JP4790620B2 - 新規な鎮痛性化合物，これを含有する抽出物及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は鎮痛性を有する新規化合物及びこれを含有する抽出物に関する。該化合物はバリングトニア(Barringtonia)属の植物から得られる。

バリングトニアは，サガリバナ科に含まれる植物の中で最大の属を成し，アジア，マレーシア及び太平洋の熱帯地方に広く分布する［１］。

バリングトニアは，２ｍから２５ｍを超える範囲の大きさの木又は低木である。４種が北オーストラリアに存在することが知られており［２］，そのうちの３種，Ｂ．ラセモサ［（Ｌ．）シュプレンク］(B. racemosa [(L.) Spreng])，Ｂ．カリプトラタ［（ミエトルス）Ｒ．Ｂｒ．ｅｘ バイレイ］(B. calyptrate [(Mietrs.) R. Br. ex Bailey])，及びＢ．アシアチカ［（Ｌ．）クルツ］(B. asiatica [(L.) Kurtz])は，北クイーンズランド由来のもののみが知られている。第４のオーストラリアの種であるＢ．アクタンギュラ［（Ｌ．）ガエルトン］(B. acutangula [(L.) Gaertn])は，より広い分布を有し，北クイーンズランドから北西オーストラリアに至る北オーストラリア全域に見出されている。バリングトニア・アクタンギュラは，更に２つの亜種，Ｂ．アクタンギュラ亜種アクタンギュラ，及びＢ．アクタンギュラ亜種スピカータ(spicata)に分けられる［１］。後者はバリングトニア分布エリアの至る所で見つかるが，前者は北オーストラリアに制限される。

それらの分布範囲の全体にわたって，多くのバリングトニア属植物が地元住民によって種々の方法で使用されてきた。バリングトニア属植物の一般的な用途の１つは魚毒としてである［２〜５］。いくつかの種，例えばＢ．アクタンギュラ［２〜４，６〜１１］，Ｂ．スペシオサ(speciosa)［５］，Ｂ．ラセモサ［２，３，１０〜１２］，Ｂ．アシアトリカ［２，３，５，１０，１１］及びＢ．カリプトラタ［１０］が魚毒として報告されている。この木の果実及び樹皮が魚毒としてよく使用されるが［２，３，５〜１２］，他のいくつかの植物器官，例えば葉［８，１１］，根［４，８，９，１１］，種子［２，９，１０，１２］及び木部［１２］も使用されている。いくつかの種の葉，果実及び種子は食用であることが知られている［３，９，１２〜１５］。

バリングトニア属植物の他のいくつかの特性及び用途が報告されている。これらは，Ｂ．ラセモサのタンニン酸の存在によるなめし剤としての［３，１２，１６］，及び，ニコチンの約半分の活性であると報告されている殺虫剤としての［１２，１６，１７］使用を含んでいる。バリングトニアの果実は野生のブタを毒殺するために使用されてきた［１２］。Ｂ．ラセモサの種子に加えてＢ．アシアチカの果実は自殺及び「．．．殺人を意図した．．．」投与のために使用されており［１１，１２］，ココナッツミルクが解毒剤となる。これらの毒性は，Ｂ．アシアチカの核の中で高濃度で存在することが実証されている，ＨＣＮの存在によるかもしれない［１１］。

バリングトニア属植物の多くは伝統薬として広範囲な用途が見出されてきており，Ｂ．アクタンギュラの果実は「ナースフルーツ」と呼ばれてきた［６］。この植物の全ての部分が使用され，内用及び外用の両方で投与されてきた。製剤の調製は，乾燥及び粉末化，熱水又は冷水による抽出，加熱や搾汁を含む［３，１１，１２，１６，１８］。外用としては，想像がつくように，皮膚病に対して注目される傾向がある。一般的な傷，リューマチ，湿疹，潰瘍，疥癬，輪癬，白癬，掻痒，炎症及びハンセン病などの病気が，バリングトニア属植物で治療されてきた［３，１１，１２，１６，１８］。粉末化した種子が，頭痛を緩和する吸入薬として使用されてきており，また，加熱した種子は芳香性で，疝痛及び分娩を助けるために使用されてきた［３］。眼炎，胸の風邪及び疼痛，喘息，熱，疝痛，鼓腸，非性病性狭窄，咽喉痛，及び胃痛を和らげる外用の用途も報告されてきた［３，６，１１，１２，１６，１８］。

バリングトニアの一般的な内用の用途は，下痢，赤痢及び胃痛の緩和のための，催吐剤，去痰剤，緩下剤としてのものである［３，６，８〜１２，１６，１８，１９］。ある種の製剤は苦味強壮薬として摂取され［３，８，９，１１，１８，１９］，Ｂ．ラセモサの種子は虫下しとして摂取される［１８］。

魚毒として，バリングトニア属植物，特にＢ．アクタンギュラ［４］は，オーストラリアにおいて広範囲に使用されたが，バリングトニア属植物が存在する他の地方と比較して，この植物は医薬としてほとんど活用されなかったようである。オーストラリア人の中では，バリングトニア抽出物は，傷，おでき，そして水痘のような皮膚疾患に対して（Ｂ．ラセモサ及びＢ．アクタンギュラ），胸痛及び熱に対して（Ｂ．カリプラタ），眼炎，疝痛，出産において，また嘔吐を引き起こすため（Ｂ．アクタンギュラ）に使用されてきた［１０，１１，１６，１８］。バリングトニア属植物の用途のより詳細な説明は文献に見出し得る（例えば［３，１２，１８］）。

バリングトニア属植物の薬用植物としての広い伝統的用途を考えると，生理活性成分の化学的性質がほとんど注目されていなかったことは驚くべきである。

Ｂ．インシングニス(insingnis)，Ｂ．ブリーセイ(vriesei)及びＢ．ラセモサ中のサポニン様配糖体の存在は，早くも１８９８年に実証された（［６］に報告された）。続いて，１９０１年には，サポニンがＢ．スペシオサから単離され，これは加水分解によりグルコース及びバリングトゲニン(barringtogenin)を生じた（［６］ではＢ．スピノサ(spinosa)としてその種を報告しているが，［２０］に報告されている）。同じ著者が，更に別のサポゲニン，すなわちバリングトゲニチン(barringtogenitin)の存在を報告した。ノゾエ(Nozoe)はＢ．アシアチカの種子からＡ_１−バリニン(barrinin)及びＡ_１−バリゲニン(barrigenin)を単離し，続いてＡ_１−バリニンのサポニンがグルコン酸，ｄ−グルコース，ｄ−ガラクトース及びメチルペントースを含むことを報告した［２１，２２］。Ａ_１−バリゲニンのアルカリ加水分解により，チグリン酸及び新しいアグリコン，Ａ_１−バリゲノール(barrigenol)が得られた［２３］。また，Ａ_１−バリゲニンのアセチル化により，別のアグリコン，Ａ_２−バリゲノールが単離された［２３］。

サポニンの高濃度の存在は，Ｂ．アクタンギュラ及びＢ．ラセモサの種子，葉及び樹皮由来のものについて報告された。また，３つのサポゲニンが同定された［２０］。後に続いた研究の多くは，これらのサポニン類を単離し性質を特徴づけることを目的としたものであった。

１９５５年にコール他(Cole et al.)［２４］によって最初に割り出されたＡ_１−バリゲノールの構造を，図１に示す。

１９５０年代には，出版物の数によって証拠づけられるように，サポニン及びサポゲニンに対する興味が増加し，主に分解技術を使用して，構造が割り出され，改定された。Ａ_１及びＡ_２−バリンゲノールの後，バリングトニア属植物から単離された第１のサポゲニンは，Ｂ．ラセモサの果実から単離されたバリングトゲノール及びバリングトゲン(barringtogenic)酸であり［２５］，その構造は図２に示されている。

バリングトニア・アクタンギュラは，新規なサポニン及びサポゲニンの源であり続けた。再び，この種の果実から，一連の化合物，バリングトゲノールＢ，Ｃ，Ｄ及びＥが単離され，それらの構造が調べられた［８，２６〜３４］。

バリングトゲノールＣは，Ｂ．アクタンギュラ果実から単離され，化学技術によりその構造が既に記載したように割り出された（図４）（例えば［８，２６，２７，３１〜３４］）。

更に，バリングトゲノールＤは，やはりＢ．アクタンギュラ果実から単離され，バルア他(Barua et al.)によって記述され［２６］，構造はチャクラボルティ(Chakraborti)とバルアによって提示された［２９，３０］（図５）。

バリングトゲノールＥは，Ｂ．アクタンギュラの枝木から単離され，質量スペクトルと化学情報を用いて構造が割り出された（図６）［８，２８］。バリングトゲノールＥがおそらく自然から単離されたトリテルペン安息香酸塩の最初の例であることが注目された［８，２８］。

Ｂ．アクタンギュラから単離された他の化合物は，図７に示すようにタンギノール(tanginol)を含み［８，３５，３６］，図８に示すようにバリン酸(barrinic acid)を含む［３７］。

更に，いくつかの化合物がＢ．アクタンギュラから単離され，それらの構造が部分的にＮＭＲを使用して割り出された。これらはバリゲン(barrigenic)酸，バリン酸の１９β異性体（果実）［３６］及びアクタングル(acutangulic)酸及びタングル(tangulic)酸（葉）（図９）［３８〜４０］を含む。

１９９１年になって初めて［４１］，Ｂ．アクタンギュラ由来の手付かずのサポニンの構造が公表された。スペクトルと化学的データにより，その構造が導かれ，２α，３β，１９α−トリヒドロキシ−オレアン−１２−エン−二酸２８−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドとして割り出された（図１０）［４１］。

この構造が公表された直後に，同じグループが，Ｂ．アクタンギュラ由来の更に３つのサポニンの完全な構造，バリングトシド(barringtosides)Ａ，Ｂ及びＣを公表した（図１１）［４２］。

このバリングトニア属植物は，広範囲の病気に対して薬用植物として使用されてきたが，単離されたトリテルペンのいずれについても生物活性に関する情報を突き止めることができなかった。しかしながら，トリテルペン類が，いくばくかの抗炎症作用を有することは知られている（例えば［４３，４４］）。バリングトニアの樹皮の収斂性は，やはり抗微生物作用を有することが知られている（例えば［４５］）タンニン酸の存在によるものとされてきた［１６，１８］。皮膚傷，傷及び他の皮膚疾患に対する調合剤としてバリングトニア属植物が一般的に使用されるのは，これらのタンニン類の存在によるものかもしれない。これらの木由来の調合剤によって引き起こされる，報告されている効果は，ステロイドの活性（例えば抗炎症剤，抗喘息，抗リューマチなど）により説明することができ，バリングトニア属植物由来の抽出物中のβ−及び（−シトステロール及びスチグマステロール−３β−Ｏ−Ｄ−グルコシドの存在は，これらの活性のいくつかを説明するものかもしれない。また，サポニンが広範囲の生物活性を示すことも有名であり，その多くは，より早期に概説された（例えば［４６，４７］），観察された薬理作用を説明するものとなり得るものであった。

前の議論から明白なように，バリングトニアのこれまでの研究で見つかった化合物の主要な群は，サポニン類である。サポニン類は，植物及びより低級な海洋生物に広く認められる二次代謝産物の重要なクラスである。調査されたすべての植物のおよそ７９％がサポニンを含むことが報告された［４８］。更に，サポニンが植物によって防御剤として生産されることが提示された［４８］。更に多くのサポニンがより低級な海洋生物から単離されるであろうが，今のところ，門棘皮動物門，特にナマコ（ナマコ綱）及びヒトデ（ヒトデ亜綱）から単離されている［４６］。

サポニン類は３つの主成分，トリテルペン，ステロイド又はステロイダルアルカロイドのようなアグリコン（ゲニン又はサポゲニン），１つ以上の糖鎖，一般にＤ−グルコース，Ｄ−ガラクトース，Ｄ−グロクロン酸，Ｄ−ガラクツロン酸，Ｌ−ラムノ−ス，Ｌ−アラビノース，Ｄ−キシロース及びＤ−フコース，及び場合によりアンゲリカ酸及びチグリン酸のような酸からなる［４６，４７，４９］。サポニン類は，更にアグリコンに付けられる糖鎖の数により，モノ−，ジ−又はトリ−デスモシド類(desmosides)に分類される［４７］。

サポニン類の溶血性，軟体動物殺傷性及び魚類殺傷性は，よく特性が明らかにされており，植物及び動物抽出物の生物学的指標に基づく分画における検定技術としても利用されてきた（例えば［４７，４８，５０，５１］）。しかしながら，溶血性についてはさまざまであるか，又はまったく存在しない場合もあり，また，軟体動物殺傷性は，サポニンの構造に多少依存する［４６，４７］。想像がつくように，サポニン類の生物学的及び薬理学的性質については，多くの発表があり，それらの例は［４６，４７］に見ることができる。

鎮痛活性は少数のサポニン類において実証された。下記は鎮痛効果があることが見出されたサポニン類のうちのいくつかの例である。酢酸ライジングテストを用いて，バルバトシド(barbatoside)Ａ（ＥＤ_５０ ９５ｍｇ／ｋｇ）及びＢ（ＥＤ_５０ ５０ｍｇ／ｋｇ）といったダイアンサス・バルバタス(Dianthus barbatus)由来のクアイル酸(quaillic acid)の配糖体類が，アセチルサリチル酸（ＥＤ_５０ １２５ｍｇ／ｋｇ）よりも活性が高いことが示された［５２］。ドリコス・ファルカタス(Dolichos falcatus)由来のサポニン調合剤を５ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ｉｐ）注射すると，マウスを５５℃に曝露することにより惹起した疼痛に対して，著しい鎮痛効果を生じることが示された［５３］。更に，プラチコドン・グランディフロラム(Platycodon grandiflorum)の抽出物は，２ｇ／ｋｇの服用量で皮下（ｓｃ）注射された時，マウスにおいて鎮痛効果を引き起こした［５４］。その活性成分のうちの１つがプラチドディン(platicodin)であると記載され，また，マウスが受けた服用量は１６０ｍｇ／ｋｇと同等であった。効果は１００〜２００ｍｇ／ｋｇのアスピリンに匹敵した。パナクス・ノトジンセン(Panax notoginseng)由来の総合サポニン調合剤の注射（ｉｐ，１００〜２５０ｍｇ／ｋｇ）は，モルヒネ及びｌ−テトラヒドロパルマチンより速効で短時間作用性であることが分かり，アミノピリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）に匹敵するものであった［５５］。サポニン調合剤が鎮静剤効果を引き起こし，睡眠誘導におけるペントバルビタールのＥＤ_５０を減少させ，チオペンタール誘導睡眠を延長させ，そしてＣＮＳ抑制においてクロルプロマジンとの相乗効果を示した［５５］ことも注目された。多くのダイアノシド類(dianosides)が，ダイアンサス・スペルバス変種ロンギカリシナス(Dianthus superbus ver. longicalycinus)［５６〜５８］から単離され特徴づけされた。ダイアノシドＡ及びＢは，１０及び３０ｍｇ／ｋｇ（ｓｃ）で，酢酸により惹起した苦痛を有意に抑制することが見出され，ダイアノシドＢの方がより強い効力を有していた［５６］。マエサ・チサ変種アウグスチフォリア(Maesa chisa var. augustifolia)から得られた配糖体分画についての薬理学的効果の詳細な試験において，ゴメス他(Gomes et al.)［５９］は，とりわけマウスにおけるライジングテストでの鎮痛効果を実証した。酢酸で引き起こされた苦痛において５２％の抑制を示したのとは対照的にｐ−フェニルキノノンで誘導された苦痛においては３３％の抑制が観察された。ちなみにアスピリンは，ｐ−フェニルキノン誘導の苦痛を８５％，酢酸誘導の苦痛を８０％阻害した。挙尾現象が無いこと，そして加熱板試験及びテイルフリック試験のいずれにおいても活性が欠如していることは，その配糖体分画によって生じた鎮痛が麻薬によって生じるそれとは異なるものであったことを示唆している。

