CN101002082A - 用于测量由样本在光信号中引起的相位偏移的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

用于测量在光信号中引起的相位偏移的设备具有：第一光源，用于沿着包括例如荧光样本的样本的测量光径发射光信号；以及第二光源，用于沿着伪测量光径发射光信号。提供了测量电子电路，用于接收这些光信号，并且提供在时间上分离的、表示相应光信号的相位的输出。在使用时，由荧光样本在测量光径的光中引起相位偏移。提供了参考电子电路，用于接收表示由第一和第二光源发射的光信号的相位的信号。提供了电路，用于在第一光源的操作期间比较从这两个电路输出的光的相应相位，以提供表示第一测量相位差的输出。然后，通过在第二光源的操作期间进行类似的相位差测量并且比较这两个相位差来对该测量施加校正。

Description

用于测量由样本在光信号中引起的相位偏移的方法和设备
本发明涉及一种用于测量由样本在光信号中引起的相位偏移的方法和设备。
在传统的荧光显微术中，记录荧光团发射的强度分布。可以测量的另一参数是“荧光寿命”。当通过光脉冲激励荧光团时，该发射显示衰变(典型地以纳秒的量级)。被称为荧光寿命的该衰变时间表示荧光团及其状态的特征。
荧光寿命感测是在荧光共振能量转移(FRET)分析中测量能量转移效率的有力方法。FRET是两种染料物品的激发态之间的距离相关相互作用，其中在没有光子发射的情况下，激励能量从给体转移到受体。FRET的效率相反地依赖于分子间间距的六次幂。因此，FRET的检测可以用来确定在标注为给体的物品与标注为受体的物品之间的距离。例如，这可以用来确定两个物品是否彼此结合。
在基于FRET的竞争分析中，由于FRET活性分子与也是FRET活性的竞争试剂结合，可能发生FRET。该竞争试剂与FRET非活性材料(分析物)竞争，该FRET非活性材料在与FRET活性分子结合时将不会导致FRET。竞争试剂和分析物中的每个在有限数量的时间内可逆地与FRET活性材料结合。这意味着竞争试剂和分析物都有机会与FRET活性材料结合，以达到平衡。当在这样的分析中存在的竞争试剂的数量是预定的时，可以使用FRET发生量来计算所存在分析物的浓度。当没有分析物存在时，将发生100％的可能FRET。
当以足够高的频率调制激励光时，不仅可以通过荧光强度，还可以以激励光和发射荧光之间的相位偏移来检测FRET信号。
然而，难以获得由荧光引起的相位偏移的准确读数，这是因为由于影响传感器的电子器件的因素，例如，测量电子器件已经受到温度变化和老化，光信号的测量相位可能漂移。
已经试图利用相位荧光计来准确地测量由荧光引起的相位偏移。如图1所示，可购得的相位荧光计有时具有两个相同的信号分支，样本信号分支201和参考信号分支203。激励光209由光源205生成，照射到荧光样本207上。该激励光的小部分211在样本207之前分离出，以照明参考分支203中的检测器213。将在参考信号分支203中检测的光的相位与从样本207发射的荧光的相位进行比较，以给出参考和样本分支之间的相位差。这给出由于样本信号分支中的光的荧光引起的相位偏移的初始测量。相位测量补偿光源或光源驱动电路中的相位漂移，但是没有考虑可能由电子电路引起的相位漂移。
在荧光样本207的照明的不久之前和之后，将荧光样本替换为参考对象215，其在激励光照射在其上时不发荧光。如同先前那样，激励光209由光源生成，以照射参考对象。在参考对象之前分离出激励光的小部分，以照射参考分支上的检测器。将在参考信号分支中检测的光的相位与在样本分支中检测的光的相位进行比较，从而为在样本对象发荧光时测量的最终信号提供校准。在这种情况下由样本分支和参考分支检测的信号之间的任何相位差将归于电子器件的差别或相应路径长度的差别。
最后，通过将在出现荧光时两个分支之间的相位差，与在不出现荧光时两个分支之间的相位差进行比较，计算由荧光样本对象引起的相位滞后。
这消除了由电元件引起的相位漂移，并且考虑了可能由光的光径引起的任何相位差。
上述系统要求电机化或手动驱动机构，用于将对象从样本对象更换为参考对象。此时，需要改变接收由于其非荧光特性而从参考对象反射的光的滤光器。此外，可能需要改变光径中的滤光器，以适于不同光强度。这还将需要使用电机化机械系统来完成。这种系统是不良的，因为其最终是昂贵的、消耗空间的、生产复杂的，并且由于活动部件而易于损坏。此外，可能期望小型化如上所述的系统，使得能够为医疗目的而使用这样的系统，例如，用于连续的血糖测量。在诸如相位荧光计将会被人磨损的应用中，使用引起剧烈振动和噪声的电机将是不良的。
本发明的目的是提供一种测量相位差的系统和方法，其包括无需人工或机械干预地执行的对电子漂移的校正。
根据本发明的第一方面，提供了用于测量由样本在光信号中引起的相位偏移的设备，该设备包括：
第一光源，用于沿着测量光径发射光信号，其中测量光径包括样本位置；
第二光源，用于沿着伪测量光径发射光信号，第一和第二光源被布置成交替操作；
测量电子电路，用于接收来自测量和伪测量光径的光信号，该测量电子电路被布置成提供在时间上分离的输出，其分别表示从测量和伪测量光径中的每个接收的光信号的相位，其中在使用时，由在所述样本位置的样本在测量光径中的光内引起相位偏移，使得从测量光径接收的第一光源的光的相位不同于从第一光源发射的光的相位；
