JP4763213B2

JP4763213B2 - 殺虫活性を有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＧａｌｂｕｓ菌株および殺虫剤としての使用方法

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Publication number: JP4763213B2
Application number: JP2001577434A
Authority: JP
Inventors: ロリジョーレーマン，; ジミーエンシオオージャラ，; デニスキャロルマンカー，; デズモンドリトジメネス，; ナンシーアンバウム，; パメラゲイルマローン，
Original assignee: アグラクエストインコーポレイテッド
Priority date: 2000-04-13
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2011-08-31
Anticipated expiration: 2021-04-11
Also published as: BR0110083B1; JP2004507221A; DE60120143D1; ZA200209121B; CA2405950C; MXPA02010145A; CA2405950A1; BR122012030881B1; TWI257951B; PL362613A1; EP1272611A2; BR0110083A; IL152266A0; AU2001257595B9; WO2001079450A3; ES2263616T3; ATE328066T1; WO2001079450A2; EP1272611B1; US6682925B1

Description

（発明の分野）
本発明は、バイオ農薬の分野に含まれる。さらに詳細には、本発明は、殺虫活性を有するストレプトミセス属の新規株およびこれの使用方法に関連する。
【０００１】
（発明の背景）
天然産物は、微生物、植物および他の生物によって産生される物質である。微生物の天然産物は、化学的多様性の豊富な供給源を提供する。これらの天然産物の薬学的目的の使用には長い歴史がある。ヒト治療については天然産物に重点をおかれていたにも関わらず、農業的使用に対しては、わずかの天然産物の殺虫剤しか存在しない。最も奏効する微生物天然産物の殺虫剤は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの毒素である、アバメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）およびスピノシン（ｓｐｉｎｏｓｙｎｓ）である。Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）細菌は、細胞質タンパク質結晶（δ−エンドトキシン）を芽胞形成の間に産生し、これは、昆虫の病理において最も重要な因子である（Ｅｌｌａｒ，Ｄ．Ｊ．（１９９７）「ＴｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ δ−ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓａｎｄｐｒｏｓｐｅｃｔｓｆｏｒｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，」Ｉｎ：ＭｉｃｒｏｂｉａｌＩｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ：ＮｏｖｅｌｔｙｏｒＮｅｃｅｓｓｉｔｙ？ＴｈｅＢｒｉｔｉｓｈＣｒｏｐＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＣｏｕｎｃｉｌＳｙｍｐｏｓｉｕｍＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓＮｏ．６８，Ｃｏｖｅｎｔｒｙ，ＵＫを参照のこと）。δ−エンドトキシンは、スプレー調製品および（トランスジェニック植物へのエンドトキシン遺伝子の導入を介した）「全身性」バイオ農薬の両方で使用される。Ｂｔのスプレー調製品の市場の成長は、１９９７年から２０００年までの間において、約１０％と推定され、２０００年までに＄１００，０００，０００〜＄１３０，０００，０００の市場を生じる（Ｌｉｓａｎｓｋｙ，Ｓ．（１９９７）「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ」Ｉｎ：ＭｉｃｒｏｂｉａｌＩｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ：ＮｏｖｅｌｔｙｏｒＮｅｃｅｓｓｉｔｙ？ＴｈｅＢｒｉｔｉｓｈＣｒｏｐＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＣｏｕｎｃｉｌＳｙｍｐｏｓｉｕｍＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓＮｏ．６８，Ｃｏｖｅｎｔｒｙ，ＵＫを参照のこと）。主なＢｔトランスジェニック作物は、トウモロコシおよび綿である。米国でのトランスジェニックＢｔトウモロコシ市場は、作付け面積において１９９６年のわずか１．４％から１９９８年の１９．１％まで成長した。Ｂｔ綿における成長は、劇的ではなく、作付け面積において１９９６年の１４．６％から１９９８年の１６．８％まで増加した。市場全体は最近、鱗翅目の悪疫に対して指向している。１９９９年に米国において、毛虫に対して用いる殺虫剤市場は、４００，０００，０００米国ドルを超えた。
【０００２】
アバメクチンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓによって、発酵の間に産生される。アバメクチンは、天然に存在する大環状のラクトンの１つであり、ダニ、ナシキジラミ（ｐｅａｒｐｓｙｌｌａ）およびコナガに対する活性を示す。エマクチンは、アバメクチンの半合成アナログであり、鱗翅目の幼虫に対する活性を示す。無脊椎動物において、アバメクチンは、シナプス前部塩素イオンチャネル（ＧＡＢＡ活性化しない）の開口を誘導し、塩素イオンの流出、終神経の脱分極を導き、それによって、神経伝達物質の放出を導く。Ｔｕｒｎｅｒ、Ｍ．Ｊ．およびＳｃｈａｅｆｆｅｒ、Ｊ．Ｍ．（１９８９）「ＭｏｄｅｏｆａｃｔｉｏｎｏｆＩｖｅｒｍｅｃｔｉｎ、」Ｉｎ：ＩｖｅｒｍｅｃｔｉｎａｎｄＡｂａｍｅｃｔｉｎ、Ｗ．Ｃ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ（編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮｅｗＹｏｒｋを参照のこと。昆虫の調節におけるアバメクチンの使用は、１９９８年の世界市場で＄８０，０００，０００〜＄１２０，０００，０００の価値があると推定された。
【０００３】
スピノシンは、放線菌類Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｓｐｉｎｏｓａによって産生される、新規のクラスの発酵物由来テトラサイクリックマクロライドである。スピノシンＡおよびＤは、スピノサド（ｓｐｉｎｏｓａｄ）殺虫薬Ｔｒａｃｅｒ（登録商標）の主成分であり、鱗翅目の悪疫および蚊に対して活性を示す。Ｓｐａｒｋｓ、Ｔ．Ｃ．ら（１９９９）「Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ−ｄｅｒｉｖｅｄｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｃｏｎｔｒｏｌａｇｅｎｔｓ：ｔｈｅｓｐｉｎｏｓｙｎｓ」Ｉｎ：ＢｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓＵｓｅａｎｄＤｅｌｉｖｅｒｙ、Ｈａｌｌ、Ｆ．Ｒ．ら編ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ、１５５−１７０頁を参照のこと。その活性様式は、独特であり、ニコチンアセチルコリンレセプターへの１次の部位攻撃およびＧＡＢＡレセプターへの２次の攻撃またはＧＡＢＡレセプターにおける２次の攻撃を伴う。Ｓａｌｇａｄｏ，Ｖ．Ｌ．（１９９７）「Ｔｈｅｍｏｄｅｓｏｆａｃｔｉｏｎｏｆｓｐｉｎｏｓａｄａｎｄｏｔｈｅｒｉｎｓｅｃｔｃｏｎｔｒｏｌｐｒｏｄｕｃｔｓ」ＤｏｗｎｔｏＥａｒｔｈ５２：３５−４３を参照のこと。
【０００４】