発明の要約
本発明の一態様は，決して最も広義のものではないが，下記式（Ｉ）

式中：
Ｒ_２は水素原子，Ｏ−ベンゾイル，Ｏ−チグロイル，又は

であって，ここで，Ｒ_５及びＲ_７は各々独立して，ベンゾイル，チグロイル又は３−Ｏ−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリルから選択され；
Ｒ_３は水酸基，Ｏ−アセチル，Ｏ−イソブチリル，Ｏ―ベンゾイル又はＯ−チグロイルであり；
Ｒ_４はＣＨ_２ＯＨ又はＣＨ_２ＯＣＯＣＨ_３ であり；
Ｒ_６は水素，又は

であり，
ただし，ａ）Ｒ₁は水素原子であり，
Ｒ_２が次式

で表される基を表し，Ｒ _６ が次式：

で表される基であるとき，
Ｒ _３ がＯ−アセチルであり，Ｒ _４ がＣＨ _２ ＯＨであり，Ｒ _５ がベンゾイルであり，且つＲ _７ が３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリル又はベンゾイルであるか；
Ｒ _３ がＯ−アセチルであり，Ｒ _４ がＣＨ _２ ＯＨであり，Ｒ _５ がチグロイルであり，且つＲ _７ が３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリルであるか；
Ｒ _３ がＯ−アセチルであり，Ｒ _４ がＣＨ _２ ＯＨであり，Ｒ _５ が３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリルであり，Ｒ _７ がチグロイルであるか；又は
Ｒ _３ が水素原子であり，Ｒ _４ がＣＨ _２ ＯＣＯＣＨ _３ であり，Ｒ _５ がベンゾイルであり，且つＲ _７ がベンゾイル又は３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリルであり；
ｂ）Ｒ _２ が次式：

であり，Ｒ _６ が水素原子であるとき，
Ｒ _１ が水素原子であり，Ｒ _３ がＯ−アセチルであり，Ｒ _４ がＣＨ _２ ＯＨであり，Ｒ _５ がベンゾイルであり，且つＲ _７ が３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリルであり；
ｃ）Ｒ _２ がＯ−ベンゾイル，Ｒ _６ が次式：

であるとき，
Ｒ _１ が水素原子であり，Ｒ _３ がＯ−イソブチリル，Ｏ−ベンゾイル又はＯ−チグロイルであり，且つＲ _４ がＣＨ _２ ＯＨであるか；
Ｒ _１ が水素原子であり，Ｒ _３ が水酸基であり且つＲ _４ がＣＨ _２ ＯＨ又はＣＨ _２ ＯＣＯＣＨ _３ であるか；又は
Ｒ _１ がメチルであり，Ｒ _３ がＯ−ベンゾイル又はＯ−チグロイルであり，且つＲ _４ がＣＨ _２ ＯＨであり；
ｄ）Ｒ _２ がＯ−チグロイルであるとき，Ｒ _１ は水素原子又はメチルであり，Ｒ _３ はＯ−チグロイルであり，Ｒ _４ はＣＨ _２ ＯＨであり，Ｒ _６ は次式：

であり；そして
ｅ）Ｒ _２ が水素原子のとき，Ｒ _１ は水素原子であり，Ｒ _３ はＯ−ベンゾイルであり，Ｒ _４ はＣＨ _２ ＯＨであり，Ｒ _６ は次式：

を表す化合物；もしくはそれらの薬理学的に許容される塩類を提供するものである。

「アルキル」は，１〜１８個の炭素原子を有する直鎖，分岐鎖，環状及び二環式構造，又はそれらの組み合わせを表す。限定を目的としないアルキル基の例として，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，ブチル，ｓ−及びｔ−ブチル，ペンチル，ヘキシル，ヘプチル，オクチル，ノニル，ウンデシル，ドデシル，トリデシル，テトラデシル，ペンタデシル，シクロプロピル，シクロブチル，シクロペンチル，シクロヘキシル等が挙げられる。より好ましくは，アルキル基は，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，ブチル，ｓ−及びｔ−ブチル，ペンチル及びヘキシルから選択される。

「アルケニル」は１〜７個の炭素原子を有する不飽和の直鎖構造又は分岐鎖構造，ならびにそれらの組み合わせを意味する。限定を目的としないアルケニル基の例としては，エテニル，プロペニル，イソプロペニル，ブテニル，ｓ−及びｔ−ブテニル，ペンテニル，ヘキセニルが挙げられる。

「アルカノイル」は，１〜８個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖構造のアルカノイル基を意味する。好ましくは，アルカノイルは，アセチル，プロピオノイル，ブチリル，イソブチリル，ペンタノイル及びヘキサノイルから選択される。より望ましいアルカノイルは，アセチル，プロピオノイル，ブチリル及びイソブチリルから選択される。

「アルケノイル」は，アルケニルが上記に定義されたものである，アルケニルカルボニルを意味する。好ましくは，アルケニルはペンテノイル，ヘキセノイル又はヘプテノイルから選択される。より好ましくは，アルケニルはペンテノイル（チグロイル）(tigloyl)又はヘキセノイル（アンゲロイル）(angeloyl)から選択される。

「ベンゾイルアルキル置換されたアルカノイル」の語は，少なくとも１つのベンゾイル及び少なくとも１つのアルキルで置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ１〜Ｃ６アルカノイルを意味するものとして用いられ，ここで，ベンゾイルは，直鎖又は分岐鎖Ｃ１〜６アルキルに結合する。好ましくは，ベンゾイルアルキル置換されたアルカノイルはベンゾイルメチルイソブチリルである。

「複素環の」は，１〜４個のヘテロ原子を有する非芳香族環を意味し，ここで，環は単独であるか，又は０〜４個のヘテロ原子を含有する３〜７員の脂環式の環，アリール及びヘテロアリールから選択される第２の環に融合するものであり，前記ヘテロ原子は，各々独立にＯ，Ｎ及びＳから選択される。限定を目的としない複素環の例としては，ピロリジニル，ピペリジニル，ピペラジニル，モルホリニル，テトラヒドロフラニル，イミダゾリニル，チオモルホリニル等が挙げられる。

「アリール」は，１〜３個のベンゼン環を含む６〜１４員炭素環式芳香族環系を意味する。２つ以上の芳香族環が存在する場合，環はともに融合され，隣接した環は共通の結合を共有するようになっている。例としては，フェニル及びナフチルが挙げられる。アリール基は，各々独立にハロゲン，アルキル又はアルコキシから選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよい。

ここで使用される語「ヘテロアリール」は，Ｏ，Ｓ及びＮから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する単一の環を含む５〜１０員芳香族環系を表す。ヘテロアリールには，フラニル，ジアジニル，イミダゾリル，イソオキサゾリル，イソチアゾリル，ピリジル，ピロリル，チアゾリル，トリアジニル等が含まれるが，これらに限定されない。

好ましくは，Ｒ _２ が次式：

であり，Ｒ _５ 及びＲ _７ はベンゾイルを表すか，Ｒ _５ がベンゾイル又はチグロイルを表し且つＲ _７ が３−ベンゾイル−２−メチルブチリルを表すか，Ｒ _５ が３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリルを表し且つＲ _７ がチグロイルを表す。

好ましくは，式（Ｉ）の化合物は下記から選択される；
ａ． ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−［３−Ｏ−（３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリル）−４−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｌ−アラビノピラノシル］−２２−Ｏ−アセチルバリングトゲノールＣ；
ｂ． ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−ベンゾイルバリングトゲノールＣ；
ｃ． ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−ベンゾイル−２８−Ｏ−アセチルバリングトゲノールＣ；
ｄ． ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−ベンゾイル−２２−Ｏ−イソブチリルバリングトゲノールＣ；
ｅ． ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−メチルグルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−ジベンゾイルバリングトゲノールＣ；
ｆ． ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−ジベンゾイルバリングトゲノールＣ；
ｇ． ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−メチルグルクロノピラノシル−２１−Ｏ−ベンゾイル−２２−Ｏ−チグロイルバリングトゲノールＣ；
ｈ． ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−ベンゾイル−２２−Ｏ−チグロイルバリングトゲノールＣ；
ｉ． ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−メチルグルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−チグロイルバリングトゲノールＣ；
ｊ． ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−チグロイルバリングトゲノールＣ；
ｋ． ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−デオキシ−２２−Ｏ−ベンゾイルバリングトゲノールＣ；
ｌ． ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−［３，４−ジ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｌ−アラビノピラノシル］−２２−Ｏ−アセチルバリングトゲノールＣ；
ｍ． ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−［３，４−ジ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｌ−アラビノピラノシル］−２８−Ｏ−アセチルバリングトゲノールＣ；
ｎ． ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−［３−Ｏ−（３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリル）−４−Ｏ−チグロイル−α−Ｌ−アラビノピラノシル］−２２−Ｏ−アセチルバリングトゲノールＣ；
ｏ． ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−［３−Ｏ−チグロイル−４−Ｏ−（３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリル）−α−Ｌ−アラビノピラノシル］−２２−Ｏ−アセチルバリングトゲノールＣ；
ｐ． ３−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−［３−Ｏ−（３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリル）−４−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｌ−アラビノピラノシル］−２２−Ｏ−アセチルバリングトゲノールＣ；もしくは，
ｑ． ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−［３−Ｏ−（３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリル）−４−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｌ−アラビノピラノシル］−２８−Ｏ−アセチルバリングトゲノールＣである。

ここで使用される「薬理学的に許容可能な塩類」は，全身投与に対して毒物学的に安全な塩類を意味する。薬理学的に許容可能な塩類は，アルカリ及びアルカリ土類，アンモニウム，アルミニウム，鉄，アミン，グルコサミン，コリン，硫酸塩，硫酸水素塩，硝酸塩，クエン酸塩，酒石酸塩，酒石酸水素塩，リン酸塩，炭酸塩，重炭酸塩，リンゴ酸塩，マレイン酸塩，ナプシル酸塩，フマル酸塩，琥珀酸塩，酢酸塩，テレフタル酸塩，パモ酸塩，櫛状のｓ−メチルメチオニン塩類ピペラジン(pectinate and s-methyl methionine salts piperazine)等を含む群から選択され得る。

本発明の別の態様は，バリングトニア属の，好ましくはバリングトニア・アクタンギュラ種の植物又は植物の一部から抽出された式（Ｉ）の化合物を１つ以上含む組成物である。植物の一部としては，果実，種子，樹皮，葉，花及び木部が挙げられる。好ましくは，植物の一部は樹皮，花及び葉から選択される。より好ましくは，植物の部分は樹皮である。

本発明の他の態様は，有効量の１つ以上の式（Ｉ）の化合物と薬理学的に許容される担体を含む，痛みの治療及び／又はコントロールのための医薬組成物にある。

剤形としては，錠剤，分散剤，懸濁剤，注射剤，溶液，シロップ，トローチ，カプセル，坐薬，エアゾール，経皮的なパッチ等が挙げられる。これらの剤形には，更に，特に，医薬組成物を調節して放出することを企図した，もしくはそのために適応させた注射又はインプラント装置を含む。治療薬の調節された放出は，例えば，該組成物を，アクリル樹脂，ロウ，高級脂肪族アルコール，ポリ酢酸及びポリグリコール酸，及びヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなある種のセルロース誘導体といった，疎水性ポリマー類でコーティングすることにより達成してもよい。更に，調節された放出は，他のポリマーマトリックス，リポソーム及び／又はミクロスフェアの使用により達成してもよい。

また，全身投与用の薬理学的に許容される担体を，本発明の組成物に組み入れてもよい。

適切には，医薬組成物は薬理学的に許容される賦形剤を含む。「薬理学的に許容される賦形剤」は，全身投与において安全に使用され得る固体又は液体の充填剤，希釈剤又はカプセル化材料を意味する。特定の投与経路によって，当該分野でよく知られる種々の担体を使用し得る。これらの担体又は賦形剤は，糖類，デンプン類，セルロース及びその誘導体，麦芽，ゼラチン，タルク，硫酸カルシウム，植物油，合成油，多価アルコール類，アルギン酸，リン酸塩緩衝液，乳化剤，等張の食塩水，及び発熱物質を含まない水を含む群から選択され得る。

適切な投与経路はどのようなものでも，患者に本発明の医薬組成物を与えるために採用され得る。例えば，経口，直腸，非経口，舌下，口腔，静脈内，関節内，筋肉内，皮内，皮下，吸入，眼内，腹腔内，脳室内，経皮等が採用され得る。

投与に適する本発明の医薬組成物は，粉末又は顆粒として，又は水性液体，非水性液体，水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョン中の溶液もしくは懸濁液として，薬理学的に活性な本発明の化合物の１つ以上を所定量含むバイアル，カプセル，包袋又は錠剤のような個別的な単位で提供されてもよい。そのような組成物はいかなる調剤方法によって調合されてもよいが，方法はすべて，１つ以上の本発明の薬理学的に活性な化合物を，１つ以上の必須成分を組成する担体と結合させる工程を含む。一般的に，該組成物は本発明の薬剤を，液体担体又は微細に分散された固体担体又はその両方と均一かつ緊密に混合し，それから必要に応じて，生成物を成形して所望の外形とすることにより調製される。

式（Ｉ）の，及び本発明の組成物の活性化合物は，痛みを治療及び／又はコントロールするのに十分な量で存在する。式（Ｉ）の化合物，及びこれを含有する医薬組成物の適切な投与量は，当該分野の技術者により容易に決定され得るが，約０．００２ｍｇ／ｋｇから５．０ｍｇ／ｋｇ程度であり得る。

本発明の更に別の態様によると，痛みの治療及び／又はコントロールのための薬剤の製造における，式（Ｉ）の１つ以上の化合物の使途が提供される。

実験セクション
セクションＡ 疼痛検定
ホルマリン検定
ホルマリン検定は，ラット又はマウスの前後方の足への少量のホルマリンを皮下注射することを含み，この注射に対する行動的反応が疼痛反応の指標として記録される。この方法の変法が，ドゥビッソン(Dubuisson)及びデニス(Dennis)［６０］により記載されており，行動的反応がラット及びネコの両方について詳述された。これとは別に，生じた疼痛は，最初に非常に強く，鋭く，刺すようであり，燃えるようであることが記載され，標準疼痛診断項目で３／５を占めた。約４，５分後に，この強烈な疼痛は，定常的で脈動的な疼痛となり，これは注射部位に軽い圧痛を残して，３０〜６０分間をかけて徐々に消失した［６０］。