参考电子电路，用于接收表示由第一和第二光源发射的光信号的相位的信号；
用于将由响应于第一光源的测量电子电路的输出表示的光相位与由参考电子电路表示的光相位进行比较，以提供表示第一测量相位差的输出，并且将由响应于第二光源的测量电子电路的输出表示的光相位与由参考电子电路表示的光相位进行比较，以提供表示第二测量相位差的输出的电路，以及基于第二测量相位差而对第一测量相位差施加校正，以校正由于由所述测量和参考电子电路引起的相位变化所导致的所述第一测量相位差的误差，以便获得由样本在第一光源的光中引起的相位偏移的改进测量的电路。
优选地，测量光径包括光束分离器，接收来自所述第一光源的光，并且朝着所述样本位置反射所述光，并且接收从所述样本位置发射的使用中的荧光发射光，并且将所述荧光发射光传送到所述测量电子电路。
更优选地，测量光径包括：激励滤光器，其被布置为选择适于激励在所述样本位置的荧光样本的光的波长；以及发射滤光器，适于选择从所述样本位置发射的荧光的波长。
振荡器耦接到第一和第二光源中的每个，以产生振荡强度的光信号。通过直接数字合成来生成驱动电流，该驱动电流馈入第一和第二光源中的每个，以产生振荡强度的光信号。
在一个实施例中，伪测量路径包括所述光束分离器，该光束分离器被布置为接收来自第二光源的光，朝着所述样本位置反射所述光，接收从所述样本位置反射的所述光，并且将该光传送到所述测量电子电路。
优选地，伪测量光径还包括所述发射滤光器，用于选择与从样本位置发射的荧光的波长相当的光的波长。
在可选实施例中，来自第二光源的光不被光束分离器接收，并且被直接导向到测量电子电路。
因此，伪测量路径还包括用于降低从第二光源发射的光的强度的电光衰减器。
在优选实施例中，伪测量路径中的光不包括适于激励荧光样本的光波长。
在一个实施例中，从所述第一和第二光源发射的光具有相同的波长，并且伪测量路径还包括滤光器，用于消除适于激励荧光样本的波长的光。
在可选实施例中，第一光源和第二光源发射不同波长的光，并且从第二光源发射的光不包括适于激励荧光样本的波长。
优选地，测量电子电路包括光电转换器，用于从所述测量路径和伪测量路径接收光信号，其中光电转换器输出与照明其的光的强度相对应的电信号。
更优选地，样本电路的光电转换器是雪崩光电二极管，由此将偏压提供给雪崩光电二极管，以增强与照明该雪崩光电二极管的光的强度相对应的电信号。
提供这样的装置，其用于分别沿着参考和伪参考光径将来自第一和第二光源的光导向到参考电路的光电转换器。
优选地，参考电路的光电转换器是光电二极管。
在优选实施例中，该系统还包括电子电路，用于调制在测量电路和参考电路中的每个内处理的信号，以产生表示所处理信号的相位的输出。
优选地，调制在测量和参考电路中的每个内的信号的电子电路包括在测量电子电路和参考电子电路中的每个内的混频器，每个混频器耦接到另一振荡器。
在一个实施例中，从该另一振荡器输出具有从0.1到103兆赫的调制频率的信号，并且通过相应的混频器，将其与测量和参考电路中的每个内的信号相组合，并且从每个所述光源输出的光的调制频率与所述调制频率相差102到105赫的数量(外差检测)。
测量电子电路和参考电子电路每个还包括带通滤波器，其中通过该带通滤波器消除来自测量电路和参考电子电路的混频器中的每个的输出的高频分量。
在可选实施例中，从该另一振荡器输出具有与从每个光源输出的光的调制频率相同的调制频率的信号，并且通过相应的混频器将其与所述测量和参考电路中的每个内的信号相组合(零差检测)。
在另一实施例中，从每个光源输出的光的调制频率为10到105赫。
优选地，测量和参考电子电路中的每个的光电转换器被布置为将电子信号输出到产生电压输出的放大器，相应的混频器被布置为接收所述电压输出和来自该另一振荡器的调制频率的信号，以产生表示所述输入的频率差的拍频输出，所述输出表示在光电转换器处接收的光的相位。
将预定频率提供到测量和参考电路中的每个的混频器的另一振荡器是压控晶体振荡器。
优选地，通过直接数字合成来生成到测量和参考电路中的每个的混频器的预定频率。
在优选实施例中，测量和参考电子电路中的每个的带通滤波器分别被布置为接收从每个混频器输出的拍频，以减少相应信号中的噪声。
优选地，测量和参考电子电路每个还包括：放大器，用于放大来自带通滤波器的经滤波信号；以及模数转换器，用于对经放大信号进行数字化。
在优选实施例中，信号处理和控制单元被提供以从测量电路和参考电路中的每个接收数字化输出，该信号处理和控制单元包括另一电路，用于比较分别在第一和第二光源的操作期间接收的数字化信号，并且计算由样本引起的相位变化。将计算结果输出到显示器。
优选地，信号处理和控制单元被布置为控制第一和第二光源的交替操作、另一振荡器的频率和提供给雪崩光电二极管的偏压。
在一个实施例中，连续地从第一和第二光源中的每个交替生成并输出两个不同频率的光，以允许进一步的计算。
本发明还扩展到一种测量由样本在光信号中引起的相位偏移的方法，包括以下步骤：
沿着测量光径发射第一光信号，其中测量光径包括样本位置；
沿着伪测量光径发射第二光信号，该第一和第二光信号被交替地发射；
在测量电子电路中从测量和伪测量光径接收光信号；
从测量电子电路提供在时间上分离的输出，其中该输出分别表示从每个测量和伪测量光径接收的光信号的相位；