ストレプトミセス属は、殺虫性の天然産物の認識された供給源である。アバメクチンおよびスピノシンに加えて、コレステロールオキシダーゼ（Ｐｕｒｃｅｌｌ、Ｊ．Ｐ．ら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４０６−１４１３）、アロサミジン（ａｌｌｏｓａｍｉｄｉｎ）（Ｓａｋｕｄａ、Ｓ．（１９８６）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．２７：２４７５−２４７８）、バリノマイシン（Ｈｅｉｓｅｙ、Ｒ．（１９８８）Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｎ．３６：１２８３−１２８６）、ピロリジン誘導体（Ｊｉｚｂａ、Ｊ．ら（１９９２）ＦｏｌｉａＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ３７：４６１−４６２）、レスピランチン（ｒｅｓｐｉｒａｎｔｉｎ）（Ｕｒｕｓｈｉｂａｔａ、Ｉ．ら（１９９３）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ４６：７０１−７０３）、プラシノン（ｐｒａｓｉｎｏｎｓ）（Ｂｏｘ、Ｓ．Ｊ．ら（１９７３）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６：６９９−７０４）、ピエルシジン（ｐｉｅｒｃｉｄｉｎ）（Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｎ．ら（１９６８）Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３２：１１１５−１１２２）、グリセウリン（ｇｒｉｓｅｕｌｉｎ）（Ｎａｉｒ、Ｍ．Ｇ．ら（１９９３）ＪＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ４６：１７６２−１７６３）、マルチノマイシン（ｍａｒｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）（Ｃａｒｔｅｒ、Ｇ．Ｔ．ら（１９９４）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ４７：１５４９−１５５３）、ファエリファンジン（ｆａｅｒｉｅｆｕｎｇｉｎ）（Ｎａｉｒ、Ｍ．Ｇ．ら（１９８９）Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．５２：７９７−８０９）、インドノマイシン（ｉｎｄａｎｏｍｙｃｉｎ）（Ｚｈａｎｇ、Ｄ．ら（１９９７）ＪＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ５０：６１７−６２０）、シクロホスチン（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｔｉｎ）（Ｋｕｒｏｋａｗａ、Ｔ．ら（１９９３）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ４６：１３１５−１３１８）、マウマイシン（ｍａｎｕｍｙｃｉｎ）（Ｚｅｅｃｋ、Ａ．ら（１９８７）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ４０：１５３０−１５４０）、イチシノマイシン（ｉｃｈｔｈｙｏｍｙｃｉｎ）（Ｚｉｚｋａ、Ｚ．ら（１９９１）Ｃｙｔｏｂｉｏｓ６５：３１−３８）、ヴァージニアマイシン（Ｐｒｉｋｒｙｌｏｖａ、Ｖ．ら（１９９２）ＦｏｌｉａＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：３８６−３８８）、スイダテストリン（ｓｕｉｄａｔｅｓｔｒｉｎ）（Ｋｎｕｅｓｓｅｌ、Ｉ．、ら（１９９８）Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｂ．１２０Ｂ：６３９−６４６）、グアラマイシン（ｇｕａｌａｍｙｃｉｎ）（Ｔｓｕｃｈｉｙａ、Ｋ．Ｊ．（１９９５）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ４８：６２６−６２９）、および他の殺虫性天然産物が、ストレプトミセス属系統に由来することが報告されている。
【０００５】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓは、その産物が、強力な抗ボトリチスマクロライドである、ガルボノリドＡ（ｇａｌｂｏｎｏｌｉｄｅＡ）およびガルボノリドＢ（ｇａｌｂｏｎｏｌｉｄｅＢ）であることが認識されている（ＰａｕｌＡ．Ｋ．およびＢａｎｅｒｊｅｅ、Ａ．Ｋ．（１９８３）ＦｏｌｉａＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：３８６−３９６；Ｓｉｇｍｕｎｄ、Ｊ．Ｍ．およびＨｉｒｓｃｈ、Ｃ．Ｆ．（１９９８）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ５１：８２９−８３６；Ａｃｈｅｎｂａｃｈ、Ｈ．特許番号ＤＥ８６−３６３２１６８；およびＺａｅｈｎｅｒ、Ｈ．特許番号ＤＥ３６３２１６８）。Ｎａｋａｙａｍａら（１９８７）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１：８５３−８６０は、コムギ黒錆病（Ｐｕｃｃｉｎｉａｇｒａｍｎｉｓ）の強力なインヒビターであるルツマイシン（ｒｕｓｔｍｉｃｉｎ）の発見を報告した。その後、ガルボノリドＡは、ルツマイシンと同一の分子であることが示された。Ａｃｈｅｎｂａｃｈら（１９８８）ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５４４：１２８−１４０は、ガルボノリドＡが、ガルボノリドＢよりも、多くのｅｎｄｏｍｙｃｅｔｏｕｓｙｅａｓｔｓおよび多くの不完全菌（例えば、ＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓおよびＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ）に対してずっと活性であることを報告した。イオノフォア活性、膜不安定化、ＤＮＡもしくはＲＮＡの生合成の阻害、またはキチン生合成の阻害についての証拠がないことは、これらのマクロライドに起因し得る。最近、Ｍａｎｄａｌａら（１９９８）ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：１４９４２−１４９４９）、およびＨａｒｒｉｓら（１９９８）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ５１：８３７−８４４；およびＨａｒｒｉｓ，Ｇ．ら、特許番号ＧＢ２３２４３００）は、ルツマイシンがイノシトールホスホセラミドシンテターゼ（スフィンゴリピド生合成における最初の真菌特異的酵素）を阻害することを実証した。本発明者らはここで、強力な殺虫特性を有し、多くの農業に関連する鱗翅目に対して活性を有する、Ｓ．ｇａｌｂｕｓの新規株を報告する。
【０００６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規化合物、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ登録番号３０２３２）および鱗翅目に対する殺虫薬としての使用について同じ活性を維持する。これらの変異体を提供する。本発明は、殺虫薬として使用するためのこの株からの代謝物上清を包含する。本発明はまた、請求項の株を、単独でかまたは他の化学的もしくは生物的殺虫薬と併用するかのいずれかで、植物または果実を処理して、鱗翅目の侵入を制御する方法を包含する。さらに、請求項の株を発酵させて、その殺虫薬としての生物活性を殺虫薬として増大させる方法を提供する。
【０００７】
（本発明の実施様式）
（微生物の寄託）
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓの菌株は、ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅＰａｔｅｎｔＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ），ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，１８１５ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，６１６０４，ＵＳＡにおいて、ブダペスト条約に従って、寄託されている。この登録番号は、ＮＲＲＬ３０２３２である。
【０００８】
この菌株は、培養物へのアクセスが本出願の係争中に利用可能となることを保証する条件下で、寄託されている。この寄託は、各国における外国の特許法によって要求された場合利用可能であり、ここで、この出願の写しまたはその結果（ｐｒｏｇｅｎｙ）が提出される。しかし、寄託物の有効性は、政府事業により譲渡された特許権の失効において本発明を実施するためのライセンスを設定しないことが理解されるべきである。
【０００９】
（定義）
本明細書中で使用される場合、特定の用語は、以下に定義された意味を有し得る。
【００１０】
単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を指図しなければ、複数の表示を含む。例えば、「ａｃｅｌｌ」という用語は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
【００１１】
「含む」という用語は、その組成物および方法が列挙した成分を含むが、他を除外しないことを意味するように意図される。「本質的に〜からなる」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、その組み合わせに任意の本質的に重要な他の成分を除外することを意味する。従って、本質的に本明細書中で定義されたような要素からなる組成物は、単離および精製方法からの痕跡混入物および農業的受容可能なキャリアを除外しない。「〜からなる」は、他の成分および本発明の組成物を適用するための重要な方法工程の痕跡要素を越えるものを除外することを意味する。これら変化（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）用語のそれぞれによって定義された実施形態は、本発明の範囲内である。
【００１２】
本明細書中で使用される場合、「生物学的制御」は、２番目の生物体を用いることによる、病原体または昆虫の制御として定義される。生物学的制御の公知のメカニズムは、根の表面上の空間に対して真菌をアウトコンピーティング（ｏｕｔ−ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ）することによって根腐れを制御する腸の細菌、または昆虫の害を制御するためのＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの適用を含む。抗生物質のような細菌の毒素が、病原体および昆虫を制御するために使用されてきた。その毒素を、単離および植物に直接適用し得るか、またはインサイチュで毒素を産生するように細菌種を投与し得る。
