JP4740456B2 - 鳥類卵の尿膜液を局在化させるための方法 - Google Patents

Description

【０００１】
技術分野
本発明は、鳥類の卵殻に存在する尿膜液を容易に試料採取し、評価することができるように、または物質を注射することができるように、液を貯留または局在化させる方法に関する。従って、本発明はまた、卵の尿膜に含有される尿膜液を試料採取または検討する目的のために、卵の尿膜内に探針を方向づける方法と、卵殻の尿膜内に物質を注射する方法とに関する。
【０００２】
背景技術
尿膜または尿膜嚢は、第5日から第13日の卵に発生して、大きくなり、その後は、卵が孵化するまでに吸収されて、サイズが小さくなる。尿膜嚢は、呼吸面、カルシウム吸着組織、中腎によって排泄される尿のための液体廃棄物容器および胚の後期発育を維持するための貯水器として機能する。尿膜嚢は孵卵約第11日めにピーク容量に達し、約第13日め以降サイズが減少し始める。尿膜嚢は、本質的に、胚周囲まで成長するので、通常、内殻膜下に比較的薄い層として存在し、最大容量期間中であっても注射標的として困難である。
【０００３】
インフルエンザおよび他のウィルスワクチンを作製するための方法は
発育鶏卵中でのウィルスの増殖を含む。典型的には、尿膜腔内に小容量のウィルスを注射することによって、各卵に接種しなければならない。次いで、注射後の卵を孵卵し、尿膜液およびその中で増殖中のウィルスの採取を可能にするために開口する。例えば、Lobmannに付与された米国特許第4,338,296号を参照。
【０００４】
また、その後孵化した鶏において有用な影響を実施するために、種々の物質を鳥類胚にin ovoで注射するか、または発育鳥類卵内の種々のコンパートメント内に注射することができる。このような有用な影響には、成長の促進、疾患の予防、多数の孵卵中の卵の孵化割合の増加および孵化後の家禽の身体的特徴の改善が挙げられる。また、ある種の接種はin ovo投与に好適である（Sharmaに付与された米国特許第4,458,630号参照）。
【０００５】
鳥類の卵の尿膜液を試料採取するまたは尿膜液に注射する一方法は、尿膜を位置付けるために個々の卵を明かりに透かし見て、次いで注射筒を使用して手で尿膜に注射するまたは尿膜を試料採取することを含む。手で尿膜内に注射することは、尿膜内で種々の微生物を培養する目的のために生物科学において実施されている。しかし、高容量または自動化された方法を使用した尿膜の信頼できる標的化は困難であるので、家禽業界は、一般に、注射標的として尿膜を使用していない。
【０００６】
数多くの自動式卵注射装置が開発されている。これらには、全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている、Lewisに付与された米国特許第5,056,464号、Hebrankに付与された米国特許第4,903,635号および同第4,681,063号、Paulらに付与された米国特許第5,136,979号並びにMillerに付与された米国特許第4,040,388号、同第4,469,047号および同第4,593,646号が挙げられる。
【０００７】
最近、気嚢および気嚢膜を横切ることによって、垂直に配向された卵の大端を介して垂直下方向の注射を使用して尿膜内に注射する家禽業界の努力が報告されているが、従来の卵注射装置を使用して大規模スケールでこれを実施する努力においては、尿膜の代わりに気嚢または羊膜にかなりの数の注射が実施される結果もまじっている。従って、本発明の目的は、例えば卵中で培養されうる微生物又は胚に有益である物質を注射するために信頼性高く尿膜嚢を標的化できる方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、尿膜嚢内に含有される尿膜液を分析または試料採取する目的のために、皮下針などの探針を突き刺すために信頼性高く尿膜嚢を標的化することができる方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、従来の卵注射装置を使用して大規模スケールで卵の尿膜内に信頼性高く注射するための改善された方法を提供することと、気室膜（air cell membrane）を突き刺すことなく、尿膜に注射するまたは到達する方法を提供することとである。本発明のさらに別の目的は、従来の卵装置を使用して大規模スケールで卵の尿膜内に注射する過程において改善された卵トレーを使用する方法を提供することである。本発明のこれらの目的および他の目的は、以下の説明および請求の範囲を考慮すると当業者に明らかになる。
【０００８】
発明の開示
本発明の方法によると、卵の主要軸が、気嚢を含有する卵の直立した大端が0度の位置を規定する、垂直に直立した位置から約10〜180度であるように、鳥類の卵殻を回転または傾斜させる。垂直に直立した位置から卵をこのように配向させることにより、卵の最上部に尿膜を貯留させることができる。尿膜嚢のこの肥大した領域は、注射または試料採取の標的とされる；注射器または試料採取装置は尿膜に到達するために気室を横切らなくてもよい。
