JP4807758B2 - サンプルによって光信号に誘起される位相ずれを測定する方法および装置 - Google Patents

Description

本発明は、サンプルによって光信号に誘起される位相ずれを測定する方法および装置に関する。

従来の蛍光顕微鏡検査では、蛍光体の発光の輝度分布が記録される。測定可能な別のパラメータとして「蛍光寿命」がある。光パルスによってフルオロフォアが励起されると、発光は（通常はナノ秒のオーダーで）減衰を示す。この、蛍光寿命と呼ばれる減衰時間は、フルオロフォアおよびフルオロフォアの状態の特性である。

蛍光寿命の検知は、蛍光共振エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイにおいてエネルギー転移効率を測定する強力な方法である。ＦＲＥＴは、２つの色素種の励起状態の間の、距離依存の相互作用であり、それにおいては、光子が発光することなく、励起エネルギーがドナーからアクセプタに転移する。ＦＲＥＴの効率は、分子間離隔距離の六乗に逆依存する。したがって、ＦＲＥＴの検出を行うことにより、ドナーとラベル付けされている種と、アクセプタとラベル付けされている種との間の距離を求めることが可能である。これを用いて、たとえば、２つの種が互いに結合しているかどうかを判定することが可能である。

ＦＲＥＴに基づく競合アッセイでは、ＦＲＥＴ活性分子が、やはりＦＲＥＴ活性である競合エージェントと結合した結果として、ＦＲＥＴが起こる可能性がある。競合エージェントは、ＦＲＥＴ活性分子と結合してもＦＲＥＴを発生させないＦＲＥＴ不活性材料（検体）と競合する。競合エージェントおよび検体のそれぞれが、有限の時間長の間、ＦＲＥＴ活性材料と可逆的に結合する。このことは、競合エージェントおよび検体の両方が、ＦＲＥＴ活性材料と結合して平衡状態に到達する可能性があることを意味する。そのようなアッセイに存在する競合エージェントの量があらかじめ決まっていれば、発生するＦＲＥＴの量から、存在する検体の濃度を計算することが可能である。検体が存在しない場合は、起こり得るＦＲＥＴが１００％発生する。

励起光を十分高い周波数で変調すると、蛍光の強度によるばかりでなく、励起光と蛍光発光との間の位相ずれからも、ＦＲＥＴ信号を検出することが可能である。

しかしながら、蛍光によって発生した位相ずれを正確に読み取ることは困難である。これは、測定用電子回路が温度変化およびエージングの影響を受けやすいことなど、センサの電子回路に影響する要因の結果として、光信号の位相の測定値がドリフトする可能性があるためである。

蛍光によって発生する位相ずれを、位相蛍光光度計を用いて正確に測定する試みが行われている。市販の位相蛍光光度計は、図１に示すように、２つの同一の信号分岐（サンプル信号分岐２０１および基準信号分岐２０３）を有するものがある。光源２０５から発生した励起光２０９が、蛍光性サンプル２０７に放射される。この励起光のごく一部２１１が、サンプル２０７の前で分割されて、基準分岐２０３内の検出器２１３を照らす。基準信号分岐２０３で検出された光の位相が、サンプル２０７から発せられた蛍光光の位相と比較され、基準分岐とサンプル分岐との間の位相差が与えられる。これにより、サンプル信号分岐内の蛍光光の結果として誘起された位相ずれの初期測定値が与えられる。この位相測定値は、光源または光源駆動回路における位相ドリフトを補償するが、電子回路によって発生する可能性のある位相ドリフトの説明となるものではない。

蛍光性サンプル２０７は、照らされる直前および直後に、励起光を放射されても蛍光発光しない基準測定物体２１５と置換される。それまでと同様に、励起光２０９は、光源から発生して、基準測定物体に放射される。この励起光のごく一部が、基準測定物体の前で分割されて、基準分岐の検出器を照らす。基準信号分岐で検出された光の位相が、サンプル分岐で検出された光の位相と比較され、サンプル測定物体が蛍光発光したときに測定される最終信号に対する較正が行われる。この場合、サンプル分岐と基準分岐とで検出される信号の間に位相差があるとすれば、それは、電子回路の違い、またはそれぞれの経路の長さの違いに起因するものであろう。

蛍光性サンプル測定物体によって誘起される位相遅れは、最終的には、蛍光発光するときの２つの分岐の間の位相差と、蛍光発光しないときの２つの分岐の間の位相差とを比較することによって計算される。

これによって、電気部品によって発生する位相ドリフトが除去され、光がたどる光路によって発生しうるあらゆる位相差の説明がつく。

前述のシステムは、測定物体をサンプル測定物体から基準測定物体に変更する、電動式または手動式の機構を必要とする。このとき、基準測定物体が非蛍光性であるために、基準測定物体からの反射光を受け取るフィルタを変更することが必要になる。さらに、様々な光強度に適合させるために光路内のフィルタを変更することも必要になる可能性がある。それもまた、電動式の機械的システムを用いて行われることが必要であろう。この種のシステムは、結局のところ高価であり、場所を取り、製造が複雑であり、部品が移動する結果として損傷を被りやすいので、望ましくない。さらに、前述のようなシステムを医療用途（たとえば、継続的な血糖値測定）に用いることを可能にするために、システムを小型化することが望ましいであろう。位相蛍光光度計を人間が装着するような用途では、過剰な振動および騒音を引き起こすモータを使用することは望ましくないであろう。

本発明の目的は、手動介入または機械的介入を必要とせずに実施される、電子的ドリフトの補正を含む位相差測定のシステムおよび方法を提供することである。

本発明の第１の態様によれば、サンプルによって光信号に誘起される位相ずれを測定する装置が提供され、この装置は以下のものを備える。

サンプルの位置を含む測定光路に沿って光信号を発する第１の光源。

ダミー測定光路に沿って光信号を発する第２の光源。第１および第２の光源は、交互に動作するように構成される。

測定光路およびダミー測定光路から光信号を受け取る測定電子回路。この測定電子回路は、測定光路およびダミー測定光路のそれぞれから受け取る光信号の位相をそれぞれ表す出力を、別々のタイミングで与えるように構成される。運用時には、前記サンプル位置にあるサンプルによって、測定光路内の光に位相ずれが誘起され、それによって、測定光路から受け取った第１の光源の光の位相が、第１の光源から発せられた光の位相と異なる。

第１および第２の光源から発せられた光信号の位相を表す信号を受け取る基準電子回路。

第１の光源に応答する測定電子回路の出力によって示される光の位相と、基準電子回路によって示される光の位相とを比較して、第１の測定された位相差を示す出力を与えることと、第２の光源に応答する測定電子回路の出力によって示される光の位相と、基準電子回路によって示される光の位相とを比較して、第２の測定された位相差を示す出力を与えることとを行う回路、および、サンプルによって第１の光源の光に誘起された位相ずれの改善された測定値を取得するために、第２の測定された位相差に基づく補正を第１の測定された位相差に適用して、前記測定電子回路および基準電子回路によって誘起された位相変化に起因する、前記第１の測定された位相差の誤差を修正する回路。

好ましくは、測定光路はビームスプリッタを含み、このビームスプリッタは、前記第１の光源から光を受け取り、前記光を前記サンプル位置に向かって反射し、前記サンプル位置から発せられた、運用時の蛍光発光を受け取り、前記蛍光発光を前記測定電子回路に伝達する。