【００１３】
「真菌（ｆｕｎｇｕｓ）」または「真菌（ｆｕｎｇｉ）」という用語は、クロロフィルを欠く、広範に種々の有核の胞子を有する生物体を含む。真菌の例としては、酵母、カビ、ウドンコ病、錆菌類、およびキノコが挙げられる。
【００１４】
「細菌」という用語は、明確な核を有さないあらゆる原核生物を含む。
【００１５】
「殺真菌性」または「抗真菌性」は、真菌の死亡率を増加させるか、または増殖速度を阻害する物質の能力を意味する。
【００１６】
「抗生物質」は、別の生体を殺すまたは別の生体の増殖を阻害することができるあらゆる物質を含み、これらとしては、他の微生物が挙げられるがこれらに限定されない。抗生物質は、微生物によってか、または合成プロセスもしくは半合成プロセスによって産生され得る。
【００１７】
用語「変異体」とは、親菌株の改変体、および変異体または改変体を得るための方法をいい、ここで、殺虫活性は親菌株によって発現される活性よりも高い。「親菌株」とは、変異誘発前の初代Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ菌株として、本明細書中で定義される。このような変異体を得るために、親菌株は、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホンのような化学物質を用いてか、またはγ線、Ｘ線もしくはＵＶ放射線を用いた照射によってか、または当業者に周知の他の手段によって処理され得る。
【００１８】
「改変体」は、ＮＲＲＬ登録番号３０２３２の全ての同定する特徴を有する菌株であり、高ストリンジェンシーな条件下で、ＮＲＲＬ登録番号Ｂ−３０２３２のゲノムにハイブリダイズするゲノムを有する場合に同定され得る。
【００１９】
「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化される複合体を形成する反応をいう。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対形成、フーグスティーン結合、または任意の他の配列特異的な様式によって起こり得る。その複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、複数鎖の複合体を形成する３本以上の鎖、１本の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらのいずれかの組み合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行われ得る。一般的に、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、１０×ＳＳＣ中で、または同等のイオン強度／温度の溶液中で約４０℃にて行われる。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、代表的には６×ＳＳＣ中約５０℃で、そして高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、一般的に１×ＳＳＣ中約６０℃で行われる。
【００２０】
ＮＲＲＬ登録番号第３０２３２号の改変体はまた、ＮＲＲＬ登録番号第Ｂ−３０２３２号のゲノムと、８５％を越える、より好ましくは９０％を越える、またはより好ましくは９５％を越える配列同一性であるゲノム配列を有する菌株として定義され得る。ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）が、別の配列に対して特定の割合（例えば８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有することは、整列した場合、２つの配列を比較してその塩基（またはアミノ酸）の割合が同一であることを意味する。この整列および相同性の割合または配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム、例えばＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）補遺３０、第７．７．１８節、表７．７．１で記載されているものを用いて決定され得る。好ましくは、整列のためにデフォルトパラメーターを使用する。好ましい整列プログラムは、デフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝コード＝標準；フィルター＝無し；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予期＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；分類＝ＨＩＧＨＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複性、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細を、以下のインターネットアドレスにおいて見出し得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００２１】
「培養」という用語は、様々な種類の培地上または培地中での生物体の増殖をいう。
【００２２】
「ブロス培養物全体」とは、細胞および培地を両方含む液体培地をいう。
【００２３】
「上清」とは、培養液中で増殖した細胞を遠心分離、ろ過、沈降、または当該分野で周知の他の手段によって除去した場合に残る液体培養液をいう。
【００２４】
「有効量」は、有益なまたは望ましい結果を得るのに十分な量である。有効量を、１回以上の投与において投与し得る。治療および防御に関して、「有効量」は、昆虫が前成虫期または成虫期の成長において摂食、成長および再生する能力を減少、遅延または除去させるのに十分な量である。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「昆虫」という用語は、昆虫綱クラスの全ての生物体を含む。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「鱗翅目」という用語は、毛虫または寄生虫の形態をとる幼虫期、および蛾,またはチョウの形態をとる成虫期によって特徴付けられる昆虫階級をいう。
【００２７】
「前成虫」昆虫とは、例えば卵、幼生、および若虫を含む、成虫期より前の任意の形態の生物体を指す。
【００２８】
「殺虫性」とは、昆虫の死亡率を増加させるか、または増殖速度を阻害する物質の能力をいう。
【００２９】
「農薬の」は、昆虫、線虫、およびダニの死亡率を増加させるまたは増殖速度を阻害する物質の能力をいう。
【００３０】
「ポジティブコントロール」は、農薬活性を有することが知られている化合物を意味する。「ポジティブコントロール」は、市販の化学的農薬を含むがこれに限らない。
【００３１】
「ネガティブコントロール」という用語は、農薬活性を有さないことが公知の化合物を意味する。ネガティブコントロールの例は、水、培地ブランク、またはアセトン、エタノールもしくは酢酸エチルのような低濃度の溶媒である。
【００３２】
培地ブランクは、発酵微生物の非存在下において滅菌した発酵培養液から構成される。
【００３３】
「溶媒」という用語は、溶液中に別の物質を保持する任意の液体を含む。
【００３４】
「溶媒抽出可能」とは、溶媒に溶解し、そして次いで溶媒から単離し得る任意の化合物をいう。溶媒の例としては、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、アセトン、エタノール（ＥｔＯＨ）、アセトニトリル、メタノール（ＭｅＯＨ）、ブタノール（ＢｕＯＨ）、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような有機溶媒が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３５】
「代謝物」という用語は、生物学的活性を有する微生物の発酵の任意の化合物、物質または副産物をいう。
【００３６】
「組成物」は、活性薬剤および、不活性（例えば、検出可能な薬剤もしくは標識、または液体キャリア）、またはアジュバントのように活性な、別の化合物、キャリアまたは組成物との組み合わせを意味することを意図する。
【００３７】
本発明は、上記のように殺虫活性を有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、ＮＲＲＬ登録番号３０２３２、ならびにその変異体および改変体の全ての同定する特徴を有する菌株の生物学的に純粋な培地を提供する。１つの実施形態において、本発明は、ＮＲＲＬ登録番号３０２３２で示された菌株である。
【００３８】
本発明は、本明細書中に記載される菌株の生物学的に純粋な培地から、代謝産物を単離するためのプロセス、およびそれによって単離された代謝産物を提供する。この代謝産物は、抽出可能な溶媒であり、かつ１０，０００ダルトン未満の分子量を有することで特徴付けられる。
【００３９】
本明細書中で同定される生物学的に純粋な培地から生物学的に活性な上清を精製するためのプロセス、およびそれによって単離された上清が、さらに提供される。単離された上清は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓ、ＮＲＲＬ登録番号３０２３２、またはその変異体および改変体の殺虫活性と同様の殺虫活性を有する。
【００４０】
上記の生物学的に純粋な培地、上清、または単離された代謝産物およびキャリアの少なくとも１つを含有する組成物もまた、本発明によって提供される。別の局面において、この組成物は、さらに、少なくとも１つ化学農薬または生物学的農薬を含む。これらの組成物は、湿潤可能な粉末、顆粒、水性懸濁液、および乳剤、ならびにマイクロカプセル化された処方物の任意の１つ以上として処方される。
