JP4698992B2

JP4698992B2 - 試料計測装置及び計測方法

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Publication number: JP4698992B2
Application number: JP2004267221A
Authority: JP
Inventors: 輝夫晝馬; 秀直岩井
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 2004-09-14
Filing date: 2004-09-14
Publication date: 2011-06-08
Anticipated expiration: 2024-09-14
Also published as: JP2006084233A

Description

本発明は、液体中にある細胞などの試料を計測するための試料計測装置、及び試料計測方法に関するものである。

溶媒の液体中にある細胞などの微細な生体試料を計測する場合、計測対象の細胞が無色であるため、細胞を染色した上で観察を行う染色法、蛍光標識を用いる方法、あるいは抗原−抗体反応計測での磁気標識を用いる方法などが用いられている。また、細胞などの生体試料を計測する方法として、位相差顕微鏡を用いて位相差像を取得する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
特開平７−２７０３０２号公報

上記した染色法、あるいは蛍光標識や磁気標識等を用いる計測方法では、染色等により細胞をそのままの状態で計測することができないという問題がある。また、例えば、浮遊細胞を分離する際に染色法を適用した場合には、色素を用いて細胞の選別を行うため、単離した細胞を人体に戻すことは困難である。また、磁気標識を用いる方法では、精度良く細胞を単離することができるものの、１種類の目的細胞のみしか得ることができない。

一方、位相差顕微鏡を用いた場合には、液体と細胞との間での屈折率差によって生じる光の位相差を利用して、染色等を行うことなく細胞に対して計測を行うことができる。例えば、文献１には、細胞などを含む試料液が内部を流れるフローセルの計測領域に対してレーザ光を照射し、その透過光像を位相差方式で撮像することが記載されている。しかしながら、このような計測装置では、例えばフローセルの計測領域に細胞を導く際に１細胞のみとする必要があるなど、計測上の制限が多いという問題がある。

本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、細胞などの試料に対して好適に計測を行うことが可能な試料計測装置、及び試料計測方法を提供することを目的とする。

このような目的を達成するために、本発明による試料計測装置は、（１）計測対象となる生体試料である試料を含む液体を内部に保持する試料保持手段と、（２）試料保持手段の計測領域に対して所定の計測方向に沿って計測光を照射し、試料を通過した光を測定してその位相差像を取得するとともに、試料に対して３以上の計測方向のそれぞれについて位相差像を取得することが可能に構成された位相差像取得手段と、（３）位相差像取得手段によって取得された３以上の計測方向についての位相差像に基づいて試料の３次元画像を再構成する画像再構成手段とを備え、試料保持手段は、試料を含む液体が内部を流れるフローセルであるとともに、位相差像取得手段は、３以上の計測方向のそれぞれについて、３以上の異なる位相での測定を行って、試料を通過した光の波形、及びその試料を通過したことによる波形ずれについての情報を得ることによって位相差像を取得することを特徴とする。

また、試料計測方法は、（ａ）計測対象となる生体試料である試料を含む液体が内部に保持される試料保持手段の計測領域に対して所定の計測方向に沿って計測光を照射し、試料を通過した光を測定してその位相差像を取得するとともに、試料に対して３以上の計測方向のそれぞれについて位相差像を取得する位相差像取得ステップと、（ｂ）位相差像取得ステップにおいて取得された３以上の計測方向についての位相差像に基づいて試料の３次元画像を再構成する画像再構成ステップとを備え、試料保持手段は、試料を含む液体が内部を流れるフローセルであるとともに、位相差像取得ステップにおいて、３以上の計測方向のそれぞれについて、３以上の異なる位相での測定を行って、試料を通過した光の波形、及びその試料を通過したことによる波形ずれについての情報を得ることによって位相差像を取得することを特徴とする。

上記した試料計測装置及び計測方法においては、試料保持手段の計測領域内にある試料に対して計測光を照射し、その位相差像を取得することによって試料の計測を行う構成を用いている。これにより、染色等を行うことなくそのままの状態で細胞などの試料を計測することができる。

また、この試料の位相差像の取得について３以上の計測方向で位相差計測を行い、それによって得られる３以上の位相差像から試料の画像を再構成している。このような構成によれば、計測方向が異なる３以上の位相差像を用いることで３次元的な試料の画像を得ることができ、液体中にある試料に対して好適に計測を行うことが可能となる。特に、本構成では、例えば試料保持手段の計測領域内に複数の試料が存在するような場合でも、３以上の位相差像から得られる３次元画像により、試料毎に計測を行うことが可能である。ここで、試料保持手段としては、試料を含む液体が内部を流れるフローセルを用いることが好ましい。あるいは、フローセル以外の保持手段を用いても良い。

上記構成の試料計測装置及び計測方法は、細胞などの生体試料を計測対象とする生体試料計測装置及び計測方法として好適に用いることができる。このような生体試料計測装置を用いれば、例えば液体中にある細胞を選別対象とする生体試料選別装置など、様々な装置が実現可能である。また、生体試料以外の試料を計測対象としても良い。