より好ましくは、測定光路は、前記サンプル位置において蛍光性サンプルを励起するのに好適な光の波長を選択するように構成された励起フィルタと、前記サンプル位置からの蛍光発光の波長を選択するのに好適な発光フィルタとを備える。

発振器が第１および第２の光源のそれぞれと結合され、発振強度の光信号を発生させる。発振強度の光信号を発生させるために第１および第２の光源のそれぞれに供給される駆動電流が、直接デジタル合成によって生成される。

一実施形態では、ダミー測定光路はビームスプリッタを含み、ビームスプリッタは、第２の光源から光を受け取り、前記光を前記サンプル位置に向かって反射し、前記サンプル位置からの前記反射光を受け取り、その光を前記測定電子回路に伝達するように構成される。

好ましくは、ダミー測定光路に含まれる前記発光フィルタはさらに、サンプル位置からの蛍光発光の波長と同等の光の波長を選択する。

代替実施形態では、第２の光源からの光は、ビームスプリッタによって受け取られず、測定電子回路に直接誘導される。

したがって、ダミー測定光路はさらに、第２の光源から発せられる光の強度を低減する電気光学アッテネータを備える。

好ましい実施形態では、ダミー測定光路内の光は、蛍光性サンプルを励起するのに好適な光の波長を含まない。

一実施形態では、前記第１および第２の光源から発せられた光の波長が同じであり、ダミー測定光路はさらに、蛍光性サンプルを励起するのに好適な波長の光を除去するフィルタを備える。

代替実施形態では、第１の光源および第２の光源が異なる波長の光を発し、第２の光源から発せられた光が、蛍光性サンプルを励起するのに好適な波長を含まない。

好ましくは、測定電子回路は、前記測定光路およびダミー測定光路から光信号を受け取る光電気変換器を備え、この光電気変換器は、この光電気変換器を照らす光の強度に対応する電気信号を出力する。

より好ましくは、サンプル回路の光電気変換器がアバランシェフォトダイオードであって、このアバランシェフォトダイオードが、バイアス電圧を供給されて、このアバランシェフォトダイオードを照らす光の強度に対応する電気信号を増強する。

第１および第２の光源からの光を、それぞれ基準光路およびダミー基準光路に沿って基準回路の光電気変換器まで誘導する手段が提供される。

基準回路の光電気変換器は、フォトダイオードであることが好ましい。

好ましい実施形態では、システムはさらに、測定回路および基準回路のそれぞれで処理された信号を変調して、処理された信号の位相を表す出力を発生させる電子回路を備える。

好ましくは、測定回路および基準回路のそれぞれにおける信号を変調する電子回路は、測定電子回路および基準電子回路のそれぞれにおいてミキサを備え、各ミキサは追加の発振器と結合される。

一実施形態では、０．１〜１０^３メガヘルツの変調された周波数を有する信号が、追加の発振器から出力され、測定回路および基準回路のそれぞれにおける信号と、それぞれのミキサによって混合され、前記各光源から出力される光の変調された周波数が、前記変調された周波数と、量にして１０^２〜１０^５ヘルツ（ヘテロダイン検波）だけ異なる。

測定電子回路および基準電子回路のそれぞれはさらにバンドパスフィルタを備え、測定電子回路および基準電子回路の各ミキサからの出力の高周波成分が、このバンドパスフィルタによって除去される。

代替実施形態では、各光源から出力される光の変調された周波数と同じ変調された周波数を有する信号が、追加の発振器から出力され、前記測定回路および基準回路のそれぞれにおける信号と、それぞれのミキサ（ホモダイン検波）によって混合される。

さらなる実施形態では、各光源から出力される光の変調された周波数が１０〜１０^５ヘルツである。

好ましくは、測定電子回路および基準電子回路のそれぞれの光電気変換器は、電圧出力を発生させる増幅器に電気信号を出力するように構成され、それぞれのミキサが、前記電圧出力と、追加の発振器からの変調された周波数の信号とを受け取って、前記入力間の周波数差を表すビート周波数出力を発生させるように構成され、前記出力が、光電気変換器で受け取られた光の位相を表す。

測定回路および基準回路のそれぞれのミキサに所定の周波数を与える追加の発振器は、電圧制御水晶発振器である。

測定回路および基準回路のそれぞれのミキサに対する所定の周波数は、直接デジタル合成によって発生させることが好ましい。

好ましい実施形態では、測定電子回路および基準電子回路のそれぞれのバンドパスフィルタは、それぞれ、各ミキサからのビート周波数出力を受け取って、それぞれの信号のノイズを低減するように構成される。

好ましくは、測定電子回路および基準電子回路のそれぞれはさらに、バンドパスフィルタからのフィルタリングされた信号を増幅する増幅器と、増幅された信号をデジタイズするアナログデジタル変換器とを備える。

好ましい実施形態では、測定回路および基準回路のそれぞれからのデジタイズ出力を受け取る信号処理および制御装置が提供され、この信号処理および制御装置がさらに、第１および第２の光源のそれぞれの動作中に受け取られたデジタイズ信号を比較する回路と、サンプルによって誘起された位相変化を計算する回路とを備える。計算結果はディスプレイに出力される。

好ましくは、信号処理および制御装置は、第１および第２の光源の交互動作、追加の発振器の周波数、およびアバランシェフォトダイオードに供給されたバイアス電圧を制御するように構成される。

一実施形態では、異なる２つの周波数の光が第１および第２の光源のそれぞれから交互に発生して連続的に出力され、さらなる計算が可能になる。

本発明はまた、サンプルによって光信号に誘起される位相ずれを測定する方法に拡張され、以下のステップを含む。

サンプルの位置を含む測定光路に沿って第１の光信号を発するステップ。

ダミー測定光路に沿って第２の光信号を発するステップ（第１および第２の光信号は交互に発せられる）。

測定電子回路において測定光路およびダミー測定光路から光信号を受け取るステップ。

測定光路およびダミー測定光路のそれぞれから受け取る光信号の位相をそれぞれ表す出力を、測定電子回路から、別々のタイミングで与えるステップ。

基準電子回路において、第１および第２の光信号の位相を表す信号を受け取るステップ。

第１の光信号に対する応答として測定電子回路の出力によって示される光の位相と、基準電子回路によって示される光の位相とを比較するステップ。

第１の測定された位相差を表す出力を与えるステップ。

第２の光信号に対する応答として測定電子回路の出力によって示される光の位相と、基準電子回路によって示される光の位相とを比較するステップ。

第２の測定された位相差を表す出力を与えるステップ。

サンプルによって第１の光源の光に誘起された位相ずれの改善された測定値を取得するために、第２の測定された位相差に基づく補正を第１の測定された位相差に適用して、前記測定電子回路および基準電子回路によって誘起された位相変化に起因する、前記第１の測定された位相差の誤差を修正するステップ。

以下、本発明の実施形態を、添付図面を参照しながら説明する。

図２は、本発明の実施形態の各種構成要素を示している。このシステムは、ＬＥＤドライバ３と結合された水晶発振器１、一度に１つずつが活性化されることが可能な２つのＬＥＤ５、７、および励起フィルタ３７を含む。ＬＥＤ５、７のそれぞれからの光は、測定回路１５と基準回路５１とに同時に向けられる。ＬＥＤ５、７の両方からの光が、ビームスプリッタ３５によって方向づけられる。