【０００９】
卵に注射する角度は垂直に下方、水平または任意の便利な角度であってもよい。卵の長軸が垂直から約10度または約20度より大きい場合、尿膜嚢は、便利なことに、従来の卵注射装置を使用して下方に垂直な注射によって標的化される。卵の配向は、注射器または試料採取装置が卵の気嚢を横切らないように選択することができる。このように卵に注射することは、垂直下方向に移動する注射針を使用する従来の卵注射装置と併用して、所定の角度に複数の鳥類の卵を配向するように設計されている卵トレーを利用する本発明の方法によって、容易となる。
【００１０】
卵の尿膜が注射の標的とされる場合には、注射針は、最も大きい容量を有する尿膜嚢の領域、従って最も大きい標的領域を標的化する所定の角度および深さで卵内に方向付けられる。尿膜内への注射の確率を最適化するための、卵の配向、尿膜嚢の構造並びに注射の位置および方向との関係は本発明の以下の図面および詳細な説明から明らかになる。
【００１１】
本発明の第一の態様は、孵卵の最後の四半期中に鳥類の卵の尿膜内に物質を注射するための方法である。卵の長軸は、（上方向の垂直位置にある卵の大端が垂直0度を規定する）垂直から約10度〜180度の所定の角度に配向される。卵のこの配向により、卵殻の上方部分の下の卵領域に卵の尿膜を貯留させて、尿膜嚢を肥大させる。針は卵殻を介して下方向に、肥大した尿膜嚢内に直接挿入され、物質が尿膜内に注射される。
【００１２】
本発明のさらに別の態様は、孵卵第16日から第19日の複数の鶏卵の尿膜内に物質を注射するための方法である。卵は、卵トレー上で、（垂直0度が垂直上方向の位置にある卵の大端によって規定される）垂直から約10度〜180度の所定の角度に配向される。卵のこの配向は、卵殻の上方部分の下の卵の所定の領域に各卵の尿膜を貯留させ、尿膜嚢を肥大させる。注射針は卵殻を介して各卵の肥大した尿膜嚢に下方向に挿入され、物質が各卵の尿膜内に針を介して注射される。
【００１３】
本発明のさらに別の態様は、孵卵の最後の四半期の鳥類の卵の尿膜内に探針を方向付けるための方法である。卵の長軸は、（上方向に垂直位置の卵の大端が垂直0度を規定する）垂直から約10度〜180度の所定の角度に配向される。この配向により、卵殻の上方部分の下に尿膜嚢を貯留させ肥大させる。探針は、卵殻を介して肥大した尿膜嚢内に下方に挿入される。
【００１４】
好ましい実施態様の説明
本発明は、発育家禽卵の尿膜または尿膜嚢を信頼性高く配置、局在化および/または標的化するための方法を提供する。本明細書において使用する「家禽」という用語には鶏、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジおよびダチョウ並びに卵の生産のために家庭で飼育される他の鳥類が含まれる。
【００１５】
孵卵の最終段階において、尿膜は、通常、鳥類の卵の内側の卵殻膜下の比較的薄い層として存在し、本質的にその中の胚を取り囲む。後期段階（第三および第四四半期）の発育卵において、尿膜は正確に注射するのが困難な標的である。本発明は、例えば針または探針を使用して尿膜の内容物を信頼性高く標的化することができるように、鳥類の卵を配向することに関する。このような方法は、発育鳥類の卵の尿膜内に物質を注射する際、および鳥類の卵の尿膜内容物を試料採取または評価する際に有用である。卵を適切に配向することにより、尿膜コンパートメントへの接近しやすさが高まる。
【００１６】
卵殻が気室の上部から除去された卵では、卵の長軸が垂直から移動したとき、尿膜は最初卵の下部に貯留するが、数秒後、卵の上方面に移動することを本発明者らは意想外にも見出した（本明細書の実施例8参照）。気室上部に卵殻が維持されている（および見るために卵殻のごく小さい窓が開けられている）卵では、卵の長軸が垂直から移動されたとき、尿膜は、卵の下側への最初の位置付けを受けなかったことが追加の検討により明らかになった。本発明の1つの理論に結びつけることは望まないが、卵殻が無傷の正常な卵では、卵内の内部圧を維持する際に、卵殻が何らかの役割を果たし、これが、気室の上部から卵殻が除去されている卵で観察された尿膜の最初の下方への移動を防ぐと本発明者らは考える。
【００１７】
Phelpsらに付与された米国特許第5699751号は、卵殻の下方側に尿膜を貯留し、肥大させるために、垂直からある角度に鳥類の卵を配向させることを記載している。米国特許第5699751号は、尿膜への注射は、気室に突き刺すことなく尿膜に到達するために、上方向にまたは卵の横から行うべきであることを教示している。注射を下方向に実施すると、針が尿膜に到達するために気室を横切ることを米国特許第5699751号は教示している。卵が転倒される場合には、米国特許第5699751号が、尿膜の貯留部分に到達するために気室を介した上方向の注射を開示している。前記米国特許の教示内容とは異なって、無傷の卵殻では、卵の長軸が垂直から傾斜されると、卵殻の上面の下に尿膜が貯留し、肥大することを本発明者らは予期しないことに見出した。転倒された卵では、本発明者らは、卵の大端に配置される気室の反対側の卵の小端（最上端）に尿膜が貯留することを測定した。