また、試料の位相差像の具体的な取得方法については、計測装置は、位相差像取得手段が、３以上の計測方向のそれぞれについて、３以上の異なる位相での測定を行うことによって位相差像を取得することが好ましい。同様に、計測方法は、位相差像取得ステップにおいて、３以上の計測方向のそれぞれについて、３以上の異なる位相での測定を行うことによって位相差像を取得することが好ましい。このように、試料を通過した光を３以上の異なる位相で測定することにより、試料を通過したことによって生じる光の位相差を確実に求めることができる。

また、位相差像取得手段の構成については、位相差像取得手段が、３以上の計測方向のそれぞれに対応する３以上の位相差計測手段によって構成されることとしても良い。あるいは、位相差像取得手段が、単一の位相差計測手段によって構成され、試料保持手段が、その内部に保持される試料を含む液体の位相差計測手段に対する方向を変更可能に構成されることとしても良い。あるいは、位相差像取得手段が、試料保持手段の内部に保持される試料を含む液体に対する方向を変更可能に構成された単一の位相差計測手段によって構成されることとしても良い。

これらの構成によれば、３以上の位相差計測手段、あるいは単一の位相差計測手段からなる位相差像取得手段を用いて、試料の画像を再構成するために必要な３以上の位相差像を好適に取得することができる。

本発明の試料計測装置及び計測方法によれば、試料保持手段の計測領域内にある細胞などの試料に対して計測光を照射し、その位相差像を取得することによって試料の計測を行うとともに、３以上の計測方向で位相差計測を行い、それによって得られる３以上の位相差像から試料の画像を再構成することにより、３次元的な試料の画像を得ることができ、液体中にある試料に対して好適に計測を行うことが可能となる。

以下、図面とともに本発明による試料計測装置、及び試料計測方法の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。

図１は、本発明による試料計測装置の基本構成を模式的に示すブロック図である。本試料計測装置１Ａは、液体Ｌ中にある細胞などの生体試料Ｓを計測対象とする生体試料計測装置であり、試料保持機構１０と、位相差像取得装置２０と、画像再構成装置３０とを備えて構成されている。

試料保持機構１０は、生体試料Ｓを含む液体Ｌを内部に保持する試料保持手段である。また、この試料保持機構１０内の所定領域が、試料Ｓに対して計測を行うための計測領域Ｒとなっている。

位相差像取得装置２０は、試料保持機構１０の計測領域Ｒ内にある試料Ｓの位相差像を取得するための取得手段である。図１に例示する構成においては、位相差像取得装置２０は、計測光源２１と、撮像装置２２とを計測領域Ｒを挟むように配置することによって構成されている。計測光源２１は、試料保持機構１０の計測領域Ｒに対して所定の計測方向に沿って計測光を照射する。撮像装置２２は、計測光源２１から計測領域Ｒへと照射されて計測領域Ｒ内にある試料Ｓを通過した光を測定して、その位相差像を取得する。

特に、本実施形態においては、位相差像取得装置２０は、計測対象の試料Ｓに対して、３つの計測方向Ｄ１〜Ｄ３のそれぞれについて位相差像を取得することが可能に構成されている。なお、試料保持機構１０は、位相差像取得装置２０による計測領域Ｒへの計測光の照射、及び位相差像の取得が可能なように、例えば計測光の波長を含む波長域の光が透過可能な材料によって構成される。また、３つの計測方向Ｄ１〜Ｄ３について位相差像を取得するための構成等については、具体的には後述する。

位相差像取得装置２０によって取得された３つの計測方向Ｄ１〜Ｄ３のそれぞれについての位相差像は、画像再構成装置３０へと入力されている。この画像再構成装置３０は、入力された３つの計測方向についての位相差像に基づいて、試料保持機構１０の計測領域Ｒ内にある試料Ｓの画像を再構成する再構成手段である。

画像再構成装置３０は、例えば、画像再構成処理を実行するＣＰＵ、及び画像再構成処理に必要なプログラム等を格納するメモリなどを含むコンピュータを用いて構成される。また、図１においては、この画像再構成装置３０に対して、入力装置３６及び表示装置３７が接続されている。入力装置３６は、例えばコンピュータに接続されたキーボードやマウス等から構成され、本計測装置１Ａにおける位相差像取得装置２０による位相差像取得動作、あるいは画像再構成装置３０による画像再構成動作の実行に必要な情報、指示の入力等に用いられる。また、表示装置３７は、例えばコンピュータに接続されたＣＲＴディスプレイや液晶ディスプレイ等から構成され、本計測装置１Ａにおける位相差像取得及び画像再構成に関する必要な情報の表示、例えば再構成された試料の画像の表示等に用いられる。