【００４１】
本発明によって組成物の良好な分散および接着を達成するために、ブロス培養物全体、上清、が画分および／または代謝産物／抗生物質を、分散および接着を補助する組成物を用いて処方することが有益であり得る。従って、適切な処方物は、当業者に公知である（湿潤可能な粉末、顆粒など、または適切な培養液などにおいてマイクロカプセル化され得るもの、水性流動可能な懸濁液もしくは水性懸濁液のような液体、および乳剤）。他の適切な処方物は、当業者に公知である。
【００４２】
上記の菌株、代謝産物、画分、上清およびこれらの活性成分を含有する組成物のいずれかを使用して、昆虫感染から植物、根または果物を処理または保護する方法を提供し得る。昆虫としては、鱗翅目、鞘翅類および双翅目からなる群より選択される昆虫が挙げられるがこれらに限定されない。１つの局面において、昆虫は、鱗翅目（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｅｘｉｇｕａ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、Ｐｌｕｔｅｌｌａｓｐｐ．、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａｚｅａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）である。
【００４３】
本発明の菌株を培養して、上清を単離することによって、殺虫剤として上清活性を生成するための方法もまた、本発明によって提供される。本発明によって生成される上清もまた、本明細書中で主張される。
【００４４】
メタノールおよび水の階段勾配を使用する逆相抽出、固相抽出によって、代謝産物が単離される。この代謝産物は、その分子量（１０，０００ダルトン未満）によって同定され得る。
【００４５】
本明細書中に列挙される全ての特許および刊行物は、参考として援用される。以下の実施例は、本発明の例示のために提供される。これらの実施例は、制限されるようには解釈されるべきではない。
【００４６】
（実施例）
以下の実施例は、本発明を例示することを意図するが、限定することは意図されない。
【００４７】
（実施例１）
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓ、菌株ＮＲＲＬ登録番号３０２３２の特徴づけ）
ＮＲＲＬ登録番号３０２３２を、１６ＳｒＲＮＡ配列決定に基づいて同定した。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子データ配列（ＡｃｃｕｌａｂＣｕｓｔｏｍｅｒＨａｎｄｂｏｏｋｖ．１．０）を産生するために使用されるプロトコールを、以下に記載する。
【００４８】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を、細菌コロニーから単離されたゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅する。増幅のために使用したプライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉ位００５および５３１に対応する。増幅産物を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（Ａｍｉｃｏｎ）分子量カットオフ膜を使用して、過剰なプライマーおよびｄＮＴＰから精製し、そしてアガロースゲル上の産物の一部を泳動させることによって、質および量について検査する。
【００４９】
１６ＳｒＲＮＡ増幅産物のサイクル配列決定を、ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳＤＮＡポリメラーゼおよびｄＲｈｏｓｄａｍｉｎｅ色素ターミネータを使用して行う。過剰な色素−標識ターミネータを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０スピンカラムを使用して、配列決定反応物から除去した。産物を遠心分離により収集し、減圧下で乾燥し、そしてロードの準備が完了するまで−２０℃で凍結した。サンプルを、ホルムアミド／ルーデキストラン／ＥＤＴＡの溶液中に再懸濁し、そしてロード前に変性させる。このサンプルを、ＡＢＩＰｒｉｍｅ３７７ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒ上で電気泳動させる。データを、ＰＥ／ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓＤＮＡ編集およびアセンブリソフトウエアを用いて分析した。一旦得られると、配列を、ＭｉｃｒｏＳｅｑ^ＴＭ配列分析ソフトウエアを使用して、ＰＥ／ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓＭｉｃｒｏＳｅｑ^ＴＭデータベースと比較する。配列をまた、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｉｂｏｓｏｍａｌＤａｔａｂａｓｅＰｒｏｉｅｃｔ（ＲＤＰ）とも比較する。
【００５０】
１６ＳｒＲＮＡ配列決定の結果は、ＮＲＲＬ番号３０２３２を、９９％（ＧｅｎＢａｎｋ）の％ＩＤ、および０．９８（ＲＤＰ）の類似性ランクを有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓとして同定した。これらのスコアにより、特定のレベルにおける一致が示される。
【００５１】
（実施例２）
（植物病原体に対するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓ、ＮＲＲＬ登録番号３０２３２の活性）
新規のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓ菌株を、以下の様式において植物病原体に対して試験するために増殖した。単離された微生物を、３つの異なる放線菌類培養培地中で初めに発酵させた。培地３８を２ｇ／Ｌのトマトペースト、２ｇ／Ｌのカラスムギ紛、および１．０ｇ／Ｌの海塩から構成した。培地３１を４５ｇ／Ｌのカラスムギ紛、２ｇ／Ｌの酵母抽出物、６ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４および４．８ｇ／ＬのＮａ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ７）から構成した。培地６を２０ｇ／Ｌの可溶性デンプン、１０ｇ／Ｌのブドウ糖、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮ−ＺアミンＡ、および１ｇ／ＬのＣａＣＯ_３から構成した。
【００５２】
微生物を、トマト−カラスムギ寒天（２ｇ／Ｌのトマトペースト、２ｇ／Ｌのカラスムギ粉、および２０ｇ／Ｌの寒天）から選定し、発泡体プラグで栓をした１２ｍｌの滅菌発酵培地を含む５０ｍｌの円錐管に導入した。播種された管を、６日間回転式振盪機で２７±３℃にてインキュベートした。小規模の発酵産物の管を、ＢｅｃｋｍａｎＪＢ−６冷却遠心分離機の回転バケットローター（ＬＳ４．２）を使用して、４，２００ｒｐｍ（３，５００重力）で１５分間回転させた。この上清を、無菌的に収集し、そして滅菌した９６ディープウェル（ｄｅｅｐｗｅｌｌ）プレート、または自動化に従うラック中の５ｍｌの管に移した。各上清を、無菌的に、三連で滅菌した９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。化学制御を、培地ブランクおよび水制御に沿ってポジティブ検査として加えた。次いで、溶融寒天の層を階段的様式で重ねた（ｏｖｅｒｌａｙ）。
【００５３】
２５マイクロリットル（μｌ）の上清のアリコートを、７５μｌの２．５％溶解寒天で重ね、続いて、０．７５％ＰｏｔａｔｏＤｅｘｔｒｏｓｅＡｇｅｒ（ＰｏｔａｔｏＤｅｘｔｒｏｓｅＢｒｏｔｈ２３ｇ／Ｌ、寒天７．５ｇ／Ｌ）の１００μｌのアリコートで重ねた。最後に、２５μｌの病原体胞子懸濁液を、ＰＤＡの上面に重ね、そしてこのプレートを、２４±２℃で４日間インキュベートした。病原体増殖を、尺度指標を用いてランク付けし、この指標において、５つは水制御と等しい増殖を示し、１つの評点は、増殖が完全に無いことを示した。指標値（２）〜（４）は、胞子形成および増殖の中間レベルを表すが、（０）は、失敗した試験または不必要な試験を示す。
【００５４】
以下の病原体／化学対を試験した：Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｓｉｃｏｌａ（ＡＢＲＡＢｅｎｏｍｙｌ）、Ｂｏｔｒｙｔｒｉｓｃｉｎｅｒｅａ（ＢＯＴＣ／Ｂｅｎｏｒｎｙｌ）、Ｍｏｎｉｌｉｒａｕａｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ（ＭＯＮＦ／Ｂｅｎｏｍｙｌ），Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｐｓｉｃｉ（ＰＣＡＰ／Ｍｅｔａｌａｘｙｌ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ（ＰＳＴＯ／Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、およびＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃｏｃｃｏｉｄｅｓ（ＣＯＬＣ／Ｃｈｌ＋ｏｒｏｔｈａｌｏｎｉｌ）。表１は、３つの異なる反復試験の結果を示している。これらの試験は、３つの異なる発酵データを含み、そして以下に実証される。化学制御は、全ての独立した反復試験において、（１）の指標評点をスコア付けし；培地ブランクは、（５）の評点であった。
【００５５】
（表１．ＮＲＲＬ登録番号３０２３２殺真菌活性）
【００５６】
【表１】