在参考电子电路中接收表示第一和第二光信号的相位的信号；
将由测量电子电路的输出表示并且响应于第一光信号的光的相位与由参考电子电路表示的光的相位进行比较。
提供表示第一测量相位差的输出；
将由测量电子电路的输出表示的、响应于第二光信号的光的相位与由参考电子电路表示的光的相位进行比较；
提供表示第二测量相位差的输出；
基于第二测量相位差对第一测量相位差施加校正，以校正由于所述测量和参考电子电路引起的相位变化所导致的所述第一测量相位差的误差，以便获得由样本在第一光源的光中引起的偏移相位的改进测量。
以下将参考附图描述本发明的实施例，其中：
图1是可购得的荧光计的示意图。
图2是本发明的一个实施例的示意图。
图3是本发明的第二实施例的示意图；
图4A和4B是示出第一和第二光源的激励谱的图、以及激励滤光器、光束分离器和发射滤光器的频谱的图；
图5是本发明的第三实施例的示意图；
图6是具有附加电路的图5所示的实施例的另一示意图；
图7是本发明的第四实施例的示意图；
图8示出了用于本发明实施例的平滑激励脉冲的图；
图9示出了本发明的设备的平面图。
图10示出了供实际操作使用的校准曲线。
图11示出了两个并行直接数字合成器的示意图。
图2中所示的是本发明实施例的各个组件。该系统包括：耦接到LED驱动器3的晶体振荡器1；可以每次激活一个的两个LED5、7；以及激励滤光器37。来自LED5、7中每个的光同时被引导到测量电路15和参考电路51。来自LED5、7两者的光通过光束分离器35来引导。
测量电路15包括：发射滤光器43、雪崩光电二极管13、用于将所接收的电流信号转换为电压信号的跨阻抗放大器17、混频器19、放大器23、带通滤波器25、模数转换器27和雪崩光电二极管偏压电源28。
类似地，参考电路51包括光电二极管53、跨阻抗放大器55、混频器57、放大器59、带通滤波器61和模数转换器63。参考和测量电路两者还具有：信号处理和控制单元29，用于处理来自两个电路的信息；另一晶体振荡器31；显示单元67，用于显示结果；以及接口69，具有至少两个按钮。
虽然本发明是关于发光二极管的使用而描述的，但是应当理解，可以使用其它光源例如激光二极管。
在操作时，LED驱动器3耦接到晶体振荡器1，并且被布置成分别从第一和第二LED5、7中的每个产生光信号。在该实施例中，通过晶体振荡器1来产生正弦光信号。然而，应当清楚，假如可以确定光信号的相位，本领域公知的其它方法可以是适合的，例如通过生成具有矩形脉冲的光信号。
例如，在一个实施例，从第一和第二光LED中的每个生成和发射的光信号具有平滑的激励脉冲。如图8所示，正脉冲比正弦波形更窄，以致该脉冲的总体形状近似为高斯曲线。
如CARLSSON K.PHILLIP J在″Theoretical investigation of thesignal-to-noise ratio for different fluorescence lifetime imagingtechniques″，Proc SPIE 4611，70-78，2002中所阐述的，狄拉克脉冲激励是供荧光团使用的最有利的激励方法。狄拉克脉冲无限窄，并且狄拉克激励信号产生1的额定品质因数(F)。然而，这样的脉冲激励实际上难以产生。
信噪比(SNR)与F的平方成反比。因此，在F＝1时达到最优SNR。正弦调制产生4的品质因数，并且如此，就SNR而言，正弦调制好于狄拉克调制16倍。然而，正弦调制更容易产生，因为存在较低的带宽要求和功耗。
如Carlsson所阐述的那样，平滑激励脉冲给出品质因数1.55，与狄拉克脉冲激励比较，其对应于2.4倍的SNR减小。因此，这比标准正弦信号更有利。
直接数字合成可以用来生成正弦波以及平滑的脉冲激励。如图11所示，直接数字合成器71包括地址计数器73、用于存储各种波形的可编程只读存储器(PROM)75、寄存器77和数模转换器79。
对应于正弦波的完整周期的数字振幅信息存储在PROM75中，其中PROM75用作正弦查询表。地址计数器逐步前进并且访问PROM的存储位置和内容中的每个，将该等效正弦振幅字提供到高速数模转换器79。响应于来自PROM的数字输入字，数模转换器生成模拟正弦波。合成器完成一个波的速率支配频率。时钟81由信号处理和控制单元29来提供。
LED驱动器3由信号处理和控制单元29来控制，使得第一LED5(以下被称为“测量LED”)和第二LED7(以下被称为“参考LED”)交替地导通和关断，使得在任一时刻测量5或参考LED7中的仅仅一个是激活的。因此，交替地从测量LED5和参考LED7发射光信号。
在图2所示的实施例中，来自测量LED5的光沿着两个不同路径即第一光径11和第一参考路径48被引导。类似地，来自参考LED7的光沿着两个不同路径即第二光径9和第二参考路径49被引导。第一光径11和第二光径9遵循类似的路线，以通向样本电路15的雪崩光电二极管(APD)13。
类似地，第一参考路径48和第二参考路径49遵循类似路线，以通向参考电路51的光电二极管53。
第一光径中的光穿过激励滤光器37，并且通过光束分离器35被引导到荧光样本33上。第一光径中的光(激励光)39穿过激励滤波器37，以确保其具有稳定的谱特性。激励光39导致样本的激励，使得其发射具有与从测量LED5发射的光39不同的相位、频谱和强度的荧光41。