次に、図１に示した試料計測装置１Ａにおいて実行される試料計測方法について説明する。

まず、計測対象となる生体試料Ｓを含む液体Ｌを用意し、この液体Ｌが試料保持機構１０の内部に保持された状態とする。そして、試料保持機構１０の計測領域Ｒに対し、３つの計測方向Ｄ１〜Ｄ３のそれぞれについて位相差像の取得を行う。具体的には、試料保持機構１０の計測領域Ｒに対して計測方向に沿って計測光源２１からの計測光を照射する。さらに、計測領域Ｒを通過した光を撮像装置２２で測定する。このとき、計測領域Ｒ内に試料Ｓがあれば、試料Ｓを通過した光による位相差像が得られる。このような位相差計測を３つの計測方向Ｄ１〜Ｄ３についてそれぞれ行うことにより、３つの位相差像が取得される（位相差像取得ステップ）。

次に、画像再構成装置３０において、試料Ｓの画像の再構成を行う。画像再構成装置３０は、位相差像取得装置２０によって取得された互いに計測方向が異なる３つの位相差像について所定の解析を行う。そして、その解析結果に基づいて試料保持機構１０の計測領域Ｒ内にある試料Ｓの画像を再構成する（画像再構成ステップ）。

上記実施形態による試料計測装置及び計測方法の効果について説明する。

図１に示した生体試料計測装置１Ａ、及びそれを用いた計測方法においては、試料保持機構１０の計測領域Ｒ内にある細胞などの生体試料Ｓに対して計測光源２１からの計測光を照射し、その位相差像を取得することによって試料Ｓの計測を行う構成を用いている。このような構成では、図２に計測光の位相の変化を模式的に示すように、液体Ｌのみの部分を通過した光と、試料Ｓを通過した光とで、液体Ｌと細胞などの試料Ｓとの間での屈折率差、及びそれによる光の遅延によって位相差が生じる。したがって、計測領域Ｒ内にある試料Ｓを含む液体Ｌに対して位相差像を取得することにより、試料Ｓの染色等を行うことなく、そのままの状態で試料Ｓの計測を行うことができる。

また、この試料Ｓの位相差像の取得について異なる３つの計測方向Ｄ１〜Ｄ３で位相差計測を行い、それによって得られる３つの位相差像から画像再構成装置３０において試料Ｓの画像を再構成している。ここで、液体中の試料に対して単一の計測方向で位相差計測を行う方法では（特許文献１参照）、位相差の有無を計測することは可能であるが、それ以上の具体的な情報を得ることはできない。例えば、試料保持機構の計測領域内に試料として複数の細胞が存在する場合、単一の計測方向で位相差計測を行う方法では、それらの識別を行うことはできない。

これに対して、上記のように、３つの計測方向Ｄ１〜Ｄ３で位相差計測を行う構成によれば、計測方向が異なる３つの位相差像を用いることで３次元的な試料Ｓの画像を得ることができ、液体Ｌ中にある試料Ｓに対して好適に計測を行うことが可能となる。特に、本構成では、上記したように試料保持機構１０の計測領域Ｒ内に試料Ｓとして複数の細胞が存在するような場合であっても、互いに計測方向が異なる３つの位相差像から再構成された３次元画像によってそれらを識別して、細胞毎に必要な計測を行うことが可能である。

ここで、上記実施形態では、細胞などの生体試料Ｓを計測対象とする生体試料計測を例として説明したが、このような構成は、一般には、生体試料以外の試料を計測対象とした試料計測装置及び計測方法として適用可能である。

また、位相差像の取得を行う計測方向については、図１においては３つの計測方向Ｄ１〜Ｄ３について計測を行うこととしたが、一般には、位相差像取得装置２０において、３以上の計測方向のそれぞれについて位相差像を取得すれば良い。この場合、画像再構成装置３０において、位相差像取得装置２０で取得された３以上の計測方向についての位相差像に基づいて、試料Ｓの画像の再構成が行われる。

また、試料Ｓの位相差像の取得については、位相差像取得装置２０は、３以上の計測方向のそれぞれについて、３以上の異なる位相での測定を行うことによって位相差像を取得することが好ましい。このように、試料Ｓを通過した光をそれぞれの計測方向で３以上の異なる位相で測定することにより、光の波形、及びその試料Ｓを通過したことによる波形ずれについての情報を得ることができ、したがって、試料Ｓの位相差像を確実に求めることができる。

次に、位相差像取得装置の構成について説明する。図１に示したように３つの計測方向Ｄ１〜Ｄ３のそれぞれについて試料Ｓの位相差像を取得する場合、位相差像取得装置２０の構成としては、図３の構成例に示すように、３つの計測方向Ｄ１〜Ｄ３のそれぞれに対応する３つの位相差計測装置によって位相差像取得装置２０を実現する構成を用いることができる。

図３においては、試料保持機構１０の計測領域Ｒに対して第１計測方向Ｄ１に沿って計測光を照射する第１光源２１１及びレンズ２１１ａと、第１光源２１１からみて計測領域Ｒを挟む位置に配置された第１撮像装置２２１とによって第１位相差計測装置が構成されている。また、第２計測方向Ｄ２に沿って計測光を照射する第２光源２１２及びレンズ２１２ａと、第２撮像装置２２２とによって第２位相差計測装置が構成されている。また、第３計測方向Ｄ３に沿って計測光を照射する第３光源２１３及びレンズ２１３ａと、第３撮像装置２２３とによって第３位相差計測装置が構成されている。

