JP4828131B2 - グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ−3阻害剤 - Google Patents
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Description
また、Ca2+の細胞内への流入の調節機能の一つに、電位依存型L型Ca2+チャネルがある。このチャンネルに結合してCa2+の細胞内への流入を抑制する物質は、心筋や血管などの平滑筋細胞でCa2+と拮抗し、虚血性心疾患、高血圧、末梢血管障害、脳血管障害、心不整脈などに対する予防薬や治療薬として有用である。
さらに、Ca2+シグナル伝達系は、MAP(Mitogen Avtivated Protein kinase)キナーゼであるMpk1を活性化することから、Ca2+シグナル伝達を抑制する物質は、その活性化調節が異常となった各種の癌に対する予防薬や治療薬として有用である。また、Ca2+シグナル伝達系は、グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ-3(Gsk-3:Glycogen Synthase Kinase-3)と関連していることから、Ca2+シグナル伝達を抑制する物質は、糖尿病、痴呆症などに対する予防薬や治療薬として有用である。
このように、生命の根幹を成すシグナル伝達系の一つであるCa2+シグナル伝達系を抑制する物質は、Ca2+シグナル伝達の亢進により引き起こされる様々な疾病(過剰免疫反応、アレルギー、癌、痴呆症、II型糖尿病、高血圧、狭心症など)を、そのシグナルを阻害することで、予防や改善や治療できることから注目されている。Ca2+シグナル伝達阻害剤の、免疫抑制剤や抗アレルギー剤への適用例としては、サイクロスポリンA、FK-506がある。また、Ca2+シグナル伝達阻害剤の、高血圧や狭心症に対する予防薬や治療薬への適用例としては、ニフェジピン、バラパミル、ジルチアゼムがある。しかしながら、これらは活性も強いが毒性も強いため、副作用が少ないまたは皆無のCa2+シグナル伝達阻害剤の探索はたいへん意義深い活動である。
そこで本発明は、新規なCa2+シグナル伝達阻害剤を提供することを目的とする。
基本となる系の有用性は、微生物培養液や合成化合物ライブラリーを用いて既に実証済みであり、既知化合物であるラディシコールのCa2+シグナル伝達阻害作用がこの系により発見されている(生物工学, 77, 406-408, 1999)。この系は、高濃度のCa2+を含む培地では、Ca2+シグナルが超活性化され酵母は生育しないが、培地中にその経路を阻害する物質が含まれている場合には、酵母を生育させる(酵母の生育円が生じる)というポジティブスクリーニングである(図1参照)。そのため、毒性が無く、特異性の高い化合物の発見が可能である(Biosci. Biotechnol. Biochem., 64(9), 1942-1946, 2000)。実際に、この系を用いて、医薬品として実用化されている免疫抑制剤のFK506やサイクロスポリン、Ca2+拮抗剤のニフェジピンなどのCa2+シグナル伝達阻害作用が確認されている。さらに、図2に示した通り、この系によれば、Ca2+拮抗剤やカルシニューリン阻害剤以外にも、論理的にはMpk1阻害剤、Gsk-3阻害剤も選択が可能であり、実際に、Gsk-3β阻害剤は、酵母の生育円を生じさせることから、本発明者らは、後述の通り、この系を用いて、一般式(1)で表されるポリアセチレン化合物がGsk-3阻害作用を有することを確認している。
この実施例において用いた改良系は、遺伝子Δzds1Δsyr1Δpdr1Δpdr3破壊酵母を用いたものである。この遺伝子4重破壊酵母は、遺伝子1重破壊酵母の薬剤の膜透過性を高めるために、さらに膜成分と薬剤排出ポンプの遺伝子を自体公知の方法で破壊したものであり、薬剤感受性に優れることから、遺伝子1重破壊酵母を用いた基本系よりも精度よくCa2+シグナル伝達阻害作用の評価を行うことができる。
遺伝子4重破壊酵母をYPD培地(イーストエキストラクト10g/l、ペプトン20g/l、デキストロース20g/l、pH6.5)で28℃、一晩前培養し、培養液の1/10希釈液A590=0.2の液を3ml、5MのCaCl2を3ml、YPD寒天培地44mlをよく懸濁し、シャーレに12.5mlずつ分注した。測定用の各種濃度のサンプルをペーパーディスク(8mm、thick)に40μlしみ込ませてシャーレの上に載せ、28℃で3日間培養した後、生育円の大きさを測定し、Ca2+シグナル伝達阻害活性を評価した。ポジティブコントロールは、免疫抑制剤サイクロスポリンA(平均生育円20.9 mm、10μg/disc)またはFK506(平均生育円21.9 mm、0.02μg/disc)とした。この評価系で、セリ、ミツバ、アシタバ、ニンジン、ウド、セロリ、パセリのそれぞれについて、メタノール抽出物400μg/discでのCa2+シグナル伝達阻害活性を酵母の生育円の大きさで評価した結果を表1に示す。