然后，荧光41在照明样本电路15的APD13之前，穿过发射滤光器43。然后，该信号由样本电路15来处理，使得可以确定由APD13检测的荧光41的相位。
同时，沿着参考路径48将来自测量LED5的光39导向到参考电路51的光电二极管53，使得可以确定参考光的相位。在参考电路51处接收的光的相位应该与从测量LED5发射的光的相位相同。
比较在样本电路15和参考电路51中的每个内确定的光的相位，以确定在第一光径11中引起的相位偏移。可以预料，沿着第一光径11的主要相位偏移由荧光样本33引起。然而，不能认为该测量是绝对的，因为由于电子器件的老化或温度变化，每个电路中的电子器件可能引起不同程度的相位漂移。
为了确定由荧光样本33引起的绝对相位偏移，需要对由系统的电子器件引起的这样的漂移进行校正。为此，紧邻在测量LED5的激活之前和之后，激活参考LED7。从参考LED7发射的光的一部分沿着参考路径49被引导到参考电路51。从参考LED7发射的光的剩余部分沿着第二光径9向测量电路15引导。
在该实施例中，为了允许校正，第二光径中的光不使荧光样本激励。这可以以两种方式来实现。如图2所示，从参考LED5发射的光45通过光束分离器35向荧光样本33引导。
在一个实施例中，从参考LED7发射的光具有与从测量LED5发射的光不同的波长。具体地，来自参考LED7的光在光谱上位于发射滤光器43的通带，使得光从样本位置散射或者反射。在可选实施例中，从测量LED5和参考LED7两者发射的光具有相同波长。在该实施例(未示出)中，另一滤光器被提供在样本位置的照明之前，以排除激励该样本所需的那些波长。
如同先前那样，将测量分支中的信号与在参考分支中检测的信号进行比较。在理想条件下，两个检测信号之间的相位差表示由样本引入的相位变化。然而，在实际操作中，由电子电路引起的相位漂移的程度将在测量和参考分支之间变化。由于在测量LED5的操作期间和在参考LED7的操作期间的信号测量之间几乎没有时间流逝，因此假定在测量和参考分支两者中的电路条件在读数之间不会显著地变化。
因此，假定在参考LED7的操作期间样本和测量之间检测的任何相位差是由电子器件和各个路径长度的差别引起的。
应当理解，在从测量LED5到APD13和从参考LED7到APD13的路径长度上，存在微小的变化。然而，这是不变的，即各个路径长度之差将总是保持相同，从而导致可以容易地对恒定相位偏移进行校正。样本电路的雪崩光电二极管(APD)13使用高电压被施加反向偏压。这导致典型地在50和500之间的初始光电电流的放大。馈入APD13的光信号非常弱，并且在普通光电二极管中将产生信号，其将与由放大器产生的噪声相当或者更低。APD的使用提高信号的信噪比，并且因此提高测量的精度。然而，本领域的技术人员应当清楚，能够输出与照明其的光的强度相对应的电信号的任何电气装置将是适合的。例如，在可选实施例中，APD可以由光电倍增管(PMT)来替换。
可选地，在样本位置提供第二荧光样本。在图3所示的该实施例中，其布置成使得第二荧光样本仅仅可被沿着伪测量路径通过的光激励。这可以通过从参考LED发射具有适当激励波长的光来实现。此外，滤光器可以被提供在伪测量路径中，其仅仅允许用于第二荧光样本的激励的有关波长的光穿过。
具有两个反射频带和两个传输频带的二色光束分离器34用来选择性地允许光从光源反射到样本位置，并且用于仅仅允许相关荧光从样本位置传递到测量电路。类似地，发射滤光器43具有两个传输频带，以允许从荧光样本两者发射的荧光穿过。
图4A和4B示出了可能适合的波长的示例。在这个示例中，从第一LED发射的光具有波长592nm。可以看出，荧光样本具有围绕该波长的吸收谱，并且来自第一荧光样本的对应发射谱基于略微更大的波长。类似地，从第二LED发射的光具有近似700nm的波长。第二荧光样本具有围绕该样本波长的吸收谱并且对应发射谱基于略微更大的波长。
图4B示出了对应滤光器的传输特性。可以看出，由二色光束分离器反射的光的两个波长频带与从各个LED发射的光的波长相对应，也就是，近似为592nm和740nm。如图4B所示，这些频率超出二色光束分离器的传输频带的范围，并且如此，反射对应于这些波长的光。类似地，二色光束分离器的两个传输频带与从荧光样本两者发射的荧光的波长相对应。最后，发射滤波器的传输频带也对应于从两个样本发射的荧光的波长。
在上述实施例中，反向偏置高电压由APD偏压电源28来提供，该APD偏压电源28由信号处理和控制单元29控制。信号处理和控制单元29还对操作另一晶体振荡器31负责。从另一振荡器输出的波形也是通过直接数字合成来生成。优选的是，具有相同的时钟来驱动两个直接数字合成器单元。该时钟由信号处理和控制单元39提供，使得将两个振荡器实现为两个并行的直接数字合成器。来自另一晶体振荡器的正弦信号馈入样本电路15和参考电路51中的每个的混频器19、57。如果输入到样本电路15和参考电路53的光电转换器13、53的每个中的光信号是正弦的，则来自混频器的输出将由下面方程式表示：
Y(t)＝A1*sin(ω1*t)*A2*sin(ω2*t+2)
＝A1*A2*cos((ω1+ω2)*t+2)-A1*A2*cos((ω2-ω1)*t+2)
在本申请中，混频器用于将该信号下混频到可操纵的频率范围。因此，该信号被低通滤波，这将该方程式简化为：
