JP4788773B2

JP4788773B2 - 質量分析データ解析装置

Info

Publication number: JP4788773B2
Application number: JP2008546845A
Authority: JP
Inventors: 紀雄向
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2006-11-27
Filing date: 2006-11-27
Publication date: 2011-10-05
Anticipated expiration: 2026-11-27
Also published as: JPWO2008065704A1; WO2008065704A1

Description

本発明は、質量分析データ解析装置に関し、特にＭＳＭＳスペクトルを採取可能な質量分析計で得られたデータを使用して、代謝物等の化学的変化により生成される物質を探索するためのデータ解析装置に関する。

様々な疾病・疾患の診断、医薬品や機能性食品の有効性や安全性の評価、生活習慣や健康に関する研究などの分野において、生体内での化学的変化の産物である代謝物を分析することは非常に重要であり、近年、メタボロミクス（Metabolomics）と呼ばれる、代謝物を網羅的に解析する手法が注目されている。

このような代謝物の解析を行うには、クロマトグラフィ（典型的には高速液体クロマトグラフィ）と高精度な質量分析計とを組み合わせた手法が有用である（例えば非特許文献１など参照）。この場合、質量分析計で得られたマススペクトルを解析することで代謝物を探索する必要がある。一般的に、従来の代謝物探索においては、組成や構造が既知である代謝物についてその質量（厳密には質量電荷比 m/z）を登録したデータベースを予め作成しておき、分析により取得されたマススペクトルに現れているピークの質量をデータベースと照合することで代謝物を同定する。しかしながら、このような探索方法では、データベースに登録されていない未知の代謝物が試料中に存在してもそれを見つけることができないし、或るピークが未知の代謝物によるものであるとの推測ができたとしても、その代謝物の組成を知ることはできない。

但し、代謝物は元の物質（原物質）から決められた代謝パスを通って代謝されるため、原物質が既知の代謝パスを通って代謝される場合は、その構造変化を予測することができる。従って、このような場合は、代謝物がデータベースに登録されていない場合であっても、比較的容易に同定を行うことができる。しかしながら、想定していない代謝パスや複数の代謝パスを経由して原物質が代謝される場合、その代謝生産物の構造を予め推定しておくのは困難となる。

そこで、このような代謝物の探索には、代謝前後のサンプルについてそれぞれクロマトグラフ質量分析を行い、代謝後のみに存在する成分を代謝物候補として列挙する方法が取られている。すなわち、代謝後サンプルの質量分析データにおいて測定質量範囲をある一定の質量幅（厳密には質量電荷比幅）で連続的に切り出してクロマトグラム（これを「抽出イオンクロマトグラム」と呼ぶ）を作成し、代謝前サンプルから同じ質量幅で切り出したクロマトグラムと比較して、同じ時間帯にクロマトピークが存在するかを比較するのである。ここで、代謝後サンプルにおいて検出されたピークが代謝前サンプルにおいても存在すれば、それは代謝物ではなく、元から存在していた物質であると判定される。一方、代謝前サンプルに同様のピークが存在しなかった場合には、代謝過程において生成された物質（すなわち代謝物）の可能性が高いと判定される。

「島津のメタボロミクスソリューション」、[平成１８年１１月８日検索]、株式会社島津製作所、インターネット＜URL: http://www.an.shimadzu.co.jp/topics/2006/200610/metabo/metabolome.htm＞

しかし、上記のような従来の代謝物探索方法では、本来はノイズであるクロマトグラム上の変動が代謝物候補と判定されることがあり、このため、探索結果として列挙されるクロマトグラムピークの数も膨大になりがちである。更に、近年の質量分析計の高分解能化により、クロマトグラムを切り出す幅をより細かく設定できるようになったため、比較処理するクロマトグラムの本数も飛躍的に増加し、結果としてますます代謝物候補として判定されるノイズピークの数が増加する傾向にある。また、処理するクロマトグラムの本数が増えるにつれ、処理時間が長くなるという問題があった。

例えば、図７は、代謝前サンプル及び代謝後サンプルのそれぞれについてクロマトグラフ質量分析を行って得られたデータを、0.1m/z毎に切り出してクロマトグラムを描いたものである。ここでは、代謝後のサンプルにおいてのみm/z=455.3のクロマトグラムにピーク（矢印で示した箇所）が現れているため、これが代謝物の候補として判定される。なお、図中には、m/z=455.1〜455.5のクロマトグラムのみを例示しているが、実際には測定質量範囲全域に亘ってクロマトグラムの生成及び比較処理が行われる。従って、例えば、m/z=100〜800の範囲で測定を行った場合、0.1m/z毎に処理を行うと7000本程度のクロマトグラムを処理する必要がある。分解能の高い質量分析計であれば、より細かい質量幅でクロマトグラムを描出できるため、更に処理本数が増すことになる。