(1)ミツバからのファルカリンディオールの単離精製
乾燥させたミツバ36.55gをメタノールで抽出し、その抽出物1.78gを得た。それをメタノール50mlに溶解した後、水450mlを加えてから等量の酢酸エチルで抽出し、抽出物0.15gを得た。これをメタノールに100mg/mlに溶解し、クロロホルム:メタノール=20:1の溶媒を用いシリカゲルTLCで展開し、Rf=0.21〜0.30の活性バンドを得た。活性バンドをかきとり、メタノールで活性物質を溶出したところ12.9mgを得た。これをメタノールに溶解し、遠心した後、上清をHPLCにかけて、80%メタノール、3ml/min、PEGASIL ODS (10φx250mm)の条件で活性物質4.6mgを得た。この活性物質の各種機器分析を行うことで、この活性物質はファルカリンディオールと同定した。
乾燥させたウドの葉30.51gをメタノールで抽出し、その抽出物6.03gを得た。それをメタノール50mlに溶解した後、水450mlを加えてから等量の酢酸エチルで抽出し、抽出物1.26gを得た。これをメタノールに100mg/mlに溶解し、シリカゲルカラムにてクロロホルム:メタノール=100:0 ⇒ 99:1 ⇒ 98:2 ⇒ 97:3 ⇒ 95:5 ⇒ 90:10 ⇒ 85:15の溶媒で展開し、活性部分0.58gを得た。これをメタノールに溶解し、LH-20カラム(3x30cm)によりメタノールで展開し、活性部分0.43gを得た。これをメタノールに溶解してHPLCにかけ、75%メタノール、3ml/min、PEGASIL ODS(10φx250mm)の条件で2種類の活性物質、物質A(12.2mg)と物質B(23.1mg)をオイル状で得た。物質Aと物質Bの各種機器分析を行うことで、物質Aはデヒドロファルカリンディオール、物質Bはファルカリンディオールと同定した。(M-H2O)+の高分解能のEI-MSの結果から、物質A:C17H20O(実測値:240.1515、理論値:240.1514)、物質B:C17H22O(実測値:242.1662、理論値:242.1670)が得られた。
単離精製されたファルカリンディオールとデヒドロファルカリンディオールのそれぞれを、種々の濃度でペーパーディスクにしみ込ませ、そのCa2+シグナル伝達阻害活性を酵母の生育円の大きさで評価した。結果を表2に示す。
単離精製されたファルカリンディオールとデヒドロファルカリンディオールのそれぞれの10μMにおけるGsk-3βに対する阻害活性を、Leclerc S., et al., J. Biol. Chem., 276(1), 251(2001)記載の方法にて調べた。結果を表3に示す。
ファルカリンディオールまたはデヒドロファルカリンディオールのナトリウム塩1.5gを生理食塩水100mlに溶解し(合計1.5g/100ml)、バイアルに充填した後、加熱殺菌を行って、静注用注射剤を製造した。
以下の組成で各成分を混合し、打錠して、ファルカリンディオールまたはデヒドロファルカリンディオールを50mg含む500mgの錠剤400個を製造した。
ファルカリンディオールまたはデヒドロファルカリンディオール
・・・ 20g
馬鈴薯澱粉 ・・・ 6g
ステアリン酸タルク ・・・ 4g
6%HPC乳糖 ・・・ 170g
(合計200g)
以下の組成で各成分を混合し、圧縮成形し、粉砕し、整粒して、20〜50メッシュの5%顆粒剤を製造した。
ファルカリンディオールまたはデヒドロファルカリンディオール
・・・ 10g
乳糖 ・・・ 187g
ステアリン酸マグネシウム ・・・ 3g
(合計200g)
以下の組成で各成分をよく混合し、混合物を1号カプセルに充填して、カプセル剤300個を製造した。
ファルカリンディオールまたはデヒドロファルカリンディオール
・・・ 5g
乳糖 ・・・ 40g
馬鈴薯澱粉 ・・・ 50g
ヒドロキシプロピルメチルセルロース ・・・ 3.5g
ステアリン酸マグネシウム ・・・ 1.5g
(合計100g)
以下の各成分を滅菌精製水100mlに溶解し、常法により点眼剤を製造した。
ファルカリンディオールまたはデヒドロファルカリンディオール
・・・ 0.1g
塩化ナトリウム ・・・ 0.9g
塩化ベンザルコニウム ・・・ 微量
1N水酸化ナトリウム ・・・ 適量
1N塩酸 ・・・ 適量
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JP2005044775A JP4828131B2 (ja) | 2005-02-21 | 2005-02-21 | グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ−3阻害剤 |
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2005
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