JP4798367B2 - 新規微生物、当該微生物腐食による耐食性の評価方法、当該微生物による腐食の判定方法、及び、当該微生物を用いたガス中の二酸化炭素の低減方法 - Google Patents
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Description
以上のように、嫌気条件における硫酸塩還元菌による微生物腐食は、広く知られており、その検出や存在量測定のための技術が報告されている。
また、嫌気環境に棲息する微生物生態系を構成する主要な微生物として、硫酸塩還元菌のほかに、メタン生成菌があるが、メタン生成菌を嫌気環境における腐食原因菌としては、一般的に認知されてはいない。例えば、非特許文献7には、微生物腐食の原因菌が紹介されているが、この中でメタン生成菌は、腐食原因菌として説明されていない。これは、硫酸塩還元菌の生成する硫化水素が極めて強力な腐食原因物質であるのに対して、メタン生成菌が生成するメタンは、腐食原因物質ではないことが、メタン生成菌が腐食原因菌としてみなされてこなかったことの、大きな要因として考えられる。
また、本発明の微生物を用いることにより、鉄または鉄を含む合金の微生物腐食に対する耐食性を評価することができる。
また、本発明の微生物を検出することにより、鉄または鉄を含む合金の微生物腐食の対策、防止に役立てることができる。
さらに、本微生物を使用することにより、地球温暖化ガスである二酸化炭素の削減が可能である。
(巨視的観察結果)
37℃、2週間における生育は、108 cells/mlに達する。培養4日目を経過すると、鉄表面が灰色に変化し、金属光沢が失われる。培養2週間以上では、培地に多量の炭酸鉄、水酸化鉄などの沈殿物が形成され、培地が濃い灰色に濁る。
(顕微鏡観察結果)
37℃、2週間培養における細胞の形状は、ややいびつな円形をした球菌である。直径は0.5から1.2umであり、蛍光顕微鏡観察では、メタン生成菌に特有なF420の自家蛍光を有することが認められる。
例えば、本発明の微生物を含む水を直接、鉄若しくは鉄を含む合金の表面に付着させたり、本発明の微生物を含む寒天状ゲル、スラッジ、錆、土壌などを直接、鉄若しくは鉄を含む合金の表面に付着させる方法などがある。
二酸化炭素の濃度について特に限定条件は無い。ただし、メタン生成を促進するために、二酸化炭素濃度が1%以上であることがより望ましい。二酸化炭素と混合するガスとしては、窒素やアルゴンなどを用いることができる。例えば、窒素あるいはアルゴンに対して二酸化炭素を19:1から1:1の比率の間で用いることがより望ましい。
CO2 + H2O HCO3 - + H+ 式(2)
Fe2+ + HCO3 - FeCO3 + H+ 式(3)
二酸化炭素を含むガスを、本発明の微生物と鉄または鉄を含む金属が共存する水と接触させる方法としては、例えば、二酸化炭素を含むガスを、直接この水の中に吹き込むことなどがあるが、これ以外の方法でも構わない。例えば、二酸化炭素を含むガスを微小な気泡として、この水との接触面積を増せば、効率的に二酸化炭素をこの水に溶存させ、反応を効率化するなどの方法もある。二酸化炭素の吹込みにより、水は酸性化するが、一方、二酸化炭素の還元によるメタン生成では、水はアルカリ化するため、pHの緩衝作用が期待でき、本発明の微生物の生育に良好なpHに保たれることが期待できるからである。
上記式(1)〜式(3)で記述した二酸化炭素の削減メカニズムを仮定すると、仮に一世帯で発生する二酸化炭素の一割にあたる480kgの二酸化炭素の削減を考える場合、必要な鉄の質量は1400kgとなる。
1.ゲノムDNAの単離
本発明の微生物KA1株の検体を、顆粒状鉄を唯一の電子供与体、炭酸を唯一の炭素源とした培地で37℃で14日間培養した。ついで集菌した菌体から、Zhouらの方法(Zhou, J. -Z., M. A. Bruns, and J. M. Tiedje. Applied and Environmental Microbiology 62:316-322. 1996)によりゲノムDNAを抽出した。
得られたゲノムDNAを鋳型として16S rDNAフラグメントのPCR増幅を行った。なお、PCRは、TaKaLa LA Taq (TAKARA, Japan)と以下のプライマー(ARC8F及びARC1406R) (Huber, H., M. J. Hohn, R. Rachel, T. Fuchs, V. C. Wimmer, and K. O. Stetter. Nature 417:63-67. 2002)を用いて、T-3000 Thermocycler (Biometra, Germany)上でサーマルサイクルを行った。