なお、上記問題は代謝物の探索のみならず、或る物質が何らかの化学的な変化を生じた結果生じた生成物の探索についても事情は同じである。

本発明はこのような問題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、質量分析により取得されたマススペクトルデータに基づいて、化学的変化により生じた生成物の探索を行う質量分析データ解析装置において、探索の確度を高めると共に解析処理に要する時間を短縮することのできる質量分析データ解析装置を提供することである。

上記課題を解決するために成された本発明に係る質量分析データ解析装置は、クロマトグラフで分離した試料成分を順次ＭＳ測定し、得られたマススペクトル中の所定の条件を満たすピークに対応するイオンを前駆イオンとしてＭＳＭＳ測定を行うクロマトグラフ質量分析装置に適用され、該クロマトグラフ質量分析装置によって化学的変化の前後における試料を分析して得られたデータに基づき該化学的変化による生成物の探索を行う質量分析データ解析装置であって、前記ＭＳ測定で取得されたデータに基づいて前記各前駆イオンの質量電荷比におけるイオン強度の経時変化を示すクロマトグラムを作成する手段と、該クロマトグラムを前記化学的変化の前後における試料について比較し、変化後の試料のみに存在するピークを前記生成物由来のピークとして判定する生成物探索手段とを有することを特徴としている。

ここで、上記「化学的変化」とは典型的には代謝であり、この場合「生成物」とは代謝物（代謝産物）を意味する。

図６に示すように、ＭＳＭＳ測定に際しては、イオンの開裂操作を伴わないＭＳ測定により得られたマススペクトル（以下、「ＭＳスペクトル」）に存在する前駆イオン（プリカーサイオン）を開裂させ、その結果生じたフラグメントイオンのマススペクトル（以下、「ＭＳＭＳスペクトル」）が取得される。このとき、一般的には、ＭＳスペクトル中の所定の条件を満たすピーク、例えば、予め定められた閾値以上の強度を有するスペクトルピーク、もしくはクロマトグラム強度が所定の閾値以上になった時点において最大の強度を有するスペクトルピーク等が前駆イオンとして選択される。従って、ＭＳＭＳスペクトルが取得されたということは、その前駆イオンは何らかの物質に由来するものであり、クロマトグラム上の電気的もしくは化学的ノイズでないことは明らかである。

そこで、上記本発明に係る質量分析データ解析装置では、このようなＭＳＭＳ測定の前駆イオンの質量電荷比について生成されたクロマトグラムを、化学的変化の前後における試料について比較することにより、試料成分を含むクロマトグラムのみを解析対象として前記化学的変化による生成物の探索を行うことができる。

上記のような構成を有する本発明の質量分析データ解析装置によれば、ノイズに由来するピークが代謝物として判定されるのを防ぎ、代謝物探索の確度を向上させることができる。また、サンプル成分を含まないクロマトグラムを排除して処理対象を絞り込むことにより、解析速度を大幅に短縮することが可能となる。

なお、本発明に係る質量分析データ解析装置は、更に、上記生成物探索手段によって生成物由来のピークとして判定されたピークを含むクロマトグラムを、前記前駆イオンのＭＳスペクトル及びＭＳＭＳスペクトルと共に表示する表示手段を有するものとすることが望ましい。

これにより、上記により探索された生成物に関するＭＳスペクトル及びＭＳＭＳスペクトルのフラグメントパターンを上記クロマトグラムと共に容易に参照することが可能となり、ユーザによる同定操作を省力化することができる。

分解能の高い質量分析計を用いる場合、得られる質量桁数は、小数点以下４桁から５桁に及ぶ。従って、これを用いることで、元素質量の数学的組み合わせから、目的物質の元素組成をある程度推定することが可能となる。そこで、本発明に係る質量分析データ解析装置は、更に、上記前駆イオンの質量電荷比に基づいて上記生成物の組成を推定する組成推定手段を有するものとするとより望ましい。

これにより、上記生成物探索手段によって挙げられた生成物の組成を推定することができ、その結果を、例えばクロマトグラムの保持時間と共に表示することにより、ユーザによる同定作業を支援することができる。代謝生産物は、代謝前の物質の構造をある程度維持していることが多く、代謝前の組成が分かっている場合、上記のように代謝物の組成候補が表示されれば、同定を行う上で非常に有益な情報となる。