Y(t)＝-A1*A2*cos((ω2-ω1)*t+2)
可以预期，当馈入样本电路15和参考电路51两者的光电转换器的光信号来源于同一光源时，入射到光电转换器13、53上的光信号的频率应该相同。
在一个实施例中，另一晶体振荡器31被布置为分别以与进入到样本和参考电路的光信号相同的频率振荡。这被称为零差检测。这种检测导致与信号之间的相位差成比例的信号输出。在该实施例中，最终信号的振幅与相位差具有某种数学关系。对于ω1＝ω2，基于被低通滤波信号的方程式简化为：
Y(t)＝-A1*A2*cos(2)
因此，在模拟信号到数字信号的转换之后，将有可能使用这些对应振幅来执行计算，以获得由荧光样本33引起的任何相位偏移。
在从另一振荡器31输出的信号的频率与入射到光电转换器13、53上的光信号的频率存在固定差值的情况下，这被称为外差检测。外差原理基于以频率f的光源(测量光源5和参考光源7)的调制。在样本电路15和参考电路51中的信号的增益以如下频率来调制：
f+df或
f-df
如上所述，这导致信号的下变频，但是保持两个分支之间的相位差。f典型地在几兆赫直到200兆赫的范围内。df典型地在100到1000Hz的范围内，不过原则上，1Hz直到数MHz将是适合的。高频分量分别由带通滤波器25、61来消除，以减少样本电路15和参考电路51中的噪声。如同先前那样，从模数转换器27、63输出的数字信号可以由信号处理和控制单元来处理，以确定相应信号的相位偏移。这可以在三个阶段中进行：
1)针对样本测量，确定在样本电路中接收的信号和在参考电路中接收的信号之间的相位滞后；
2)针对参考测量，确定在样本电路中接收的信号和在参考电路中接收的信号之间的相位滞后；以及
3)将两个结果相减。
如果在比较第一光源的操作和第二光源的操作期间的相位偏移时，由包括LED和LED驱动电子器件的电子电路引起的相位漂移是可忽略的，则该操作可以由下列方程式描述：
电子器件中的恒定相位滞后和相位漂移如下：
LED驱动器和测量LED
m1+Δm1
LED驱动器和参考LED
r1+Δr1
测量分支检测器链
sd+Δsd
参考分支检测器链
rd+Δrd
由荧光团引入的相位滞后是
f1
对荧光团的相位测量给出下面的方程式(使用测量LED激励，测量分支中的相位减去参考分支中的相位)：
m1+Δm1+f1+sd+Δsd-(m1+Δm1+rd+Δrd)
这可以简化为
f1+sd+Δsd-rd-Δrd
相应的参考相位测量给出下面的方程式(使用参考LED激励，测量分支中的相位减去参考分支中的相位)：
r1+Δr1+sd+Δsd-(r1+Δr1+rd+Δrd)
这可以简化为
sd+Δsd-rd-Δrd
由荧光团引起的相位滞后通过减去荧光团和参考测量来计算：
f1+sd+Δsd-rd-Δrd-(sd+Δsd-rd-Δrd)
＝f1
可以观察到，由电子器件引起的恒定相位偏移和漂移被抵消。由信号处理和控制单元29基于预先计算的校准曲线计算分析物的浓度。该结果作为数被显示在显示器67上。
校准曲线是由光径差(若有的话)以及剂量响应曲线引起的相位偏移的结果，剂量响应曲线是分析化学性质的特征。图6示出了关于校准曲线的示例。如果在分析化学性质上存在批变化，则可以通过使用例如包括两个按钮的简单用户接口69来键入校准参数。所述按钮还可以用来启动测量、或根据需要为连续血糖监测设置测量顺序。在血糖监测的情况下，该系统的校准可以通过用普通分立的血糖计执行参考葡萄糖测量并且键入该结果来完成。然后，由该装置使用参考测量和由该装置执行的对应测量来完成该校准。
上述系统的可选实施例在图5和6中示出，其中在参考LED5的操作期间，所发射的光信号45直接被导向到APD13。光45通过光导器65或通过自由光径被导向到测量电路15的APD13。在这些图中所示的实施例并未测量绝对相位，因为在照明测量分支电路之前参考光所沿的路径存在显著的差别。在参考LED7的操作期间所测量的相位可能与在测量LED5的操作期间测量的相位相差由光径长度11、9之差引起的小恒定偏移。
因此，虽然路径相同或几乎相同是优选的，但是它不是必需的。例如，在60MHz的调制频率，1.5mm的测量路径长度的变化产生近似0.1°的相位变化。相位变化与调制频率成反比，这增加了对在1GHz的路径长度上的稳定性的要求(0.1mm给出近似0.1°)。对于测量路径的路径差具有1.5mm之下的变化是优选的。
在图5所示的实施例中，在来自参考LED7的光信号直接传播到样本电路15的电光变换器13的情况下，可能期望调整所检测光的强度。这可能是需要的，以便允许样本电路15在与接收由荧光样本33发射的光时类似的条件下操作。可完成此的一种方式是通过调整到参考LED7的驱动电流。然而，因为来自参考LED7的输出将会不同，所以这将影响参考分支中的条件。因此，优选的是，通过将电光衰减器47引入第二光径9中来调整所检测的来自参考LED7的光的强度，从而保持参考分支中的光强，如图6所示。
例如，电光衰减器47可能是扭转向列液晶显示器(TN LCD)、超扭转向列液晶显示器(STN LCD)、数字微镜装置/数字光处理器(DMD/DLP)或铁电液晶显示器。