測定回路１５は、発光フィルタ４３、アバランシェフォトダイオード１３、受け取った電流信号を電圧信号に変換するインピーダンス変換増幅回路１７、ミキサ１９、増幅器２３、バンドパスフィルタ２５、アナログデジタル変換器２７、およびアバランシェフォトダイオードバイアス電源２８を備える。

同様に、基準回路５１は、フォトダイオード５３、インピーダンス変換増幅回路５５、ミキサ５７、増幅器５９、バンドパスフィルタ６１、およびアナログデジタル変換器６３を備える。基準回路および測定回路の両方にさらに、両回路からの情報を処理する信号処理および制御装置２９、追加の水晶発振器３１、結果を表示するディスプレイ装置６７、および少なくとも２つのボタンを有するインターフェース６９が設けられる。

本発明の説明は、発光ダイオードを使用する場合について行われているが、他の光源（たとえば、レーザダイオード）を使用することも可能であることを理解されたい。

動作時には、ＬＥＤドライバ３は、水晶発振器１と結合され、第１および第２のＬＥＤ５、７のそれぞれから光信号を別々に発生させるように構成される。この実施形態では、水晶発振器１によって正弦波光信号が発生する。しかしながら、光信号の位相が確定可能であれば、当該技術分野で周知の他の方法（たとえば、方形パルスを有する光信号を発生させる方法）も好適であり得るのは明らかである。

たとえば、一実施形態では、第１および第２の光ＬＥＤのそれぞれから発せられる光信号が、滑らかな励起パルスを有する。図８に示すように、正のパルスが正弦波の波形のそれより狭いので、パルスの全体的な形状はほぼガウス形である。

論文「Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ ｒａｔｉｏ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（ＣＡＲＬＳＳＯＮ Ｋ．ＰＨＩＬＬＩＰ Ｊ、Ｐｒｏｃ ＳＰＩＥ ４６１１、７０〜７８頁、２００２年）に記載されているように、Ｄｉｒａｃパルス励起は、フルオロフォアに用いるのに最も有利な励起方法である。Ｄｉｒａｃパルスは無限に狭く、Ｄｉｒａｃ励起信号は、公称性能指数（Ｆ）１を与える。そのようなパルス励起は、しかしながら、実際に発生させるのが困難である。

信号対ノイズ比（ＳＮＲ）は、Ｆの二乗に反比例する。したがって、最適なＳＮＲは、Ｆ＝１のときに達成される。正弦波変調は性能指数４を与えるので、正弦波変調は、ＳＮＲに関しては、Ｄｉｒａｃ変調より１６倍不利である。しかしながら、正弦波変調は、帯域幅および消費電力についての要求がより低いので、より発生させやすい。

Ｃａｒｌｓｓｏｎによって示されているように、滑らかな励起パルスは性能指数１．５５を与え、これは、Ｄｉｒａｃパルス励起の２．４倍のＳＮＲ低減に相当する。したがって、これは、標準的な正弦波信号より有利である。

直接デジタル合成を用いて、正弦波波形ならびに滑らかなパルス励起を発生させることが可能である。図１１に示すように、直接デジタル合成装置７１は、アドレスカウンタ７３、各種波形を格納するプログラマブル読み出し専用メモリ（ＰＲＯＭ）７５、レジスタ７７、およびデジタルアナログ変換器７９からなる。

正弦波の一周期に対応するデジタル振幅情報がＰＲＯＭ７５に格納され、ＰＲＯＭ７５は正弦波ルックアップテーブルとして動作する。アドレスカウンタがカウントを進めながらＰＲＯＭの各メモリロケーションにアクセスすると、そのコンテンツ（対応する正弦波振幅ワード）が高速デジタルアナログ変換器７９に渡される。デジタルアナログ変換器は、ＰＲＯＭからのデジタル入力ワードに応答してアナログ正弦波を発生させる。合成装置が１つの波を完成させる速度によって周波数が決まる。信号処理および制御装置２９によってクロック８１が与えられる。

第１のＬＥＤ５（以下、「測定ＬＥＤ」と称する）および第２のＬＥＤ７（以下、「基準ＬＥＤ」と称する）のオンオフが交互に切り替わって、どの時点でも測定ＬＥＤ５または基準ＬＥＤ７のうちの一方だけが活性状態であるように、信号処理および制御装置２９がＬＥＤドライバ３を制御する。したがって、測定ＬＥＤ５および基準ＬＥＤ７から交互に光信号が発せられる。

図２に示した実施形態では、測定ＬＥＤ５からの光が、異なる２つの光路（第１の光路１１、および第１の基準光路４８）に沿って方向づけられる。同様に、基準ＬＥＤ７からの光が、異なる２つの光路（第２の光路９、および第２の基準光路４９）に沿って方向づけられる。第１の光路１１および第２の光路９は、ほぼ同じ経路をたどって、サンプル回路１５のアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）１３に至る。

同様に、第１の基準光路４８および第２の基準光路４９は、ほぼ同じ経路をたどって、基準回路５１のフォトダイオード５３に至る。

第１の光路の光は、励起フィルタ３７を通り、ビームスプリッタ３５によって蛍光性サンプル３３に方向づけられる。第１の光路の光（励起光）３９を励起フィルタ３７に通すのは、スペクトル特性を安定させるためである。励起光３９は、サンプルが、測定ＬＥＤ５から発せられた光３９と位相、スペクトル、および強度が異なる蛍光光４１を発するように、サンプルの励起を引き起こす。

その蛍光光４１は、発光フィルタ４３を通ってから、サンプル回路１５のＡＰＤ１３を照らす。その信号がサンプル回路１５によって処理され、それによって、ＡＰＤ１３によって検出された蛍光光４１の位相が求められることが可能である。

同時に、測定ＬＥＤ５からの光３９は、基準光路４８に沿って基準回路５１のフォトダイオード５３に誘導され、それによって、基準光の位相を求めることが可能である。基準回路５１で受け取られた光の位相は、測定ＬＥＤ５から発せられた光の位相と同じでなければならない。

サンプル回路１５および基準回路５１のそれぞれにおいて求められた光の位相が比較されて、第１の光路１１に誘起された位相ずれが求められる。第１の光路１１に沿っての位相ずれの主たる部分は、蛍光性サンプル３３によってもたらされると考えられる。しかしながら、この測定を絶対的なものと見なすことはできない。それは、各回路における電子部品が、電子部品のエージングおよび温度の変化の結果として、程度が変動する位相ドリフトを引き起こす可能性があるからである。

蛍光性サンプル３３によって引き起こされる絶対的な位相ずれを求めるには、システムの電子部品によって引き起こされるそのようなドリフトを補正することが必要である。これを可能にするために、測定ＬＥＤ５を活性化する直前および直後に、基準ＬＥＤ７を活性化する。基準ＬＥＤ７から発せられた光の一部は、基準光路４９に沿って、基準回路５１に方向づけられる。基準ＬＥＤ７から発せられた光の残りは、第２の光路９に沿って、測定回路１５に方向づけられる。

この実施形態では、第２の光路の光は、補正を可能にするために、蛍光性サンプルの励起を引き起こさない。これを達成する方法は２つある。図２に示すように、基準ＬＥＤ７から発せられた光４５は、ビームスプリッタ３５によって、蛍光性サンプル３３に向けられる。