あるいは、試料保持機構１０の内部に保持される試料Ｓを含む液体Ｌに対する方向を変更可能に構成された単一の位相差計測装置によって位相差像取得装置２０を実現する構成とすることも可能である。この場合、位相差計測装置の位置を変更することで、３つの計測方向Ｄ１〜Ｄ３について位相差像を取得することができる。

このような構成では、例えば図３において、計測光源２１１及び撮像装置２２１によって単一の位相差計測装置を構成する。そして、図中に矢印によって示すように、計測光源２１２、２１３として示された位置へと計測光源２１１の位置を変更するとともに、撮像装置２２２、２２３として示された位置へと撮像装置２２１の位置を変更する。これにより、計測光源２１１及び撮像装置２２１からなる単一の位相差計測装置を用いて、３つの計測方向Ｄ１〜Ｄ３のそれぞれについての位相差像の取得が可能となる。

また、単一の位相差計測装置で位相差像取得装置２０を構成した場合の計測方向の変更方法については、計測光源と撮像装置とのうちで光源のみの位置を変更しても良い。例えば、図４において、計測光源２１の配置（ａ）、及び計測光源２１の位置を変更した配置（ｂ）を示すように、光源２１の位置を変更することで、試料Ｓに対して計測光が照射される計測方向を変更することができる。

あるいは、位相差像取得装置２０の構成としては、図５の構成例に示すように、単一の位相差計測装置によって位相差像取得装置２０を構成するとともに、試料保持機構１０において、その内部に保持される試料Ｓを含む液体Ｌの位相差計測装置に対する方向を変更可能とする構成を用いることができる。

図５においては、試料保持機構１０の計測領域Ｒに対して計測方向Ｄに沿って計測光を照射する計測光源２１及びレンズ２１ａと、光源２１からみて計測領域Ｒを挟む位置に配置された撮像装置２２とによって単一の位相差計測装置が構成されている。そして、図中に矢印によって示すように、試料保持機構１０を回転駆動し、それに伴って内部の液体Ｌを回転されることで、試料Ｓに対して計測光が照射される計測方向を変更することができる。

図６は、試料保持機構１０の具体的な構成の一例を示す図であり、（ａ）は上面断面図を、（ｂ）は側面断面図を示している。この試料保持機構１０は、上記したように内部に保持される試料Ｓを含む液体Ｌの位相差計測装置に対する方向を変更可能に構成されたものであり、内側容器１１と外側容器１２とを有して構成されている。

内側容器１１は、計測光を透過させる透明材料によって所定の軸Ａｘを中心軸とする略円筒形状に形成され、その内部に、試料（例えば細胞などの生体試料）Ｓを含む液体Ｌが保持される。また、内側容器１１の長手方向の所定範囲に対し、その外周を囲む略矩形形状の外側容器１２が設置されている。また、外側容器１２の内部には、屈折率整合液１３が満たされており、内側容器１１と外側容器１２との接合部には、屈折率整合液１３が漏れないようにＯリング１４が設けられている。

このような構成において、内側容器１１を軸Ａｘを回転軸として回転駆動することにより、その内部の液体Ｌを回転させて、試料Ｓに対する位相差像の計測方向を変更することができる。ここで、試料Ｓを含む液体Ｌについては、内側容器１１の回転によって効率良く試料Ｓを回転させるため、粘性の高い液体を用いることが好ましい。

また、図６に示すように内側容器１１に加えて外側容器１２を設ける構成では、内側容器１１を回転させた場合でも、外側容器１２の平面状の側面から計測光を入射させることができる。これにより、試料Ｓに到達する前の計測光の波面の乱れが抑制される。また、外側容器１２の内部に屈折率整合液１３を満たしておくことにより、内側容器１１の側面での波面の乱れの発生も抑制される。ただし、このような外側容器１２については、不要であれば設けない構成としても良い。また、計測光に対して試料を回転させる方法としては、光ピンセットや磁気ビーズ等を用いても良い。

図７は、図１に示した試料計測装置を用いた試料選別装置の構成を模式的に示すブロック図である。本試料選別装置１Ｂは、液体Ｌ中にある細胞などの生体試料Ｓを選別対象とする生体試料選別装置であり、図１に関して上述した試料保持機構１０と、位相差像取得装置２０とを備えて構成されている。

本選別装置１Ｂにおいては、試料保持機構１０として、試料Ｓを含む液体Ｌが内部を流れるフローセル１５が用いられている。図中においては、フローセル１５内で液体Ｌが流れる方向を矢印によって示している。フローセル１５の上流側には、選別の対象となる複数種類の細胞からなる生体試料Ｓを含む液体Ｌが蓄積されている試料蓄積部１６、及び試料蓄積部１６からフローセル１５への液体Ｌの注入を所定の流量となるように制御する試料注入部１７が設けられている。また、フローセル１５の下流側には、試料Ｓの複数種類の細胞を選別するための選別装置５０が設けられている。