本発明に係るデータ解析装置を含む質量分析システムの一実施例の概略構成図。本実施例の質量分析システムによる未知代謝物の解析処理動作の手順の一例を示すフローチャート。本実施例のデータ解析装置における未知代謝物の探索方法を説明する図。本実施例のデータ解析装置において未知代謝物のクロマトグラム、ＭＳスペクトル、ＭＳＭＳスペクトルを表示した状態を示す図。本実施例のデータ解析装置において未知代謝物の組成推定結果を表示した状態を示す図。ＭＳＭＳスペクトルの取得方法を説明する図。従来のデータ解析装置における未知代謝物の探索方法を説明する図。

符号の説明

１０…ＨＰＬＣ
２０…質量分析計
３０…データ処理部
３１…データ取得部
３２…クロマトグラム作成部
３３…代謝物探索部
３４…組成推定部
３５…表示制御部
４０…表示部

以下、本発明に係る質量分析データ解析装置の一実施例について、図面を参照しながら詳細な説明を行う。

図１は、本発明に係る質量分析データ解析装置を含む質量分析システムの一実施例の概略構成図である。質量分析計２０は、例えば、イオントラップ飛行時間型質量分析計（ＩＴ−ＴＯＦＭＳ）であり、高速液体クロマトグラフ装置（ＨＰＬＣ）１０から溶出される試料を順次イオン化し、ＭＳ測定及びＭＳＭＳ測定を行って、取得されたデータをデータ処理部３０に送出する。データ処理部３０は、機能ブロックとして、データ取得部３１、クロマトグラム作成部３２、代謝物探索部３３、組成推定部３４、及び表示制御部３５を含む。データ取得部３１は質量分析計２０から送出されたデータ（例えば、ＭＳスペクトル及びＭＳＭＳスペクトル）を受け取るものであり、クロマトグラム作成部３２は、データ取得部３１で取得されたＭＳスペクトルデータに基づいて、所定の質量電荷比におけるイオン強度を縦軸に、保持時間を横軸に取った抽出イオンクロマトグラム（Extracted Ion Chromatogram：ＸＩＣ）を作成する（詳細は後述する）。代謝物探索部３３は、前記抽出イオンクロマトグラムを代謝前サンプルと代謝後サンプルとで比較し、代謝後サンプルのみに存在するピークを代謝物由来のピークとして抽出する。組成推定部３４は、上記前駆イオンの質量電荷比に基づいて、該代謝物の組成を推定する。また、表示制御部３５は、上記各部から出力されるデータをデータ処理部３０に接続された表示部４０に表示させるための処理を行う。なお、データ処理部３０は、通常、パーソナルコンピュータにより具現化され、該コンピュータにインストールされた所定のプログラムを実行することで上記のような解析処理機能が達成される。

次に、この質量分析システムによる代謝物の探索及び同定処理の一例について、図２のフローチャートを参照しつつ説明する。まず、代謝前サンプルと代謝後サンプルをそれぞれＨＰＬＣ１０及び質量分析計２０で分析し、マススペクトルデータを取得する（ステップＳ１１）。このとき、質量分析計２０では、イオンの開裂操作を伴わない質量分析（ＭＳ測定）によりＭＳスペクトルデータが取得されると共に、所定の閾値以上の強度を有するイオンが前駆イオンとして自動的に選択され、該前駆イオンの開裂によって生じたフラグメントイオンの質量分析（ＭＳＭＳ測定）によりＭＳＭＳスペクトルデータが取得される。

以上により取得されたデータは、質量分析計２０からデータ処理部３０へ送出される。クロマトグラム作成部３２では、全測定時間に亘って取得されたＭＳスペクトルのデータセットから前記ＭＳＭＳ測定における前駆イオンの質量電荷比に関するデータが抽出され、該質量電荷比における抽出イオンクロマトグラムが作成される（ステップ１２）。続いて、代謝物探索部３３において代謝前サンプルと代謝後サンプルの抽出イオンクロマトグラムが比較され、代謝後サンプルのみに存在するピークが抽出される（ステップＳ１３）。

具体的には、まず、代謝後サンプルの抽出イオンクロマトグラム上に存在するピークが検出され、その後、代謝前サンプルの同一質量電荷比における抽出イオンクロマトグラムにおいて同一の時間帯にピークが存在するか否かが判定される。このとき、同様のピークが代謝前サンプルにも存在すれば、該ピークは原物質に由来するものと判定され、同様のピークが代謝前サンプルに存在しなかった場合は、該ピークは代謝過程によって新たに生成した物質（代謝物）に由来するものと判定される。