一実施形態では、基準ＬＥＤ７から発せられた光は、測定ＬＥＤ５から発せられた光と波長が異なる。具体的には、基準ＬＥＤ７からの光は、サンプル位置から散乱または反射されるように、スペクトル的に発光フィルタ４３の通過域に位置する。代替実施形態では、測定ＬＥＤ５および基準ＬＥＤ７から発せられた光の波長は同じである。この実施形態（図示せず）では、サンプルの励起に必要な波長を除外するために、サンプル位置を照らす前にさらに別のフィルタが設けられる。

前述のように、測定分岐内の信号は、基準分岐内で検出された信号と比較される。理想的な条件では、検出された２つの信号の間の位相差は、サンプルによって誘起された位相変化を表す。しかしながら、実際の動作では、電子回路によって引き起こされる位相ドリフトの程度が、測定分岐と基準分岐との間で変動する。測定ＬＥＤ５の動作時の信号測定と、基準ＬＥＤ７の動作時の信号測定との間で時間がほとんど経過しないので、測定分岐と基準分岐の両方における回路の条件は、読み取りと読み取りの間で有意な変化を呈しないと見なされる。

したがって、基準ＬＥＤ７の動作時にサンプルと測定分岐との間で位相差が検出された場合、その位相差は、電子部品と、それぞれの光路の長さの違いとによって引き起こされたと見なされる。

測定ＬＥＤ５からＡＰＤ１３までの光路長と、基準ＬＥＤ７からＡＰＤ１３までの光路長とにわずかなばらつきがあることを理解されたい。しかしながら、これは一定である。すなわち、それぞれの光路長の差は、常に同じままであり、したがって位相オフセットは一定であり、容易に補正可能である。サンプル回路のアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）１３は、高電圧によって逆バイアスされている。これにより、初期光電流の増幅度は、一般に５０〜５００になる。ＡＰＤ１３に供給される光信号は、非常に微弱であり、通常のフォトダイオードであれば、発生する信号は、増幅器で発生するノイズと同等かそれより小さくなる。ＡＰＤを用いると、信号の信号対ノイズ比が上がり、測定の精度が上がる。しかしながら、照射される光の強度に対応する電気信号を出力することが可能な電気的デバイスであれば何でも好適であることは、当業者であれば明らかであろう。たとえば、代替実施形態では、ＡＰＤを光電子増倍管（ＰＭＴ）に置き換えることが可能である。

代替として、第２の蛍光性サンプルがサンプル位置に与えられる。この実施形態は、図３に示すように、第２の蛍光性サンプルが、ダミー測定光路を通る光によってのみ励起可能であるように構成される。これは、励起に適した波長の光が基準ＬＥＤから発せられることによって達成可能である。さらに、第２の蛍光性サンプルの励起に適した波長の光だけが通過可能なフィルタをダミー測定光路に設けることが可能である。

２つの反射帯域と２つの伝送帯域とを有するダイクロイックビームスプリッタ３４を用いて、光が光源からサンプル位置に反射されることを選択的に可能にし、適切な蛍光光だけがサンプル位置から測定回路に送られることを可能にする。同様に、発光フィルタ４３は、２つの伝送帯域を有し、これによって、両方の蛍光性サンプルから発せられた蛍光光を通過させる。

適切と考えられる波長の例を、図４Ａおよび４Ｂに示す。この例では、第１のＬＥＤから発せられる光の波長は５９２ｎｍである。図に見られるように、蛍光性サンプルは、この波長の周囲に吸収スペクトルを有し、第１の蛍光性サンプルからの対応する発光スペクトルは、それよりやや長い波長の周囲に配置される。同様に、第２のＬＥＤから発せられる光の波長は、約７００ｎｍである。第２の蛍光性サンプルは、このサンプル波長の周囲に吸収スペクトルを有し、対応する発光スペクトルは、それよりやや長い波長の周囲に配置される。

図４Ｂは、対応するフィルタの伝送特性を示している。ダイクロイックビームスプリッタによって反射される光の、２つの帯域の波長は、それぞれのＬＥＤから発せられる光の波長（すなわち、約５９２ｎｍおよび７４０ｎｍ）に合致していると見ることができる。図４Ｂに示すように、これらの周波数は、ダイクロイックビームスプリッタの伝送帯域の外側になり、したがって、これらの波長に相当する光は反射される。同様に、ダイクロイックビームスプリッタの２つの伝送帯域は、両方の蛍光性サンプルから発せられる蛍光光の波長に合致する。最後に、発光フィルタの伝送帯域も、両サンプルから発せられる蛍光光の波長に対応する。

前述の実施形態では、ＡＰＤバイアス電源２８によって逆バイアス高電圧が与えられるが、ＡＰＤバイアス電源２８は信号処理および制御装置２９によって制御される。信号処理および制御装置２９はさらに、追加の水晶発振器３１を操作する。追加の発振器からの波形出力も、直接デジタル合成によって生成される。同じクロックが両方の直接デジタル合成装置を駆動することが好ましい。このクロックは、２つの発振器が、並列である２つの直接デジタル合成装置として実装されるように、信号処理および制御装置２９によって与えられる。追加の水晶発振器からの正弦波信号が、サンプル回路１５および基準回路５１のそれぞれのミキサ１９、５７に供給される。サンプル回路１５および基準回路５１の光電気変換器１３、５３のそれぞれへの光信号入力が正弦波であれば、ミキサからの出力は次式で表される。

Ｙ（ｔ）＝Ａ１＊ｓｉｎ（ω１＊ｔ）＊Ａ２＊ｓｉｎ（ω２＊ｔ＋φ２）
＝Ａ１＊Ａ２＊ｃｏｓ（（ω１＋ω２）＊ｔ＋φ２）−Ａ１＊Ａ２＊ｃｏｓ（（ω２−ω１）＊ｔ＋φ２）

本応用では、ミキサは、信号を処理可能な周波数レンジにダウンミックスするために用いられる。したがって、信号にはローパスフィルタがかけられ、上式が次式に縮小される。

Ｙ（ｔ）＝−Ａ１＊Ａ２＊ｃｏｓ（（ω２−ω１）＊ｔ＋φ２）

サンプル回路１５および基準回路５１の両方の光電気変換器に供給される光信号は、同じ光源から発せられているので、光電気変換器１３、５３に入射する光信号の周波数は同じでなければならないはずである。

一実施形態では、追加の水晶発振器３１は、サンプル回路および基準回路にそれぞれ入る光信号と同じ周波数で発振するように構成される。これは、ホモダイン検出として知られる。このタイプの検出では、信号間の位相差に比例した信号出力が得られる。この実施形態では、最終信号の振幅は、位相差との間に何らかの数学的関係がある。ω１＝ω２の場合、上式の、ローパスフィルタをかけられた信号は、次式に縮小される。

Ｙ（ｔ）＝−Ａ１＊Ａ２＊ｃｏｓ（φ２）

したがって、アナログ信号からデジタル信号への変換の後に、これらの対応する振幅を用いて、蛍光性サンプル３３が原因である位相ずれがあればそれを抽出する計算を実施することが可能である。

追加の発振器３１からの信号出力の周波数と、光電気変換器１３、５３に入射する光信号の周波数との間に一定の差がある場合、これは、ヘテロダイン検出として知られる。ヘテロダインの原理は、光源（測定光源５および基準光源７）の、周波数ｆによる変調に基づく。サンプル回路１５および基準回路５１の信号利得は、次式の周波数で変調される。

