JP4695840B2 - 不死化された抗体分泌細胞の製造方法 - Google Patents
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Description
モノクローナル抗体は、学術分野と商業的な医薬分野及び生物操作分野との両者において広範に利用されている。モノクローナル抗体は、通常は抗原と呼称される特異的な存在物、例えば、必ずしも限定されないが、タンパク質又はペプチドを、エピトープとして知られる前記存在物の特異的部位との相互作用を通じて検出するのに使用される。別々のタンパク質に同一のエピトープが存在することがあり、同様に任意の1つのタンパク質が幾つかの異なるエピトープを提示することがある。かかる反応物は、基礎研究、診断、アッセイ開発及び、近年では治療用途において一般に使用されている。
βリンパ球が活性化すれば所与の抗原に特異的な抗体の製造に至ることができる。しかしながらこれらβリンパ球は、かかる細胞が細胞培養において短命であるため、インビトロでの抗体反応物製造に利用するには限界がある(Kohler及びMilstein 1975)。こうして、これら抗体分泌細胞の培地での生存を可能にするために、自力で培地中で無期限に増殖できる不死化細胞株(骨髄腫)とそれらを結合させる方法が開発された。今日使用される多くの骨髄腫細胞株、例えばSp2細胞は当初はそれ自体、抗体を分泌するものであった。ゆえに、モノクローナル抗体技術の先駆者が直面した課題には3つあった:1)抗体をそれ自体分泌しないが、骨髄腫/βリンパ球のハイブリドーマの不死化増殖を可能にする好適な不死化細胞株を開発すること、2)βリンパ球と骨髄腫細胞株との融合を最適化すること、3)融合されていない骨髄腫とβリンパ球との両者にからハイブリドーマ細胞を餞別する方法を工夫すること。Kohler及びMilstein(1975)は、センダイウイルスを用いてβリンパ球と骨髄腫細胞株とを融合させることにより前記の目標を達成する方法を初めて記述した。後に、ポリエチレングリコール(PEG)も同じ目標を達成できることが発見された。PEGは今日では、第一選択の細胞融合剤として広範に使用され;該試薬はしばしば“ヒューゾゲン(fusogen)”と呼称される。
脾由来βリンパ球と骨髄腫細胞株との間の細胞融合の成否は、少なくともある程度は、多くの要素によって支配されていると言える。これらの要素とは、必ずしも限定されないが、ヒューゾゲン、温度、細胞混合プロトコール、脾細胞と骨髄腫細胞との比、細胞融合時間、細胞融合回収プロトコール、培地/バッファー混合物、並びに当然ながら、研究者などである。プロトコールの正確な詳細及び細胞融合の成否はしばしば研究所ごとに異なり、そして実験ごとにも異なる(Igarashi及びBando、1990)。
ハイブリドーマの選別には脾細胞と骨髄腫細胞の両者の特異的な増殖特性を利用する。まず前記のように脾細胞は培養において増殖できない、従って未融合の細胞は死滅する。骨髄腫細胞は、酵素ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)を欠損するのでヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培地(HAT培地)中では増殖できないことから、Kohler及びMilstein(1975)によって最初に選ばれた。DNA合成に主要な経路がアミノプテリンによって遮断されるので、救済経路が外来のヒポキサンチン及びチミジンを利用するためにはHPRTが要求である。骨髄腫細胞はHAT培地中で死滅するのに対し、ハイブリドーマは脾細胞が提供するHPRTによって増殖することができる。
従って本発明は、不死化された抗体分泌細胞を製造する方法であって、
(a)1以上の導入遺伝子を発現可能な抗体分泌細胞であり、刺激の不存在下では非不死化状態にあり、刺激に曝されるとその1以上の導入遺伝子により不死化状態に変化することができる細胞を有する遺伝子導入動物を用意すること、
