microorganisms has been reported, there is no disclosure regarding an effective method for producing an optically active substance as described above (Japanese Patent Laid-Open No. 61-25492).
[0005]
Thus, at present, an effective production method of (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid has not been proposed, and therefore, its ester (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid ester In fact, the manufacturing method has not been sufficiently studied.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of the above prior art, and (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid ester, which is extremely useful as an intermediate for various organic chemical products including physiologically active substances, can be conveniently used. And it aims at providing the method of manufacturing economically.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present invention uses Pro Leather (trade name), Protease S (trade name), Protease A (trade name) or Protease P (trade name) as a protease.
[0008]
[Chemical 2]

[0009]
(Wherein R ¹ represents a methyl group or an n-butyl group ) An enantiomeric mixture of trans-2,3-epoxybutyric acid ester represented by the following formula is optically resolved by hydrolysis (2S, 3R) The present invention relates to a method for producing a 2,3-epoxybutyric acid ester.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
According to the production method of the present invention, a protease is used and the general formula (I):
[0011]
[Chemical 3]

[0012]
(In the formula, R ¹ is a linear or branched alkyl group having 1 to 18 carbon atoms which may be substituted with a halogen atom or an aromatic substituent, or a halogen atom or an aromatic substituent. An enantiomeric mixture of trans-2,3-epoxybutyric acid ester represented by a linear or branched alkenyl group having 1 to 18 carbon atoms may be optically resolved by hydrolysis reaction (2S , 3R) -2,3-epoxybutyric acid ester can be obtained easily and efficiently. That is, a mixture of enantiomers of trans-2,3-epoxybutyric acid ester represented by the general formula (I) is used as a raw material, and the ester is hydrolyzed stereoselectively by allowing protease to act on this, followed by separation and purification. Thus, (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid ester is obtained.
[0013]
The trans-2,3-epoxybutyric acid ester used in the present invention is represented by the general formula (I) and can be easily obtained, for example, by oxidation of crotonic acid ester (Japanese Patent Laid-Open No. 3-196519). .
[0014]
In the general formula (I), the alkyl group represented by R ¹ is preferably a carbon such as a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, or a t-butyl group. Substituted with a halogen atom such as a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom such as an alkyl group of 1 to 8 or, for example, a 2-chloroethyl group, a 2-bromoethyl group, a 2-chloropropyl group or a 2-bromopropyl group Examples of the alkyl group include an alkyl group substituted with an aromatic substituent such as a benzyl group, a 1-phenylethyl group, a 2-phenylethyl group, and a 3-phenylpropyl group, and an alkenyl group represented by R ¹ Are, for example, isopropenyl group, allyl group, 3-butenyl group, for example 2-chloroallyl group, 2-bromoallyl group, 3-chloro An alkenyl group substituted with a halogen atom such as a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom, such as a 3-butenyl group or a 3-bromo-3-butenyl group, such as a 3-phenyl-2-propenyl group, a 4-phenyl- Examples thereof include an alkenyl group substituted with an aromatic substituent such as a 2-butenyl group.
[0015]
The trans-2,3-epoxybutyric acid ester is an enantiomeric mixture, and its mixing ratio is 1: 1, that is, a racemate is preferable in terms of practical value, but the present invention is not particularly limited, and any Mixed ratio enantiomeric mixtures can also be used.
[0016]
The protease can be used in the present invention, for example, Bacillus (Bacillus) genus Aspergillus (Aspergillus) genus, Staphylococcus (Staphylococcus) genus, Rhizopus (Rhizopus) genus Clostridium (Clostridium) genus Streptomyces (Streptomyces) genus And proteases produced by microorganisms belonging to the genus Penicillium ; proteases produced by plants such as papain, bromelain and ficin; proteases produced by animals such as trypsin, chymotrypsin, pepsin and pancreatin However, the ester group of the enantiomeric mixture of trans-2,3-epoxybutyric acid ester can be stereoselectively hydrolyzed to recover the desired (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid ester. Ah In particular, there is no limit to the type of protease if. Among the exemplified, for example, Bacillus sp. (Bacillus sp.), Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae), those derived from such as Aspergillus melleus (Aspergillus melleus) is particularly preferable because excellent by stereoselectivity.