在另一可选实施例中，可以通过测量到第一和第二LED的驱动电流的相位来直接地测量光的相位。在该实施例中，将不需要沿着参考路径将来自第一和第二LED两者的光发射到参考电路的光电转换器。作为替代，并且如图7所示，从LED驱动器直接测量相位，并且将其输入到参考电路的混频器。
如上所述的系统可以用来确定存在于竞争分析中的分析物的浓度。在竞争分析中，由于FRET活性分子与也是FRET活性的竞争试剂相结合，可能发生FRET。所检测的相位偏移基于所检测荧光的平均寿命。通过将来自测量LED5的光引导到具有已知浓度的分析物的溶液来校准上述系统。可以使用从各个电路中的信号获得的信息来创建校准曲线。在实时操作期间，提供了预定浓度的FRET活性物质和竞争试剂。通过计算在由测量电子电路接收的光中引起的相位偏移来检测FRET。因为FRET的数量对应于所存在分析物的数量，所以将该相位偏移与校准曲线进行比较，以使得能够确定所存在分析物的浓度。
这样的系统的一个应用是血糖浓度的测量。在该情形下，荧光团连接到葡萄糖结合分子，并且能量受体连接到葡萄糖类似物。只要葡萄糖类似物结合到葡萄糖结合分子，就将发生最大可能的FRET。当存在葡萄糖时，其与葡萄糖类似物竞争结合位点并且取代受体分子。此时，发生较少的FRET。
在需要两个荧光样本来获得测量的情况下，除了将荧光团连接到葡萄糖结合分子之外，还可以提供不受葡萄糖浓度的影响的另一参考荧光团作为第二荧光样本。在这种情况下，如果第二荧光样本具有已知的对结果荧光的强度和相位的影响，则可以将其用作参考来计算由FRET引起的相位偏移。
在进行测量时，如果在皮肤中发现的其它荧光团在由激励光照射时发射荧光，则它们有可能会引起干扰。该附加干扰将会使得难以检测由FRET引起的相位偏移。在该情形下，优选的是，使该系统适于使得能够从参考和测量LED交替地发射两个或更多个不同调制频率的光。附加的频率优选地将处于与第一频率相似的范围。由于取决于对相位变化作出贡献的荧光团的两个或更多个因素，调制频率典型地但不一定彼此不同。在外差检测的情况下，两个振荡器之间的频率差保持恒定，使得无需另外的处理电子器件。
因为不同的荧光团每个将会具有不同的寿命，这将引起相应信号相位中不同程度的偏移。另外，每个荧光团将引起荧光信号的振幅上的不同减少。使用两个或更多个不同调制频率的光将使得能够通过信号处理和控制单元29基于荧光信号的相位和振幅中的变化而进行其它计算。在这个方面，检测振幅差所需的电路将与检测相位偏移的电路相同。馈入测量和参考电路中的每个内的相应模数转换器27、63的拍频将具有与荧光信号的强度相对应的振幅。这些数字化信号将被馈入信号处理和控制单元，以使得能够确定由FRET引起的频率偏移。对于可测量的每个附加寿命，将需要以不同频率的测量。在每个不同频率，应该在测量LED和参考LED都激活的情况下进行测量。
该系统还可以用于荧光寿命成像显微术(FLIM)。FLIM允许辨别从不同荧光材料发射的荧光，其中这些不同荧光材料展现出类似的吸收和发射特性，但是显示了荧光寿命的差别。通过测量荧光的相位偏移和其振幅减小来计算荧光寿命。在寿命图像获取中，获取若干图像，其中相位将根据在那个特定点的荧光的寿命而变化。作为FLIM结果获得的信号将受到可引起该信号的相位漂移的类似因素的影响。因此，为了将该相对寿命图像与实际寿命图像相关，参考是必要的。上述系统将能够针对该图像的每个像素或行执行如上所述的连续测量。
应当理解，在所附权利要求的范围内，可以对所述和所示的实施例进行变化和修改。

Claims (60)

1.用于测量由样本在光信号中引起的相位偏移的设备，该设备包括：
第一光源，用于沿着测量光径发射光信号，其中测量光径包括样本位置；
第二光源，用于沿着伪测量光径发射光信号，第一和第二光源被布置成交替操作；
测量电子电路，用于接收来自测量和伪测量光径的光信号，该测量电子电路被布置成提供在时间上分离的输出，其分别表示从测量和伪测量光径中的每个接收的光信号的相位，其中在使用时，由在所述样本位置的样本在测量光径中的光内引起相位偏移，使得从测量光径接收的第一光源的光的相位不同于从第一光源发射的光的相位；
参考电子电路，用于接收表示由第一和第二光源发射的光信号的相位的信号；
用于将由响应于第一光源的测量电子电路的输出表示的光相位与由参考电子电路表示的光相位进行比较，以提供表示第一测量相位差的输出，并且将由响应于第二光源的测量电子电路的输出表示的光相位与由参考电子电路表示的光相位进行比较，以提供表示第二测量相位差的输出的电路，以及基于第二测量相位差而对第一测量相位差施加校正，以校正由于由所述测量和参考电子电路引起的相位变化所导致的所述第一测量相位差的误差，以便获得由样本在第一光源的光中引起的相位偏移的改进测量的电路。
2.如权利要求1所述的设备，其中第一光源还沿着参考光径发射光信号，并且第二光源还沿着伪参考光径发射光信号，其中该参考电子电路还包括用于从参考和伪参考光径接收光信号的装置，该参考电子电路被布置成提供在时间上分离的输出，其分别表示从参考和伪参考光径中的每个接收的光信号的相位。
3.如权利要求1或权利要求2所述的设备，其中测量光径包括光束分离器，接收来自所述第一光源的光，并且朝着所述样本位置反射所述光，并且接收从所述样本位置发射的使用中的荧光发射光，并且将所述荧光发射光传送到所述测量电子电路。