これらのウェルのいくつかにおいて試験した病原体（特にＰＣＡＰＲｅｐ１）のわずかな阻害がいくらか存在したが、これらの結果は、Ｒｅｐ２において決定的に確証しなかった。全体的に、これらのデータは、新規株ＮＲＲＬ登録番号３０２３２の６日間の培養物の全培養液上清が、アガー拡散型アッセイにおける植物病原体の胞子に対して一般に活性でないことを示した。
【００５７】
（実施例３）
（昆虫に対するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ登録番号３０２３２）の活性）
殺虫活性を評価するために、６連の各微生物抽出物を、９６ウェルプレート中のコムギ胚芽／カゼインベースの人工食餌（２９ｇ／Ｌアガー、１３．８ｇ／ＬＣｅｌｕｆｉｌ、３８．５ｇ／Ｌスクロース、３２．２ｇ／Ｌカゼイン、２７．５ｇ／Ｌコムギ胚芽、９．２ｇ／ＬＷｅｓｓｏｎ塩混合物，９．０ｇ／Ｌビタミンプレミックス（ｖｉｔａｍｉｎｅｐｒｅｍｉｘ）、３３ｍｇ／Ｌストレプトマイシン、３３ｍｇ／Ｌクロロテトラサイクリンヒドロクロライド、１．２ｍｌ／Ｌプロピオン酸（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｃｉｄ）、０．１２ｍｌ／Ｌリン酸，１０ｍｌ／Ｌ１００標準強度のエタノール、１ｇ／Ｌメチルパラベン、０．３ｇ／Ｌ安息香酸ナトリウム、ｌ．０ｇ／Ｌソルビン酸）の上に重ねた。一時的に同期化したテンサイアワヨトウ（ｂｅｅｔａｒｍｙｗｏｒｍ）の卵を、衛生化し、そして希釈アガー溶液中に懸濁した。ＩｎｖｅｒｔｅｄＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）９６ウェルろ過プレートをテンプレートとして用いて、２５μｌの５〜１０個の７日齢の卵を、長方形のＷｈａｔｍａｎ（登録商標）＃２のろ紙に藩種した。ろ紙を、乾燥させ、逆さにし、そしてこの食餌／抽出物プレートのウェル開口部に適合させた。これらのろ紙を、通気性のプレートの蓋をカバーし、所定の位置にテーピングした。これらのプレートを、Ｐｅｒｃｉｖａｌ増殖チャンバ中で２８±２℃にて、１６：８の光周期下、３０〜４０％の相対湿度でインキュベートした。これらの卵は孵化し、そして新生仔は、その抽出物処理した食餌に落ちた。４日後、これらのプレートをＰｅｒｃｉｖａｌから回収し、セロハンテープ（登録商標）を取り除き、そしてこれらのプレートを卓上に落下させて、蠕虫をろ紙から外した。蓋／ろ紙を、透明なＭｙｌａｒの有孔片に置き換え、そして熱した鉄で所々シールした。この試験物を、もう１日、Ｐｅｒｃｉｖａｌに戻した。幼虫の成長を、植物病原体スクリーニングに類似した指標を用いて視覚的に評価した（ここでは、１等級が１００％の死亡率を示し、そして４等級が未処理のコントロールに等しい成長を示した）。２等級は、１００％未満であるが、５０％より高い死亡率または重度の発育不良を示す。３等級は、５０％未満であるが、２５％より高い死亡率または発育不良を示す。化学的コントロールプレートを、各反復の実験データについて実施した。Ｊａｖｅｌｉｎ（登録商標）；（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｋｕｒｓｔａｋｉ株）の８回の段階希釈（１０００〜７ＰＰＭ）は、用量応答データを得た。ウェスタンキュベット西洋斑点キュウリ（Ｗｅｓｔｅｒｎｓｐｏｔｔｅｄｃｕｃｕｍｂｅｒ）カブトムシ（ＣＲＷ：Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ）を、化学的コントロールとしてビフェンスリン（ｂｉｆｅｎｔｈｒｉｎ）を用いて、類似のアッセイで試験した。モモアカアブラムシ（ＧＰＡ：Ｍｙｚｕｓｐｅｒｓｉｃａｅ）またはエンドウヒゲナガアブラムシ（ＰＡ：Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎｐｉｓｕｍ）を、９６ウェルプレートアッセイにおいて試験した。上清を、９６ウェルプレートの底でろ紙ディスクに吸収させた。アブラムシを、ウェルに配置し、そしてパラフィルム膜を取り付けたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）９６ウェルフィルタープレートを用いて、この基礎プレートを覆った。フィルタープレートウェルに、４０μｌの上清および４０μｌの人工液体食餌（３００ｇ／Ｌスクロース、１０ｇ／Ｌカゼインヒドロシレート（ｈｙｄｒｏｓｙｌａｔｅ）、１ｇ／ＬＷｅｓｓｏｎ塩混合物、１ｇ／Ｌビタミンプレミックス、３３ｍｇ／Ｌストレプトマイシン、３３ｍｇ／Ｌクロロテトラサイクリンヒドロクロライド、１ｇ／Ｌメチルパラベン，０．３ｇ／Ｌ安息香酸ナトリウム、１．０ｇ／Ｌソルビン酸（ｐＨ６．８））でロードした。化学的コントロールプレートを、段階希釈したイミドクロプリド（ｉｍｉｄｏｃｌｏｐｒｉｄ）で処理し、ここで、基礎プレートで処理したろ紙は、接触活性を検出し、そして膜処理したウェルは、摂取活性を検出した。アブラムシの死亡率を、２４〜４８時間後に読み取った。水／食餌のコントロール膜上で摂食している生きたアブラムシの数および水処理したろ紙を有するウェル中で歩行／休息している生きたアブラムシの数を、表にした。上限および下限およびそれらの標準偏差を計算し、指標範囲算出を可能にした。２匹の斑点ハダニ（ｓｐｏｔｔｅｄｓｐｉｄｅｒｍｉｔ）（ＳＭ：Ｔｅｔｒａｎｙｒａｃｈｕｓｏｒｔｉｃａｅ）を、ろ紙を有する９６ウェルプレートを用いて評価した。上清（４０μｌ）、およびそれに続いて２０μｌアリコートの人工液体食餌を、ろ紙にピペッティングし、そしてこれらのプレートを、強制空気下で部分的に乾燥させた。死亡率を、２４〜４８時間後に評価した。段階希釈したアベルメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）を、化学的コントロールとして用いた。回虫（ＣＥ：Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ）、昆虫病原性（ｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）線虫（ＨＢ：Ｈｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｂａｃｔｅｒｉｏｐｈｏｒａ）および根瘤線虫（ＭＪ：Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｊａｖｏｎｉｃａ）を、９６ウェルプレート中のＪ２の液体懸濁液として評価した。Ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ（登録商標）を化学的コントロールとして用いた。
【００５８】
表２のこれらのデータは、テンサイアワヨトウに対するＮＲＲＬ登録番号３０２３２の特異性を示す。ＡＴＣＣ登録番号４９４６０は、スピノシン（ｓｐｉｎｏｓｙｎ）を産生する生物体であるＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｓｐｉｎｏｓａのＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎの野生型単離体である。Ｓｐａｒｋｓら（１９９９）“Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ−ｄｅｒｉｖｅｄｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｃｏｎｔｒｏｌａｇｅｎｔｓ：ｔｈｅｓｐｉｎｏｓｙｎｓ”Ｉｎ：Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ，ＵｓｅａｎｄＤｅｌｉｖｅｒｙ，ＨａｌｌＦ．Ｒ．ら，編，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ，１５５〜１７０頁を参照のこと。以下の表２に示されるように、ＡＴＣＣ登録番号４９４６０およびＮＲＲＬ登録番号３０２３２は両方とも、培地３１においてテンサイアワヨトウに対して活性であった。
【００５９】
（表２）
（ＮＲＲＬ３０２３２およびＡＴＣＣ４９４６０の殺虫活性）
【００６０】
【表２】