(b)該動物から抗体分泌細胞を抽出すること、かつ
(c)その抗体分泌細胞を刺激に曝し、それによりその抗体分泌細胞を1以上の導入遺伝子により不死化すること
を特徴とする方法を提供する。
(a)1以上の導入遺伝子を発現可能であり、刺激の不存在下に非不死化状態であり、そして該細胞を刺激に曝すとその1以上の導入遺伝子により不死化状態に変化することができる抗体分泌細胞を有する遺伝子導入動物を用意すること、
(b)該動物から抗体分泌細胞を抽出すること、
(c)その抗体分泌細胞を刺激に曝し、それによりその抗体分泌細胞をその1以上の導入遺伝子により不死化させること、
(d)抗体を産生する不死化された抗体分泌細胞を選別すること、かつ
(e)その不死化された抗体分泌細胞から不死化細胞のクローン集団を製造すること
を特徴とする方法を提供する。
対象の抗体を分泌するβリンパ球の不死化細胞株の作成
Kohler及びMilstein(1975)の方法体系(前記参照)に代わるハイブリドーマ製造の方法は、免疫化されたマウスの脾臓(又は他の組織)から採取したβリンパ球の範囲内で必要な遺伝物質を獲得し、特定の環境条件を変更することによって不死化の誘発を可能にすることである。本発明では、この遺伝物質の獲得は遺伝子導入技術(Ryding et al. 2001)の使用により達成し、確実に全ての子孫を改変された染色体DNAについてホモ接合性にする。遺伝物質を染色体DNAに導入する方法は他にもあり、例えばリポトランスフェクションやウイルスによる運搬が挙げられる。しかしながらこれらの方法では、生殖系列を用いて遺伝子導入動物に移入するようには、100%の標的細胞が対象の遺伝物質を含有しているとの保証ができない。したがって本明細書に記載の発明の目的のために必要な遺伝子導入動物についての2つの特質を定義する必要がある。
活性化されたときに特定の細胞型の不自然な不死化をもたらす遺伝子はしばしば癌遺伝子と呼称される。その活性化はしばしば癌に結びつき、そしてそれ自体は腫瘍形成に関連する。特定の癌の分子基盤が、少なくとも部分的に不適切な活性化に、又は何らかの他の様式で癌遺伝子の調節に結びついている場合が多々ある。特に、本発明に関しては癌遺伝子が免疫系の癌に関連していることに留意する。殊に、リンパ球の癌及びそれらの腫瘍形成に関与する遺伝子の同定である。かかる遺伝子の異常な活性化又は不活性化は、しばしば癌遺伝子の正常な転写調節が改変された異常な染色体転座の結果である。癌遺伝子c−mycはそういった事例である。
βリンパ球不死化の更なる方法は、活性化すると該細胞の不死化を惹起する適当なシグナル経路の引き金を引くことである。この一例では、抗CD40 mAbとエプスタイン−バールウイルス(EBV)と間の相乗作用現象をヒトβリンパ球の活性化及び形質転換において利用することができた(Tsuchiyama et al. 1997; Niedbala及びStott 1998; Rush及びHodgkin 2001)。βリンパ球は、抗CD40抗体に暴露されると感受性が高まるので、EBVで不死化される可能性が増大する。CD40とCD21の複合体(EBVのための受容体)が同時に連結すれば、ヒトβリンパ球の短期増殖と長期形質転換率は共に増大する。あるいは、この相乗効果の根底にある分子機構の細胞内基盤を解明すれば、不死化する導入遺伝子を発現する戦略が得られるはずである。