[0017]
Examples of commercially available proteases include Pro Leather (registered trademark) derived from Bacillus sp and Protease S “Amano” (trade name, manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), Protease A “Amano” derived from Aspergillus oryzae (Amano) And a protease P “Amano” 6 (trade name, manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) derived from Aspergillus meleus.
[0018]
The amount of the protease used depends on the type of protease and varies depending on the enzyme activity per unit weight, and is not generally determined. However, the reaction rate and the obtained (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid are not determined. In order not to lower the optical purity of the ester, it is 0.1 part or more, preferably 1 part or more with respect to 100 parts by weight of the racemic trans-2,3-epoxybutyrate ester (hereinafter referred to as part). It is desirable to adjust so that it may become, and in order not to reduce economical efficiency and the yield of (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid ester, racemic of trans-2,3-epoxybutyric acid ester It is desirable to adjust to 100 parts or less, preferably 50 parts or less with respect to 100 parts of the body.
[0019]
In addition, when the enantiomeric mixture of trans-2,3-epoxybutyric acid ester used for the reaction is a mixture other than a racemate whose mixing ratio is not 1: 1, the amount of the protease used depends on the mixing ratio of the enantiomeric mixture. The amount may be appropriately changed to an amount outside the above range.
[0020]
Each of the proteases may be used alone or in combination of two or more as necessary. Among these proteases, those produced by microorganisms can be obtained by culturing microorganisms, and the form of use is that the bacterial cell culture solution is used as it is, as a crude enzyme, purified enzyme, or by immobilizing it by a conventional method. Any form such as use may be used, and it is not particularly limited. In addition, the protease produced from animals and plants may be in any form such as animal or plant tissue cells or animal and plant cultured cells as they are, used as crude enzymes, purified enzymes, or immobilized by conventional methods, and is not particularly limited. It is not something.
[0021]
The hydrolysis reaction for recovering the desired (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid ester stereoselectively from a mixture of enantiomers of trans-2,3-epoxybutyric acid ester using a protease is performed as a substrate trans The enantiomer mixture of 2,3-epoxybutyric acid ester and the protease can be usually stirred by stirring in water or a buffer solution. When a buffer solution is used, the protease is used within the optimum pH of the protease. Since the hydrolysis reaction proceeds while maintaining the enzyme activity, there is an advantage that the amount of protease used can be reduced.
[0022]
Examples of the buffer include those usually used such as a buffer for inorganic acid salts such as sodium phosphate and potassium phosphate, and a buffer for organic acid salts such as sodium acetate and sodium citrate. It is preferable to use these buffers and perform a hydrolysis reaction in accordance with the optimum pH of the protease using the pH of the reaction solution.
[0023]
The amount of buffer used varies depending on the type and concentration of the buffer used and is not generally determined. However, the reaction rate and the optical purity of the obtained (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid ester are reduced. In order to avoid this, it is desirable to adjust to 200 parts or more, preferably 500 parts or more with respect to 100 parts of the racemic body of trans-2,3-epoxybutyric acid ester. , 3R) -2,3-epoxybutyric acid ester, in order not to decrease the yield, it is 20000 parts or less, preferably 5000 parts or less based on 100 parts of racemic body of trans-2,3-epoxybutyric acid ester. It is desirable to adjust so that.
[0024]
In addition, when the enantiomeric mixture of trans-2,3-epoxybutyric acid ester used for the reaction is a mixture other than a racemate whose mixing ratio is not 1: 1, the amount of the buffer used is the mixing ratio of the enantiomeric mixture. Accordingly, the amount may be appropriately changed to an amount outside the above range.
[0025]
Furthermore, for example, by using an aqueous solution of sodium hydroxide, potassium hydroxide or the like and controlling the pH of the reaction solution with a pH stat, the same effect as that obtained when the buffer solution is used can be obtained.