ホルマリン検定は，いくつかの理由から，この研究のために選択された。第１に，最も重要なこととして，この検定法は，「Ｐａｉｎ」のようなジャーナルでしばしば報告されており，倫理的な問題点が克服されていることを示すものであろう。検定において観察された２つの明確な相が，痛覚の２つの明確な相を反映していることも実証された。第１相は，早期又は急性相で，ホルマリンの注射直後に始まり，約３〜５分持続する。この段階は痛覚受容器の直接の化学的刺激であると考えられる。この初期相に続き，最小活動期間が１０〜１５分間続く。続いて，第２の，後期又は持続相が始まり，２０〜４０分間続く。早期及び後期の両相で示される反応は，モルヒネ，コデイン，ネフォパム及びオルフェンダリン(orphendarine)のような既知の鎮痛剤を使用して減少させることができる［６１］。後期相は，インドメタシン及びナプロキセンのような非ステロイド性の抗炎症性化合物，及びデキサメサゾン及びヒドロコルチゾンのようなステロイド類の両方によって影響を受けた（例えば［６１］）。興味深いことに，アスピリン及びパラセタモールは，ホルマリン試験の両相において，投与量に依存する形で鎮痛性を呈することが示された［６１］。

この検定をいくつかの箇所で実行する場合，ホルマリン濃度を含め，実験対象及び注射部位を考慮する必要がある。

鎮痛剤としてモルヒネ及び他の目的化合物を使用して，雄のマウスについてホルマリン検定を行い，マウスにおける疼痛反応を測定する手段としてのこの検定の実行可能性及び信頼度を吟味した。

方法及び材料実験の対象 体重２５〜３５ｇのオスのクェッケンブッシュ(Quackenbush)マウスを使用した。それらを，コロニーケージ（４００×３００×１３０ｍｍ；ワイヤテナーズ(Wiretainers)社製）に収容し，エサ（標準のラット／マウス用ペレット；ノルコ・フィード(Norco Feed)社製）及び水に自由に接近できるようにした。短期間収容については，１つのケージ当たり最高１５〜１６匹のマウスが収容され，より長い期間については，この数が，１つのケージ当たり１０匹未満のマウスに減らされた。床敷材は，かんな屑又はより一般には再生紙のペレット（ブリーダーズ・チョイス(Breeders Choice)社製）とした。

１２時間の明暗サイクルを０６：００時に明かりを点ける動物飼育設備において継続した。行動におけるいかなる日内変化も最小限にするために，試験はすべて明相の間に行った。設備の温度は２１℃に，湿度は４５から６５％の間に維持した。

新規に得た動物は，試験のために使用する前に，最低２日間，該飼育設備に収容した。

試験化合物
ホルマリン（アジャックス(Ajax)社製）は，保存料として１０％のメタノールを含む約３７．５％のホルムアルデヒド溶液として供給した。この保存溶液は，水で１：２０に希釈し，２％のホルムアルデヒド溶液（５％のホルマリン）とし，痛覚刺激剤として使用した。

塩酸モルヒネは，タスマニア・アルカロイズ・プロプライエタリーリミテッド(Tasmanian Alkaloids Pty. Ltd.)の一部門であるエクスタル(Extal)のご厚情により寄贈され，滅菌等張（０．９％）食塩水により希釈して適切な濃度とした。

試験方法
試験用の専用部屋がなかったため，試験は全て週末に研究所で，前記飼育設備における明相の最初の時間に合うように行った。これらの時間は，研究所の他の従業員による試験中の妨害を最小限にし，且つ，その日の時間による反応におけるあらゆる変動を最小限にするために選択した。

マウスは試験の少なくとも１時間前に研究所へ運ばれた。続いて，マウスを空のコロニーケージに個別に入れた。それらは観察部屋としても機能した。マウスはその環境を探索させるために更に３０分間放置された。この間，及び試験の間，食物又は水は利用可能としなかった。

モルヒネ及び他の目的化合物は，ホルマリン投与の３０分前に１０ｍＬ／ｋｇの量で腹腔内（ｉｐ）注射された。最小限に拘束して，２０μＬのホルマリン溶液を，右後足の背面に皮下（ｓｃ）注射した。マウスをケージに戻し，直ちに観察を始めた。記録された唯一の挙動反応は，５分の区画当たりに動物が注射された足又は脚部を噛む又は舐めるのに費やす時間量であった。各動物は，試験に一度だけ使用し，その後ＣＯ_２により安楽死させた。

結果−対照
この検定が文献に匹敵する結果を与えるかを確認するために，２つの対照実験を実施した。更にバックグラウンドとして，グルーミング動作が記録された。このデータは，マウスが両方の後ろ足を噛むか舐めるかに費やした時間量として記録され，平均値を正常なグルーミングバックグラウンドとした（図１２）。マウスは，これらの観察用のために，生理食塩水をｉｐ投与した。

図１２は，マウスがそれらの後足のグルーミングに費やす時間が５分毎に約４秒であることを示している。この時間にはいくらか小さな幅があったが，これらの値は有意ではなく，したがって更なる計算に含めないことが決定された。

第２の対照実験では，等張の食塩水のｉｐ注射が用いられ，続いて３０分後にホルマリンの注射を行った。この対照実験の結果を図１３に示す。以前の研究者により報告された反応の特徴的な二相性（例えば［６１］）を図１３に示す。

この手法の有効性を確認するために行われた最終対照実験は，モルヒネについての用量反応曲線を構築することを目的とした。モルヒネの４用量，３ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８），６ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７），９ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６）及び１２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）を採用した。総実験時間にわたる鎮痛活性の計算が，鎮痛剤としての抽出物を評価するために要求された。痛覚刺激反応についての急性及び持続相の間に認められたあらゆる相違に留意した。全実験時間（４５分）について実験と対照における疼痛の持続を比較することが必要であった。

対照動物において疼痛反応を示すのに費やされた総時間は，４５１±２８秒

であった。この値を用いて，疼痛抑制パーセンテージが，下記式を使用して計算され得る。
疼痛反応（％）＝（１−反応時間（秒）／対照時間）×１００
＝（１−反応時間（秒）／４５１）×１００
ここで反応時間は，目的の化合物を投与した後に見られる４５分間にわたって記録された平均疼痛反応時間である。全実験時間についてのモルヒネの用量反応曲線を，図１４に示す（ＥＤ_５０＝４．８ｍｇ／ｋｇ）。

既に，モルヒネの効果は，ホルマリン分析における，早期すなわち急性相に於いてよりも，後期すなわち持続相に於いて，より大きくなることが示されている。４〜５ｍｇ／ｋｇの間のモルヒネのおおよそのＥＤ_５０値が，マウスにおける急性相について報告されているが，持続相についてはモルヒネの２〜３ｍｇ／ｋｇが必要とされている（例えば［６２］）。全実験時間については，皮下投与のモルヒネで，４．８ｍｇ／ｋｇというＥＤ_５０値が与えられ［６３］，また，ほとんど完全な鎮痛性が，６ｍｇ／ｋｇで誘導されたことが注目された［６４］。本研究で得られた結果は，同様の傾向を示した。

要約
要約すると，このホルマリン検定は信頼性が高く，実行するのが容易であることが見出され，最小数の実験対象から十分な情報をもたらした。検定の対照の結果は，他の研究者のものと遜色の無いものであった。この方法はＩＳＡＰ［６５，６６］，及びグリフィス(Griffith)大学動物実験倫理委員会(GUECEA)の倫理ガイドラインに適合するものである。

セクションＢ バリングトニアからの本発明の化合物の単離
イントロダクション
バリングトニアからの粗抽出物及び分画を，マウスホルマリン検定を用いて，疼痛抑制における有効性に関して試験した。

サポニンの単離及びその後の特性評価には精巧な技術を用いることが要求される。サポニンの精製は，後述する多くの方法により達成されるが（例えば［６７〜６９］），一般的には下記を含む（図１５）。すなわち，水性アルコール（メタノール又はエタノール）での抽出，これに先行する又はこれに続く脱脂工程，溶剤の除去及び残留物の水飽和ｎ−ブタノールへの懸濁である。この段階に於いて，サポニンは，ジエチルエーテルで沈殿させることができるが，この工程は省略してもよい。続いて，残留物をクロマトグラフィーにかける。この最後の工程は，セファデックスＬＨ２０，シリカ，ジオール又は逆相（Ｃ８及びＣ１８）クロマトグラフィーなどのいくつかの技術を単独で又は組み合わせて含み得る。向流クロマトグラフィー及びその変法（ＤＣＣＣ，ＲＬＣＣ，ＣＰＣ）の技術は，サポニンの単離においても適用できることが見出されている。

クロマトグラフィーの技術を使用するサポニンの単離に関連する大きな問題は，ＵＶ検出用の適切な発色団の不足である。ＲＩ，質量検出の使用により，及び誘導体化とＵＶ検出により，これらの問題を克服することができるが，これらの技術の各々は，さまざまなところで議論されているそれら固有の長所及び難点を有する［６７］。

しかしながら，精製を導くために生物検定を用いることで，使用される単離方法が決定され得る。このセクションは，バリングトニア・アクタンギュラの樹皮の水抽出物からいくつかの純粋なサポニンの単離に結びつく方法を記載する。

実験一般的な方法及び材料
前記のように，マウスホルマリン検定を実行した。検定結果は，対照と比較した疼痛反応の抑制率（％）（セクションＡを参照）として報告した。

特記しない限り，溶剤及び試薬はすべてＡＲ等級であった。純水（ｄｄＨ_２Ｏ）（パームチット(Permutit) オーストラリア)，導電率＜０．０７：Ｓ／ｃm)をすべての分離において使用した。高純度の（オムニソルブ(Omnisolve)社製，ＥＭサイエンス(EM Science)）メタノール（ＭｅＯＨ）及びアセトニトリル（ＭｅＣＮ）をすべての分析的なＨＰＬＣ分離のために使用し，ＡＲ等級のＭｅＯＨ及びＨＰＬＣ等級のＭｅＣＮを，セミ分取及び分取処理のために使用した。水を含め，すべての溶剤は，使用の前にろ過した（０．４５μｍのナイロン，アクチボン(Activon)社製）。

バリアン(Varian)社製の２００ＭＨｚ（ジェミニ(Gemini)２００），４００ＭＨｚ（ユニティ(Unity)），５００ｍＨｚ（ユニティ・イノヴァ(Unity Inova)）又は６００ＭＨｚ（ウルトラ・シムズ(Ultra Shims)を取り付けたユニティ・イノヴァ）システムを使用し，重水素化した溶剤（ＣＤ_３ＯＤ，ＣＤ_５Ｎ，ｄ_６−ＤＭＳＯ）を使用して，ＮＭＲを行った。少量の試料しか利用できない場合は，Ｄ_２Ｏ又はＤＭＳＯに合わせたシゲミ(Shigemi)社製のＮＭＲチューブ（３又は５ｍｍ）を，より濃縮された試料をＮＭＲに提供するために使用した。化学シフトはすべて百万分率（ｐｐｍ）で報告した。標準のバリアンのパルスシークエンスをすべての実験のために使用した。

低解像度エレクトロスプレー質量分析法（ＬＲ−ＥＳＭＳ）を，ウォーターズ(Waters)６００ＨＰＬＣシステムに接続されたフィソンズ(Fisons)社製のＶＧプラットフォームＬＣＭＳ上で実行した（メタノール，流量０．９ｍＬ／ｍｉｎ）。スペクトルは，コーン電圧（±５０Ｖ，±１００Ｖ，±１５０Ｖ及び±２００Ｖ）の範囲で，陰イオン及び陽イオンの両方のモードで集め，マスリンクス(MassLynx)ソフトウェアを使用して分析した。高分解能ＥＳＭＳ（ＨＲ−ＥＳＭＳ）は，クイーンズランド，タウンズビル(Townsville)の，オーストラリア海洋科学研究所(Australian Institute of Marine Science)で実行された。この装置は，アナリティカ・オブ・ブランフォード(Analytica of Branford)（ブランフォード(Branford)，コネチカット，米国）の外部エレクトロスプレー源を備えたブルカー(Bruker)社（ビレリカ(Billerica)マサチューセッツ，米国）製のバイオアペックス(BioApex)４７ｅＦＴＭＳであった。この装置は，試料注入の前に，ポジティブ及びネガティブモードで較正され，分子量は５ｐｐｍ以内で報告された。

植物材料
植物試料は，バリングトニア・アクタンギュラ（Ｌ．）ゲトルン亜種アクタンギュラ(Barringtonia acutangula(L.)Gaetrn spp. acutangula)であると確認され，証書はクイーンズランド植物標本館に提出された（＃ＡＱ５９５３５１）。この木は北オーストラリアにわたって見つかるが，このプロジェクトで使用された試料は，北西オーストラリアのキンバリー(Kimberley)地区から集められた。この木からの樹皮の最初のコレクションは１９８９年７月１４日に作られ，また，その後のコレクションは１９９４年に作られた。同様の特性を保証するために，収集は，同じエリアで，及びその年の同時期に行われた（１９９４年７月１８日）。花と葉の少量の試料も入手した。

Ｂ．アクタンギュラの花は小さく，更なる研究に十分な材料を供給するためには多数必要であった。この木の花は，洪水となり収穫が困難となる雨季に咲く。したがって，それ以上，収集は不可能であり，花に存在する活性については，研究が待たれる状態のままである。大量の樹皮が，初期の収集から入手でき，そこから活性の存在が実証された。したがって，この研究は，樹皮中の鎮痛活性を特徴づけることを目標とした。

樹皮は，与える損傷を最小にして，木の連続した成長を保証するような方法でそのエリアに住んでいる原住の人々によって木から剥がされた。樹皮試料は最高温度５０℃で，空気乾燥又はオーブン乾燥した。乾燥試料は粗粉末に粉砕し，粉末化試料は，抽出に使用するまで室温で気密容器に貯蔵した。

少量の花及び葉の試料は，乾燥し，粉末化し，樹皮と同様の方法で貯蔵した。

植物材料の抽出
乾燥し，粉末化した樹皮を，約１０倍容量（ｗ／ｖ）の脱塩水（ｄＨ_２Ｏ）に数時間浸漬した。生じた混合物を，複数層のモスリンで濾過し，遠心分離し（ダモン社ＩＥＣディビジョン(Damon IEC Division)ＤＰＲ６０００，４５００ｇ，４５分），上清を凍結乾燥した（ヴィルティス(Virtis)フリーズモバイル(Freezemobile)１２）。乾燥した抽出物は，気密容器に４℃で貯蔵した。

花（０．２５ｇ）及び葉（１．３５ｇ）は，樹皮の水抽出と同様の方法の中でｄＨ_２Ｏで抽出した。

いくつかの方法を，樹皮Ｈ_２Ｏ抽出物を分画化するために使用したが，それらを以下に記載する。

方法１
検定若しくは更なる精製のために，水抽出物をｄｄＨ_２Ｏ中に再溶解させた。かなりの量（〜３０％）は溶解しないまま残ったが，遠心分離（ソルバール(Sorvall)ＲＣ５Ｂ Ｐｌｕｓ，１２，０００ｇ，２０分間）によって除去し，続いて濾過（０．４５μｍのナイロン，アクチボン）を行った。必要な場合は，該抽出物のＨ_２Ｏ不溶部分を懸濁液として検定に供した。