ｆ＋ｄｆ または
ｆ−ｄｆ

前述のように、これによって、信号のダウンコンバージョンが行われるが、２つの分岐の間の位相差は維持される。ｆは、一般に、数メガヘルツから２００メガヘルツの範囲にある。ｄｆは、一般に、１００ヘルツから１０００Ｈｚの範囲にあるが、原則としては、１Ｈｚから数ＭＨｚが好適であろう。サンプル回路１５および基準回路５１のノイズを低減するために、それぞれバンドパスフィルタ２５、６１によって高周波成分が除去される。前と同様に、アナログデジタル変換器２７、６３から出力されるデジタル信号を信号処理および制御装置で処理して、それぞれの信号の位相ずれを求めることが可能である。これは以下の３つの段階に分けて行うことが可能である。

１）サンプル測定の場合に、サンプル回路で受け取られた信号と、基準回路で受け取られた信号との間の位相遅れを求める。
２）基準測定の場合に、サンプル回路で受け取られた信号と、基準回路で受け取られた信号との間の位相遅れを求める。
３）２つの結果を互いから差し引く。

ＬＥＤおよびＬＥＤ駆動電子部品を含む電子回路によって引き起こされる位相ドリフトが、第１の光源の動作時ならびに第２の光源の動作時の位相ずれと比較して無視できる程度であれば、動作を以下の式で表すことが可能である。

電子回路の一定の位相遅れおよび位相ドリフトは次のとおりである。
ＬＥＤドライバおよび測定ＬＥＤ
φｍ１＋Δφｍ１
ＬＥＤドライバおよび基準ＬＥＤ
φｒ１＋Δφｒ１
測定分岐検出器チェーン
φｓｄ＋Δφｓｄ
基準分岐検出器チェーン
φｒｄ＋Δφｒｄ
フルオロフォアによって導入される位相遅れは次のとおりである。
φｆ１
フルオロフォアに対する位相測定によって次式（測定ＬＥＤによる励起、測定分岐の位相−基準分岐の位相）が与えられる。
φｍ１＋Δφｍ１＋φｆ１＋φｓｄ＋Δφｓｄ−（φｍ１＋Δφｍ１＋φｒｄ＋Δφｒｄ）
これは次式まで縮小可能である。
φｆ１＋φｓｄ＋Δφｓｄ−φｒｄ−Δφｒｄ
それぞれの基準位相測定によって次式（基準ＬＥＤによる励起、測定分岐の位相−基準分岐の位相）が与えられる。
φｒ１＋Δφｒ１＋φｓｄ＋Δφｓｄ−（φｒ１＋Δφｒ１＋φｒｄ＋Δφｒｄ）
これは次式まで縮小可能である。
φｓｄ＋Δφｓｄ−φｒｄ−Δφｒｄ
フルオロフォアによって誘起された位相遅れは、フルオロフォア測定値および基準測定値を差し引いて計算される。
φｆ１＋φｓｄ＋Δφｓｄ−φｒｄ−Δφｒｄ−（φｓｄ＋Δφｓｄ−φｒｄ−Δφｒｄ）
＝φｆ１
電子回路によって誘起される一定の位相オフセットおよびドリフトがキャンセルされることがわかる。
検体の濃度は、信号処理および制御装置２９によって、あらかじめ計算された較正曲線に基づいて計算される。結果は、数値でディスプレイ６７に表示される。

較正曲線は、光路長の差（もしあれば）と、アッセイケミストリの特性である用量反応曲線とによって誘起された位相オフセットの結果である。較正曲線の例を図１０に示す。アッセイケミストリにバッチ変化が存在する場合は、（たとえば、２個のボタンからなる）単純なユーザインターフェース６９を用いて較正パラメータをキー入力することが可能である。前記ボタンをさらに用いて、測定を初期化したり、血糖の継続的な監視のために必要な測定シーケンスをセットアップしたりすることが可能である。血糖の監視の場合、システムの較正は、普通の単体の血糖測定装置を用いて基準グルコース測定を実施し、結果をキー入力することによって行われることが可能である。その後、その装置で、基準測定値を用いて較正を行い、対応する測定を実施する。

前述のシステムの代替実施形態を図５および６に示す。その実施形態では、基準ＬＥＤ５の動作中に、発せられた光信号４５がＡＰＤ１３に直接誘導される。光４５は、光導波路６５または自由光路によって測定回路１５のＡＰＤ１３に誘導される。これらの図に示した実施形態では、絶対位相を測定しない。それは、基準光が測定分岐回路を照らすまでにたどる光路に顕著な違いがあるためである。基準ＬＥＤ７の動作中に測定された位相は、光路長１１、９の間の差によって誘起される一定の微小オフセット分だけ、測定ＬＥＤ５の動作中に測定された位相と異なる可能性がある。

したがって、光路は同じ（または、ほぼ同じ）であることが好ましいが、必須ではない。たとえば、変調された周波数が６０ＭＨｚであれば、測定光路長が１．５ｍｍ変動すると、位相が約０．１°変化する。位相変化は変調された周波数に反比例するので、（０．１ｍｍの違いが約０．１°になる）１ＧＨｚの場合は、光路長の安定がより強く望まれる。測定光路の光路長の差における変動は１．５ｍｍ未満であることが好ましい。

図５に示した実施形態では、基準ＬＥＤ７からの光信号がサンプル回路１５の光電気変換器１３に直接伝わるが、この場合は、検出される光の強度を調節することが望ましい。これは、サンプル回路１５が、蛍光性サンプル３３から発せられた光を受ける場合と同等の条件で動作することを可能にするために必要となる場合がある。これを行う１つの方法は、基準ＬＥＤ７の駆動電流を調節することである。しかしながら、この方法は、基準ＬＥＤ７からの出力が変わるために、基準分岐の条件に影響を及ぼす。したがって、図６に示すように、第２の光路９に電気−光学アッテネータ４７を導入して、基準ＬＥＤ７からの検出された光の強度を調節することによって、基準分岐内の光強度を一定に保つことが好ましい。

たとえば、電気−光学アッテネータ４７の例として、ねじれネマチック液晶ディスプレイ（ＴＮ ＬＣＤ）、スーパーねじれネマチック液晶ディスプレイ（ＳＴＮ ＬＣＤ）、デジタル超微小ミラー素子／デジタル光プロセッサ（ＤＭＤ／ＤＬＰ）、強誘電性液晶ディスプレイなどがある。

別の代替実施形態では、第１および第２のＬＥＤの駆動電流の位相を測定することによって、光の位相を直接測定することが可能である。この実施形態では、第１および第２のＬＥＤの両方から基準光路に沿って基準回路の光電気変換器まで光を発することが必要でなくなる。その代わりに、図７に示すように、位相をＬＥＤドライバから直接測定し、その位相を基準回路のミキサに入力する。