4.如权利要求1或权利要求2所述的设备，其中所述测量光径包括：激励滤光器，其被布置成选择适于激励在所述样本位置的第一荧光样本的光的波长；以及，发射滤光器，适于选择从所述样本位置发射的荧光的波长。
5.如任一在前权利要求所述的设备，其中振荡器耦接到第一和第二光源中的每个，以产生振荡强度的光信号。
6.如权利要求5所述的设备，其中从振荡器输出的信号采取平滑激励脉冲的形式。
7.如任一在前权利要求所述的设备，其中通过直接数字合成来生成驱动电流，该驱动电流馈入第一和第二光源中的每个，以产生振荡强度的光信号。
8.如权利要求3到7所述的设备，其中伪测量路径包括所述光束分离器，该光束分离器被布置成接收来自第二光源的光，朝着所述样本位置反射所述光，接收从所述样本位置反射的所述光，并且将该光传送到所述测量电子电路。
9.如权利要求8所述的设备，其中伪测量光径还包括所述发射滤光器，用于选择与从样本位置发射的荧光的波长相当的光波长。
10.如权利要求3到7中的任一项所述的设备，其中来自第二光源的光不被光束分离器接收，而是被直接导向到测量电子电路。
11.如权利要求10所述的设备，其中伪测量路径还包括电光衰减器，用于减小从第二光源发射的光的强度。
12.如任一在前权利要求所述的设备，其中伪测量路径中的光不包括适于激励第一荧光样本的光的波长。
13.如任一在前权利要求所述的设备，其中从所述第一和第二光源发射的光具有相同的波长，并且伪测量路径还包括滤光器，用于消除适于激励第一荧光样本的波长的光。
14.如权利要求1到10中的任一项所述的设备，其中第一光源和第二光源发射不同波长的光，并且从第二光源发射的光不包括适于激励荧光样本的波长。
15.如权利要求3到7所述的设备，其中伪测量路径包括所述光束分离器，并且该光束分离器被布置成接收来自所述第二光源的光，朝着所述样本位置反射所述光，接收从所述样本位置发射的、使用中的荧光发射光，并且将所述荧光传送到所述测量电路。
16.如权利要求15所述的设备，其中所述伪测量光径包括：激励滤光器，其被布置为选择适于激励在所述样本位置的第二荧光样本的光的波长；以及发射滤光器，用于选择从所述样本位置发射的荧光的波长。
17.如权利要求15或权利要求16所述的设备，其中激励第一荧光样本所需的光的波长不同于激励第二荧光样本所需的光的波长。
18.如任一在前权利要求所述的设备，其中测量电子电路包括光电转换器，用于从所述测量路径和伪测量路径接收光信号，其中光电转换器输出与照明其的光的强度相对应的电信号。
19.如权利要求18所述的设备，其中光电转换器是光电倍增管，由此将偏压提供给光电倍增管，以增强与照明雪崩光电二极管的光的强度相对应的电信号。
20.如权利要求18所述的设备，其中样本电路的光电转换器是雪崩光电二极管，由此将偏压提供给雪崩光电二极管，以增强与照明该雪崩光电二极管的光的强度相对应的电信号。
21.如任一在前权利要求所述的设备，其中提供用于分别沿着参考和伪参考光径将来自第一和第二光源的光导向到参考电路的光电转换器的装置。
22.如权利要求21所述的设备，其中参考电路的光电转换器是光电二极管。
23.如任一在前权利要求所述的设备，还包括电子电路，调制在测量电路和参考电路中的每个内处理的信号，以产生表示所处理信号的相位的输出。
24.如权利要求23所述的设备，其中调制测量和参考电路中的每个内的信号的电子电路包括在测量电子电路和参考电子电路中的每个内的混频器，每个混频器耦接到另一振荡器。
25.如权利要求24所述的设备，其中从该另一振荡器输出具有从0.1到103兆赫的调制频率的信号，并且通过相应的混频器将其与测量和参考电路中的每个内的信号相组合，并且从每个所述光源输出的光的调制频率与所述调制频率相差从102到105赫的数量(外差检测)。
26.如权利要求25所述的设备，其中测量电子电路和参考电子电路每个还包括带通滤波器，其中通过带通滤波器消除来自测量电路和参考电子电路的混频器中的每个的输出的高频分量。
27.如权利要求24所述的设备，其中从该另一振荡器输出具有与从每个光源输出的光的调制频率相同的调制频率的信号，并且通过相应的混频器将其与所述测量和参考电路中的每个内的信号相组合(零差检测)。
28.如权利要求1到23中的任一项所述的设备，其中从每个光源输出的光的调制频率为10到105赫。
29.如权利要求24到28中的任一项所述的设备，其中测量和参考电子电路中的每个的光电转换器被布置成将电子信号输出到产生电压输出的放大器，相应的混频器被布置成接收所述电压输出和来自该另一振荡器的调制频率的信号，以产生表示所述输入的频率差的拍频输出，所述输出表示在光电转换器处接收的光的相位。
30.如权利要求24到29中的任一项所述的设备，其中将预定频率提供到测量和参考电路中的每个的混频器的该另一振荡器是压控晶体振荡器。
31.如权利要求24到30中的任一项所述的设备，其中通过直接数字合成来生成到测量和参考电路中的每个的混频器的预定频率。
32.如权利要求24到31中的任一项所述的设备，其中测量和参考电子电路中的每个的带通滤波器分别被布置成接收从每个混频器输出的拍频，以减少相应信号中的噪声。
33.如权利要求32所述的设备，其中测量和参考电子电路每个还包括：放大器，用于放大来自带通滤波器的经滤波信号；以及模数转换器，用于对经放大信号进行数字化。