[0026]
In the hydrolysis reaction, an organic solvent may be used together with water or a buffer solution. In such an organic solvent, an enantiomeric mixture of trans-2,3-epoxybutyric acid ester serving as a substrate is dissolved, and the enzymatic activity of the protease. There is no particular limitation as long as it is not disturbed.
[0027]
The reaction temperature of the hydrolysis reaction is usually preferably about 0 to 50 ° C., and the reaction time is generally about 1 to 40 hours, but the present invention is not limited thereto.
[0028]
The time and end point of the hydrolysis reaction can be confirmed by high performance liquid chromatography (hereinafter referred to as HPLC). After completion of the reaction, extraction is performed by adding an appropriate organic solvent such as n-hexane, cyclohexane, toluene, diisopropyl ether, ethyl acetate, dichloroethane, etc. to the reaction solution, and impurities mixed by extraction are washed with water as necessary. Can also be removed. The target (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid ester can be obtained by concentrating the extract under reduced pressure and then applying a conventional purification method such as distillation or column chromatography.
[0029]
In addition, since the protease in the aqueous layer has an activity of hydrolyzing trans-2,3-epoxybutyric acid ester after the separation, a continuous reaction can be performed as it is.
[0030]
【Example】
Next, the production method of (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid ester of the present invention will be described in more detail based on examples, but the present invention is not limited to only these examples.
[0031]
Examples 1-4
Racemic 25 of n-butyl trans-2,3-epoxybutyrate was added to a phosphate buffer (pH 7.3) prepared from 466.4 g of purified water, 68.2 g of potassium dihydrogen phosphate and 15.4 g of sodium hydroxide. 0.0 g and 2.5 g of the protease shown in Table 1 were added, and the reaction was allowed to stir at 25 ° C. for 8 hours. The reaction time and end point were confirmed by HPLC.
[0032]
After completion of the reaction, the reaction solution was extracted twice with 200 ml of n-hexane. After drying the organic layer with anhydrous sodium sulfate, n-hexane was distilled off under reduced pressure, and the resulting oil was subjected to silica gel column chromatography (developing solution: n-hexane / ethyl acetate = 4/1 (volume ratio)). Purification gave n-butyl (2S, 3R) -2,3-epoxybutyrate.
[0033]
About the obtained (2S, 3R) -2,3-epoxybutyrate n-butyl, HPLC using an optical resolution column (column: manufactured by Daicel Chemical Industries, Ltd., Chiral Cell OD, solvent: n-hexane / 2-propanol = 20/1 (volume ratio)). Further, the yield of n-butyl (2S, 3R) -2,3-epoxybutyrate was divided by the amount of n-butyl trans-2,3-epoxybutyrate to obtain the yield. These yields, yields and optical purity are shown in Table 1.
[0034]
[Table 1]

[0035]
From the results shown in Table 1, n-butyl (2S, 3R) -2,3-epoxybutyrate having high optical purity can be easily and economically produced according to the production method of the present invention as in Examples 1 to 4. It can be seen that can be obtained.
[0036]
Example 5
In a phosphate buffer (pH 7.3) prepared from 1866 g of purified water, 272.7 g of potassium dihydrogen phosphate and 63.3 g of sodium hydroxide, 100.0 g of racemic n-butyl trans-2,3-epoxybutyrate is prepared. Then, 30.0 g of Pro Leather (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd. , registered trademark ) was added, and the mixture was stirred and reacted at 25 ° C. for 14.5 hours, and the reaction time and end point were confirmed by HPLC.
[0037]
After completion of the reaction, the reaction solution was extracted twice with 600 ml of n-hexane. N-Hexane was distilled off from the extract under reduced pressure, and the resulting oil was purified by distillation to obtain n-butyl (2S, 3R) -2,3-epoxybutyrate.
[0038]
About the obtained (2S, 3R) -2,3-epoxybutyrate n-butyl, the optical purity and yield were determined in the same manner as in Examples 1 to 4. These results are shown below together with the yield. The boiling point and specific rotation were measured under the following conditions. The results are also shown below.