説明したシステムを用いて、競合アッセイ内に存在する検体の濃度を求めることが可能である。競合アッセイでは、ＦＲＥＴ活性分子が、やはりＦＲＥＴ活性である競合エージェントと結合した結果として、ＦＲＥＴが起こる可能性がある。検出された位相ずれは、検出された蛍光光の平均寿命に基づく。前述のシステムは、測定ＬＥＤ５からの光を、既知の濃度の検体の溶液に向けることによって較正される。様々な回路を通る信号から導出された情報を用いて、較正曲線を作成することが可能である。実時間動作中は、所定の濃度のＦＲＥＴ活性材料および競合エージェントが与えられる。ＦＲＥＴは、測定電子回路で受けた光に発生した位相ずれを計算することによって検出される。ＦＲＥＴの量は、存在する検体の量に対応するので、この位相ずれを較正曲線と比較すると、存在する検体の濃度を求めることが可能である。

そのようなシステムの一応用は、血糖濃度の測定である。そのような状況では、グルコース結合分子をフルオロフォアに対応させ、グルコース類似体をエネルギーアクセプタに対応させる。グルコース類似体とグルコース結合分子とが結合しているかぎり、最大限のＦＲＥＴが発生する。グルコースが存在する場合は、グルコースが、結合場所に関してグルコース類似体と競合し、アクセプタ分子に取って代わる。このときは、発生するＦＲＥＴが少なくなる。

測定値を取得するために２つの蛍光性サンプルが必要な場合は、グルコース結合分子をフルオロフォアに対応させるのに加え、グルコース濃度に影響されない別の基準フルオロフォアを第２の蛍光性サンプルとして与えることが可能である。この場合、結果としての蛍光光の強度および位相に対する第２の蛍光性サンプルの作用が既知であれば、ＦＲＥＴによって引き起こされる位相ずれを計算するための基準として、その第２の蛍光性サンプルを用いることが可能である。

測定時に、表皮層内にある他のフルオロフォアが励起光を照射されて蛍光光を発すると、測定への干渉になる可能性がある。このような別の干渉があると、ＦＲＥＴが原因である位相ずれの検出が困難になる。このような状況では、基準ＬＥＤおよび測定ＬＥＤから２つ以上の異なる変調された周波数の光を交互に発することを可能にするようにシステムを適合させることが好ましい。追加する周波数も、第１の周波数と同等のレンジにあることが好ましい。変調された周波数は、位相変化に寄与するフルオロフォアに応じて互いに２倍以上異なるのが一般的であるが、必ずそうであるとは限らない。ヘテロダイン検出の場合は、２つの発振器の周波数の差が一定に保たれるので、追加の処理電子回路が不要である。

フルオロフォアが異なればそれぞれの寿命も異なるので、位相ずれの程度も信号ごとに異なってくる。さらに、各フルオロフォアが引き起こす、蛍光信号の振幅の低減の程度は様々である。２つ以上の異なる変調された周波数の光を用いると、蛍光信号の位相および振幅の変化に基づいて、さらなる計算を信号処理および制御装置２９で行わせることが可能になる。この点において、振幅差を検出するのに必要な回路は、位相ずれを検出する回路と同じである。測定回路および基準回路のそれぞれのアナログデジタル変換器２７、６３に供給されるビート周波数は、蛍光信号の強度に対応する振幅を有する。これらのデジタイズされた信号が信号処理および制御装置に供給されて、ＦＲＥＴが原因である周波数ずれを求めることが可能になる。測定可能な各残存寿命については、別の周波数での測定が必要である。異なる周波数ごとに、測定ＬＥＤと基準ＬＥＤの両方を活性状態にして測定を行わなければならない。

このシステムは、蛍光寿命画像顕微法（ＦＬＩＭ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｉｆｅｔｉｍｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で用いることも可能である。ＦＬＩＭは、同様の吸収特性および発光特性を呈しながら蛍光寿命が異なる、別々の蛍光性材料から発せられる蛍光光を識別することを可能にする。蛍光寿命は、蛍光光の位相ずれとその振幅の低減を測定することによって計算される。寿命画像取得では、いくつかの画像を取得するが、その個々の点における蛍光光の寿命に応じて位相が変動する。ＦＬＩＭの結果として取得された信号は、信号の位相ドリフトを引き起こす可能性のある要因と同様の要因の影響を受けやすい。したがって、この相対的な寿命画像を実際の寿命画像と関連付けるために基準が必要である。前述のシステムは、画像の画素ごと、またはラインごとに、前述の連続的な測定を実施することが可能である。

説明および図示した実施形態に対して、添付の特許請求の範囲を逸脱することなく、変形および修正を施すことが可能であることを理解されたい。

市販の蛍光光度計の概略図である。 本発明の一実施形態の概略図である。 本発明の第２の実施形態の概略図である。 第１および第２の光源の励起スペクトルを示すグラフであり、励起フィルタ、ビームスプリッタ、および発光フィルタのスペクトルのグラフを併せて示している。 第１および第２の光源の励起スペクトルを示すグラフであり、励起フィルタ、ビームスプリッタ、および発光フィルタのスペクトルのグラフを併せて示している。 本発明の第３の実施形態の概略図である。 図５に示した実施形態に回路を追加した、さらなる概略図である。 本発明の第４の実施形態の概略図である。 本発明の実施形態に用いられる滑らかな励起パルスのグラフである。 本発明の装置の平面図である。 実際の動作で使用する較正曲線を示す図である。 並列である２つの直接デジタル合成装置の概略図である。

Claims (60)