アップレギュレーションすれば腫瘍形成及び細胞不死化に到ると推測される癌遺伝子に加えて、腫瘍抑制因子タンパク質が存在し、その活性には主として該癌遺伝子とは正反対の表現型効果があり、したがって細胞の腫瘍形成的増殖が抑制される。これら2つのクラスのタンパク質の活性の均衡が望ましい細胞増殖特性を維持するための鍵となる。すなわち、その抑制因子タンパク質が不活性化すれば、当該細胞は不死化するか、又は癌遺伝子の同時過剰発現/活性化により不死化が達成される可能性が高まると推定される。実際にこれは事実である(Mostecki et al. 2000; Yu及びThomas-Tikhonenko 2002)。原則的に2つの方法のうちの1つによって不活性化を達成できる。第一には、それ自身が腫瘍抑制因子を不活性化するか、あるいはそれが腫瘍抑制因子の不活性化を媒介するタンパク質の発現による方法、あるいは又、腫瘍抑制因子遺伝子をコードする配列を標的とするアンチセンスmRNA/リボザイム又はオリゴヌクレオチドの適切な転写又は導入によるものでよい。
アンチセンスRNAを使用して標的とするべき幾つかの遺伝子又は遺伝子は上に概説したが、それらの産生物によって、発現、活性化又は不活性化のいずれかの際に、それら遺伝子を発現する細胞は不死化に到ることができる。本発明の場合には、不死化のために特に対象とする細胞型は抗体分泌βリンパ球である。遺伝子産生物の活性化により細胞不死化がもたらされる場合には、これらの不死化因子を活性化する2つの方法が選択肢として存在する。これらは以下のように分類できる。第一は、遺伝子転写レベルでの制御による活性化であり、第二は、遺伝子産生物の活性化の制御である。遺伝子転写レベルでの制御を使用すれば、不死化タンパク質の発現の他にアンチセンスRNA/リボザイムの転写の調節も可能である。
細胞不死化の活性化が転写/翻訳レベルでの制御に依存する系の所望の特徴は以下の通りである。その活性化法は厳密に(“リーク”なく)調節され、その結果不死化が望まれる時点まで細胞増殖機構が正常に機能していなければならない。細胞不死化が十分迅速に活性化され、その結果対象の細胞全てが短時間の間に、好ましくは同時に確実に不死化状態になることである。そのような活性化因子又は不死化因子は、単クローンがβリンパ球由来の抗体を分泌し続けるのを絶対妨害しないことである。更にそのような活性化因子又は活性化の方法は、その過程を標的にすることが細胞の不死化にとって必要がないような細胞の生理的過程をなんらかの機構によって阻害しないことが必要である。また、そのような不死化は活性化因子の添加により構成的に活性化できること、又はそのような活性化因子が十分な量、入手可能であり、その結果選択したクローン細胞株全てを不死化増殖することができることである(Pollock及びRivera 1999; Wang et al. 1999)。
遺伝子産生物の転写制御の代わりとして、条件的に不活性な形で、該遺伝子を構成的に発現する方法がある。外部条件の操作によって活性化させることができる遺伝子産生物の例は、温度感受性ラージT抗原(前記のtsA58)である。遺伝子導入マウス、“不死化マウス”(Jat et al. 1991; Noble et al. 1995; Jat et al. (1997) 米国特許第5,688,692号; Jat et al. (1999) 米国特許第5,866,759号)では、ラージT抗原tsA58遺伝子は、構成的なマウス主要組織適合遺伝子複合体H−2KbクラスIプロモーターの制御下で広範に発現される(Weiss et al. 1983)。このプロモーターは更にインターフェロンγの存在下に更に活性化させることができる。全ての起源組織が試験されている訳ではないが、この手法が不死化された細胞株の作成に効果的であるといった多くの例が文献にある(Noble et al 1995)。不死化された細胞株を提供するための“不死化マウス”の利用性の議論については前記参照のこと。
どの不死化法を選択したとしても、これらの方法は全てクローン性増殖が可能な細胞の集団を得ることを意図するものである。クローンの数は採取された細胞の数によってのみ制限され、それは恐らく脾細胞又は他のリンパ組織、例えばリンパ節から採取された細胞の全数であると思われる。この細胞集団は、非分泌性細胞(T細胞、マクロファージなど)及び抗体分泌細胞の両者からなる。抗体分泌細胞の中で、1つだけの集団がマウスの免疫化に使用される抗原を分泌しており、またある場合には、細胞表面上にそれを提示している。このように、後者の細胞型について、対象の抗体を分泌する細胞が抗原と結合する細胞表面受容体を提示しているかどうかを選択する迅速なスクリーニング法が必要とされている。これは、蛍光活性化細胞選別(FACS)の技術を利用して達成できる。