【００１８】
本明細書において使用する卵の「頂部」は、（気室を含有する）大端であり、「底部」は小端である。卵の「長軸」（BB'）は、卵の頂部から底部まで通過するもので、矢状軸（sagittal axis）または短軸（CC）はそれに直角である。図3Bに示すように、面BCの断面は、本明細書では、冠状または正面断面、すなわち、短軸（または矢状軸）に直角な面に沿った長軸で卵を半分に分割するものと考えられる。矢状断面は、長軸に直角な面に沿った短軸で卵を半分に（すなわち、頂部と底部に）分割するものである。卵が直立（または転倒）されている場合には、「卵殻の上方面」は、長軸の中点と交差する水平の矢状面より上の卵殻である。卵が垂直から角度付けられている場合には（長軸B-B'が垂直軸A-A'から角度付けられている場合には）、本明細書において使用する「卵殻の上方面」は面BCの上の卵殻部分領域であり（図3B）、本明細書において使用する卵殻の「上方4分の1区」は、面BCの上の卵殻の領域であり、かつ長軸の中点と交差し、長軸と垂直な矢状面の上にある領域でもある。
【００１９】
図1を参照すると、垂直軸A-A'からα度に角度付けられた主要軸または長軸B-B'を有する卵10が例示されている。卵10では、気嚢11は気嚢膜13によって尿膜嚢12から分離されている。尿膜嚢12は、卵の配向の変化に応答して卵内で流体で流動可能である尿膜16を含有する。15で一般に示した卵の大部分は羊膜、卵白および卵黄嚢並びに発育中の鶏胚（図示せず）を含有する。
【００２０】
図1をさらに参照すると、尿膜は、卵の垂直以外の配向の結果として卵の上方右側に貯留し、それによって一般に卵殻の上方4分の1区の下に配置された、16で一般に示した尿膜嚢の肥大した部分が生じる。尿膜嚢のこの肥大した部分は物質を尿膜内に注射するため、または試料採取用装置または探針を尿膜内に挿入するための標的領域を形成する。物質を尿膜内に注射するために尿膜内へ注射装置を挿入することに関する、以下に記載の本発明の方法は、試料採取装置、探針または他の分析もしくは診断用装置または物質を尿膜内に挿入することに、等しく好適である。
【００２１】
16の尿膜内への注射は、図1によってさらに例示されるようにいくつかの異なる角度から効果的に実施することができる。例えば、尿膜嚢に進入するために、注射は垂直下方向に軸A-A'に平行に卵の上方4分の1区を介して開始することができる（図示せず）。または、注射は、側面から水平に（図示せず）または針17で示した角度で、卵の上方面に開始することができる。本発明の方法を使用すると、垂直下方に移動する針または探針を使用する場合でも、尿膜の注射または貫通は気室膜の注射または貫通を必ずしも生じない。針は尿膜嚢に直接接近するが、卵内への針の貫通程度は注射角度の関数である。
【００２２】
尿膜のサイズは、注射予定の卵の胚の発育の段階と関係がある。従って、尿膜に到達するのに必要な注射または挿入の深さは卵の発育段階並びに使用する鳥類の卵の種および株に応じて変化する。鶏卵では、胚発育16〜19日の卵が本発明に使用するのに好ましい。その理由は、この段階の尿膜は比較的大きいからである。17〜18日が特に好ましい。注射または挿入の深さは尿膜内に針または探針を配置するのに十分な深さでなければならないが、羊膜または胚を貫通するほど深くてはいけない。先端が尖っていない針を使用することによって羊膜または胚の貫通を最小にする。胚発育16〜19日の鶏卵では、卵殻面下、1/8〜1/4インチの注射または挿入が好ましい。
【００２３】
本発明の方法は、有利なことに、卵の最上部側を介した進入を可能にする。ほとんどの市販の卵注射装置は、垂直に、卵内に下方向に移動する針を使用して卵に注射するように設計されている。例えば、Millerに付与された米国特許第4,469,047号、Hebrankに付与された同第4,681,063号、Hebrankに付与された同第4,903,635号、Lewisに付与された同第5,056,464号、PaulおよびIlichに付与された同第5,136,979号、並びにBoundsに付与された公開されたPCT出願WO98/31216を参照。（本明細書に掲載されている全ての米国特許の内容は全体の内容が本明細書に組み入れられていることが意図されている）。卵を配向する本発明の方法はまた、垂直下方の注射を可能にすると同時に、気室膜の貫通を回避する。従って、注射の好ましい方法は、針17の進行に沿った下方向である。その理由は、この注射方法は、現行の自動式注射機械にわずかな改良を加えるだけでより容易に実施されるからである。
【００２４】