[0039]
Yield: 33.3g
Yield: 33.3%
Optical purity: 97.7% ee
Boiling point (6 Torr): 77 ° C
Specific rotation (C = 2, in chloroform, 25 ° C.): + 17.3 °
[0040]
Further, ¹ H-NMR spectrum and IR spectrum data of the obtained n-butyl (2S, 3R) -2,3-epoxybutyrate are shown below.
[0041]
¹ H-NMR (200 MHz, in CDCl ₃ , δ value (ppm), measured with GX-500 manufactured by JEOL Ltd.): 0.93 (t, 3H), 1.39 (m, 2H), 1 .62 (m, 2H), 3.17 (d, 1H), 3.21 (qd, 2H), 4.16 (td, 2H) IR (neat, cm ^-1 , FTIR- manufactured by Shimadzu Corporation) Measured at 4200): 1744
[0042]
Example 6
To a phosphate buffer (pH 7.3) prepared from 1866 g of purified water, 272.7 g of potassium dihydrogen phosphate, and 63.3 g of sodium hydroxide, 100.0 g of racemic methyl trans-2,3-epoxybutyrate and pro 30.0 g of leather (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd. , registered trademark ) was added, and the reaction was allowed to stir at 25 ° C. for 12 hours, and the reaction time and end point were confirmed by HPLC.
[0043]
After completion of the reaction, the reaction solution was extracted twice with 600 ml of n-hexane. N-Hexane was distilled off from the extract under reduced pressure, and the resulting oil was purified by distillation to obtain methyl (2S, 3R) -2,3-epoxybutyrate.
[0044]
The obtained methyl (2S, 3R) -2,3-epoxybutyrate was subjected to optical purity and yield in the same manner as in Examples 1 to 4. These results are shown below together with the yield. The boiling point and specific rotation were measured under the following conditions. The results are also shown below.
[0045]
Yield: 29.1g
Yield: 29.1%
Optical purity: 95.4% ee
Boiling point (26 Torr): 72 ° C
Specific rotation (C = 2, in chloroform, 24 ° C.): + 21.9 °
[0046]
Further, ¹ H-NMR spectrum and IR spectrum data of the obtained methyl (2S, 3R) -2,3-epoxybutyrate are shown below.
[0047]
¹ H-NMR (200 MHz, in CDCl ₃ , δ value (ppm), measured with GX-500 manufactured by JEOL Ltd.): 1.41 (d, 3H), 3.21 (d, 1H), 3 .24 (qd, 1H), 3.78 (s, 3H)
IR (neat, cm ⁻¹ , measured with FTIR-4200 manufactured by Shimadzu Corporation): 1750
[0048]
From the results of Examples 5 and 6 as described above, according to the production method of the present invention, high optical purity (2S, 3R) -2,3-epoxybutyrate n-butyl and (2S, 3R) -2,3 It can be seen that methyl epoxybutyrate can be obtained easily and economically.
[0049]
【The invention's effect】
According to the production method of the present invention, (2S, 3R) -2,3-epoxybutyric acid ester which is extremely useful as an intermediate for various organic chemical products including physiologically active substances is produced simply and economically. be able to.

Claims (2)

As a protease, Pro Leather (trade name , registered trademark ), Protease A “Amano” (trade name) or Protease P “Amano” 6 (trade name) is used.

(Wherein R ¹ represents a methyl group or an n-butyl group) An enantiomeric mixture of trans-2,3-epoxybutyric acid ester represented by the following formula is optically resolved by hydrolysis (2S, 3R) A method for producing -2,3-epoxybutyric acid ester.   The enantiomer mixture of trans-2,3-epoxybutyric acid ester and the protease are stirred in water or a buffer solution to hydrolyze the enantiomeric mixture of trans-2,3-epoxybutyric acid ester (2S, 2). 3R) -2,3-Epoxybutyric acid ester production method.