本発明の更なる実施態様は、FACSの双検出能又は多検出能を利用することにより、マウスから採取された混合細胞集団からのβ−リンパ球を、蛍光標識された抗β細胞特異的mAbを使用して選別することである。以下の任意の抗原又は該抗原の組み合わせに特異的な蛍光標識されたモノクローナル又はポリクローナル抗体を利用して、適切なβ−リンパ球集団を選択的に濃密にしてよい:B220、CD19、sIgM、sIgD、sIgG、CD23、CD19、CD40、CD79a、MHCクラスII(Hardy et al. 1991; Allman et al. 1993; Erickson et al. 1996)。次いで前記の選択手順をすでに概説した抗原特異的な任意の手順と組み合わせて使用して、選別された細胞集団が確かにβ−リンパ球細胞株であることを更に確認できる。
代替の細胞選別システムでは、磁性コロイドが利用されるが、これは対象の細胞に特異性を有する抗体に結合した場合にその抗体に磁性標識を付与する。次いで該細胞を双極磁場フローソーターに導通させると、その磁性特性により細胞が分別され、その細胞が今度はコロイド標識された抗体との相互作用によって特定される(Moore et al. 1998)。この方法を使用してTリンパ球の亜集団が効果的に選別されている。FACS選別で必要とされるように蛍光マーカーで対象の抗原を標識するのではなく、該抗原は磁性コロイドで標識される。このようにして、適切な特異性を有する抗体を分泌する不死化されたβ−リンパ球を、それらが細胞表面免疫グロブリンを発現するしないにかかわらず標識し、選択することができる。
モノクローナル抗体の製造のため第一選択の宿主はKohler及びMilstein(1975)による技術が創作されて以来マウスのままである。しかしながら抗体は、他の種、特にラット、ウサギ及びヒツジにおいても製造されている。ラット骨髄腫細胞株は、ラット−ラット融合のために開発されている(De Clercq et al. 1986)。Spieker−Polet他(1995)はウサギ−ウサギハイブリドーマの製造を可能にする融合相手を得ることを記載している。該細胞株は、v−abl癌遺伝子をEν重鎖エンハンサー(Rosenbaum et al. 1990)の制御下に発現し、かつN−myc癌遺伝子をEκK鎖エンハンサー(Sμgiyama 1994)の制御下に発現する二重遺伝子導入動物の作成によって得られた。HATに感受性の融合相手は、8−アザグアニンの存在下にX線照射した後に腫瘍性脾臓から得られる細胞の好適な選択によって作成された。抗体を製造するために宿主として、ウシを使用する方法(Guidry et al. 1986)、ヒツジを使用する方法(Flynn et al. 1989)、ブタを使用する方法(Lumanglas及びWang 1995)及びハムスターを使用する方法(Sanchez-Madrid及びSpringer 1986)も記載されている。これらのアプローチは、マウス骨髄腫と免疫をした宿主由来の脾細胞間の種間ヘテロハイブリドーマの形成を工程として含む方法を利用している。本明細書に記載の発明を、前記の任意の種及び他の種に同様に適用でき、適切な遺伝子技術が開発されていることは当業者には明らかである。