1. サンプルによって光信号に誘起される位相ずれを測定する装置であって、
   サンプル位置を含む測定光路に沿って光信号を発する第１の光源、および、ダミー測定光路に沿って光信号を発する第２の光源であって、交互に動作するように構成された第１および第２の光源と、
   前記測定光路および前記ダミー測定光路から前記光信号を受け取る測定電子回路であって、前記測定電子回路が、前記測定光路および前記ダミー測定光路のそれぞれから受け取る前記光信号の位相をそれぞれ表す出力を、別々のタイミングで与えるように構成され、運用時には、前記サンプル位置にあるサンプルによって、前記測定光路内の光に位相ずれが誘起され、それによって、前記測定光路から受け取った、前記第１の光源の光の位相が、前記第１の光源から発せられた光の位相と異なっているところの測定電子回路と、
   前記第１および第２の光源から発せられた前記光信号の位相を表す信号を受け取る基準電子回路と、
   前記第１の光源に応答する前記測定電子回路の出力によって示される光の位相と、前記基準電子回路によって示される光の位相とを比較して、前記第１の測定された位相差を示す出力を与え、そして、前記第２の光源に応答する測定電子回路の出力によって示される光の位相と、前記基準電子回路によって示される光の位相とを比較して、第２の測定された位相差を示す出力を与える回路と、
   前記サンプルによって前記第１の光源の光に誘起された位相ずれの改善された測定値を取得するために、前記第２の測定された位相差に基づく補正を前記第１の測定された位相差に適用して、前記測定電子回路および基準電子回路によって誘起された位相変化に起因する、前記第１の測定された位相差の誤差を修正する回路と
   を備える装置。
2. 前記第１の光源がさらに、基準光路に沿って光信号を発し、前記第２の光源がさらに、ダミー基準光路に沿って光信号を発し、前記基準電子回路がさらに、前記基準光路および前記ダミー基準光路からの前記光信号を受け取る手段を備え、前記基準電子回路が、前記基準光路および前記ダミー基準光路のそれぞれから受け取る前記光信号の位相をそれぞれ表す出力を、別々のタイミングで与えるように構成される、請求項１に記載の装置。
3. 前記測定光路がビームスプリッタを含み、前記ビームスプリッタが、前記第１の光源から光を受け取り、前記光を前記サンプル位置に向かって反射し、前記サンプル位置から発せられた、運用時の蛍光発光を受け取り、前記蛍光発光を前記測定電子回路に伝達する、請求項１または２に記載の装置。
4. 前記測定光路が、前記サンプル位置において第１の蛍光性サンプルを励起するのに好適な光の波長を選択するように構成された励起フィルタと、前記サンプル位置からの蛍光発光の波長を選択するのに好適な発光フィルタとを備える、請求項１または２に記載の装置。
5. 発振器が前記第１および第２の光源のそれぞれと結合され、発振強度の光信号を発生させる、請求項１から４のいずれか１つに記載の装置。
6. 前記発振器から出力される信号が、滑らかな励起パルスの形である、請求項５に記載の装置。
7. 発振強度の光信号を発生させるために前記第１および第２の光源のそれぞれに供給される駆動電流が、直接デジタル合成によって生成される、請求項１から６のいずれか１つに記載の装置。
8. 前記ダミー測定光路が前記ビームスプリッタを含み、前記ビームスプリッタが、前記第２の光源から光を受け取り、前記光を前記サンプル位置に向かって反射し、前記サンプル位置から反射された前記光を受け取り、前記光を前記測定電子回路に伝達するように構成される、請求項３から７のいずれか１つに記載の装置。
9. 前記ダミー測定光路が、前記サンプル位置からの蛍光発光の波長と同等の光の波長を選択する前記発光フィルタをさらに含む、請求項８に記載の装置。
10. 前記第２の光源からの光が、前記ビームスプリッタによって受け取られず、前記測定電子回路に直接誘導される、請求項３から７のいずれか１つに記載の装置。
11. 前記ダミー測定光路が、前記第２の光源から発せられる光の強度を低減する電気−光学アッテネータをさらに備える、請求項１０に記載の装置。
12. 前記ダミー測定光路内の光が、前記第１の蛍光性サンプルを励起するのに好適な光の波長を含まない、請求項１から１１のいずれか１つに記載の装置。
13. 前記第１および第２の光源から発せられた光の波長が同じであり、前記ダミー測定光路が、前記第１の蛍光性サンプルを励起するのに好適な波長の光を除去するフィルタをさらに備える、請求項１から１２のいずれか１つに記載の装置。
14. 前記第１の光源および前記第２の光源が異なる波長の光を発し、前記第２の光源から発せられた前記光が、前記蛍光性サンプルを励起するのに好適な波長を含まない、請求項１から１０のいずれか１つに記載の装置。
15. 前記ダミー測定光路が前記ビームスプリッタを含み、前記ビームスプリッタが、前記第２の光源から光を受け取り、前記光を前記サンプル位置に向かって反射し、運用時に、前記サンプル位置から発せられた蛍光光を受け取り、前記蛍光光を前記測定回路に伝達するように構成される、請求項３から７のいずれか１つに記載の装置。
16. 前記ダミー測定光路が、前記サンプル位置において第２の蛍光性サンプルを励起するのに好適な光の波長を選択するように構成された励起フィルタと、前記サンプル位置からの蛍光発光の波長を選択するのに好適な発光フィルタとを備える、請求項１５に記載の装置。
17. 前記第１の蛍光性サンプルを励起するのに必要な光の波長が、前記第２の蛍光性サンプルを励起するのに必要な光の波長と異なる、請求項１５または１６のいずれか１つに記載の装置。
18. 前記測定電子回路が、前記測定光路および前記ダミー測定光路から光信号を受け取る光電気変換器を備え、前記光電気変換器が、前記光電気変換器を照らす光の強度に対応する電気信号を出力する、請求項１から１７のいずれか１つに記載の装置。
19. 前記光電気変換器が光電子増倍管であって、前記光電子増倍管が、バイアス電圧を供給されて、前記アバランシェフォトダイオードを照らす光の強度に対応する電気信号を増強する、請求項１８に記載の装置。
20. 前記サンプル回路の前記光電気変換器がアバランシェフォトダイオードであって、前記アバランシェフォトダイオードが、バイアス電圧を供給されて、前記アバランシェフォトダイオードを照らす光の強度に対応する電気信号を増強する、請求項１８に記載の装置。
21. 前記第１および第２の光源からの光を、それぞれ前記基準光路および前記ダミー基準光路に沿って前記基準回路の光電気変換器まで誘導する手段が設けられている、請求項１から２０のいずれか１つに記載の装置。
22. 前記基準回路の前記光電気変換器がフォトダイオードである、請求項２１に記載の装置。
23. 前記測定回路および前記基準回路のそれぞれで処理された信号を変調して、前記処理された信号の位相を表す出力を発生させる電子回路をさらに備える、請求項１から２２のいずれか１つに記載の装置。
24. 前記測定回路および前記基準回路のそれぞれにおける信号を変調する前記電子回路が、前記測定電子回路および前記基準電子回路のそれぞれにおいてミキサを備え、各ミキサが追加の発振器と結合される、請求項２３に記載の装置。
25. ０．１から１０^３メガヘルツの変調された周波数を有する信号が、前記追加の発振器から出力され、前記測定回路および前記基準回路のそれぞれにおける信号と、それぞれの前記ミキサ手段によって混合され、前記各光源から出力される光の変調された周波数が、前記変調された周波数と、量にして１０^２から１０^５ヘルツ（ヘテロダイン検出）だけ異なる、請求項２４に記載の装置。
26. 前記測定電子回路および前記基準電子回路のそれぞれがさらにバンドパスフィルタを備え、前記測定電子回路および前記基準電子回路の前記各ミキサからの出力の高周波成分が、前記バンドパスフィルタによって除去される、請求項２５に記載の装置。
27. 各光源から出力される光の変調された周波数と同じ変調された周波数を有する信号が、前記追加の発振器から出力され、前記測定回路および前記基準回路のそれぞれにおける信号と、それぞれの前記ミキサ手段（ホモダイン検出）によって混合される、請求項２４に記載の装置。
28. 各光源から出力された前記光の変調された周波数が１０ヘルツから１０^５ヘルツである、請求項１から２３のいずれか１つに記載の装置。
29. 前記測定電子回路および基準電子回路のそれぞれの前記光電気変換器が、電圧出力を発生させる増幅器に電気信号を出力するように構成され、それぞれの前記ミキサが、前記電圧出力と、前記追加の発振器からの変調された周波数の信号とを受け取って、前記入力間の周波数差を表すビート周波数出力を発生させるように構成され、前記出力が、前記光電気変換器で受け取られた前記光の位相を表す、請求項２４から２８のいずれか１つに記載の装置。
30. 前記測定回路および前記基準回路のそれぞれの前記ミキサに所定の周波数を与える前記追加の発振器が電圧制御水晶発振器である、請求項２４から２９のいずれか１つに記載の装置。
31. 前記測定回路および前記基準回路のそれぞれの前記ミキサに対する所定の周波数が直接デジタル合成によって生成される、請求項２４から３０のいずれか１つに記載の装置。