Ｈ_２Ｏに加えて，いくつかの代替溶剤を使用し，また，これらの抽出物からの濾液（０．４５μｍのナイロン，アクチボン）を続いて検定に供した。代替溶剤としては，ＭｅＯＨ，ＣＨＣｌ_３，ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ_３（１：９），ＭｅＯＨ：トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ，０．５％），酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ），１％のアンモニア溶液（ＮＨ_４ＯＨ），ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などが挙げられた。Ｈ_２Ｏ不溶性部分のアセチル化，加水分解及び音波破砕について以下に記載する。抽出物は前述のように検定に供された。

方法２
方法１のように調製された，乾燥した水抽出物を，１％のアンモニア溶液（アジャックス）に溶解し，遠心分離（ソルバールＲＣ５Ｂ Ｐｌｕｓ，１２，０００ｇ，２０分間）にかけて，全ての不溶性物質（〜２２％）を除去した。上澄みを，ＴＳＫＨＷ４０Ｓカラム（下記参照）にかけ，１％のＮＨ_４ＯＨを用いて５ｍＬ／ｍｉｎで溶出した。最初は，水を移動相として使用したが，少量のアンモニアが，より鋭い，良好な分離のピークを生じることがわかった。抽出物がカラム上に沈殿することに起因するあらゆる問題を最小限にするために，水抽出物を移動相に溶解させた。得られたクロマトグラムから，最初にＴＳＫ−１，ＴＳＫ−２，ＴＳＫ−３，ＴＳＫ−４及びＴＳＫ−５とラベルされた５つの分画を収集した。しかしながら，ＴＳＫ−５からＴＳＫ−４を一定して分離するのに困難が生じたため，これらの分画の両方をＴＳＫ−４ａとしてプールすることにした。抽出物は，既に記載したように検定に供された。

ゲル浸透カラムで活性な分画（ＴＳＫ−４ａ）をＭｅＯＨに溶解し，ろ過し（０．４５μｍのナイロン，アクチボン），分取Ｃ１８カラム（下記参照）にかけた。該カラムは，ｄｄＨ_２Ｏ中のＭｅＯＨのステップ勾配（０，３５，７０及び１００％のＭｅＯＨ）により溶出し，得られたクロマトグラムにより分画を収集した。

方法３
このセクションの中で利用された方法は，全ての点で方法２に類似している。唯一の違いは分取Ｃ１８クロマトグラフィーのために使用されたステップ勾配にある。ここでは，ステップ勾配は，ｄｄＨ_２Ｏ中のＭｅＯＨ（０〜１００％のＭｅＯＨ）の増分１０％から成る勾配が使用された。

方法４
この方法では，ゲル浸透ステップの必要性を無視して，水抽出物をＣ１８分取カラムに直接かけた。水抽出物を，ｄＨ_２Ｏに溶解し，遠心分離（ソルバール社製ＲＣ５Ｂ Ｐｌｕｓ，１２０００ｇ，２０分間）にかけ，上澄みを，Ｃ１８分取カラム（下記参照）にかけた。カラムは方法３のように溶出された。

活性分画の分離
粗製の活性分画から純粋な化合物を分離するために使用される方法を個別に開発した。分離を容易にするために使用されるカラムとしては，Ｃ１８，Ｃ８，ジオール及びフェニル基結合シリカなどが挙げられた。適切な移動相としては，ＭｅＯＨ，ＭｅＣＮ，イソプロパノール（ｉ−ＰｒＯＨ），ヘキサン，ＥｔＯＡｃ，Ｈ_２Ｏ，０．０１ＭのＨＡｃ及び１％のＴＦＡなどが挙げられた。一般的に，使用される手法として，Ｃ８又はＣ１８のカラム，及びＭｅＯＨ又はＭｅＣＮの，Ｈ_２Ｏ又は１％のＴＦＡによる勾配から始めた（初期の分離は，０．０１ＭのＨＡｃを使用した）。異なるカラム（例えば，フェニル基又はジオール）を使用することが必要になるまで方法の修正がなされ，最上限の分離及び分別を提供するために該処理を繰り返した。各分画のために採用された方法は，結果と検討のセクションの，適切な箇所で議論される。

クロマトグラフィー
分析及びセミ分取クロマトグラフィー
セミ分取及び分析クロマトグラフィーを，フォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ９９６），オートサンプラー（７１７ｐｌｕｓ）及びフラクションコレクターを備えたウォーターズ社６００ＨＰＬＣシステムを使用して実行した。クロマトグラフィーの情報は，ミレニアム(Millenium)社製の２０１０クロマトグラフィーマネージャーソフトウェア（バージョン２．１０）を使用して，集められ，保存された。

分析的なクロマトグラフィーは，ダイナマックス(Dynamax)カラムを用い，２つのフォーマットのうちの一方において実行された。逆相（Ｃ１８又はフェニル基）カラムは，４．６×２５０ｍｍ（８μｍの不揃いシリカ，６０Åの孔径，１ｍＬ／ｍｉｎ），又は４．６×５０ｍｍ（「ショート・ワンズ(Short Ones)」，３μｍの球状シリカ，６０Åの孔径，１ｍＬ／ｍｉｎ）のいずれかであった。同様に，セミ分取クロマトグラフィーは，１０×２５０ｍｍ（８μｍの不揃いシリカ，６０Åの孔径，４ｍＬ／ｍｉｎ）又は１０×５０ｍｍ（「ショート・ワンズ」，３μｍの不揃いシリカ，６０Åの孔径，４ｍＬ／ｍｉｎ）のいずれかである逆相（Ｃ１８又はフェニル基）カラムを使用して実行された。分析及びセミ分取クロマトグラフィーのために使用された溶剤はすべて，ヘリウムを噴霧することにより脱気させた。

分取クロマトグラフィー
大規模分取クロマトグラフィー（ゲル浸透及びＣ１８−シリカ）は，拡張フローキットを備えたギルソン(Gilson)（モデル３０３ポンプ，８０４圧力モジュール）又はウォーターズ６００ＨＰＬＣシステムのいずれかを使用して実行された。両方のシステムとも，ＵＶ検知器（２５４ｎｍ，吸光度モード）（エルマ・オプチカル・ワークス(ERMA Optical Works)ＥＲＣ７２１５），フラクションコレクター（イスコ・フォクシー(ISCO Foxy)又はウォーターズ），及びチャートレコーダー（オムニスクライブ(Omniscribe)シリーズＤ５０００）又はインテグレーター（Ｃ−Ｒ６Ａ クロマトパック(Chromatopac)，シマズ(Shimadzu)）のいずれかに接続した。

ゲル浸透クロマトグラフィーは，４９×３５０ｍｍのガラスカラム（ビューチ(Buchi)社製）（流量５ｍＬ／ｍｉｎ，４分分画）内において，ＴＳＫＨＷ４０Ｓ充填剤（メルク(Merck)）を使用して実行した。

Ｃ１８シリカ分取クロマトグラフィーは，２６×２３０ｍｍのガラスカラム（ビューチ）（流量 １２．５ｍＬ／ｍｉｎ）を使用して実行し，分画は得られたクロマトグラムによって集めた。研究の初期の段階の間は，分離は研究所で調製したＣ１８−シリカ充填剤を使用して行い，一方，後期の分離は，Ｃ１８−ダビシル(Davisil)（オールテック(Alltech)社製）充填材料が使用された。Ｃ１８シリカの調製については，以下に記載する。

初期の分取クロマトグラフィーに用いるＣ１８シリカの調製
全ての処理は，乾燥した窒素雰囲気の下で行なわれた。トルエン（ＡＲ等級，アジャックス社製）はナトリウムワイヤーで乾燥され，蒸留され，ナトリウムワイヤー及び３Åシーブ（アジャックス社製）上で貯蔵された。ＭｅＯＨ及びジクロロメタン（ＤＣＭ）は，蒸留され，３Åシーブ上に貯蔵された。乾燥トルエン（４００ｍＬ）及び乾燥したシリカゲル（２００ｇ，４０〜６３μｍ，メルク）を使用してスラリーを作り，これに，オクタデシルトリクロロシラン（４０ｍＬ，フルカ(Fluka)）を加え，その混合物を２４時間撹拌した。このスラリーを，ブフナー漏斗(Bucher funnel)で続いて濾過し，生成物を各々４００ｍＬの乾燥トルエン，乾燥ＭｅＯＨ及び乾燥ＤＣＭで連続して洗浄した。最後に，この末端非キャップＣ１８シリカ生成物を，３７℃で２４時間乾燥した。末端キャップは，末端非キャップＣ１８シリカを４００ｍＬの乾燥トルエンに懸濁し，４０ｍＬのトリメチルクロロシラン（フルカ）を加え，その混合物を２４時間放置することにより行った。最終生成物は，更に２４時間，３７℃で乾燥する前に，４００ｍＬの乾燥トルエン及び４００ｍＬの乾燥ＤＣＭで連続的に洗浄した。

水抽出物の不溶性成分のアセチル化
水抽出物の水不溶性部分の試料１ｇを，５ｍＬの乾燥ピリジン（ナトリウムワイヤー上で還流，４Åシーブ上に貯蔵）に添加した。その混合物を０℃に冷却し，１ｍＬの無水酢酸を加え，該混合物は室温（ＲＴ）で一晩撹拌した。氷（１〜２ｇ）を，反応を止めるために加えた。その混合物を，酢酸エチル（２５ｍＬのｄｄＨ_２Ｏ及び２５ｍＬの酢酸エチル）で分液した。有機相は，各々１０ｍＬの１Ｍ ＨＣｌ，ｄｄＨ_２Ｏ，飽和ＮａＨＣＯ_３，そして再びｄｄＨ_２Ｏで連続的に洗浄した。最後に，有機相をＮａ_２ＳＯ_４又はＭｇＳＯ_４で乾燥し，溶剤は蒸発乾燥させた。

水抽出物の不溶性成分の塩基加水分解
この処理の概略図を図１６に示す。活性な水不溶性の水抽出物の部分の試料（０．５ｇ）を２０ｍＬの０．５ＭのＮａＯＨに添加し，１時間撹拌し，続いて遠心分離にかけた（１２０００ｇ，１５分間）。濾液が透明になるまで，ペレット（３６０ｍｇ）をｄｄＨ_２Ｏで繰り返し洗浄した。このペレットの一部（３３０ｍｇ）をＤＣＭ２０ｍＬで抽出し，前記のように遠心分離にかけ，ペレット（３２０ｍｇ）を回収した。そのペレット（１００ｍｇ）を２ＭＮａＯＨ１０ｍＬに添加し，２時間還流し，一晩冷却した。その混合物を，ＤＣＭ（２０ｍＬ）及びｎ−ブタノール（２０ｍＬ）で連続的に分液し，溶剤を真空下で蒸発させた。水相のｐＨを１Ｍ ＨＣｌで７に調節した。再び，水相を，ＤＣＭ及びｎ−ブタノールで連続的に分液し，溶剤は真空下で除去した。最後に，水相を１ＭのＨＣｌで酸性（ｐＨ１）にし，ＤＣＭ及びｎ−ブタノールで分液し，また，溶剤は前記のように除去した。水相中に残る溶剤も，真空下で除去した。すべてのステップから得た試料を，活性の検定に供した。

水抽出物の不溶性成分の酸加水分解
酸加水分解のための操作は，塩基加水分解のために概説された操作に準拠する。活性な，水不溶性の水抽出物の一部を，塩基加水分解処理と同様に処理し，ペレットの一部（１００ｍｇ）を，図１６に概説したような酸加水分解にかけた。

水抽出物の不溶性成分の超音波処理
活性な不溶性材料の試料を，水中で音波粉砕した（２０ｋＨｚ，３００Ｗで１０分間）。可溶性材料及び不溶性材料の両方を分析した。

結果と検討
水抽出物の鎮痛効果を試験し，続いて活性の原因である化合物を精製し，特徴づけることを目的とする。

花と葉
花及び葉の水抽出物は，各々花抽出物が１２．８ｍｇ及び葉抽出物が１３９．６ｍｇであり，それらは前記したホルマリン検定に使用した。検定の結果を図１７に示す。

花の活性は，５ｍｇ／ｋｇにおいて非常に高かったが（〜７０％の抑制），葉は同じ投与量で活性が低かった（〜１８％の抑制）。

方法１
粉末化した樹皮をｄＨ_２Ｏで抽出し，粗水抽出物（９．８％）を得た。その粗水抽出物を，１０ｍｇ／ｍＬ／ｋｇの濃度でｄｄＨ_２Ｏに溶解し，前記のように鎮痛性について検定した。これらの結果は図１８で見ることができる。

図１８より，対照（セクションＡ参照）と比較すると，この抽出物が疼痛反応をかなり減少（７８％）させたことが明らかである。ホルマリン検定によって測定したところでは，疼痛反応がかなり減少し，急性段階に限定されることも認められ得る。しかしながら，この抽出物が粒状物質を含んでおり，該抽出物の総重量の約４０％であったことが注目された。この懸濁液はろ過され，可溶性及び不溶性材料を１０ｍｇ／ｍＬ／ｋｇの投与量で別々に検定した。鎮痛性が，可溶性物質（４５％）より不溶性物質（６６％）においてより高いことがわかった。しかしながら，抽出物の水溶性の部分でより顕著なものであったが，両方の場合において，検定の持続相において疼痛反応が観察された（図１８）。

水抽出物の，活性な水不溶性部分のアセチル化により，活性が６６％から２８％の疼痛抑制に減少した。従って，これは活性成分の分離において有用な技術であるとは証明されなかった。

これらの結果によると，活性のかなりの量が，水に不溶性であるようである。種々の溶媒を用いて，不溶性成分樹皮から活性を抽出する試みがなされた（表１）。全ての抽出物は，既に記載したように，１０ｍｇ／ｍＬ／ｋｇで検定された。

メルクインデックス(Merck Index)には，ＤＭＳＯが抗炎症作用を有しており，鎮痛剤として提示されており，化合物の吸収を増強するために浸透性担体として使用されていることが記載されている。ＤＭＳＯ抽出物は凍結乾燥されたが，常にいくらかの残留ＤＭＳＯが残った。したがって，残留ＤＭＳＯが検定に干渉したかどうかを判断することが重要であった。高い投与量が用いられたが（５％），ＤＭＳＯは疼痛反応を５７％減少させることがわかった。したがって，あらゆる干渉を回避するために，ＤＭＳＯはそれ以降のいかなる抽出についても取り上げられなかった。したがって，表１からわかるように，水抽出物は，マウスホルマリン分析において，少なくとも他の溶剤からの抽出物と同じくらい活性であった。他の溶剤による追加の抽出を行うことはできなかったので，水抽出物での鎮痛性の活性を特徴づけることが決定された。

この時，水溶性抽出物及び水不溶性抽出物の両方の用量反応曲線を作成し，結果（図２０）を比較することが決定された。これらの結果から，疼痛反応を５０％減少させるのに必要な抽出物の量（ＥＤ_５０）が，約３６ｍｇ／ｋｇ（可溶性）及び５ｍｇ／ｋｇ（不溶性）であることがわかる。これらの結果は，抽出の容易さと相俟って，更に精製する努力を水溶性材料に集中させる決定を支持した。