図３に、上記ステップＳ１２で生成される抽出イオンクロマトグラムの一例を示す。図３（ｂ）は、代謝後サンプルについて作成された上記前駆イオンの質量電荷比における抽出イオンクロマトグラムであり、図３（ａ）は、同一の質量電荷比について生成された代謝前サンプルの抽出イオンクロマトグラムである。代謝後サンプルにおいて、前駆イオンの質量電荷比である、m/z=442.28, m/z=367.72, m/z=455.30, m/z=842.97, m/z=247.16の抽出イオンクロマトグラムは、それぞれサンプル成分由来のピークを有している。これらを、同一質量電荷比について作成された代謝前サンプルの抽出イオンクロマトグラムと比較すると、代謝後サンプルにおいてm/z=442.28, m/z=455.30, m/z=842.97の抽出イオンクロマトグラムに存在するピークは、代謝前サンプルには存在しないことから、これらが代謝物由来のピークと判定される。本発明によれば、このように前駆イオンの質量電荷比について作成された抽出イオンクロマトグラムのみを比較処理の対象とすることにより、従来のように、所定の質量電荷比幅毎に作成された全ての抽出イオンクロマトグラムを処理する場合に比べて効率的且つ確実に代謝物の探索を行うことができる。

上記代謝物探索が完了すると、その結果が表示部４０に表示される（ステップＳ１４）。図４は、このときの表示画面の一例を示すものであり、代謝物として判定されたピークについて、上記抽出イオンクロマトグラム(図中の「前駆イオン質量クロマトグラム」)と共に、上記前駆イオンのＭＳスペクトル及びＭＳＭＳスペクトルを表示したものである。上記により探索された代謝物を最終的に同定する際には、ＭＳスペクトルはもちろん、ＭＳＭＳスペクトルのフラグメントイオン情報が有効な手がかりとなる。従って、このような表示を行うことにより、必要な情報をユーザが容易に参照できるようになり、ユーザによる同定作業の効率を向上させることができる。なお、ＭＳＭＳスペクトルピークを更に開裂させてＭＳ^ｎスペクトルを得る機能を備えた質量分析計を用いる場合には、そのＭＳ^ｎスペクトルも、上記ＭＳスペクトル、ＭＳＭＳスペクトルと共に表示させることが望ましい。

続いて、組成推定部３４において、上記前駆イオンの質量電荷比から、元素質量の数学的組み合わせに基いて代謝物の元素組成が推定され（ステップＳ１５）、推定された組成候補とクロマトグラムピークの保持時間等がテーブル形式で表示部４０に表示される（ステップＳ１６）。図５には、このような組成推定結果を示す画面表示の一例を示す。ここで、表示画面には、探索した代謝物に関する、クロマトグラムピークの保持時間（ＲＴ）、前駆イオン質量（Ion m/z）、クロマトグラムピークの面積百分率（Area %）、推定した元素組成（Formula (M)）、推定した元素組成の一致度（Score）、推定した元素組成の質量と前駆イオン質量の差（Diff (mDa)）といった情報が表示されている。このような表示を行うことにより、ユーザによる代謝物同定において有用な情報を提供することができる。

なお、上記実施例は本発明の一例であって、本発明の趣旨の範囲で適宜に修正、変更、追加などを行っても本願請求の範囲に包含されることは明らかである。例えば、本発明は代謝による変化のみならず、高分子化合物の合成による化学的変化など、一般的な化学的変化に伴って生成される未知物質の探索に利用することができる。

Claims

クロマトグラフで分離した試料成分を順次ＭＳ測定し、得られたマススペクトル中の所定の条件を満たすピークに対応するイオンを前駆イオンとしてＭＳＭＳ測定を行うクロマトグラフ質量分析装置に適用され、該クロマトグラフ質量分析装置によって化学的変化の前後における試料を分析して得られたデータに基づき該化学的変化による生成物の探索を行う質量分析データ解析装置であって、前記ＭＳ測定で取得されたデータに基づいて前記各前駆イオンの質量電荷比におけるイオン強度の経時変化を示すクロマトグラムを作成する手段と、該クロマトグラムを前記化学的変化の前後における試料について比較し、変化後の試料のみに存在するピークを前記生成物由来のピークとして判定する生成物探索手段とを有することを特徴とする質量分析データ解析装置。
更に、
上記生成物探索手段によって判定された生成物由来のピークを含むクロマトグラムを、上記前駆イオンのＭＳスペクトル及びＭＳＭＳスペクトルと共に表示する表示手段を有することを特徴とする請求項１に記載の質量分析データ解析装置。
更に、
上記前駆イオンの質量電荷比に基づいて上記生成物の組成を推定する組成推定手段を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の質量分析データ解析装置。
コンピュータを請求項１〜３のいずれかに記載の質量分析データ解析装置として機能させるためのプログラム。