（実施例４）
（ＮＲＲＬ登録番号３０２３２によって産生される殺虫性代謝物の化学的特徴付け）
この活性原理の安定性を決定するために、全培養液の１ｍｌアリコートを、２Ｎの塩酸（ＨＣｌ）を用いてｐＨ１まで調整した。１時間後、ｐＨを、２Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて７に再調整した。同様に、全培養液の１ｍｌアリコートを、２Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いてｐＨ１０に調整した。１時間後、ｐＨを２ＮのＨＣｌで７に再調整した。酸処理の間、この活性は失われるが、塩基性条件下でこの活性は維持された。
【００６１】
この活性法則の抽出率を決定するために、２０ｍｌアリコートの全培養液を２０ｍｌの酢酸エチルを各々用いて３回分配し（全抽出量６０ｍｌ）、そして次いで、２０ｍｌの水飽和ｎ−ブタノール（ＢｕＯＨ）を用いて３回分配した（全抽出量６０ｍｌ）。残りの水相を含む全ての画分を乾燥させ、次いで再懸濁した。乾燥させたＥｔＯＡｃ抽出物をアセトン：水に懸濁し、ＢｕＯＨ画分をＥｔＯＨ：水に懸濁し、そして残りの水相を水に再懸濁して、等量の１×培養液まで戻した。各相由来の合わせた画分は、等容量からなった。１×でアッセイした場合、ＥｔＯＡｃ画分が活性な代謝物の大部分を含み、ほんの一部がＢｕＯＨ画分中に引きこまれたことを見出した。より希釈した濃度（１／４×）では、活性はＥｔＯＡｃ画分においてのみ観察された。
【００６２】
２００μｌのアセトン中の１０ｍｌの全培養液相当のＥｔＯＡｃ画分を、２５％のＭｅＯＨ：水、５０％のＭｅＯＨ：水、７５％のＭｅＯＨ：水、および１００％のＭｅＯＨの段階勾配を用いて、逆相（ＲＰ）固相抽出（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄｓｐｅ，ｏｃｔａｄｅｃｙｌ）によってさらに精製した。活性な代謝物を、１００％ＭｅＯＨで抽出した。
【００６３】
以下の表３のデータは、４回の抽出物／分配、２回の逆相クロマトグラフィー、および２回のｐＨ試験からの結果を示す。
【００６４】
（表３）
（ＮＲＲＬ登録番号３０２３２の生物活性；抽出物、分配、ＲＰクロマトグラフィーおよびｐＨ変更）
【００６５】
【表３】