液体Ｌ中の試料Ｓの細胞は、試料蓄積部１６から注入部１７を介してフローセル１５へと注入される。そして、フローセル１５内を流れて計測領域Ｒに到達し、この計測領域Ｒにおいて、位相差像取得装置２０により、３つの計測方向Ｄ１〜Ｄ３のそれぞれについての試料Ｓの位相差像が取得される（図１参照）。なお、計測対象となる試料Ｓとしては、例えば、複数の目的細胞と非目的細胞との混合細胞試料が挙げられる。

位相差像取得装置２０によって取得された３つの計測方向Ｄ１〜Ｄ３のそれぞれについての位相差像は、制御装置４０へと入力されている。本構成例においては、この制御装置４０は、画像再構成部４１と、解析部４２とを有して構成されている。制御装置４０は、例えばＣＰＵ及びメモリなどを含むコンピュータを用いて構成される。

画像再構成部４１は、位相差像取得装置２０から入力された３つの計測方向についての位相差像に基づいて、試料保持機構１０であるフローセル１５の計測領域Ｒ内にある試料Ｓの画像を再構成する再構成手段である。また、解析部４２は、画像再構成部４１で再構成された試料Ｓの画像情報を参照して細胞の種類等を識別し、試料Ｓを選別するための指示信号を選別装置５０へと送出する。フローセル１５内において、計測領域Ｒを通過した試料Ｓは、その下流側に設けられた選別装置５０に到達し、制御装置４０からの指示信号に基づいて試料Ｓの選別が行われる。

上記実施形態による試料選別装置及び選別方法の効果について説明する。

図７に示した生体試料選別装置１Ｂ、及びそれを用いた選別方法においては、フローセル１５の計測領域Ｒ内にある試料Ｓの位相差像を取得することによって試料Ｓの計測を行う構成を用いている。これにより、試料Ｓの染色等を行うことなく、そのままの状態で試料Ｓの計測を行うことができる。

また、この試料Ｓの位相差像の取得について異なる３つの計測方向Ｄ１〜Ｄ３で位相差計測を行い、それによって得られる３つの位相差像から制御装置４０の画像再構成部４１において試料Ｓの画像を再構成して、得られた画像情報に基づいて試料Ｓの選別を行っている。このような構成では、フローセル１５の計測領域Ｒ内に試料Ｓとして複数の細胞が存在するような場合であっても、互いに計測方向が異なる３つの位相差像から再構成された３次元画像によってそれらを識別して、細胞毎に必要な計測、及びその選別装置５０による選別を行うことが可能である。

また、図７に示した構成においては、試料Ｓを内部に保持する試料保持機構１０としてフローセル１５を用いている。これにより、液体Ｌ中に含まれる多数の細胞を対象として計測を行うような場合に、個々の細胞についての計測、あるいはその計測結果に基づく細胞の選別等を効率良く行うことができる。あるいは、試料保持手段としては、フローセル以外にも様々な構成を用いて良い。また、このような試料選別装置及び選別方法は、図１に示した試料計測装置及び計測方法と同様に、生体試料以外の試料に対しても一般に適用可能である。

次に、試料計測装置に用いられる位相差像取得装置の具体的な構成についてさらに説明する。なお、以下においては説明の簡単のため、単一の計測方向に対する位相差像の取得について説明する。

図８は、位相差像取得装置の第１の構成例を示す図である。この位相差像取得装置２０Ａは、マッハツェンダ型の干渉計を用いて光の位相差像を計測する構成となっている。本構成において、点光源である計測光源２１から出射された光はコリメートレンズ２５０によってコリメートされ、平面波としてハーフミラー２５１へと入射する。そして、この平面波の光は、ハーフミラー２５１により、試料保持機構１０内の試料Ｓへと照射される計測光と、光の位相差を計測するための参照光とに分岐される。図８の構成においては、ハーフミラー２５１を透過する光が参照光、ハーフミラー２５１で反射される光が計測光となっている。

ハーフミラー２５１で計測光路へと分岐された計測光は、反射ミラー２５２によって反射され、試料Ｓを含む液体Ｌを内部に保持する試料保持機構１０の計測領域Ｒに対して所定の計測方向に沿って照射される。そして、計測領域Ｒ内にある試料Ｓによって位相変調及び回折を受けた光は、対物レンズ２５３、結像レンズ（チューブレンズ）２５４、及びハーフミラー２５５を介してスクリーン２５６上に結像される。なお、対物レンズ２５３は、その焦点面に試料Ｓがくるように配置されている。

一方、ハーフミラー２５１で参照光路へと分岐された参照光は、補償光学系を兼ねたビームエキスパンダ２５７により拡大される。そして、反射ミラー２５８、遅延光学系２５９、及びハーフミラー２５５を介してスクリーン２５６に到達する。これにより、スクリーン２５６上には、試料Ｓを通過した計測光と参照光とが映し出される。

また、計測光と参照光との光路差が計測光源２１から出射される光のコヒーレンス時間内の距離となるように、遅延光学系２５９での光路長を調整する。このとき、スクリーン２５６上には、計測光と参照光とによる干渉縞が観測され、その干渉像がＣＣＤカメラなどの撮像装置２２によって測定される。