注射の正確な位置および角度が選択の問題であり、尿膜の上層の卵の上面のいずれの領域であってもよいことが当業者に理解される。針の配向は卵の配向および注射を実施するのに利用される装置に依存する。図1に角度αで例示された卵の配向は垂直から約45度であるが、配向は約10度から180度まで広げることができる（図2に示す配向）。好ましくは、貯留した尿膜注射標的領域を最大にすると同時に垂直下方向の注射も可能にするためには、角度αは少なくとも15度であり、好ましくは少なくとも約20〜30度で、約90度まで、または180度までである。好ましい卵配向角度は約20度〜約45度を含む。卵の長軸がより垂直に近いように、すなわち角度αが約10度より小さいように卵に注射すると、注射針が気室を横切る可能性が増加する。気室の貫通を回避することが望まれる場合には、同様の発育齢および条件で、同一の品種および株の鳥の卵を使用したルーティーンの実験により、このような卵の大多数において気室を貫通させない卵の最小配向角度を決定することができる。
【００２５】
ここで図2を参照すると、α180度の転倒した垂直位置の卵20が例示されており、軸A-A'/B-B'に沿った下方向の配向にある卵の大端が気嚢を含有している。卵の内部構成要素は図1のように識別される。本発明の構造において、尿膜16は卵の頂部に貯留して尿膜嚢の肥大した部分を形成する。この配向において、尿膜内への注射は、例えば軸A-A'に沿って、卵の小端内に下方に移動する垂直針または探針を使用して効果的に実施することができる。（卵の小端への注射は、大端への注射と比較して、ひびが入る卵の数を増加させる。）または、注射は、水平または角度を付けた針でどちらの側からでも実施することができる。軸A-A'に沿った垂直下方の注射は、一般に、卵に注射するのに好ましい。その理由は、このような注射は、わずかな改良を加えた現行の卵注射装置で最も容易に実施することができるからである。
【００２６】
図3Aは、孵卵の最後の四半期の発育鶏卵の内部コンパートメントの一般的な位置を示す。卵30に示すように、尿膜16は基質11の下層にあり、本質的に、卵黄嚢、羊膜、卵白および胚（図示せず）を含有する15として一般に示された領域を取り囲んでいる。卵30は垂直に配向され、長軸B-B'は垂直軸A-A'に対応する。図3Bは、長軸B-B'が垂直軸A-Aから45°配向され、短軸または矢状軸C-Cを示す卵50を例示する。面BCは卵殻を上方面と下方面に分離する。
【００２７】
図4〜11は、種々に配向（直立、垂直から45°、垂直から90°および垂直から180°）された種々の発育日数（孵卵12日から18日）のブロイラー産の鶏卵の正面断面図（すなわち、長軸B-B'に本質的に平行である）の写真の透写図である。気室11および尿膜16の位置を示す。
【００２８】
本明細書において使用する「鳥」および「鳥類」という用語は、任意の鳥類種の雄または雌を含むが、卵または肉のために市販用に飼養される家禽を含むことを主に意図している。従って、「鳥」および「鳥類」という用語は、鶏、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジを含むことを特に意図している。本明細書に使用する「in ovo」という用語は、孵化する前の卵内に含有される鳥をいう。本発明は、鶏、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジを含む任意の種類の鳥の卵で実施することができる。鶏および七面鳥の卵が好ましく、鶏卵が最も好ましい。本発明の方法に使用する卵は、尿膜に注射するまたは尿膜を試料採取する理由に応じて、任意の孵卵段階であってもよい。注射がその後孵化する鳥に有用な物質である場合には、注射は、好ましくは、孵卵の第四四半期に行う。本明細書において使用する「18日め」の卵は、この用語が当技術上理解されているように、孵卵の第18日めにある卵をいう。本発明の方法は、卵が受けている処理に応じて、任意の孵卵段階にある卵に使用することができる。例えば、増殖のための尿膜内への微生物の注射は、典型的には、鳥類の胚に有用なワクチンなどの物質の注射より、孵卵のより早期に行う。従って、本発明の方法は、孵卵の第一、第二、第三または第四四半期の卵に使用することができる。鶏卵の場合には、本発明の方法は、好ましくは、孵卵第5日ぐらいから孵卵第18日ぐらいまで使用される。
【００２９】
本明細書において使用する、卵の尿膜に「直接」針または探針または試料採取装置を挿入することは、気室または鳥類の胚を横切ることなく尿膜内に挿入することをいう。尿膜内に「直接」装置を挿入することは、卵殻および卵殻と尿膜嚢との間に差しはさまれた膜を貫通することを必要とすることが、当業者に理解される。しかし、このような直接的な挿入は気室または胚を横切らない。
【００３０】
本発明の方法は個々の卵に実施することができると同時に、市販の状況では、本発明の方法は、典型的には、複数の卵に実施される。一般に、市販の状況では、複数の卵が共通の孵卵器内でいっしょに孵卵される。孵卵の最終四半期が開始するころには、卵は孵卵器から孵化器に移される。この段階は「転移」として知られている。転移時には、尿膜内への有用な物質の注射ができると同様に、卵内の胚の条件または状態を評価するために尿膜液を試料採取または検出する段階を有利に実施することができる。