方法２
この方法は，水溶性抽出物の分取ゲル浸透分離を含むものであった。最初に，５つの分画が集められ，出発物質であるＨ_２Ｏ抽出物に対して，下記の平均収率が得られた。ＴＳＫ−１：０．４％，ＴＳＫ−２：１５％，ＴＳＫ−３：２３％，ＴＳＫ−４：０．７％，ＴＳＫ−５：２０％及び不溶性部分（２２％）。分画ＴＳＫ１〜５は，１００ｍｇ／ｋｇの粗水溶性等価物の投与量で（即ち，該ＥＤ_５０の約２．５倍）で検定され，結果は表２に見ることができる。

疼痛反応の最も大きな明白な減少は分画２（７４％）で認められたが，これは物質を１５．８ｍｇ／ｋｇ必要とした。対照的に，分画４では，疼痛反応を３１％抑制するのに０．７ｍｇ／ｋｇの物質が必要とされ，分画４が分画２よりおよそ１０倍強力だったことを示唆した。しかしながら，ＴＳＫ−４として溶出した小さなピークは，しばしばＴＳＫ−５のはるかにより強いピークによって不明瞭になった。したがって，ＴＳＫ−５からの分画ＴＳＫ−４の分離は，一定しないことがわかり，後の分離では，それらが集められ，ＴＳＫ−４ａと名づけられた。出発物質としてのＨ_２Ｏ抽出物に対して，下記の平均収率が得られた。ＴＳＫ−１：１．７％，ＴＳＫ−２：２３％，ＴＳＫ−３：２０％，ＴＳＫ−４ａ：１６％及び不溶性な部分（１７％）（図２１）。

この時点で，用量反応曲線が，分画ＴＳＫ−４ａについて作成された（図２２）。このグラフから，この抽出物のＥＤ_５０が約１．８ｍｇ／ｋｇであることが示された。これは，全精製処理を経ての鎮痛性が，樹皮の粗水溶性抽出物の３０倍程度であることを示す。

活性分画（ＴＳＫ−４ａ）の更なる分離は，Ｈ_２Ｏ中，０，３５，７０及び１００％のＭｅＯＨのステップ勾配を用いた分取Ｃ１８カラムによる溶出によって達成された。クロマトグラムの結果を図２３に示す。

この分画はクロマトグラムによって確認されて集められ，真空下で乾燥され，検定された。出発物質ＴＳＫ−４ａに対して下記の収率が得られた。０％−ＭｅＯＨ：５４％，３５％−ＭｅＯＨ：１７％，７０％−ＭｅＯＨ：２．４％，１００％−ＭｅＯＨ：０．７％及び不溶性部分２．２％。分析に使用された投与量は，３ｍｇ／ｋｇのＴＳＫ−４ａと等価な量（即ち，ＥＤ_５０の約２倍）であった。検定の結果は表３に示される。

これらの結果はカラムから溶出されたすべての分画の中で活性を示すものであったが，０％で溶出された活性は他の分画と比較して小さかった。（７０％のメタノールで溶出した分画がマウスを鎮静させたが，他の分画はそうではなかったことは，興味深く，注目すべきである）。更に各分画を分離する試みにより，予期されたことであるが，各分画がまだ多数の化合物を含むことを示された。

方法３
分画ＴＳＫ−４ａで実証された活性を分離するために分取Ｃ１８シリカカラムを使用して，勾配のステップ数を４から１１に増加した（１０％の増分，Ｈ_２Ｏ中の０〜１００％のＭｅＯＨ）。クロマトグラムの結果は，図２４に示され，ＴＳＫ−４ａ出発物質を基にした収率は，０％−ＭｅＯＨ（Ｆ０）：６１．５％，１０％−ＭｅＯＨ（Ｆ１０）：３．６％，２０％−ＭｅＯＨ（Ｆ２０）：３．２％，３０％−ＭｅＯＨ（Ｆ３０）：２．９％，４０％−ＭｅＯＨ（Ｆ４０）：２．６％，５０％−ＭｅＯＨ（Ｆ５０）：１．６％，６０％−ＭｅＯＨ（Ｆ６０）：０．９％，７０％−ＭｅＯＨ（Ｆ７０）：２．４％，８０％−ＭｅＯＨ（Ｆ８０）：０．２％，９０％−ＭｅＯＨ（Ｆ９０）：０．１％，１００％−ＭｅＯＨ（Ｆ１００）：０．２％及び不溶性部分３．１％であった。

再度，各分画を検定した。結果は表４に見ることができる。これらの分析の結果は，抽出物の％抑制率／ｍｇを基にした，最も強力な分画は，７０，８０及び９０％のＭｅＯＨで溶出されたものであることが示された。

しかしながら，これらの分画の各々が，まだ多数の化合物を含み，この方法によって得られた収率では，更なる分析に見合う純粋な化合物を供給するのには不十分であることがすぐに明らかになった。単離ステップの間の累積的なロスが低い収率に帰着したことが疑われた。したがって，Ｃ１８上の直接クロマトグラフィーによる大規模処理を行って，更なる分画化のために大量目的物を得た。

方法４
ほとんどの活性が，移動相として７０，８０及び９０％のＭｅＯＨを使用して，Ｃ１８カラムから溶出されたことが証明された。したがって，ゲル浸透ステップは省略され，また，水溶性の抽出物は遠心単離とろ過によって全ての不溶性部分を除去した後に，Ｃ１８分取カラムに直接かけた。クロマトグラムの結果を，図２５に示す。

この方法を使用して実行された最初の分離は，研究所で製剤されたＣ１８シリカを使用し，一方，後の分離は，市販品として入手可能なＣ１８充填材料（オールテック・ダビシル）を使用して実行された。両方の充填材料を使用して得られた収率の比較を，表５に示す。

予め決定されたように，使用する動物の数を最小限にするために，鎮痛活性についてそれ以上の試験は行わなかった。したがって，この工程から溶出された各々の分画の活性は確認されなかった。しかしながら，Ｈ_２Ｏ中の７０，８０及び９０％のＭｅＯＨでＣ１８カラムから溶出された分画に活性がある場合は，より低い濃度であるとしても，それより前の分離段階が省略されたとしても，活性成分が同じ分画に見出されると考えてよいことになることに留意されたい。研究において，分取Ｃ１８カラムからＨ_２Ｏ中のＭｅＯＨの７０，８０及び９０％で溶出したこれらの分画を調べ続けたのは，この根拠によるものであった。全ての分画の予備的^１Ｈ−ＮＭＲにより，集められた分画中の主な化合物がサポニン類とタンニン類であることが示唆された。タンニン類は，低濃度のＭｅＯＨで溶出した分画で検出されたが，サポニン類はより高いＭｅＯＨ濃度でＣ１８カラムから溶出される傾向があった。最初に，この研究を，７０，８０及び９０％でＭｅＯＨで溶出した分画に限定することが決定されていた。しかしながら，多くの化合物がこれらの各分画に存在することが明白になった。

集めた分画の番号付けの概要
今回の研究で集められた分画及び化合物を確実に同定するために，次の番号付け方式が採用された。最初の３つの数字は，Ｃ１８分取カラムから元の分画を溶出したメタノールのパーセンテージを示す。残りの数字は，続いての分画化において集められたピークを示す。これは，図２６に，分画Ｆ７０．２．５．２について，図式的に示されている。

７０％のメタノールで溶出された分画（Ｆ７０）
７０％のＭｅＯＨで溶出した分画（Ｆ７０）を，ＭｅＯＨ：１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）勾配を使用して，Ｃ１８セミ分取カラム（２５ｃｍ）で更に分離した。ＴＦＡはクロマトグラム中のピークを鋭くするために移動相に加えた。このプロジェクトにおける初期段階の分離では，単一波長の検出器及びチャート記録計を使用し，分離能を改善するために酢酸（０．０１Ｍ）を使用した。しかしながら，残余の酢酸を除去することが残余のＴＦＡを除去することよりも困難だったことがわかった後は，ＴＦＡを後の分離のために選択した。この時点で，フォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）を使用することの利点が明らかになった。従来のＵＶ検出器は，通常，単一の波長で分離をモニターすることができる。しかしながら，ＰＤＡは，いくつかの波長で同時に分離をモニターすることができた。例として，図２７に示されるクロマトグラムを参照する。一般的に，サポニン類はＵＶ発色団を有さず，２１０ｎｍに近接する波長で，より検出されやすい。しかしながら，２３３ｎｍで高い吸光度をもたらし得ることがわかった。実際，抽出物のある分離については，抽出物中に存在するサポニン類がＵＶ活性な発色団を含んでいたことを示しており，２５４ｎｍで適切に観察することができた。図２６は，分離のために使用された条件で，示された３つの波長を使用して，抽出物が，５つの別個の分画へ抽出物を分離され得ることを示す。勾配条件を変えてもピークを更に分離する結果は得られず，したがって，更なる精製ステップに適用するものとして，これらの５つのピークを集めた。表６に，得られた収率，及びこの時点では純粋な化合物が単離されなかったことを示す予備的^１Ｈ−ＮＭＲの結果を示す。

分画Ｆ７０．２
分画Ｆ６０からのかなりのキャリーオーバが存在することを^１Ｈ−ＮＭＲが示唆したので，分画Ｆ７０．１は更に調査されなかった。移動相中のＭｅＯＨのパーセンテージを変化させることによりＦ７０．２（２５ｃｍのＣ１８）を分離することを試みたが，分画Ｆ７０．２を更に分離する結果とはならなかった。移動相を，アセトニトリル（ＭｅＣＮ）：１％のＴＦＡ混合物に変えると，よりうまくいくことがわかり，１％のＴＦＡ中の４０％のＭｅＣＮでの無勾配操作では，この分画を８つのピークに分離する結果となった（図２８及び表７）。

予備的^１Ｈ−ＮＭＲにより，分画Ｆ７０．２．３，Ｆ７０．２．４，Ｆ７０．２．６及びＦ７０．２．７がほぼ単一の化合物であり，同一の条件を使用してクロマトグラフィーを繰り返すことにより，構造の解明を始めるために十分な材料となる純粋な化合物が得られた。しかしながら，そのままでは，ｄ_６−ＤＭＳＯ中のＮＭＲ試料は，少量の不純物を含んでいることが分かった。これは，おそらく乾燥で完全には除去されなかった残余のＴＦＡにより，化合物に幾ばくかの少量の加水分解が生じていることを示唆した。存在した少量の不純物は，構造の解明に障害とならず，また，得られた純粋な化合物の量が少なかったので，不純物を除去する試みはそれ以上行わなかった。２２０，２３３及び２５４ｎｍで記録された分画Ｆ７０．２．６のクロマトグラフ純度を表すクロマトグラムを，図２９に示す。

前記のように，すべての分画の純度は，ＮＭＲ溶剤としてｄ_５−ピリジンを用いた^１Ｈ−ＮＭＲにより決定された。しかしながら，溶媒を凍結乾燥によって除去すると，分画内の１つ以上の化合物がＮＭＲ溶媒と反応して明るいピンクの錯体を生じていたことがわかった。これは，分画Ｆ７０．２．２で特に顕著であった。この錯体の^１Ｈ−ＮＭＲは，分画中の化合物が変化していなかったことを示唆する傾向を示したが，かなりの量のピリジンが残留した。この分画の再クロマトグラフィーではこのピンクの発色は除去されず，また，より長時間の凍結乾燥によって，もしくは少量のベンゼン又はトルエンを用いてピリジンを共沸させることによって，残留したピリジンを除去しようと試みたが，成功しなかった。したがって，構造の解明に十分な化合物を得るために，繰り返し抽出を行い，後の全てのＮＭＲスペクトルを溶剤としてｄ_６−ＤＭＳＯを用いることにより得た。

分画Ｆ７０．２．１は，大部分は分画Ｆ７０．１からキャリーオーバされた化合物から成ることをＨ−ＮＭＲが示唆したので，それ以上分画しなかった。分画Ｆ７０．２．２を，移動相としてＨ_２Ｏ又は１％のＴＦＡ中のＭｅＯＨ又はＭｅＣＮを用い，Ｃ１８又はＣ８のカラムを使用して，更に分画することはできなかった。しかしながら，予備的^１Ｈ−ＮＭＲでは，芳香族のシグナルの存在が示された。フェニル基を結合したシリカを使用した分離は，ｐ相互作用に基づく。したがって，フェニルカラム（５ｃｍ）を分画Ｆ７０．２．２を図３０及び表８の中で示されるように，８つの分画に分離するために使用した。Ｆ７０．２．２から得た分画は混合物であったが，Ｆ７０．２．２．３，Ｆ７０．２．２．６とＦ７０．２．２．７のピークは^１Ｈ−ＮＭＲによるとほぼ単一の化合物であった。しかしながら，構造を解明するべく十分に純粋な化合物を得るために分画を再度クロマトグラフィーで分離するには，不十分な材料しか得られなかった。

残りのピークのうち，Ｆ７０．２．５のみが，更に分離を試みるために十分な量で得られた。Ｃ１８とＣ８のカラムを使用してＦ７０．２．５を分離する試みは失敗に終わったが，フェニル基を結合したシリカ（５ｃｍ）では，１％のＴＦＡ中のＭｅＯＨ勾配を用いることにより，Ｆ７０．２．５を８つのピークに分別した（図３１及び表９）。

この分画についての全収率は，前の分離から期待されていたものより低かった。しかしながら，Ｆ７０．２．５は，完全にはＭｅＯＨに溶融せず，したがって，材料の一部はろ過時に失われてしまったことに留意されたい。Ｆ７０．２．５から得られた８つのピークのうち，Ｆ７０．２．５．２のみが構造を割り出すために十分な純度及び量で分離された。ピークＦ７０．２．５．３も十分な量で分離されたが，このピークは^１Ｈ−ＮＭＲによると２つの化合物を含んでおり，更に分別することはできなかった。^１Ｈ−ＮＭＲによると，ピークＦ７０．２．５．５とＦ７０．２．５．６はほぼ単一の化合物であったが，それらは，更に分画を試みたところ，いくつかの化合物を含んでいることがわかった。従って構造の解明には不十分な材料しか入手できなかった。

分画７０．３
Ｆ７０．２の場合と同様に，分画Ｆ７０．３は，ＭｅＯＨ／１％のＴＦＡ混合液を用いても十分に分離することはできなかった。再度，１％のＴＦＡ中ＭｅＣＮ勾配を用いることとし，セミ分取Ｃ１８シリカ（２５ｃｍ）を使用して，Ｆ７０．３を７つの分画に分離した（図３２及び表１０）。分離は今度も２３３ｎｍで首尾好くモニターすることができた。

この段階では，ＨＰＬＣや^１Ｈ−ＮＭＲによって化合物を１００％純粋なものとすることはできなかったが，同じ条件でクロマトグラフィーを繰り返すことにより，最終的に５つのピークを得た（Ｆ７０．３．２，Ｆ７０．３．５，Ｆ７０．３．６，及びＦ７０．３．７）。図４．１８は，分画Ｆ７０．３．５及びＦ７０．３．７のクロマトグラムであり，試料を乾燥させた直後の^１Ｈ−ＮＭＲによって明らかとされる，純粋な化合物を含むピークが示されている。Ｆ７０．３．７として単離されたピークは^１Ｈ−ＮＭＲやＨＰＬＣによって純粋物であると思われたが，その化合物は分解され，Ｆ７０．３．６及びＦ７０．３．５のものと同じ滞留時間で溶出されるピークを生じた（図３３）。