さらに、このような構成において、遅延光学系２５９での遅延光路長を変化させることによって、遅延光学系２５９を通過した参照光の計測光に対する位相を変化させ、３以上の異なる位相で干渉像の測定を行う。例えば干渉像の測定を３つの位相で行うとすると、３つの測定での位相の変化量δ１〜δ３、及び対応する干渉像Ｉ１〜Ｉ３からなるデータの組（δ１，Ｉ１）〜（δ３，Ｉ３）が得られる。そして、これらの３つのデータの組を用いることにより、試料Ｓの位相差像が取得される。

また、３つの計測方向Ｄ１〜Ｄ３のそれぞれに対する位相差像の取得については、例えば、計測方向を試料Ｓに対する計測光の照射角度θによって表して、角度θ１の第１計測方向Ｄ１について、データの組（θ１、δ１１，Ｉ１１）〜（θ１、δ１３，Ｉ１３）から第１の位相差像が取得される。また、角度θ２の第２計測方向Ｄ２について、データの組（θ２、δ２１，Ｉ２１）〜（θ１、δ２３，Ｉ２３）から第２の位相差像が取得される。また、角度θ３の第３計測方向Ｄ３について、データの組（θ３、δ３１，Ｉ３１）〜（θ３、δ３３，Ｉ３３）から第３の位相差像が取得される。そして、これらの第１〜第３の位相差像により、試料Ｓの画像が再構成される。

なお、計測光の照射角度がθｋの計測方向Ｄｋ（ｋ＝１，２，３）に対応するデータの組（δｋ１，Ｉｋ１）〜（δｋ３，Ｉｋ３）は、それによって求められる位相差のデータφｋに置き換えることができる。このように置き換えた場合、計測方向Ｄｋについてのデータは、計測方向と位相差とのデータの組（θｋ，φｋ）によって特定される。このデータ（θｋ，φｋ）は、例えばＸ線ＣＴアルゴリズムでの「投影データ」と同様のデータであり、これらのデータ群から試料Ｓの３次元画像を再構成することが可能である。また、計測方向が異なる３つの位相差像の取得については、具体的には、例えば図３〜図６に関して上述した構成など、様々な構成を用いて良い。

図９は、位相差像取得装置の第２の構成例を示す図である。この位相差像取得装置２０Ｂは、マイケルソン型の干渉計を用いて光の位相差像を計測する構成となっている。本構成において、点光源である計測光源２１から出射された光はコリメートレンズ２６０によってコリメートされ、ハーフミラー２６２へと入射する。そして、この光は、ハーフミラー２６２により計測光と参照光とに分岐される。図９の構成においては、ハーフミラー２６２を透過する光が計測光、ハーフミラー２６２で反射される光が参照光となっている。

コリメートレンズ２６０とハーフミラー２６２との間には、レンズ２６１が配置されている。コリメートレンズ２６０からの光は、レンズ２６１によって後方焦点位置である計測光路側の焦点Ｆ１へと集束される。また、焦点Ｆ１と試料Ｓとの間には、レンズ２６３が配置されている。レンズ２６３は、その前方焦点位置が、レンズ２６１の後方焦点位置である焦点Ｆ１と一致するように配置されている。このように、レンズ２６１、２６３の焦点が重なる光学系は無限遠補正光学系とよばれ、レンズ２６１、２６３の間のスペースに様々な光学素子を挿入することができる。

また、レンズ２６３の後方焦点位置には試料Ｓを含む液体が保持される試料保持機構１０が配置されており、そのすぐ後方には反射ミラー２６４が設置されている。試料Ｓを通過した光は反射ミラー２６４で反射され、レンズ２６３、ハーフミラー２６２、及びレンズ２６５を介してスクリーン２６６上に結像される。ここで、レンズ２６５は、その前方焦点位置が焦点Ｆ１と一致するように配置され、その後方焦点面にスクリーン２６６が配置されている。

一方、ハーフミラー２６２で反射される参照光の参照光路は、ハーフミラー２６２から所定距離をおいて配置された反射ミラー２６８によって構成されている。この参照光路側では、レンズ２６１の後方焦点位置は焦点Ｆ２となっている。また、焦点Ｆ２と反射ミラー２６８との間には、レンズ２６７が配置されている。レンズ２６７は、その前方焦点位置が、レンズ２６１の後方焦点位置である焦点Ｆ２と一致するように配置されている。

また、レンズ２６７の後方焦点位置には反射ミラー２６８が設置されている。反射ミラー２６８で反射された参照光は、レンズ２６７、ハーフミラー２６２、及びレンズ２６５を介してスクリーン２６６に到達する。これにより、スクリーン２６６上には、試料Ｓを通過した計測光と参照光とが映し出される。