【００３１】
ここで図12を見ると、自動式卵注射装置に使用するための卵トレーが例示されている。トレー上の卵の望ましい配向は、図1に示す配向に応じて垂直からα度で、注射の方向は垂直下方である。卵トレーは、図13の拡大図でより明らかに例示されるように、望ましい角度で卵を保持するように構造化されている複数の卵容器41を備えた基部40を含む。
【００３２】
本発明を実施する際には、卵の大端が一般に上方向になるように、慣用の方法で、最初、卵を卵トレーに載せる。トレーは、慣用の手順により孵卵するために孵卵器内に配置することができる。卵に注射する用意ができたら、卵トレーを孵卵器から取り出し、卵注射機械の供給ベルト上に配置する。卵は、一般に、この段階では尿膜内に注射するために適切に配向されていないので、卵トレーは、図12に例示するような、例えば回転ブラシ42を備えてもよい卵配向ステーションを通過させる。ブラシ42は矢印43の方向に回転し、トレー40が矢印44の方向でブラシの下を移動するとき、ブラシの剛毛は卵を掃くように押し倒して、卵を卵トレーの容器41内で望ましい角度で落ちつかせる。回転ブラシと接触するために、卵のかなりの部分が支持用卵容器の上に延在するように、卵トレーは構成される。また、図12において、ブラシの左側の卵は全て適切に配向されるが、ブラシの下をまだ通過していない右側の卵は無作為に配向されていることがわかる。
【００３３】
図13を特に参照すると、卵容器41の構造は、卵の小端の形状に適合するほぼ楕円形部分45を含むことがわかり、傾斜部分46は隣接する容器の間に延在する。傾斜部分は、卵が望ましい配向にあるとき、卵の下に最大の支持を提供する後方への傾斜を有する。傾斜部分46の後方傾斜はまた、図13に例示するように回転ブラシに接触するため卵の前面の大きい領域を露出し、それによって望ましい配向への卵の移動を容易にする。卵トレーは、好ましくは、成形プラスチックまたは他の材料から製造され、大きい割合の開放領域（図示せず）が孵卵期間中卵周囲の空気循環を可能にする。このような製造および設計は選択の域であり、当業者の能力の範囲内である。
【００３４】
または、卵は、本質的に垂直直立に卵を配向する標準的な卵トレー内に含有され、垂直から卵を再度配向するようにトレー自体を傾斜することができる。または、自動式卵注射装置は、各カップが鳥類の卵の卵殻に固定された密封関係で受容されるように適合された複数のカップを使用してもよい。例えば、Hebrankに付与された米国特許第4,903,635号（全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている）を参照。本発明の方法での使用については、このようなカップは、本発明方法による注射のために、卵を垂直から配向させるのに使用することができる。卵はカップによって位置が保持され、注射器または探針がカップに機能的に結合する場合には、カップは注射のために卵の表面を位置付けると同時に、卵サイズの変化を調節する。一実施態様において、自動式卵注射装置は複数の可撓性カップを備え、その各々は、卵殻の部分に対して固定された密封関係で受容されるように適合される。卵殻がカップに固定されるように吸引するために、カップの内側と連絡する手段が提供される。カップに固定された卵が本発明の方法に好適な位置に再度配向されるように、カップは注射装置に回転可能であるように接続される。例えば、卵を含有する卵トレーを移動すると同時に、各卵の上方部分をカップ内に固定させることによって、またはカップ自体またはカップが回転可能であるように取り付けられた装置の一部を移動することによって、卵を再度配向することができる。
【００３５】
本発明の別の方法では、尿膜嚢は、尿膜液内に薬剤または物質を注射するのではなく、尿膜液を分析または試料採取する目的のために探針で突き刺す標的となる。診断または他の目的のために尿膜液を試料採取することが望ましい場合には、探針は、便利なことに、卵殻を突き刺す先端構造を有する皮下針であってもよい。または、探針は、尿膜液を現場分析するように設計されたバイオセンサーまたは他の装置を備えてもよい。どちらの場合でも、探針を挿入する前に本発明の方法により卵を配向することによって、所定の領域に尿膜嚢の容量を肥大させ、尿膜嚢を高い精度での試料採取または分析の標的とすることができる。
【００３６】
本発明は、成分の調査または分析のための尿膜液の試料採取を容易にするために鳥類の卵を配向することに関する。標準的に直立に配向された（大端が上）家禽の卵では、尿膜は内殻膜の下層の比較的薄い膜として存在し、試料採取装置の困難な標的となる。卵の長軸を垂直から配向させると（例えば、直立から45°、90°または180°）、尿膜が上方に貯留されて、尿膜コンパートメントを最も可能な標的領域とし、それによって試料採取する尿膜液の最大容量を含有する。
【００３７】