ARC8F: 5’-TCYGGTTGATCCTGCC-3’ (配列番号2)
ARC1406R: 5’-ACGGGCGGTGTGTRCAA-3’ (配列番号3)
SP6W: 5’-ATTTAGGTGACACTATAGAATACTC-3’ (配列番号5)
KA1株の16S rDNA塩基配列に類似する塩基配列をGenBank (GenBank/EMBL/DDBJ 国際DNA配列データベース)から検出するために、BLAST (Altschul, S. F. ら、Nucleic Acids Research 25:3389-3402, 1997)による相同検索を行った。さらに、近隣結合法 (Saitou, N. and Nei, M., Molecular Biology and Evolution 4:406-425, 1987)による分子系統樹を作製した。進化距離の算出には、木村の2変数法 (Kimura, M., Journal of Molecular Evolution 16:111-120, 1980)を用いて、各系統枝の信頼度をブーツストラップ法 (Felsenstein, J., Evolution 39:783-791, 1985)により評価した。
得られたKA1株の分子系統樹解析の結果を図1に示す。図1から、KA1株は、メタノコッカレス(Methanococcales)目、メタノコッカシアエ(Methanococcaceae)科のメタノコッカス マリパルディス(Methanococcus maripaludis)と系統枝を形成し、その枝はブーツストラップ確立100%で支持された。
1.種菌の調整
KA1株を血清ビンに顆粒状鉄を唯一の電子供与体、炭酸を唯一の炭素源とした培地で、37℃で14日間培養した。これを以下の実験に使用する種菌とした。
顆粒状鉄3.0 gを窒素雰囲気下で122 ml容血清ビンに内封し、オートクレーブ滅菌した。
気相(N2:CO2 = 80%:20%)雰囲気下で、122 ml容血清ビンに培地40 mlを無菌的に添加した。
次いで、準備した培地に上記種菌を接種し、37℃で14日間静地培養した。
培養物から数日ごとに培養液及び気相を抜き取り、培地中に溶出した鉄の量、気相に含まれるメタンの量を定量した。なお、種菌を接種していないサンプルを対照サンプルとした。
定量結果を図2から図4に示す。
1.種菌の調整
本発明の微生物KA1株を含む集積培養物を、血清ビンに顆粒状鉄を唯一の電子供与体、炭酸を唯一の炭素源とした培地で、37℃で14日間培養した。これを以下の実験に使用する種菌とした。
炭素綱片10 gを窒素雰囲気下で122 ml容血清ビンに内封し、オートクレーブ滅菌した。
気相(N2:CO2 = 80%:20%)雰囲気下で、122 ml容血清ビンに培地40 mlを無菌的に添加した。
次いで、準備した培地に上記種菌を接種し、37℃で14日間静地培養した。
炭素綱片の付着物を回収し、Zhouらの方法(Zhou, J. -Z., M. A. Bruns, and J. M. Tiedje. Applied and Environmental Microbiology 62:316-322. 1996)により、付着物よりゲノムDNAを抽出した。
得られたゲノムDNAを鋳型として16S rDNAフラグメントのPCR増幅を行った。なお、PCRは、TaKaLa LA Taq (TAKARA, Japan)と以下のプライマー(ARC344F及びARC915R) (Casamayor, E. O., H. Schafer, L. Baneras, C. Pedros-Alio, and G. Muyzer. Applied and Environmental Microbiology 66:499-508. 2000)を用いて、T-3000 Thermocycler (Biometra, Germany)上でサーマルサイクルを行った。
ARC344F: 5’-ACGGGGGYGCAGCAGGCGCGA -3’ (配列番号6)
ARC915R: 5’-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3’ (配列番号7)
SP6W: 5’-ATTTAGGTGACACTATAGAATACTC-3’ (配列番号5)