殺真菌剤（代表的に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓに関連する）とは異なり、ＮＲＲＬ登録番号３０２３２の殺虫活性は、アルカリ性条件（ｐＨ９〜１０）下で安定であり、酸性（ｐＨ１〜２）下で不安定であった。
【００６６】
（実施例５）
（昆虫の害に対するＮＲＲＬ登録番号３０２３２の植物活性）
全植物試験は、テンサイアワヨトウに対するＮＲＲＬ登録番号３０２３２の活性を確証した。第１に、若いヘンダーソンブッシュライマメ（ｙｏｕｎｇＨｅｎｄｅｒｓｏｎｂｕｓｈｌｉｍａｂｅａｎ）由来の本葉を、３〜５秒間、全培養液に浸液させ、そして風乾させた。葉を、湿らせたろ紙および１０匹の第１齢の新生テンサイアワヨトウの幼虫を有する５０ｍｍのペトリー皿に配置した。死亡率を４８時間後に評価した。これらの結果を以下の表４に示す。
【００６７】
（表４）
（テンサイアワヨトウに対する葉浸液試験におけるＮＲＲＬ登録番号３０２３２の殺幼虫活性）
【００６８】
【表４】

類似の試験において、ＮＲＲＬ登録番号３０２３２は、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａｚｅａ、およびＡｎｔｉｃａｒｓｉａｇｅｍｍａｔａｌｉｓに対して、同じかまたはより良好な殺幼虫活性を実証した。
【００６９】
ＮＲＲＬ登録番号３０２３２の全培養液を９，０００×ｇで遠心し、そしてその上清を１週齢のＨｅｎｄｅｒｓｏｎＢｕｓｈライマメ植物にエアブラシを用いてスプレーした。新しい葉を乾燥させ、最も小さな本葉を収穫した。各葉（１回の処理あたり３連）を、湿らせたろ紙およびおよそ１０匹の新生幼虫を有する５０ｍｌのペトリー皿に配置した。これらのプレートを、インキュベーター（２８±２℃、１６：８光周期）にて４０時間後に読み取った。完全に伸長した本葉を有する大きな２週齢のマメ植物にスプレーして、潜在的な植物毒性を評価した。これらの結果を以下の表５に示す。
【００７０】
（表５）
（マメ葉におけるテンサイアワヨトウに対する上清およびＥｔＯＡｃ抽出物の有効性）
【００７１】
【表５】

^＊これは、表３において記録されたアッセイにおいて用いられた同じＥｔＯＡｃ抽出物である。
【００７２】
植物毒性は、これらのサンプルのいずれを用いても見られなかった。これらの葉の試験は、全培養液および上清が安定かつ強力であることを示す１次スクリーニングデータを支持する。このアッセイにおいて、酢酸エチルの画分は、葉にスプレーした場合、いく分かの活性を失った。
【００７３】
温室スケールでのさらなる全植物の試験は、テンサイアワヨトウに対する白菜（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）の植物防御を確証した。実験室トラック撒布器（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｔｒａｃｋｓｐｒａｙｅｒ）（ＤｅｖｒｉｅｓＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｍｉｃｈ．）を較正して、ＴＥＥ−ＪＥＴ８０１５ファンノズルを介して９０ガロン／エーカーのスプレー容積を送達した。成熟キャベツ植物を、脱イオン化水（ネガティブコントロール）、ＮＲＲＬ登録番号３０２３２の全培養液、または１．１ｂ／エーカーのＪａｖｅｌｉｎ（登録商標）ＷＧ（毒性標準）を用いて処理した。適用前に、ＮＲＲＬ登録番号３０２３２の全培養液を、２０秒間ＵｌｔｒａＴｕｒｒａｘ（Ｔｅｋｍａｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ）を用いて、機械的にホモジナイズした。各処理を３回反復した。このスプレー残渣を均一性についてチェックし、そして乾燥させた後、植物を、温室環境で、プレキシガラスおよびメッシュの囲い内に配置した。次いで、各植物に、およそ５０匹の新生幼虫およびおよそ５０個の卵を藩種した。必要な場合、葉からスプレー残渣または昆虫を洗い流すことなく、これらの植物に水を与えた。
【００７４】
７日目の定性的観察は、コントロール処理での顕著な昆虫の摂食障害、毒性標準処理（Ｊａｖｅｌｉｎ（登録商標））での少しの摂食障害、およびＮＲＲＬ登録番号３０２３２処理でのほとんどない摂食障害または非摂食障害を示した。これらの結果は、ＮＲＲＬ登録番号３０２３２処理が、優位な市場価値のある植物を生むことを示した。
【００７５】
（実施例６）
（発酵のスケールアップおよびキャタピラの害に対する活性の安定性）
発酵のスケールアップの問題は、潜在的なバイオ農薬の評価のクリティカルパスにおける有意な要素である（ＨｏｆｓｔｅｉｎおよびＦｒｅｉｄｌｅｎｄｅｒ（１９９４）“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄｄｅｌｉｖｅｒｙｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒｂｉｏｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ”Ｉｎ：ＢｒｉｇｈｔｏｎＣｒｏｐＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ：ＰｅｓｔｓａｎｄＤｉｓｅａｓｅ，ＢＣＰＣｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＭａｊｏｒＰｒｉｎｔＬｔｄ．，ＮｏｔｔｉｎｇｈａｍＵＫ，１２７３〜１２８０頁）。発酵の容量の５０ｍｌチューブ（Ｔ１）中での１２ｍｌから２５０ｍｌの振盪フラスコ（Ｓ１）中での５０ｍｌへの増加は、スケールアッププロセスにおける第１工程である。高速真空によるこの工程からの上清の濃度は、２×、ｌ×、および０．５×で試験した場合、ポジティブな用量応答を生じるＮＲＲＬ登録番号３０２３２の生物学的活性においてネガティブな作用がなかった。Ｓ１発酵由来のＮＲＲＬ登録番号３０２３２の安定性試験は、４℃での冷蔵下または−８０℃での冷凍下で維持される場合、テンサイアワヨトウに対する活性は、２〜３週間安定であることを示した。これらの結果を、以下の表６および表７に示す。
【００７６】
（表６）
（２５０ｍｌの振盪フラスコ（Ｓ１）および５０ｍｌのチューブ（Ｔ１）において成長させた１週齢（Ｗ１）の培養液の生物活性）
【００７７】
【表６】