以下の実施例は本発明を例示するために記載され、本発明を限定するものではない。
【００３８】
実施例1
材料と方法：凍結卵
Cobb×Cobbブロイラー産鶏卵の尿膜コンパートメントに食品着色料を注射し、異なる配向で配置した。次いで、卵を凍結し、調査した。未変化の尿膜を調べるために、いくつかの卵は、穴をあけたり、染料を注射せず、配置し、凍結し、調査した。
【００３９】
染料の注射：卵は明かりに透かして見て、未受精卵および胚が生存していない卵は試料から除去した。残りの卵において、気室の最も低い境界にフェルトペンマーカーで外側の卵殻上に印をつけ、卵殻に印をつけた気室の真下に穴をあけるために22ゲージのパンチを使用した。200μLの青または緑の食品着色料を22gの針を取り付けた1ccの注射器を使用して各卵に注射した。
【００４０】
卵の配向：上記のように食品着色料を注射した卵を以下の配向でダンボールフラットに配列した：直立（大端が上）、直立から45°、直立から90°。実験台面に対して最も直角な点をフェルトペンマーカーで卵に印をつけた。卵を凍結し、次いで、卵の尿膜の位置を調査し、配向が異なる卵間で比較した。
【００４１】
実施例2
12日めの卵
実施例1に記載するように、12日めのCobb×Cobbブロイラー産の卵に染料を注射し、配向し、凍結した。卵の断面（正面断面）を調査し、最も大きい尿膜貯留（例えば、最も大きい容量の尿膜液）が上方にある（すなわち、最上部の卵殻面の下にある）ように尿膜が配向されているのが見出された。これらの卵の写真を撮影した（図示せず）。尿膜および気室の位置を示すために写真の一部の透写図を作成した。図4は直立した（垂直位置）12日めの卵を示し、図5は垂直から45°配向した12日めの卵を示し、図6は垂直から90°配向した12日めの卵を示す。図4〜6の各々において、貯留した尿膜16および気室11を示す。
【００４２】
実施例3
15日めの卵
いくつかの卵を転倒させる（すなわち、卵の小端が最上部または垂直から180°にある）ように配向する追加の段階を加えて、12日めの卵について上記したように15日めのCobb×Cobbブロイラー卵を処理した。また、180°に配向された卵においても、尿膜は、最も大きい尿膜の貯留（例えば、尿膜液の容量）が上方にある（すなわち、最上部にある卵殻の表面の下にある）ように配向されていることが見出された。これらの卵の写真を撮影した（図示せず）。図7に示すように、尿膜および気室の位置を示すために、垂直から180°配向された15日めの卵の透写を実施した。貯留した尿膜16は上方に配向された卵の小端にあることが見出され、気室11は卵の下方端（大端）にあることが見出された。
【００４３】
実施例4
18日めの卵
実施例1に記載するように、18日めのCobb×Cobbブロイラー産の卵に染料を注射し、配向し、凍結した（各配向についてn=8の卵）。卵の断面（正面断面）を調査し、最も大きい尿膜貯留（例えば、最も大きい容量の尿膜液）が上方にある（すなわち、最上部の卵殻面の下にある）ように尿膜が配向されているのが見出された。これらの卵の写真を撮影した（図示せず）。尿膜および気室の位置を示すために写真の一部の透写図を作成した。図8は直立した（垂直位置）18日めの卵を示し、図9は垂直から45°配向した18日めの卵を示し、図10は垂直から90°配向した18日めの卵を示し、図11は垂直から180°配向した18日めの卵を示す。図8〜11の各々において、貯留した尿膜16および気室11を示す。
【００４４】
実施例5
13日めの卵
18日めの卵について上記したように13日めのCobb×Cobbブロイラー卵を処理した。また、尿膜は、最も大きい尿膜の貯留（例えば、尿膜液の容量）が上方にある（すなわち、最上部にある卵殻の表面の下にある）ように配向されていることが見出された。これらの卵の写真を撮影した（図示せず）。
【００４５】
実施例6
14日めの卵
18日めの卵について上記したように14日めのCobb×Cobbブロイラー卵を処理した。また、尿膜は、最も大きい尿膜の貯留（例えば、尿膜液の容量）が上方にある（すなわち、最上部にある卵殻の表面の下にある）ように配向されていることが見出された。これらの卵の写真を撮影した（図示せず）。
【００４６】
実施例7
16日めの卵
各配向の卵のいくつかに染料を注射しない、および卵殻および卵殻膜に穴を形成しないことを除いて、18日めの卵について上記したように16日めのCobb×Cobbブロイラー卵を処理した。尿膜は、染色した卵および染色しなかった卵の両方において、最も大きい尿膜の貯留（例えば、尿膜液の容量）が上方にある（すなわち、最上部にある卵殻の表面の下にある）ように配向されていることが見出された。これらの卵の写真を撮影した（図示せず）。染色過程中の卵殻および膜に穴を形成することは尿膜の挙動に変化を与えないと思われる。
【００４７】
実施例8
15日めの卵：経時的な尿膜の動きの直接観察