32. 前記測定電子回路および前記基準電子回路のそれぞれの前記バンドパスフィルタが、それぞれ、各ミキサから出力されるビート周波数を受け取って、それぞれの信号のノイズを低減するように構成される、請求項２４から３１のいずれか１つに記載の装置。
33. 前記測定電子回路および前記基準電子回路のそれぞれが、前記バンドパスフィルタからのフィルタリングされた信号を増幅する増幅器と、前記増幅された信号をデジタイズするアナログデジタル変換器とをさらに備える、請求項３２に記載の装置。
34. 前記測定回路および前記基準回路のそれぞれからのデジタイズ出力を受け取る信号処理および制御装置が提供され、前記信号処理および制御装置が、前記第１および第２の光源のそれぞれの動作中に受け取られたデジタイズ信号を比較する回路と、前記サンプルによって誘起された位相変化を計算する回路とをさらに備える、請求項３３に記載の装置。
35. 前記計算の結果がディスプレイに出力される、請求項３４に記載の装置。
36. 前記信号処理および制御装置が、前記第１および第２の光源の交互動作を制御するように構成される、請求項３４または３５に記載の装置。
37. 前記信号処理および制御装置が、前記追加の発振器の周波数を制御するように構成される、請求項３４から３６のいずれか１つに記載の装置。
38. 前記信号処理および制御装置が、前記アバランシェフォトダイオードに供給されるバイアス電圧を制御するように構成される、請求項３４から３７のいずれか１つに記載の装置。
39. 異なる２つ以上の周波数で変調された光が前記第１および第２の光源のそれぞれから交互に発生して連続的に出力され、さらなる計算が可能になる、請求項１から３８のいずれか１つに記載の装置。
40. グルコース測定システムで用いる場合に、前記サンプルが、前記サンプル内に存在するグルコースの濃度によって変調されることが可能な蛍光特性を有する、請求項１から３９のいずれか１つに記載の装置。
41. サンプルによって光信号に誘起される位相ずれを測定する方法であって、
    サンプル位置を含む測定光路に沿って第１の光信号を発するステップと、
    ダミー測定光路に沿って第２の光信号を発するステップとを含み、前記第１および第２の光信号が交互に発せられ、
    測定電子回路において前記測定光路および前記ダミー測定光路から光信号を受け取るステップと、
    測定光路およびダミー測定光路のそれぞれから受け取る光信号の位相をそれぞれ表す出力を、前記測定電子回路から、別々のタイミングで与えるステップと、
    基準電子回路において、前記第１および第２の光信号の位相を表す信号を受け取るステップと、
    前記第１の光信号に対する応答として前記測定電子回路の出力によって示される光の位相と、前記基準電子回路によって示される光の位相とを比較するステップと、
    前記第１の測定された位相差を表す出力を与えるステップと、
    前記第２の光信号に対する応答として前記測定電子回路の出力によって示される光の位相と、前記基準電子回路によって示される光の位相とを比較するステップと、
    第２の測定された位相差を表す出力を与えるステップと、
    前記サンプルによって前記第１の光源の光に誘起された位相ずれの改善された測定値を取得するために、前記第２の測定された位相差に基づく補正を前記第１の測定された位相差に適用して、前記測定電子回路および前記基準電子回路によって誘起された位相変化に起因する、前記第１の測定された位相差の誤差を修正するステップと
    を含む方法。
42. 付加的に、前記第１の光信号を基準光路に沿って発し、前記第２の光信号をダミー基準光路に沿って発するステップと、
    前記基準電子回路において、前記基準光路および前記ダミー基準光路からの前記光信号を受け取るステップと、
    前記基準光路および前記ダミー基準光路から受け取った前記光信号のそれぞれの位相をそれぞれ表す信号を、別々のタイミングで前記基準電子回路から出力するステップとをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
43. 前記第１の光信号として、前記サンプル位置における第１の蛍光性サンプルを励起するのに好適な波長の光を選択するステップと、
    前記サンプル位置から発せられる蛍光光の波長を選択するステップとをさらに含む、請求項４１または４２に記載の方法。
44. 発振強度の第１および第２の光信号を発生させるステップをさらに含む、請求項４１から４３のいずれか１つに記載の方法。
45. 直接デジタル合成によって駆動電流を生成するステップと、
    前記駆動電流を第１および第２の光源にそれぞれ供給することによって、発振強度の前記第１および第２の光信号を発生させるステップとをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
46. 前記ダミー測定光路に沿って発せられた前記第１の光信号をビームスプリッタで受け取るステップと、
    前記光を前記サンプル位置に向かって反射させるステップと、
    前記光を前記測定回路に伝達するステップと
    をさらに含む、請求項４１から４５のいずれか１つに記載の方法。
47. 前記サンプル位置から発せられた蛍光光の波長と同等の光の波長を選択するステップをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
48. 前記第２の光信号を前記第２の光源から前記測定回路に直接誘導するステップをさらに含む、請求項４１から４５のいずれか１つに記載の方法。
49. 前記第２の光源から発せられた光の強度を低減するステップをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
50. 前記測定電子回路において受け取った前記光信号を、前記光信号の強度に対応する電気信号に変換するステップと、
    前記電気信号を出力するステップと
    をさらに含む、請求項４１から４９のいずれか１つに記載の方法。
51. 前記第１および第２の光信号を、それぞれ前記第１および第２の光源から、前記基準光路および前記ダミー基準光路に沿って、前記基準回路の光電気変換器まで誘導するステップをさらに含む、請求項４１から５０のいずれか１つに記載の方法。
52. 前記測定電子回路および前記基準電子回路のそれぞれで処理された信号を変調して、前記処理された信号の位相を表す出力を発生させるステップをさらに含む、請求項４１から５１のいずれか１つに記載の方法。
53. 変調された周波数が０．１メガヘルツから１０^３メガヘルツである信号を追加の発振器から出力するステップと、
    前記変調された信号を、前記測定回路および前記基準回路のそれぞれにおいて処理された前記信号と、それぞれのミキサを用いて結合するステップと
    をさらに含む、請求項４１から５２のいずれか１つに記載の方法。
54. 前記測定電子回路および前記基準電子回路の前記ミキサのそれぞれの出力の高周波成分をバンドパスフィルタで除去するステップをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
55. 前記第１および第２の光信号の変調された周波数と同じ変調された周波数を有する信号を出力するステップと、
    前記変調信号を、前記測定電子回路および前記基準電子回路のそれぞれにおいて処理される前記信号と、それぞれのミキサを用いて結合するステップと
    をさらに含む、請求項４１から５２のいずれか１つに記載の方法。
56. 前記測定電子回路および前記基準電子回路のそれぞれからの電気信号を、電圧出力を発生させる増幅器に出力するステップと、
    前記電圧出力と、前記追加の発振器からの変調された周波数の前記信号とを、それぞれの前記ミキサで受け取るステップと、
    その後に、前記入力間の周波数差を表すビート周波数を発生させるステップと
    をさらに含む、請求項５３から５５のいずれか１つに記載の方法。
57. 前記測定電子回路および前記基準電子回路のそれぞれの前記バンドパスフィルタにおいて、各ミキサからの前記ビート周波数出力を受け取って、それぞれの信号の中のノイズを低減するステップをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
58. 前記バンドパスフィルタからの前記フィルタリングされた信号を増幅するステップと、
    前記増幅された信号をデジタイズするステップとをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
59. 前記第１および第２の光源のそれぞれの動作時に生成された、前記デジタイズされた信号を比較するステップと、
    前記サンプルによって誘起された位相変化を計算するステップと
    をさらに含む、請求項５７に記載の方法。
60. 前記計算の結果をディスプレイに出力するステップをさらに含む、請求項５９に記載の方法。

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