34.如权利要求33所述的设备，其中提供了信号处理和控制单元，用于从测量电路和参考电路中的每个接收数字化输出，该信号处理和控制单元包括另一电路，用于分别比较在第一和第二光源的操作期间接收的数字化信号，并且计算由样本引起的相位变化。
35.如权利要求34所述的设备，其中将计算结果输出到显示器。
36.如权利要求34或35中的任一项所述的设备，其中信号处理和控制单元被布置成控制第一和第二光源的交替操作。
37.如权利要求34到36中的任一项所述的设备，其中信号处理和控制单元被布置成控制该另一振荡器的频率。
38.如权利要求34到37中的任一项所述的设备，其中信号处理和控制单元被布置成控制提供给雪崩光电二极管的偏压。
39.如任一在前权利要求所述的设备，其中连续地从第一和第二光源中的每个交替生成并且输出以两个或更多个不同频率调制的光，以允许进一步的计算。
40.如任一在前权利要求所述的设备，用于在葡萄糖测量系统中使用，其中样本具有荧光特性，其可以通过存在于样本中的葡萄糖浓度来调制。
41.一种测量由样本在光信号中引起的相位偏移的方法，包括以下步骤：
沿着测量光径发射第一光信号，其中测量光径包括样本位置；
沿着伪测量光径发射第二光信号，第一和第二光信号被交替地发射；
在测量电子电路中接收来自测量和伪测量光径的光信号；
从测量电子电路提供在时间上分离的输出，其中该输出分别表示从每个测量和伪测量光径接收的光信号的相位；
在参考电子电路中接收表示第一和第二光信号的相位的信号；
将由测量电子电路的输出表示并且响应于第一光信号的光的相位与由参考电子电路表示的光的相位进行比较；
提供表示第一测量相位差的输出；
将由测量电子电路的输出表示的、响应于第二光信号的光的相位与由参考电子电路表示的光的相位进行比较；
提供表示第二测量相位差的输出；
基于第二测量相位差对第一测量相位差施加校正，以校正由于由所述测量和参考电子电路引起的相位变化所导致的所述第一测量相位差的误差，以便获得由样本在第一光源的光中引起的偏移相位的改进测量。
42.如权利要求41所述的方法，还包括：
附加地沿着参考光径发射第一光信号并且沿着伪参考光径发射第二光信号；
在参考电子电路中接收来自参考和伪参考光径的光信号；
从参考电子电路输出在时间上分离的信号，该信号分别表示从参考和伪参考光径接收的光信号中的每个的相位。
43.如权利要求41或权利要求42中的任一项所述的方法，还包括：
选择用于第一光信号的光波长，其适于激励在所述样本位置的第一荧光样本；以及
选择从所述样本位置发射的荧光的波长。
44.如权利要求41到43中的任一项所述的方法，还包括产生振荡强度的第一和第二光信号。
45.如权利要求44所述的方法，还包括：
通过直接数字合成来生成驱动电流；以及
通过分别将驱动电流馈入第一和第二光源来产生所述振荡强度的第一和第二光信号。
46.如权利要求41到45中的任一项所述的方法，还包括：
在光束分离器中接收沿着伪测量路径发射的第一光信号；
朝着所述样本位置反射所述光；以及
将该光传送到所述测量电路。
47.如权利要求46所述的方法，还包括选择与从样本位置发射的荧光的波长相当的光波长。
48.如权利要求41到45中的任一项所述的方法，还包括将第二光信号从第二光源直接导向到测量电路。
49.如权利要求48所述的方法，还包括减小从第二光源发射的光的强度。
50.如权利要求41到49中的任一项所述的方法，还包括：
将在测量电子电路中接收的光信号转换为与该光信号的强度相对应的电信号；以及
输出该电信号。
51.如权利要求41到50中的任一项所述的方法，还包括将来自第一和第二光源的第一和第二光信号分别沿着参考和伪参考路径导向到参考电路的光电转换器。
52.如权利要求41到51中的任一项所述的方法，还包括调制在测量电子电路和参考电子电路的每个中处理的信号，以产生表示所处理信号的相位的输出。
53.如权利要求41到52中的任一项所述的方法，还包括从另一振荡器输出具有从0.1到103兆赫的调制频率的信号；以及
通过相应的混频器，将经调制信号与在测量和参考电路的每个中处理的信号相组合。
54.如权利要求53所述的方法，还包括通过带通滤波器消除来自测量和参考电子电路的混频器中的每个的输出的高频分量。
55.如权利要求41到52中的任一项所述的方法，还包括：
输出具有与第一和第二光信号的调制频率相同的调制频率的信号；以及
通过相应的混频器，将经调制信号与在测量和参考电子电路的每个中处理的信号相组合。
56.如权利要求53到55中的任一项所述的方法，还包括：
将来自测量和参考电子电路中的每个的电子信号输出到产生电压输出的放大器；
在相应混频器中接收所述电压输出和来自该另一振荡器的调制频率的信号；
此后产生表示所述输入的频率差的拍频。
57.如权利要求56所述的方法，还包括：在测量和参考电子电路的每个的带通滤波器中接收从每个混频器输出的拍频，以减少相应信号中的噪声。
58.如权利要求57所述的方法，还包括：
放大来自带通滤波器的经滤波信号；以及
对经放大信号进行数字化。
59.如权利要求57所述的方法，还包括：
比较分别在第一和第二光源中的每个的操作期间生成的数字化信号；以及
计算由样本引起的相位变化。
60.如权利要求59所述的方法，还包括将计算结果输出到显示器。
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