15日めのCobb×Cobbブロイラー卵を入手し、卵殻膜を破壊することなく、気室の上部の卵殻を注意深く除去した。膜をより透明にし、尿膜嚢液の動きの直接観察を容易にするために、植物油を無傷の膜に施与した。卵を直立から90°傾斜したとき、尿膜は、最初、下方（すなわち、下方にある卵殻面に最も接近して）に配向することが観察された。約10秒以内で、尿膜は上方に移動し、上記のように上方位置に落ち着いた。尿膜のこの最初の下方への移動は、直立から90°未満の角度まで移動させた卵、例えば直立から45°配向させた卵においても見られた。
【００４８】
気室上部の卵殻の除去が尿膜の移動に影響を与えるかどうかを判定するために、15日めのCobb×Cobbブロイラー産の卵を入手し、卵の側面に小さい「窓」を形成するために卵殻を注意深く除去したが、卵膜は無傷のままとした。気室上部の卵殻は無傷のままとした。卵を垂直から180までの角度に移動させた。気室を覆う卵殻を欠損した15日めの卵の尿膜の動きとは異なって、気室上の卵殻が無傷のままである卵では、尿膜は、最初、卵の下方向に配向しなかった（垂直から1°〜180°に移動させた卵を観察した）。気室上部の卵殻を欠損している卵に見られる初期の下方への配向を伴うことなく、尿膜は上記の実施例2〜7に記載するように配向した。
【００４９】
実施例9
卵の側面を介する尿膜への注射
尿膜液を標的とするための鳥類の卵殻の側面を介した注射の信頼性を評価するために、17日めおよび18日めの鶏卵にラテックスを注射した。卵を明かりで透かして見て、気室と胚の間に観察される境界を卵殻に印した。気室線の下約1/8"〜1/4"（すなわち、底部-気室のほとんど境界）にパンチ穴を形成し、注射深さ1/4"で卵にラテックスを注射すると同時に、卵を垂直から75°〜90°に配向した。針の角度は垂直に対して約20°〜30°で、先端は気室から離れたところを卵の本体内に向けた。
【００５０】
尿膜内への装入は、これらの17日めおよび18日めの卵では100%であり、かつ卵の頂部（大端）を介し、気室を介して、尿膜内への注射を使用して達成されるものと比較して、より堅実で、信頼性が高かった。卵の頂部（大端）を介した注射（7/8"の深さ）を使用した18日めの尿膜内へのラテックスの装入の成功は、以前には、この時期の20%〜30%の尿膜を損失することが見出されていた。
【００５１】
上記の実施例は本発明を例示するものであり、本発明を限定するものと考えるべきではない。本発明は前記クレームにより限定され、それに均等なものも含む。
【図面の簡単な説明】
【図１】 角度を付けられた鳥類の卵の略図であり、卵の長軸（BB'）は垂直（AA'）に対して角度αである。
【図２】 上方垂直位置から180度転回された、すなわち卵の小端が上方で、卵の大端が下方であるように転回された鳥類の卵の略図である。
【図３Ａ】 垂直に配向された長軸（B-B'）を有する、孵卵の最後の四半期ぐらいの鳥類の卵の一般的な略図である。この図は、一般に、尿膜が卵殻の下にあり、本質的に卵内に含有される鳥類の胚を取り囲む薄い層として見出されることを例示している。
【図３Ｂ】 長軸が垂直から約45°配向された鳥類の卵を示し、垂直軸A-A'、長軸B-B'および短軸または矢状軸C-Cを示し、面BCが卵を上方面および下方面に分離する略図である。
【図４】 気室および尿膜の位置を示す、直立配向の12日めのブロイラー産の卵の正面断面図の写真の透写図である。
【図５】 主要軸が垂直から45°の角度にあり、気室および尿膜の位置を示す12日めのブロイラー産の卵の正面断面図の写真の透写図である。
【図６】 主要軸が垂直から90°の角度にあり、気室および尿膜の位置を示す12日めのブロイラー産の卵の正面断面図の写真の透写図である。
【図７】 主要軸が垂直から180°の角度、すなわち転倒しており、気室および尿膜の位置を示す15日めのブロイラー産の卵の正面断面図の写真の透写図である。
【図８】 直立した位置にあり、気室および尿膜の位置を示す18日めのブロイラーの卵の正面断面図の写真の透写図である。
【図９】 主要軸が垂直から45°の角度にあり、気室および尿膜の位置を示す18日めのブロイラー産の卵の正面断面図の写真の透写図である。
【図１０】 主要軸が垂直から90°の角度にあり、気室および尿膜の位置を示す18日めのブロイラー産の卵の正面断面図の写真の透写図である。
【図１１】 主要軸が垂直から180°の角度、すなわち転倒しており、気室および尿膜の位置を示す18日めのブロイラー産の卵の正面断面図の写真の透写図である。
【図１２】 本発明の方法を実施する際に使用するための卵トレーおよび卵配向ブラシの略図である。
【図１３】 卵容器の構造をより詳細に示す、図12の卵トレー内の卵の拡大図である。

Claims (27)

1. 鳥類の卵の尿膜内に物質を注射するための方法であって、
   孵卵の最後の四半期にある鳥類の卵を選択するステップと、
   垂直から約１０度〜１８０度の所定の角度に卵の長軸を配向づけるステップであって、上方向の垂直位置にある卵の大端が０度垂直を規定し、前記配向により、卵殻の上方部分の下にある卵の領域において卵の尿膜を貯留して尿膜嚢を肥大させるステップと、