また、計測光と参照光との光路差が計測光源２１から出射される光のコヒーレンス時間内の距離となるように、参照光学系での光路長を調整する。上記した参照光路では、レンズ２６７、及び反射ミラー２６８の位置を調整することにより、その遅延光路長が調整される。このとき、スクリーン２６６上には、計測光と参照光とによる干渉縞が観測され、その干渉像がＣＣＤカメラなどの撮像装置２２によって測定される。これにより、図８の構成と同様に、試料Ｓの位相差像が取得される。

図１０は、位相差像取得装置の第３の構成例を示す図である。以下に示す第３〜第５の構成例は、いずれもゼルニケ（Zernike）の位相差顕微鏡の原理を用いて光の位相差像を計測するものである。ゼルニケの位相差顕微鏡では、計測対象の試料や周囲の液体等を通過して直進した非回折光と、試料で回折を起こして光路が広がった回折光とに対し、直進する非回折光の光路と、それ以外の光路とで位相差（光路長差）ができるように光学系を構成する。

このような構成において、試料からの回折光に対して一定の位相差が付与された非回折光を参照光として用いることにより、回折光による試料の位相差像を計測することが可能となる。このような構成は、例えば、直進する非回折光の光路上に位相遅れを与える光学素子を配置することによって実現することができる。

図１０に示す構成においては、試料Ｓからの直進する非回折光（０次光）２７ａ、及び光路が広がった回折光２７ｂに対し、対物レンズ２７０のスペクトル面上に空間光変調器（ＳＬＭ）２７１などの位相変調素子を配置する。そして、非回折光２７ａを参照光、回折光２７ｂを計測光として、その位相差を空間光変調器２７１によって設定、制御することで、試料Ｓの位相差像を取得するための３以上の異なる位相での干渉像を測定することができる。

図１１は、位相差像取得装置の第４の構成例を示す図である。本構成例においては、３板式プリズム２８０によって試料Ｓからの光を３つの光路に強度分割し、それぞれの光路に測定光学系２８１〜２８３を設置する。第１測定光学系２８１では、レンズ２８１ａのスペクトル面２８１ｂに上記した空間光変調器などの位相変調素子を配置して、参照光である非回折光と計測光である回折光との間に所定の位相差を与える。そして、その位相差が与えられた光を、レンズ２８１ｃを介してＣＣＤカメラなどの撮像装置２８１ｄへと入射させ、この撮像装置２８１ｄにて第１の干渉像を測定する。

また、第２、第３測定光学系２８２、２８３についても同様に構成するとともに、参照光と計測光との間の位相差をそれぞれで調整して、測定光学系２８１〜２８３のそれぞれでの位相差が異なる位相差となるように設定する。これにより、試料Ｓの位相差像を取得するための３つの異なる位相での干渉像を測定することができる。特に、このような構成では、非回折光と回折光とを３板式プリズム２８０で強度分割した後に位相差を与えているため、３つの干渉像を同時に取得することができる。したがって、それらの干渉像から取得される位相差像の精度が向上される。

図１２は、位相差像取得装置の第５の構成例を示す図である。本構成の位相差像取得装置は、ゼルニケの位相差顕微鏡の原理を用いた位相差像取得装置の具体的な構成を示すものとなっている。

図１２に示す位相差像取得装置は、全体としては、透過照明の顕微鏡の構成を有している。本構成では、フィラメント状の計測光源２１、集光レンズ２９０、及び反射ミラー２９１に対し、Kohler 照明における虹彩絞りの位置に開口円盤２９２が配置されている。この開口円盤２９２は、顕微鏡の光軸（図中の一点鎖線）を中心として回転可能に設置されるとともに、その光軸を外れた所定位置に微小開口２９２ａが形成されている。計測光源２１からの計測光がこの微小開口２９２ａを通過することにより、開口円盤２９２は、リング状に光源位置が変化する点光源として機能する。

この開口円盤２９２に対して、コンデンサレンズ２９３、試料Ｓを含む液体を保持する試料保持機構１０、対物レンズ２９４、及び位相変調素子２９５がこの順に設置されている。開口円盤２９２は、コンデンサレンズ２９３の前方焦点面に配置されており、その微小開口２９２ａを通過した光は、コンデンサレンズ２９３の後方で平行光となり、試料Ｓに対して所定の角度θで入射する。また、ここでは、試料保持機構１０は、スライドガラス１０ａ及びカバーガラス１０ｂで試料Ｓを含む液体を挟み込む構成となっている。

試料Ｓ等を通過して直進した非回折光（０次光）の角度θを持った波面は、対物レンズ２９４により、対物レンズ２９４の後方焦点面にてスペクトル面を形成する。例えば、コンデンサレンズ２９３と対物レンズ２９４との間で平行光であった光は、このスペクトル面において、開口円盤２９２での微小開口２９２ａの位置に対応して決まる一点に集光される。

また、このスペクトル面には、空間光変調器などの位相変調素子２９５が配置されている。この位相変調素子２９５を用い、図１０に関して上述したように一点に集まった非回折光と、試料で回折を起こして光路が広がった回折光との間の位相差を制御することで、試料Ｓの位相差像を取得するための３以上の異なる位相での干渉像を測定することができる。