Ｃ１８カラム（２５ｃｍ）にて移動相としてＭｅＣＮ／１％のＴＦＡを用いて，Ｆ７０．３．４は，図３４ならびに表１１に示した８つのピークに分離された。８つ全てのピークを回収したが，Ｆ７０．３．４．２とＦ７０．３．４．５の化合物だけが，構造の割り出しに見合うだけの十分な量と純度で得ることができた。

分画Ｆ７０．３．３の^１Ｈ−ＮＭＲによって，該分画が３つの主要な化合物からなることが明らかとなった。このピークは，これらの化合物を分離するために更なるクロマトグラフィーに供したが，更に分別することはできなかった。

分画Ｆ７０．４
Ｆ７０．４についての最初の分離は，Ｃ１８セミ分取カラム（２５ｃｍ）にて７０％のＭｅＯＨ／１％のＴＦＡ勾配を用いて行った（図３５及び表１２）。視認できるように，分画Ｆ７０．４．２は，単一の大きなピークから成っていたが，その内実はＨＰＬＣや^１Ｈ−ＮＭＲによれば，いくつかの化合物から成ることが判明した。Ｃ１８もしくはＣ８カラムにてＭｅＯＨもしくはＭｅＣＮ勾配を用いてもＦ７０．４．２は，更に分離することはできなかったが，^１Ｈ−ＮＭＲによって，Ｆ７０．４．２中に芳香族プロトンの存在が判明したので，フェニルカラム（５ｃｍ）を用いることとした。１％のＴＦＡ中の３５％のＭｅＣＮを非勾配移動相として用いて，Ｆ７０．４．２を４つの主要なピークに分離した（図３６及び表１２Ａ）。

同じ条件でクロマトグラフィーを繰り返すことにより，Ｆ７０．４．２．２，Ｆ７０．４．２．３，及びＦ７０．４．２．４が，構造の割り出しに十分な量及び純度で得られた。図３５から，及び^１Ｈ−ＮＭＲからも明らかなように，Ｆ７０．４．２．３は２つ以上の化合物を含有していた。Ｃ１８もしくはＣ８逆相カラムにてＭｅＯＨもしくはＭｅＣＮ勾配を用いてもこの分画の分離程度は改善されなかったが，フェニルカラム（５ｃｍ）を用いると更に分離することができた。ＭｅＯＨもしくはＭｅＣＮ勾配のどちらを移動相として用いても分離が達成されたが，１％のＴＦＡ勾配中のＭｅＣＮを用いて達成された分離において，ピークの好い分別が為された（図３７及び表１３）。

図３７のクロマトグラムから明らかなように，Ｆ７０．４．３．１は，予期されたとおり，混合化合物であった。少なくとも５つのピークがクロマトグラム中に認められたが，この分画の更なる分離は試みられなかった。分画Ｆ７０．４．３．２，Ｆ７０．４．３．４，及びＦ７０．４．３．５を同じ条件で繰り返しクロマトグラフィーにかけることにより，これら分画を，構造の解明に十分な量で得ることができた。分画Ｆ７０．４．３．３は，主として２つの化合物の混合物であったが，これらをうまく分離することはできなかった。

分画Ｆ８０
Ｆ８０の予備分離は，Ｃ１８逆相カラム（２５ｃｍ）を用いて行い，そのクロマトグラムは図３８に示され，また収率は，表１４に示されている。まず，６つのピークが集められたが，Ｆ８０．２とＦ８０．３は，時間が経つと，クロマトグラムにおいて，ピークが消失している（図３８）ことから裏付けられるように，不安定なものであることが判った。このため，これらの化合物については，構造に関する情報を得ることができなかった。

Ｆ８０．４として溶出してきたピークは，クロマトグラムが証明するように明らかに２つ以上の化合物を含んでおり，それは^１Ｈ−ＮＭＲによって確認された。この分画については，２５ｃｍのＣ１８カラムを用いて，ＭｅＯＨやＭｅＣＮを使用しても，分離状態が更に改善されることは無かった。しかしながら，短尺のＣ１８カラム（５ｃｍ）に変更し，ＭｅＣＮ／１％のＴＦＡ勾配を用いると，この分画を６つのピークに分離することができた（図３９及び表１５）。Ｆ８０．４．５で溶出したピークを更に同じ条件でのクロマトグラフィーに供したところ，単一の純粋な化合物が得られた（Ｆ８０．４．５．２）。

Ｆ８０．５について，同じ条件（２５ｃｍのＣ１８）でのクロマトグラフィーを繰り返したところ，単一の化合物を精製することができた。

Ｆ８０．６は，クロマトグラフィーからは単一化合物のように思われたが，^１Ｈ−ＮＭＲからは，この分画がいくつかの化合物の混合物であることが示唆された。Ｆ８０．６の^１Ｈ−ＮＭＲ分析において，芳香族シグナルが存在していたので，フェニル基を結合させたシリカカラム（５ｃｍ）が有用であることが示唆された。１％のＴＦＡ中ＭｅＯＨ及びＭｅＣＮの両方を移動相として用いた。また，最も良い分離が，無勾配（１％のＴＦＡ中４０％のＭｅＣＮ）を用いて達成されることが判った。これによって，Ｆ８０．６を８つの分画に分離することができた（図４０及び表１６）。これら８つのピークから，５つの純粋な化合物（Ｆ８０．６．２，Ｆ８０．６．３，Ｆ８０．６．４，Ｆ８０．６．６，及びＦ８０．６．７）を，構造の割り出しを試みるのに十分な量で得ることができた。

要約
このプロジェクトでは，２１の大きな及び微小なピークが，純粋に，もしくは化合物の構造解析ができるほど十分な純度で単離された。表１７は，単利された化合物の番号と重量を示す。構造解析を始める前に，それぞれの化合物は，その純度の安定性を確認するために，それらが単離されたのと同じ条件の下でＨＰＬＣを行うことによって検査された。

前述の検討から視認できるように，表１７に示した化合物以外にも，本プロジェクトの過程で，多くの分画が単離された。これらの分画の多くは，^１Ｈ−ＮＭＲによって，あるいはクロマトグラムの状況（例えば多くの分別されないピーク）によって明らかなように，多くの化合物を含んでいた。これらのピークのいくつかは，^１Ｈ−ＮＭＲによって判別されたように，少数の化合物だけ，あるものは１つか２つだけを含むものであった。しかしながら，これらの分画の精製を続けるには，入手できた植物材料は不十分であった。表１８は，より多くの植物材料が将来的な研究のために入手できた際，それらの分画が更なる研究をする価値があるかどうかについての情報を提供するものである。

セクションＣ−化合物の構造の割り出し
序文
サポニンとして構造を割り出すには，分子を構成する各部とそれらが存在する配列を同定する必要がある。これらの考察事項は以下のように表現することができる。
−純粋なアグリコン構造
−糖残基の数
−単糖鎖における糖の性質と配列
−各糖単位のアノマー配置
−グリコシド結合間の配置と高次構造
−アグリコンへの糖鎖の付加
−分子におけるあらゆる酸の性質と位置［１，２，６］
しかしながら，ＮＭＲを単独で用いてサポニン類の完全な構造を求めることは可能であったが，配置の割り当ては，可能な場合には，別の方法で行われるべきであることに留意すべきである。

構造解析は，既知のＵＶ，ＩＲ，ＭＳ及びＮＭＲ分析法を用いて実施された。

分画Ｆ７０．３．６−化学的解析
この研究において最初に単離された化合物のなかの１つは，Ｆ７０．３．６であり，これについては比較的大量に得ることができた（１５２．６ｍｇ）。以下は，Ｆ７０．３．６の構造を割り出すために使われた技術及び方法の要点である。

材料及び方法
Ｆ７０．３．６の単離及び構造解析に用いられた材料及び方法は，セクションＢにおいて詳述されている。

加水分解を，１０ｍｇの試料を１Ｍ ＨＣｌ（アジャックス製）で還流することにより実行した。その溶液を冷却し，容量５ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）で３回抽出した。水層をＡｇ_２ＣＯ_３で中和し，ろ過した。いくつかの移動相を糖類の分離を達成するために試したところ，クロロホルム（ＣＨＣｌ_３）：ＭｅＯＨ：酢酸（ＡｃＯＨ）：Ｈ_２Ｏ（７：３：１：０．５）混合液を用いて，シリカＴＬＣプレート上で行うのが良好であった（図４１）。使用した標準糖溶液は，β−Ｄ−グルクロン酸，β−Ｄ−フコース，β−Ｄ−グルコース，∀−Ｌ−アラビノース，β−Ｄ−ガラクトース，∀−Ｌ−ラムノース，β−Ｄ−ガラクツロン酸，及びβ−Ｄ−キシロースであった。

ＴＬＣプレートは，フェノール硫酸溶液（３ｇのフェノールと５ｍＬの９７％のＨ_２ＳＯ_４を９５ｍＬエタノールに溶解したもの）で発色させた。プレートをその溶液中に浸漬し，スポットが視認できるようになるまで（１０〜１５分）１１０℃で加熱した。

機器
ＮＭＲやＥＳＭＳで用いられた方法及び機器については，セクションＢにおいて詳述されている。Ｆ７０．３．６の化合物は，陽陰両方のイオンモードでの高速原子衝撃（ＦＡＢ）ＭＳにも供した（クラトス(Kratos)社製コンセプト(Concept)ＩＳＱ高分解／四重極タンデム質量分析装置，タスマニア大学中央科学研究所(Central Science Laboratory University of Tasmania)）。マトリックスとして，メタ−ニトロベンジルアルコール（ＭＮＢＡ）を用いた。

７０．２．５由来の下位分画を分析にかけ，特に^１Ｈ，^１３Ｃ，及び^１Ｈ，^１３Ｃ−ｇＨＳＱＣ（ｇＨＳＱＣ）スペクトルを用いて，上記分画７０．３．６０で用いたのと同様の方法で，構造を割り出した。得られた構造は，３つのカテゴリー，すなわち，アグリコン類，モノデスモシド類，ビデスモシド類に収まった。それらの構造の記載は，アグリコンから始めるものとする。モノ−及びビ−デスモシド類における糖残基がＦ７０．３．６と同等の構造及び相対立体化学配置を有するものであった場合，絶対立体化学配置も同じであるものとした。

ＵＶスペクトル
ＵＶスペクトル（図４２）やＦＴＩＲスペクトル（図４３）からは，構造の情報を判別することは，ほとんどできなかった。ＵＶスペクトルでは，２０５．９ｎｍ（Ａｂｓ．＝１．７８，ε＝１１２２６）と２２９．８ｎｍ（Ａｂｓ．＝２．２８，ε＝１４４３０）に強い吸光が２つ，及び２７４．６ｎｍ（Ａｂｓ．＝０．１７，ε＝１０７６）と２８０．０ｎｍ（Ａｂｓ．＝０．１４，ε＝８８６）に弱い吸光が２つ認められた（図４１）。これらの吸光は，芳香族系に認められるＫバンド（Ｂ→Ｂ^＊遷移）及びＢバンドに合致するものである。

ＦＴＩＲスペクトル
化合物そのままを薄膜としてＦＴＩＲにかけた結果を図４３に示す。３４００ｃｍ^−１を中心とする広いバンドは，Ｏ−Ｈ伸展を示し，２８２０から３４００ｃｍ^−１の間のピーク群は，Ｃ−Ｈ伸展を示唆するものである。エステルカルボニル伸展が，１７２３及び１７０９ｃｍ^−１の強いピークにより示され，また，Ｃ−Ｏ伸展が，１２７５と１０３９ｃｍ^−１の間に認められた。

ＮＭＲ法
当初は，文献に記載されているＮＭＲ溶媒，主としてメタノール（ＭｅＯＨ−ｄ_４）及びピリジン−ｄ_５を使用することが決定された。しかし，すぐに，両溶媒が，この研究で単離したサポニン類と問題を生じることが明らかとなった。ＭｅＯＨ−ｄ_４で直面した２つの問題は，溶解性と，交換性プロトンの消失であった。単離されたサポニン類の内，いくつかはＭｅＯＨ−ｄ_４に溶解せず，いくつかは溶解してもやがてＮＭＲチューブ中で沈殿を生じてしまった。^１Ｈ−ＮＭＲにおいて，多数のオーバーラップシグナルが存在したため，多くのシグナルについて，特に糖質分子によるシグナルについて，その帰属を割り出すことができなかった。

交換性プロトンによるシグナルは，全体構造の情報を得るのに貢献し得るものでもあり、又は、複雑化するものでもあり得る。しかしながら，今回は，既に複雑なスペクトルに対して更に情報を付与するものとなったが，交換性プロトンが最終的な構造の割り出しに寄与するものであると考えた。そのため，文献において最適な溶媒であると思われたピリジン−ｄ_５で研究を行った。しかしながら，溶媒のシグナルは，スペクトルにおいて芳香族シグナルとオーバーラップする傾向を示した。溶媒の除去についても，解決が難しいことが判った。溶媒を真空凍結乾燥によって除去したが，数日経ってもかなりの量が残留した。この溶媒はまた，化合物のいくつかと反応してしまうようであり，明るいピンク色の錯体を生成してしまった。^１Ｈ−ＮＭＲからは，化合物自体が変化を生じたかどうかは不明であったが，かなりの量のピリジンが残留していることが視認された。少量のベンゼンもしくはトルエンを加えてピリジンを共沸させてみたが，回転蒸発によっても凍結乾燥によっても，この問題を解決できなかった。

最終的に，比較の目的について有用な文献情報はほとんど無かったが，ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ−ｄ_６）をＮＭＲ溶媒として使用することが決定された。化合物Ｆ７０．３．６のＤＭＳＯ−ｄ_６中^１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルは，図４４に見ることができる。該スペクトルは，おおまかに３つの領域に分割することができる。第１の最も遮蔽された領域（＊０．００〜＊２．２０）は，主として，メチルのシグナルに関係している。６つのメチルの一重項がこの領域において，＊０．７１（３Ｈ），＊０．７９（３Ｈ），＊０．８４（３Ｈ），＊０．９４（３Ｈ），＊０．９７（６Ｈ）及び＊１．３３（３Ｈ）の化学シフトで明らかである。

第２の領域（＊２．２０〜＊６．００）は，酸素に結びついている炭素に極めて接近しているプロトンを含んでおり，４つのアノマープロトンに特徴的な二重項が＊７．４３，＊７．５２，＊７．５９，＊７．６６，＊７．８９及び＊７．９４で顕著であった。最後の，第３の最も非遮蔽的領域（＊７．４０〜＊８．００）は，＊７．４３，＊７．５２，＊７．５９，＊７．６６，＊７．８９及び＊７．９４で，６つの芳香族プロトンを示している。