クローン化された50クローンのうち、そのすべてがKA1株の16S rDNA塩基配列と99%以上の相同性を示した。以上の結果より、腐食金属試料からDNAを抽出し、KA1株の特異的遺伝子配列をPCR法により増幅することによって、腐食試料中の菌の検出が行えることが示された。
容積125mLの密栓可能なガラス容器に、表1に記載の鉄を唯一の電子供与体、炭酸を唯一の炭素源とした培地から鉄のみを除いた耐食性評価試験液を50mL用意した。気相はN2:CO2 = 80%:20%として、この試験液中に、炭素鋼(鉄の質量含有率99%)試験片(10mm×10mm×2mm)を浸漬した。本発明の微生物KA1株を、本腐食試験液に添加した。本腐食試験液中のKA1株の初期添加濃度は3×105細胞/mLであった。37℃で14日間静置して、耐食性を評価した。尚、対照として、微生物を添加しない無菌の系でも耐食性を評価した。
以上のように、本発明の微生物を用いて、鉄を含む合金の耐食性を評価できる。
容積125mLの密栓可能なガラス容器に、表1に記載の鉄を唯一の電子供与体、炭酸を唯一の炭素源とした培地から鉄のみを除いた耐食性評価試験液を50mL用意した。気相はN2:CO2 = 80%:20%として、この試験液中に、汎用ステンレス鋼(鉄の質量含有率72%)と高耐食性ステンレス鋼(鉄の質量含有率50%)の試験片(10mm×10mm×2mm)を浸漬した。
結果を表5に示す。
以上のように、本発明の微生物を用いて、鉄を含む合金の耐食性を評価できる。
容積2Lの気密な容器に、0.2μm孔径のフィルタによりろ過して無菌化し、かつ窒素ガスによる曝気で溶存酸素濃度を0.2mg/L未満に下げた海水1Lを入れ、さらに顆粒状鉄100gを添加した。本試験液に本発明の微生物KA1株を初期濃度105 細胞/mLとなるように添加した。この試験液上部の気相部1Lに窒素と二酸化炭素の混合ガス(N2:CO2=80:20)を、大気圧下で1L充填した。本容器を密閉して、37℃で14日間、2rpmで容器ごと天地回転させた。14日後、気相部のガスを回収して、二酸化炭素分析計により気相中の二酸化炭素濃度を分析した。
試験開始前の気相と、試験後の気相中の二酸化炭素濃度を表6に示す。
以上の結果より、本発明の微生物KA1株を用いることにより、二酸化炭素を含むガスから二酸化炭素を削減できる。
孔径0.45μm孔径のフィルタで濾過して滅菌した海水1m3に、鉄粉を10kg添加した。この海水中に10体積%の二酸化炭素を含むガスを吹き込むことにより、海水中の溶存酸素濃度を0.2mg/L未満にした。また、海水のpHを6以上8.3以下の範囲に、希釈した塩酸及び希釈した水酸化ナトリウムを加えて維持した。さらにこの海水中に、本発明の微生物KA1株を初期濃度104細胞/mLとなるように添加した。また、対照として、本発明の微生物を添加しない無菌系でも試験した。
処理前と処理後のこの二酸化炭素を含む牌ガスの二酸化炭素濃度を表7に示す。
Claims (6)
- メタノコッカレス(Methanococcales)目メタノコッカシアエ(Methanococcaceae)科に属する受託番号NITE BP−252で特定される微生物。
- 請求項1に記載の微生物を、鉄若しくは鉄を含む合金と接触させ、又は鉄若しくは鉄を含む合金を有する水中に存在させて、当該鉄または鉄を含む合金を腐食させた後、当該腐食量を測定して、前記鉄または鉄を含む合金の前記微生物に対する耐食性を評価することを特徴とする微生物腐食による耐食性の評価方法。
- 前記腐食量の測定を、2種類以上の鉄又は鉄を含む合金について行い、それぞれの腐食量の測定結果を比較して、前記2種類以上の鉄又は鉄を含む合金それぞれの前記微生物に対する耐食性を相対的に評価することを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- メタンの生成量を測定することによって前記腐食量を測定することを特徴とする、請求項2又は3に記載の方法。
- 請求項1に記載の微生物と鉄又は鉄を含む合金とを含む水に、二酸化炭素を含むガスを接触させ、前記二酸化炭素を含むガス中の、二酸化炭素濃度を低減させることを特徴とするガス中の二酸化炭素の低減方法。
- 請求項1に記載の微生物を、鉄または鉄を含む合金と接するあるいはこれらを含む水中に存在させた水のpHを6以上8.3以下に維持することを特徴とする、請求項5に記載の方法。
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