（表７）
（２５０ｍｌの振盪フラスコ（Ｓ１）において成長させた２週齢（Ｗ２）の３０２３２培養液の生物活性）
【００７８】
【表７】

以下の表８は、２５０ｍｌのフラスコ由来の生物活性の特異性を最初の５０ｍｌチューブの発酵におけるのと同様にテンサイアワヨトウに制限した場合のこれらの結果を示す。
【００７９】
（表８）
（２５０ｍｌの振盪フラスコ（Ｓ１）において成長させた３週齢（Ｗ３）の冷凍し、凍結させたＮＲＲＬ登録番号３０２３２培養液の生物活性）
【００８０】
【表８】

スケールアッププロセスにおける第２工程は、２５０ｍｌのフラスコ（Ｓ２）における５０ｍｌの容量の反復である。５０ｍｌチューブにおける同時発酵は、株の活性を実証した。結果を以下の表９に示す。
（表９）
（２５０ｍｌの振盪フラスコ（Ｓ２）および５０ｍｌのチューブ（Ｔ２）において成長させた１週齢（Ｗ２）の培養液の応答）
【００８１】
【表９】

容量を増加させた場合、培地３８生物活性は、培地３１と比較して低下した。ＳｉｇｍｕｎｄＪ．Ｍ．およびＨｉｒｓｃｈ，Ｃ．Ｆ．（１９９８）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ５１：８２９−８３６は、トマトペーストの添加が、殺真菌活性の産生において重要な成分となること実証した。ルストミシン（ｒｕｓｔｍｉｃｉｎ）（Ｓｇａｌｂｕｓによって産生される）を用いて見られることとは対照的に、本発明者らのスケールアップは、容量を増加させた場合、複雑なカラスムギ粉末（ｃｏｍｐｌｅｘｏａｔｆｌｏｕｒ）培地（３１）がＮＲＲＬ登録番号３０２３２の殺虫活性がトマトペーストベースの培地３８を超えて増加することを示した。容量における２つのさらなる増加は、培地３１の有効性を確証した。Ｓ３は、バフルされた（ｂａｆｆｌｅ）１Ｌのフラスコ中の２００ｍｌの培地３１を利用し、そしてＳ４は、バフルされていない２．８ＬのＦｅｒｎｂａｃｈフラスコ中の５００ｍｌの容量を利用した。これらの結果を以下の表１０に示す。
【００８２】
（表１０）
（１，０００ｍｌの振盪フラスコ（Ｓ３）および２，８００ｍｌのＦｅｒｎｂａｃｈフラスコ（Ｓ４）において成長させた２週齢（Ｗ２）の培養液の生物活性）
【００８３】
【表１０】

２８００ｍｌのＦｅｒｎｂａｃｈフラスコにおける５００ｍｌの培地３１への３工程を介した発酵のサイズの増加は、ＮＲＲＬ登録番号３０２３２の殺虫活性においてネガティブな作用がなかった。
【００８４】
前述の発明は、理解の明確さを期すために、例証および実施例によっていくらか詳細に記載されてきたが、特定の変更および改変がなされることは、当業者には明白である。従って、説明および実施例は、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではなく、本発明は、添付の特許請求の範囲によって線引きされる。

Claims

単離されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓ株であって、
前記株は、登録番号３０２３２としてＮＲＲＬに寄託されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓ株、及び、登録番号３０２３２としてＮＲＲＬに寄託されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓ株の改変体からなる群より選択され、
前記改変体は、そのゲノムが、登録番号３０２３２としてＮＲＲＬに寄託されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓ株のゲノムと、高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズし、且つ、鱗翅目に対する殺虫活性を有する改変体である、
株。
単離されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓ株であって、
前記株は、登録番号３０２３２としてＮＲＲＬに寄託されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓ株、及び、登録番号３０２３２としてＮＲＲＬに寄託されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓ株の改変体からなる群より選択され、
前記改変体は、そのゲノムが、登録番号３０２３２としてＮＲＲＬに寄託されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇａｌｂｕｓ株のゲノムと、９５％を超える配列同一性を有し、且つ、鱗翅目に対する殺虫活性を有する改変体である、
株。
請求項１または２に記載の株と、少なくとも１種の化学的殺虫薬または生物的殺虫薬とを含む、組成物。
植物、根もしくは果実での昆虫のインフェステーションを防止するため、または植物、根もしくは果実を処理するための方法であって、
該方法は、該植物、根もしくは果実に、有効量の請求項１または２に記載の単離された株を適用する工程を包含する、方法。
請求項４に記載の方法であって、前記昆虫は、鱗翅目、鞘翅類および双翅目からなる群より選択される、方法。
請求項４に記載の方法であって、前記昆虫は、鱗翅目である、方法。
請求項６に記載の方法であって、前記鱗翅目のインフェステーションは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｅｘｉｇｕａ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、Ｐｌｕｔｅｌｌａｓｐｐ．、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａｚｅａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉからなる群より選択される少なくとも１種の昆虫により引き起こされる、方法。
植物、根もしくは果実での昆虫のインフェステーションを防止するため、または植物、根もしくは果実を処理するための方法であって、
該方法は、該植物、根もしくは果実に、有効量の請求項３に記載の組成物を適用する工程を包含する、方法。
請求項８に記載の方法であって、前記昆虫は、鱗翅目、鞘翅類および双翅目からなる群より選択される、方法。
請求項９に記載の方法であって、前記昆虫は、鱗翅目である、方法。
請求項１０に記載の方法であって、前記鱗翅目のインフェステーションは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｅｘｉｇｕａ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、Ｐｌｕｔｅｌｌａｓｐｐ．、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａｚｅａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉからなる群より選択される少なくとも１種の昆虫により引き起こされる、方法。
請求項１または請求項２に記載の株を含む、培養物。
植物、根もしくは果実での昆虫のインフェステーションを防止するため、または植物、根もしくは果実を処理するための方法であって、
該方法は、該植物、根もしくは果実に、有効量の請求項１２に記載の培養物を適用する工程を包含する、方法。
請求項１３に記載の方法であって、前記昆虫は、鱗翅目、鞘翅類および双翅目からなる群より選択される、方法。
請求項１４に記載の方法であって、前記昆虫は、鱗翅目である、方法。
請求項１５に記載の方法であって、前記鱗翅目のインフェステーションは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｅｘｉｇｕａ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、Ｐｌｕｔｅｌｌａｓｐｐ．、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａｚｅａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉからなる群より選択される少なくとも１種の昆虫により引き起こされる、方法。