なお、このような位相差顕微鏡の構成では、その具体的な構成については上記以外にも様々な構成を用いて良い。例えば、点光源として機能する開口円盤については、単一の微小開口を有して回転可能に設置する構成以外にも、それぞれ異なる位置に微小開口を有する３以上の開口円盤を用意しておき、それらを交換して用いる構成としても良い。あるいは、複数の微小開口を有する開口円盤を用いても良い。

また、非回折光と回折光との間の位相差を制御するための位相変調素子については、位相変調量を制御可能な空間光変調器を用いる構成以外にも、位相変調量が固定の位相変調素子を複数用意しておき、それらを交換して用いる構成としても良い。また、複数種類の位相変調素子を準備することが困難な場合等には、開口円盤の微小開口を通過した光をハーフミラー等で分岐し、マッハツェンダ型の干渉計等を用いて位相差像を取得する構成としても良い。

本発明による試料計測装置、及び試料計測方法は、上記した実施形態及び構成例に限られるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、図３〜図６においては、位相差像取得手段の構成について、３つの計測方向で位相差像を取得する場合を例として説明したが、これらの構成は３以上の計測方向で位相差像を取得する場合にも同様に適用可能である。また、位相差像取得手段の具体的な構成については、試料保持手段の構成等に応じて上記以外にも様々な構成を用いて良い。

本発明は、細胞などの試料に対して好適に計測を行うことが可能な試料計測装置、及び試料計測方法として利用可能である。

試料計測装置の基本構成を模式的に示すブロック図である。試料による計測光の位相の変化を模式的に示す図である。位相差像取得装置の構成の一例を示す上面図である。計測光源の位置の変更による計測方向の変更について示す図である。位相差像取得装置の構成の他の例を示す上面図である。試料保持機構の具体的な構成の一例を示す図である。図１に示した試料計測装置を用いた試料選別装置の構成を模式的に示すブロック図である。位相差像取得装置の第１の構成例を示す図である。位相差像取得装置の第２の構成例を示す図である。位相差像取得装置の第３の構成例を示す図である。位相差像取得装置の第４の構成例を示す図である。位相差像取得装置の第５の構成例を示す図である。

符号の説明

１Ａ…生体試料計測装置、１Ｂ…生体試料選別装置、１０…試料保持機構、１１…内側容器、１２…外側容器、１３…屈折率整合液、１４…Ｏリング、１５…フローセル、１６…試料蓄積部、１７…試料注入部、２０…位相差像取得装置、２１…計測光源、２２…撮像装置、３０…画像再構成装置、３６…入力装置、３７…表示装置、４０…制御装置、４１…画像再構成部、４２…解析部、５０…選別装置。

Claims

計測対象となる生体試料である試料を含む液体を内部に保持する試料保持手段と、
前記試料保持手段の計測領域に対して所定の計測方向に沿って計測光を照射し、前記試料を通過した光を測定してその位相差像を取得するとともに、前記試料に対して３以上の前記計測方向のそれぞれについて前記位相差像を取得することが可能に構成された位相差像取得手段と、
前記位相差像取得手段によって取得された３以上の前記計測方向についての前記位相差像に基づいて前記試料の３次元画像を再構成する画像再構成手段と
を備え、
前記試料保持手段は、前記試料を含む液体が内部を流れるフローセルであるとともに、前記位相差像取得手段は、３以上の前記計測方向のそれぞれについて、３以上の異なる位相での測定を行って、前記試料を通過した光の波形、及びその前記試料を通過したことによる波形ずれについての情報を得ることによって前記位相差像を取得することを特徴とする試料計測装置。
前記位相差像取得手段は、３以上の前記計測方向のそれぞれに対応する３以上の位相差計測手段によって構成されていることを特徴とする請求項１記載の試料計測装置。
前記位相差像取得手段は、単一の位相差計測手段によって構成され、
前記試料保持手段は、その内部に保持される前記試料を含む液体の前記位相差計測手段に対する方向を変更可能に構成されていることを特徴とする請求項１記載の試料計測装置。
前記位相差像取得手段は、前記試料保持手段の内部に保持される前記試料を含む液体に対する方向を変更可能に構成された単一の位相差計測手段によって構成されていることを特徴とする請求項１記載の試料計測装置。
計測対象となる生体試料である試料を含む液体が内部に保持される試料保持手段の計測領域に対して所定の計測方向に沿って計測光を照射し、前記試料を通過した光を測定してその位相差像を取得するとともに、前記試料に対して３以上の前記計測方向のそれぞれについて前記位相差像を取得する位相差像取得ステップと、
前記位相差像取得ステップにおいて取得された３以上の前記計測方向についての前記位相差像に基づいて前記試料の３次元画像を再構成する画像再構成ステップと
を備え、
前記試料保持手段は、前記試料を含む液体が内部を流れるフローセルであるとともに、前記位相差像取得ステップにおいて、３以上の前記計測方向のそれぞれについて、３以上の異なる位相での測定を行って、前記試料を通過した光の波形、及びその前記試料を通過したことによる波形ずれについての情報を得ることによって前記位相差像を取得することを特徴とする試料計測方法。