^１３Ｃスペクトル（図４５）は，^１Ｈスペクトルよりも込み入っておらず，いろいろなタイプの炭素を容易に同定することができた。これらには，５つのカルボニル炭素（＊１６４．２，＊１６４．３，＊１６８．５，＊１６９．６，及び＊１７１．９），２つのオレフィン炭素（＊１２１．６，及び＊１４１．７），８つの芳香族炭素（＊１２７．８，＊１２７．９，＊１２８．４，＊１２８．５，＊１２９．１，＊１２９．５，＊１３２．５，及び＊１３２．８）及び，４つのアノマー炭素（＊１０１．８，＊１０２．４，＊１０２．８，及び＊ｖ１０３．４）が含まれていた。

Ｆ７０．３．６の化合物のそれぞれの領域は，^１Ｈ，^１Ｈ−ｄｑｆＣＯＳＹ（ｄｑｆＣＯＳＹ）及び^１３Ｃ−ｇＨＭＢＣ（ｇＨＭＢＣ）スペクトル解析を用いて分析した。

化学構造の割り出しは，立体化学配置も含め，ＮＭＲに基づいており，他の得られたスペクトルは，既知の技術を用いて為されたものである。Ｆ７０．３．６の分画は，以下に示す図４６の構造に帰属するものとされた。

質量分析
Ｆ７０．３．６の構造は，１Ｄ及び２Ｄ ＮＭＲ技術により決定されたが，該構造を支持する証明が必要であった。ＵＶやＦＴＩＲスペクトルは，分子中にある官能基を呈示することで構造の帰属をいくらか支持するものとはなったが，質量分析（ＭＳ）により，構造の帰属をよりよく確認することができた。これは，高分解能ＭＳで決定した分子の質量をＮＭＲで割り出された構造と比較することにより行うことができた。更に，ＭＳにおいて生じた断片の質量も，ＮＭＲに基づく構造を指示するものであった。

イオン化源としてエレクトロスプレー（ＥＳ）を用いて，陽陰両方のイオンモードにおける情報を得た。エレクトロスプレーは，穏和なイオン化技術であり，ＥＳを用いると，通常の実行条件下で起こる分子の断片化を最小限に抑えることができる。正確な分子量の定量も，高分解能ＥＳ−ＭＳを用いて可能である。分子のイオンは，陽イオンモードにおいては陰イオンモードにおけるほど著明ではなく，断片化が陽イオンモードでより多く認められることが判った。ＥＳにおいては化合物が，特に陽イオンでナトリウムと，陰イオンで塩素と付加化合物を生成することは，稀である。このことは，ＭＳにおけるピークを断片に割り当てる際には，考慮する必要がある。

文献では，サポニン類については陰イオンモードでのＭＳについて最も報告されており，従って，まずこのモードを試してみた。陰イオン高分解能（ＨＲ）ＥＳ−ＭＳでは，全てのピークを，１つの^１３Ｃを含む化合物の，モノアイソトピック質量と質量の対で示した（図４７）。親イオンは，２つのピークとして，ｍ／ｚ値１４４１．６４７２及び１４４２．６５２９のところで出現した。この質量は，分子式Ｃ_７３Ｈ_１０２Ｏ_２９（計算値１４４２．６５０７）と合致するものであり，ＮＭＲ法で割り出された構造を支持するものであった。

他分画の構造の解明
他の分画を，上記Ｆ７０．３．６と同様の方法で分析し，以下の化合物の構造が解明された。

アグリコン類
化合物Ｆ７０．２．５．２：−この化合物は，７．２ｍｇの非結晶質の白い粉末として単離された。

Ｆ７０．２．５．２に関連する化合物，２α，３β，１９α−トリヒドロキシ−オレアン−１２−エン−２３，２８−二酸２８−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドが，以前，バリングトニア・アクタンギュラより単離されていた［１］。その化合物は，Ｃ_２８にある酸がグルコピラノシド分子を有しているという点でＦ７０．２．５．２と異なる。従って，本化合物は，２α，３β，１９α−トリヒドロキシ−オレアン−１２−エン−２３，２８−二酸である（図４８）。

第２のアグリコン（Ｆ７０．２．５．３）は，このプロジェクトにおいて，１．４ｍｇの白い物質として単離された。化合物の質量は，ｍ／ｚ４８５．２９１２（［Ｍ−１］⁻）であり，これは，分子式Ｃ_３０Ｈ_４６Ｏ_５（計算ｍ／ｚ値４８６．３３４５）と合致するものであった。このことは，Ｆ７０．２．５．２から２つの水酸基が無くなっているものであることを示唆するものであったが，さらなる構造の情報を提供するには，不十分な材料しか得られなかった。

モノデスモシド類
以下のセクションに記載されるモノデスモシド化合物は，当該アグリコンのＣ_２１及びＣ_２２の官能性に基づいて分類される。

Ｃ_２１に安息香酸とＣ_２２に水酸基
化合物Ｆ７０．２．３．２とＦ７０．３．２は，Ｃ_２１のところに安息香酸成分を，Ｃ_２２のところに水酸基を有していることが示された。両化合物とも，非結晶質の白い固体として，少量（それぞれ８．５ｍｇ及び２６．３ｍｇ）単離された。

Ｃ_２１に安息香酸とＣ_２２にイソ酪酸
化合物Ｆ７０．３．４．２：−この化合物は，１１．７ｍｇの非結晶質の白い粉末として単離された。

Ｃ_２１とＣ_２２の両方に安息香酸：このグループの化合物は，それぞれ安息香酸の官能基をＣ_２１とＣ_２２の両方に有していた。４つのこのような化合物がこのプロジェクトで単離された。これら４つの化合物のそれぞれは，非結晶質の白い物質として単離され，その重量は，Ｆ７０．４．３．５．２（２．７ｍｇ），Ｆ７０．４．２．４．２（４．９ｍｇ），Ｆ８０．６．４（１１．７ｍｇ）及びＦ８０．６．７（３．９ｍｇ）であった。

Ｃ_２１に安息香酸とＣ_２２にチグリン酸−このグループの化合物は，Ｃ_２１の安息香酸とＣ_２２のチグリン酸によって特徴付けられた。４つのこのような化合物がこのプロジェクトにおいて，それぞれ非結晶質の白い塊として，Ｆ７０．４．２．３−４２．７ｍｇ；Ｆ７０．４．３．４．２−６．４ｍｇ；Ｆ８０．６．３−２５．８ｍｇ；Ｆ８０．６．６−４．３ｍｇで単離された。

Ｃ_２１とＣ_２２の両方にチグリン酸−この系列において単離された２つの化合物，Ｆ７０．４．３．２．２（２．８ｍｇ）及びＦ８０．６．２（７．４ｍｇ）は，Ｃ_２１とＣ_２２の両方のチグリン酸基によって特徴付けられた。

他の化合物：
分画Ｆ７０．３．３が，４７．８ｍｇの非結晶質の白い塊として単離され，これは，１Ｄ及び２Ｄ ＮＭＲにより，いくつかの化合物を含有していることが示された。これらの化合物を分別しようといくつかの試みが為され，６．６ｍｇの分画Ｆ７０．３．３．２．２を回収したが，これは１Ｄ及び２Ｄ ＮＭＲによれば，まだ３つの化合物を含有していた。しかしながら，これらの化合物の中の１つについての構造を，他の化合物についてと同様の手法を用いて割り出すことができた。
ビデスモシド類−Ｃ_２１に糖成分を有するいくつかの化合物が，このプロジェクトにおいて単離された。全ての例において，この糖は，アラビノースとして割り出された。
化合物Ｆ７０．２．６．２：本プロジェクトにおいて単離された他の化合物と比べると，Ｆ７０．２．６．２の収率は，比較的高いものであった。この化合物は，３８．５ｍｇの非結晶質の白い粉末として単離された。
化合物Ｆ７０．３．４．５：少量（２．７ｍｇ）のＦ７０．３．４．５が，非結晶質の白い化合物として単離された。Ｆ７０．３．４．５の構造は，図６０に示されている。
化合物Ｆ７０．３．５．２：この化合物は，１２．２ｍｇの非結晶質の白い化合物として単離された。
化合物Ｆ７０．３．７．２：
化合物Ｆ８０．４．５．２及びＦ８０．５．２：これらの化合物は，２．８ｍｇ（Ｆ８０．４．５．２）及び２０．１ｍｇ（Ｆ８０．５．２）の非結晶質の白い塊として単離された。

要約
このセクションは，本プロジェクトで単離された化合物の構造の割り出しを要約するものである。全部で，１のアグリコン，１０のモノデスモシド(monodesmoside)及び６のビデスモシドが単離され，特徴付けされた。構造もしくは分子量に基づいて入手可能な文献を調べたが，いずれのモノ−もしくはビ−デスモシドも見つけ出すことはできず，それらは，これを書いている時点では，新規の構造のものであると思われた。アグリコンは，言及したように，バリングトニア・アクタンギュラ由来の既知の構造のものであった。抽出物には，多くの微量の化合物が含まれており，それらも特徴付けられる必要がある（前セクションを参照）。これは，相当量の樹皮の収集及び大規模な分取クロマトグラフィによって可能になるであろう。

セクションＤ−Ｆ７０．３．２及びＦ７０．３．６の鎮痛活性
試験化合物Ｆ７０．３．２及びＦ７０．３．６の静脈内投与が，ラットでの炎症性疼痛のモデルにおいて，痛みを緩和する効果を生じるかどうかについての予備的研究。

方法
動物
成体のオスのスプレーグ−ドーリーラット(Sprague-Dawley Rat)を，１２時間／１２時間の明／暗サイクルで，かつ，エサと水の両方に自由に行き着けるようにしてある温度調節室（２１±２℃）に収容した。この研究に対する倫理的承認は，クイーンズ大学動物実験倫理委員会(Animal Experimentation Ethics Committee of The University of Queensland)から与えられた。

試薬と材料
イソフルラン（フォーサン(Forthane)R）を，アボット・オーストラレーシア・プロプライエタリーリミテッド(Abbott Australasia Pty Ltd)（オーストラリア，シドニー）より入手した。ベンジルペニシリンナトリウムのバイアル（６００ｍｇ）は，ＣＳＬ社(CSL Ltd)（オーストラリア，メルボルン）より購入した。通常生理食塩水のアンプルは，デルタ・ウエスト・プロプライエタリーリミテッド(Delta West Pty Ltd)（オーストラリア，パース）より入手し，ヘパリン添加生理食塩水（５０ＩＵ／５ｍｌ）は，アストラ・ファーマシューティカルズ・プロプライエタリーリミテッド(Astra Pharmaceuticals Pty Ltd)（オーストラリア，シドニー）より購入した。

単一ルーメンポリエチレン管状材料（内径０．５ｍｍ，外径１．００ｍｍ）は，オーバーン・プラスチックス・アンド・エンジニアリング・プロプライエタリーリミテッド(Auburn Plastics and Engineering Pty Ltd)（オーストラリア，シドニー）より購入した。シリコン処理した滅菌シルク縫合糸（ダイシルク(Dysilk^TM)）は，ダイネック・プロプライエタリーリミテッド(Dynek Pty Ltd)（南オーストラリア州，アデレード）より入手した。

後足への炎症誘発
ラットに３％のイソフルラン：９７％の酸素で短時間の吸入麻酔を施し，フロイントの完全アジュバント(Freund’s complete Adjuvent)（ＦＣＡ，０．１５ｍＬ）を足底に注射（i.pl.）することにより，ラットの後ろ足に炎症を誘発させた。炎症性の疼痛を，足押圧テストを用いて評価した（詳細は下記参照）。試験化合物は，ＦＣＡのｉ．ｐｌ．投与の後，５日目もしくは６日目に投与された。

足の体積の測定
左足及び右足のそれぞれの体積を，プレチスモメーターを用い，ＦＣＡのｉ．ｐｌ．投与前の日及びＦＣＡ投与後５日目の薬物（もしくは生理食塩水）の静脈内注射の直前に測定した。

外科処置
頸静脈挿管
ラットに３％のイソフルラン：９７％のＯ_２で吸入麻酔を施し，調節器付きトリレン気化器(Trilen vapouriser)を用いて維持しながら，頸静脈挿管を行った。ポリエチレンカニューレ（予めヘパリン添加生理食塩水を満たしたもの）を，静脈内薬物投与のために，右総頚静脈に挿入した。カニューレは，肩甲骨間の領域に作った切開部まで皮下(s.c.)をくぐらせて露出させ，その基部が肩甲骨の間の皮下ポケットに位置するように設けたステンレスばねで保護した。切開部は，滅菌シルク縫合糸で閉じた。外科処置の後，ラットは代謝試験用ケージに一匹ずつ収容され，次の実験の前に，最低でも２時間，術後回復させた。この回復期間中，エサと水は自由に摂取可能にさせた。

投与された薬物
化合物Ｆ７０．３．２及びＦ７０．３．６のそれぞれを，滅菌生理食塩水に溶解した。目的化合物は，まず，０．０１ｍｇ／ｋｇを０．５ｍＬの注入量として投与した。この予備試験においては，他に，以下の静脈投与量で投与を行った。
Ｆ７０．３．２ ０．００２ｍｇ／ｋｇ，０．００５ｍｇ／ｋｇ，０．０１及び０．０２ｍｇ／ｋｇ
Ｆ７０．３．６ ０．００２ｍｇ／ｋｇ，０．００５ｍｇ／ｋｇ，０．０１ｍｇ／ｋｇ，０．０２ｍｇ／ｋｇ及び０．０５ｍｇ／ｋｇ
対照ラットには，注入量の生理食塩水の静脈内投与が施された。

痛覚抑制検査：足押圧テスト
足押圧テストのために，ラットを静かにタオルの下に静止させ，機械的増分押圧（最大２５０ｇ）を後足の甲の面に加えた。足の引込みを惹起するのに要した圧力，すなわち足押圧力閾値（ＰＰＴ）を定量した。１０秒あけて３回連続して測定した平均値を求めた。それから同様の操作を，順序効果を排除するように対象の側を交互に変えながら，対側についても行った。同様にラットを静かにタオルの下に静止させ，プレチスモメーターを用いて足の体積を測定した。

データ分析
試験化合物（Ｆ７０．３．２及びＦ７０．３．６）のそれぞれを注入量にて静脈内投与したのに続いて，足引込閾値（ｇ）を，薬物の投与の直前に定量した個々の基準ＰＷＴ値を差し引いて，正規化した。正規化した対時間ＰＷＴ曲線の面積（ＡＵＣ）を台形公式を用いて計算した。用量反応曲線は，Ｆ７０．３．２とＦ７０．３．６のそれぞれについて，静脈内投与量に対するＡＵＣ値をプロットすることにより作成した。

図６５は，同側の後足について，用量に相関してＦ７０．３．２の痛覚抑制力(antinociceptive potency)に増加が見られたことを示している。反対に，対向側の後足においては，痛覚抑制が認められなかった。

図６６は，同側の後足では，０．００２〜０．０１ｍｇ／ｋｇの用量範囲において，用量に相関してＦ７０．３．６の痛覚抑制力に増強が見られたことを示している。しかしながら，投与量を更に多くしていっても，痛覚抑制反応は増強するどころか，むしろ減少してしまった。化合物Ｆ７０．３．２と同様に，対向側の後足においては，痛覚抑制が認められなかった。