   卵殻を介して、肥大した尿膜嚢に直接針を挿入するステップと、
   針を介して、卵の尿膜内に物質を放出するステップと
   を含み、針が卵殻の上方４分の１区を介して、卵殻面下、１／８〜１／４インチに挿入され、前記卵が孵卵第１６日〜第１９日の鶏卵である方法。
2. 前記卵が孵卵第１７日〜第１８日の鶏卵である、請求項１に記載の方法。
3. 針が卵殻を介して、下方向に挿入される、請求項１に記載の方法。
4. 卵の長軸が垂直から約２０〜５０度の所定の角度に配向され、それによって、尿膜が卵の上方側に貯留されて、尿膜嚢を肥大させる、請求項１に記載の方法。
5. 注射針が、卵の上側表面を介して、尿膜嚢の肥大した領域の尿膜内に下方へ垂直に挿入される、請求項１に記載の方法。
6. 卵の長軸が垂直から７５〜９０度の所定の角度に配向され、注射針が、卵の側面を介して垂直に対して２０〜３０度の角度で、尿膜嚢に挿入される、請求項１に記載の方法。
7. 注射針が、卵の側面を介して肥大した尿膜嚢に水平に挿入される、請求項１に記載の方法。
8. 卵の長軸が１８０度まで配向され、それによって、尿膜が卵の最上端に貯留して、尿膜嚢を肥大させる、請求項１に記載の方法。
9. 注射針が尿膜内に下方へ垂直に挿入される、請求項８に記載の方法。
10. 卵の長軸が垂直から約１０５〜１５５度の角度に配向され、それによって、尿膜が卵の上方４分の１区に貯留して、尿膜嚢を肥大させる、請求項１に記載の方法。
11. 注射針が尿膜内に下方へ垂直に挿入される、請求項１０に記載の方法。
12. 注射針が垂直と水平の間の角度で挿入される、請求項１０に記載の方法。
13. 注射針が卵の側面を介して尿膜嚢内に水平に挿入される、請求項１０に記載の方法。
14. 複数鶏卵の尿膜内に物質を注射するための方法であって、
    孵卵の第１６日から第１９日の複数の鳥類の卵を選択するステップと、
    選択した前記卵を垂直から約１０度〜１８０度の所定の角度まで卵トレー上で配向させるステップであって、０度は垂直方向の上方位置にある卵の大端によって規定され、それによって、各卵の尿膜が、卵殻の上方部分の下に位置する卵の所定の領域に貯留されて、尿膜嚢を肥大させるステップと、
    各卵に、卵殻を介して、前記所定の領域の肥大した尿膜嚢内に、注射針を直接挿入するステップであって、前記針は下方に移動するステップと、
    針を介して、各卵の尿膜内に物質を放出するステップと
    を含み、針が卵殻の上方４分の１区を介して、卵殻面下、１／８〜１／４インチに挿入される方法。
15. 卵が孵卵第１７日から第１８日である、請求項１４に記載の方法。
16. 卵の長軸が約２０度から５０度までの所定の角度まで配向され、それによって、尿膜が、各卵の上方側に貯留されて、尿膜嚢を肥大させる、請求項１４に記載の方法。
17. 前記卵トレーが、所定の角度に卵を保持するように形状化された卵容器を含む、請求項１４に記載の方法。
18. 前記卵トレー上の前記卵が露出された上面を有し、前記露出された上面に対して作用する卵配向手段によって、前記卵が所定の角度に前記卵容器内で固定される、請求項１４に記載の方法。
19. 前記卵配向手段が、前記卵の露出された前記上面に対して作用する回転剛毛ブラシを備える、請求項１８に記載の方法。
20. 鳥類の卵の尿膜内に探針を方向付けるための方法であって、
    孵卵の最後の四半期にある鳥類の卵を選択するステップと、
    垂直から約１０度〜１８０度の所定の角度に卵の長軸を配向づけるステップであって、上方向の垂直位置にある卵の大端が垂直から０度であることを規定し、卵殻の前記上方部分の下に卵の尿膜を貯留し、尿膜嚢を肥大させるステップと、
    卵殻を介して、肥大した尿膜嚢に直接探針を挿入するステップと
    を含み、探針が卵殻の上方４分の１区を介して、卵殻面下、１／８〜１／４インチに挿入され、前記卵が孵卵第１６日から第１９日の鶏卵である方法。
21. 卵の長軸が垂直から約２０〜５０度の所定の角度に配向され、それによって、尿膜が卵の上方側に貯留されて、尿膜嚢を肥大させる、請求項２０に記載の方法。
22. 卵の長軸が１８０度に配向され、それによって、尿膜が卵の最上端に貯留されて、尿膜嚢を肥大させる、請求項２０に記載の方法。
23. 前記探針が、上方垂直方向から水平までの間の角度で挿入され、それによって、針が尿膜嚢に突入する、請求項２０に記載の方法。
24. 卵の長軸が垂直から約１０５〜１５５度の角度に配向され、それによって、尿膜が、卵の上側４分の１区に貯留されて、尿膜嚢を肥大させる、請求項２０に記載の方法。
25. 前記探針が皮下針である、請求項２０に記載の方法。
26. 前記探針がバイオセンサーである、請求項２０に記載の方法。
27. 前記探針が、卵殻を介して、下方向に挿入される、請求項２０に記載の方法。

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