生理食塩水のみを注射されたラットについてまとめた図６７の結果から，実験操作そのものが，有意に痛覚抑制を惹起することは無かったことを示している。

図６８に示すように，上記技術を用いたところでは，化合物Ｆ７０．３．６及びＦ７０．３．２の痛覚抑制効果は，明瞭に増強しそれから頭打ちになる。

図６９は，ＦＣＡ投与後５日目までに，同側の後足の平均（±ＳＥＭ）体積が，３．３（±０．１）ｍＬから６．０（±０．１）ｍＬまで，約２倍に増加したことを示している。一方，ＦＣＡ投与後５日目で対向側の後足の平均（±ＳＥＭ）体積（３．３±０．１ｍＬ）は，同側の後足に炎症を惹起する以前に測定した値（（３．２）±０．１ｍＬ）から，有意な差を生じなかった。

副作用の範囲が，化合物Ｆ７０．３．２及びＦ７０．３．６について，下記表１９及び２０にまとめたように，観察された。

本明細書全体を通じて，いずれか１つの実施形態もしくは特定の特徴を集めたものに制限することなく，発明の好ましい実施形態を記載することを企図している。

この明細書全体を通じて，文脈中に特に記載が無ければ，用語「からなる(comprises)」及び，「からなる(comprise)」や「からなっている(comprising)」のような派生語は，記載された数値もしくは数値の群もしくはステップが含まれることを意味するが，他の数値や数値のグループを除外することを意味しているわけではないことが，理解されるであろう。

図７０及び７１にも言及すると，それらは本発明の更に他の化合物の構造を示している。図７０は，図示のとおり，Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤの基を有することを特徴とする化合物（１）〜（７）を示している。これらの化合物は，前述のように，Ｂアクタンギュラの乾燥樹皮の水抽出物から調製されたものであり，やはり前述したように割り出された構造を有している。同様の所見が，図７１の化合物にも該当する。

図１は、Ａ１−バリンゲノールの構造を示し；
図２は、バリングトゲン酸及びバリングトゲノールの構造を示し；
図３は、バリングトゲノールβの（ａ）当初の，及び（ｂ）改定された構造を示し；
図４は、バリングトゲノールＣの構造を示し；
図５は、バリングトゲノールＤの構造を示し；
図６は、バリングトゲノールＥの構造を示し；
図７は、Ｂ．アクタンギュラ由来の化合物を示し；
図８は、バリン酸の構造を示し；
図９は、アクタングル酸，タングル酸及びバリンゲン(barringenic)酸を含むＢ．アクタンギュラ由来の化合物を示し；
図１０は、２ａ，３β，１９ａトリヒドロキシ−オレアン−１２−エン二酸２８−Ｏ−β−Ｄグルコピラノシドの構造を示し；
図１１は、バリングトシドＡ，バリングトシドＢ及びバリングトシドＣの構造を示し；
図１２は、ホルマリン検定における対照としての正常なグルーミング反応を示し；
図１３は、ホルマリン検定における対照値

を示し；
図１４は、モルヒネの用量対照曲線

を示し；
図１５は、粗サポニン混合物の調製の概要図を示し；
図１６は、水抽出物の不溶性活性部分の酸及び塩基加水分解の概要を示し；
図１７は、Ｂ．アクタンギュラの花及び葉の鎮痛性の活性を示し

；
図１８は、粗水抽出物の鎮痛活性を示し

；
図１９は、粗水抽出物の水可溶性部分（ｎ＝９）と水不溶性部分（ｎ＝４）の鎮痛活性を示し

；
図２０は、水抽出物における用量反応曲線を示し

；
図２１は、分取ゲル浸透カラムを示し；
図２２は、ＴＳＫ−４ａの用量反応曲線

を示し；
図２３は、ＴＳＫ−４ａのＣ１８分離を示し；
図２４は、ＴＳＫ−４ａのＣ１８の分取分離を示し；
図２５は、Ｈ_２Ｏ抽出物の分取Ｃ１８クロマトグラムを示し；
図２６は、化合物Ｆ７０．２．５．２に至る様々な分画に対する番号付与方法の概略を示し；
図２７は、７０％のＭｅＯＨで溶出した分画（Ｆ７０）の分離を示し；
図２８は、分画７０．２．（１％のＴＦＡ中の４０％のＭｅＣＮ溶液）の分離を示し；
図２９は、Ｆ．７０．２．６のクロマトグラムを示し；
図３０は、分画Ｆ．７０．２．２の２５４ｎｍ（左）及び２３３ｎｍ（右）における分離を示し；
図３１は、分画Ｆ７０．２．５の２２０ｎｍ（左）及び２３３ｎｍ（右）における分離を示し；
図３２は、分画Ｆ７０．３の分離を示し；
図３３は、Ｆ．７０．３．５とＦ７０．３．７のクロマトグラムを示し；
図３４は、分画Ｆ．７０．３．４（ほぼ単一の化合物）の分析的分離を示し；
図３５は、Ｆ７０．４の分離を示し；
図３６は、Ｆ７０．４．２の分離を示し；
図３７は、Ｆ７０．４．３の分離を示し；
図３８は、ピークＦ．８０．２とＦ．８０．３の消失を示す分取クロマトグラムを示し；
図３９は、Ｆ．８０．４の分取クロマトグラムを示し；
図４０は、フェニル逆相カラムを使用した分画Ｆ．８０．６の分離を示し；
図４１は、加水分解操作において使用されるＴＬＣプレートであり，Ｆ．７０．３．６の単離及び構造解析のための標準糖を示し，；
図４２は、Ｆ．７０．３．６のＵＶスペクトルを示し；
図４３は、Ｆ．７０．３．６のＦＲＩＲスペクトルを示し；
図４４は、化合物Ｆ．７０．３．６の^１Ｈ−ＮＭＲを示し；
図４５は、化合物Ｆ．７０．３．６の^１３Ｃ−ＮＭＲを示し；
図４６は、化合物Ｆ．７０．３．６の構造の完全な配置を示し；
図４７は、Ｆ．７０．３．６の陰イオンＨＲ−ＥＳＭＳを示し；
図４８は、化合物Ｆ．７０．２．５２を示し；
図４９は、化合物Ｆ．７０．２．３を示し；
図５０は、化合物Ｆ．７０．３．２を示し；
図５１は、化合物Ｆ．７０．３．４．２を示し；
図５２は、化合物Ｆ．７０．４．３．５．２／Ｆ．８０．６．７を示し；
図５３は、化合物Ｆ．８０．６．４／Ｆ７０．４．２．４．２を示し；
図５４は、化合物Ｆ．７０．４．３．４．２／Ｆ．８０．６．６を示し；
図５５は、化合物Ｆ．７０．４．２．３／Ｆ８０．６．３を示し；
図５６は、化合物Ｆ．７０．４．３．２．２を示し；
図５７は、化合物Ｆ．８０．６．２を示し；
図５８は、化合物Ｆ．７０．３．３．２．２ｂを示し；
図５９は、化合物Ｆ．７０．２．６．２を示し；
図６０は、化合物Ｆ．７０．３．４．５を示し；
図６１は、化合物Ｆ．７０．３．５ａを示し；
図６２は、化合物Ｆ．７０．３．５ｂを示し；
図６３は、化合物Ｆ．７０．３．７．２を示し；
図６４は、化合物Ｆ．８０．４．５．２／Ｆ．８０．５．２を示し；
図６５は、ＦＣＡラットの，（Ａ）同側の（炎症のある）及び（Ｂ）対向側の（非炎症の）の後足についての，平均（±ＳＥＭ）足引込み閾値の時間に対する曲線のグラフであり；
図６６は、ＦＣＡラットの，（Ａ）同側の（炎症のある）及び（Ｂ）対向側の（非炎症の）の後足についての，平均足引込み閾値（±ＳＥＭ）の時間に対する曲線のグラフであり；
図６７は、生理食塩水の単回静脈内注入を受けたＦＣＡ処理した成人のオスのスプレーグ−ドーリーラット（ｎ＝３）における同側の（炎症のある）及び対向側の（非炎症の）の後足についての，平均（±ＳＥＭ）足引込み閾値の時間に対する曲線であり；
図６８は、ＦＣＡラットの同側の後足におけるＦ７０．３．２及びＦ７０．３．６の静脈内投与の痛覚抑制効果についての平均値（±ＳＥＭ）用量反応曲線であり；
図６９は、ＦＣＡ処理前及び処理後足の体積のグラフである。

Claims (25)

1. 式（Ｉ）
   

   

   の化合物であって，
   式中：
   Ｒ_２は水素原子，Ｏ−ベンゾイル，Ｏ−チグロイル，又は
   

   

   であり，ここで，Ｒ_５及びＲ_７は各々独立して，ベンゾイル，チグロイル又は３−Ｏ−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリルから選択され；
   Ｒ_３は水酸基，Ｏ−アセチル，Ｏ−イソブチリル，Ｏ―ベンゾイル又はＯ−チグロイルであり；
   Ｒ_４はＣＨ_２ＯＨ又はＣＨ_２ＯＣＯＣＨ_３ であり；
   Ｒ_６は水素，又は
   

   

   であり，
   ただし，ａ）Ｒ₁は水素原子であり，
   Ｒ_２が次式
   

   

   で表される基を表し，Ｒ _６ が次式：
   

   

   で表される基であるとき，
   Ｒ _３ がＯ−アセチルであり，Ｒ _４ がＣＨ _２ ＯＨであり，Ｒ _５ がベンゾイルであり，且つＲ _７ が３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリル又はベンゾイルであるか；
   Ｒ _３ がＯ−アセチルであり，Ｒ _４ がＣＨ _２ ＯＨであり，Ｒ _５ がチグロイルであり，且つＲ _７ が３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリルであるか；
   Ｒ _３ がＯ−アセチルであり，Ｒ _４ がＣＨ _２ ＯＨであり，Ｒ _５ が３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリルであり，Ｒ _７ がチグロイルであるか；又は
   Ｒ _３ が水素原子であり，Ｒ _４ がＣＨ _２ ＯＣＯＣＨ _３ であり，Ｒ _５ がベンゾイルであり，且つＲ _７ がベンゾイル又は３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリルであり；
   ｂ）Ｒ _２ が次式：
   

   

   であり，Ｒ _６ が水素原子であるとき，
   Ｒ _１ が水素原子であり，Ｒ _３ がＯ−アセチルであり，Ｒ _４ がＣＨ _２ ＯＨであり，Ｒ _５ がベンゾイルであり，且つＲ _７ が３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリルであり；
   ｃ）Ｒ _２ がＯ−ベンゾイル，Ｒ _６ が次式：
   

   

   であるとき，
   Ｒ _１ が水素原子であり，Ｒ _３ がＯ−イソブチリル，Ｏ−ベンゾイル又はＯ−チグロイルであり，且つＲ _４ がＣＨ _２ ＯＨであるか；
   Ｒ _１ が水素原子であり，Ｒ _３ が水酸基であり且つＲ _４ がＣＨ _２ ＯＨ又はＣＨ _２ ＯＣＯＣＨ _３ であるか；又は
   Ｒ _１ がメチルであり，Ｒ _３ がＯ−ベンゾイル又はＯ−チグロイルであり，且つＲ _４ がＣＨ _２ ＯＨであり；
   ｄ）Ｒ _２ がＯ−チグロイルであるとき，Ｒ _１ は水素原子又はメチルであり，Ｒ _３ はＯ−チグロイルであり，Ｒ _４ はＣＨ _２ ＯＨであり，Ｒ _６ は次式：
   

   

   であり；そして
   ｅ）Ｒ _２ が水素原子のとき，Ｒ _１ は水素原子であり，Ｒ _３ はＯ−ベンゾイルであり，Ｒ _４ はＣＨ _２ ＯＨであり，Ｒ _６ は次式：
   

   

   を表す化合物；もしくはそれらの薬理学的に許容される塩類。
2. Ｒ_２が，Ｏ−ベンゾイルである請求項１記載の化合物。
3. Ｒ _２ が次式：
   

   

   であり，Ｒ _５ 及びＲ _７ はベンゾイルを表すか，Ｒ _５ がベンゾイル又はチグロイルを表し且つＲ _７ が３−ベンゾイル−２−メチルブチリルを表すか，Ｒ _５ が３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリルを表し且つＲ _７ がチグロイルを表す請求項１記載の化合物。
4. Ｒ _２ がＯ−チグロイルである請求項１記載の化合物。
5. Ｒ_２が水素原子である請求項１記載の化合物。
6. ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−［３−Ｏ−（３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリル）−４−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｌ−アラビノピラノシル］−２２−Ｏ−アセチルバリングトゲノールＣである請求項１記載の化合物。
7. ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−ベンゾイルバリングトゲノールＣである請求項１記載の化合物。
8. ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−ベンゾイル−２８−Ｏ−アセチルバリングトゲノールＣである請求項１記載の化合物。
9. ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−ベンゾイル−２２−Ｏ−イソブチリルバリングトゲノールＣである請求項１記載の化合物。
10. ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−メチルグルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−ジベンゾイルバリングトゲノールＣである請求項１記載の化合物。
11. ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−ジベンゾイルバリングトゲノールＣである請求項１記載の化合物。
12. ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−メチルグルクロノピラノシル−２１−Ｏ−ベンゾイル−２２−Ｏ−チグロイルバリングトゲノールＣである請求項１記載の化合物。
13. ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−ベンゾイル−２２−Ｏ−チグロイルバリングトゲノールＣである請求項１記載の化合物。
14. ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−メチルグルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−チグロイルバリングトゲノールＣである請求項１記載の化合物。
15. ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−チグロイルバリングトゲノールＣである請求項１記載の化合物。
16. ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−デオキシ−２２−Ｏ−ベンゾイルバリングトゲノールＣである請求項１記載の化合物。
17. ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−［３，４−ジ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｌ−アラビノピラノシル］−２２−Ｏ−アセチルバリングトゲノールＣである請求項１記載の化合物。
18. ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−［３，４−ジ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｌ−アラビノピラノシル］−２８−Ｏ−アセチルバリングトゲノールＣである請求項１記載の化合物。
19. ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−［３−Ｏ−（３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリル）−４−Ｏ−チグロイル−α−Ｌ−アラビノピラノシル］−２２−Ｏ−アセチルバリングトゲノールＣである請求項１記載の化合物。
20. ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−［３−Ｏ−チグロイル−４−Ｏ−（３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリル）−α−Ｌ−アラビノピラノシル］−２２−Ｏ−アセチルバリングトゲノールＣである請求項１記載の化合物。
21. ３−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−［３−Ｏ−（３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリル）−４−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｌ−アラビノピラノシル］−２２−Ｏ−アセチルバリングトゲノールＣである請求項１記載の化合物。
22. ３−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−［３−Ｏ−（３−ベンゾイルオキシ−２−メチルブチリル）−４−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｌ−アラビノピラノシル］−２８−Ｏ−アセチルバリングトゲノールＣである請求項１記載の化合物。
23. 治療上の有効量の，請求項６又は８記載の化合物と，薬理学的に許容される担体とを含む，痛みの治療及び／又はコントロールのための医薬組成物。
24. 前記担体が薬理学的に許容される賦形剤である，請求項２３記載の医薬組成物。
25. 痛みを治療及び／又はコントロールする医薬の製造のための請求項６又は８記載の化合物の使用。

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