マウス由来のモノクローナル抗体をヒトの治療用途に適用することは成功していない。その理由は、マウス抗体はそれの抗原特異性とは別にヒトにそれの免疫原性があるからである。そのようなヒトの抗マウス抗体(HAMA)は投与された抗体を中和し、そして患者に毒性をもたらすおそれがある。したがって特に治療用途のためにヒト化されたモノクローナル抗体を製造することに対しては大きな期待がある。ヒト化されたモノクローナル抗体の作成のために幾つかのアプローチが採られている。これらのアプローチは、例えばヒト血液由来のβ細胞と標準的なマウス骨髄腫(Foung及びPerkins 1989; Foung et al. 1990)、又はSPAZ−4異種骨髄腫(Ostberg 1986)、SPAM−8異種骨髄腫(Gustafsson et al 1995 Panova及びGustafsson 1995)、Hab−1異種骨髄腫(Faller et al. 1990)又はCBF7異種骨髄腫(Grunow et al. 1990; Walper et al. 1990; Niedbala及びStott 1998)とのEBV/電気的融合を用いて行う細胞融合である。これらの異種骨髄腫はIgG非分泌性ヒト/マウス雑種である。他の方法は、例えばヒトのβ−リンパ球を抗CD40mAbとEBVに曝すことである(Tsuchiyama et al. 1997; Niedbala及びStott 1998)。純粋なヒトの細胞融合相手も樹立されており、例えばHAT感受性細胞株HK−126(Kawahara et al. 1990)であり、これはヒトプラズマ細胞腫細胞株及びA4H12細胞(Kawahara et al. 1992)から樹立されている。
実施例1
エクジソン受容体とRXR受容体を発現する遺伝子導入マウスの誘導
VgEcR−RXR DNA断片の調製
適当な転写及び翻訳の調節制御エレメント並びにこれらのエレメントの5′及び3′の両者に隣接する25塩基対のベクター配列を含むVgEcR遺伝子とRXR遺伝子をコードする領域(CMVプロモーター、VgEcR遺伝子、TKポリアデニル化シグナル、RSVプロモーター、RXR遺伝子及びBGHポリアデニル化シグナル)をベクターpVgRXR(インビトロジェン;カタログ番号V730−20)から、以下のプライマー、5′−GTACTAGTAGGGATTTTGGTCATGGCTAG−3′(配列番号1;5′VgEcR−RXRプライマー)及び5′−GTACTAGTCAGCTGGTTCTTTCCGCCTCAG−3′(配列番号2;3′VgEcR−RXRプライマー)を使用してPCR増幅させる。これらのプライマーはSpeI制限部位“テイル”を含む。増幅されたPCR産物中には他のSpeI部位は存在しない。次いで6134塩基対のPCR産物をSpeIで消化させ、6124塩基対の産物を得て、これをSpeI消化された脱リン酸化されたpcDNA2.1(インビトロジェン;カタログ番号V400−20)にクローニングする。次いで該PCR産物のコピーを含有する陽性クローン(pcDNA2.1−VgEcR−RXR)の組み換え挿入物を含む領域の配列を決定し、PCRの精度を確認する。
キアゲンマキシプレップキット(キアゲン カタログ番号12362)を使用して、>500μgのpcDNA2.1VgEcR−RXRプラスミドDNAを調製する。前記DNAの300μgをSpeIで消化させ、そして6124塩基対の挿入物(VgEcR−RXR)と2981塩基対の断片とをゲル電気泳動で分離したのち、キアクイックゲル抽出キット(キアゲン カタログ番号28740)を使用して抽出する。次いで抽出されたDNAを1×TEバッファー(10mMのトリス pH7.5/1mMのEDTA)中で10mlにし、そして10gのCsClを添加し、緩慢に混合して溶解させる。該試料を超遠心管に装填し、65000rpmで室温において垂直ローター中で6時間遠心分離する。管の底部から約1cmのところに挿入されたニードルを用いてフラクション(0.5ml)を回収する。各フラクションの一部(5μl)を1%アガロースゲル(1×TAE)に流し、ゲルを紫外線に曝すことによってDNAを含有するフラクションを測定する。次いでこれらのDNA含有フラクションをまとめて、100倍容量の微量注射バッファー(5mMのトリス pH7.4/0.1mMのEDTA)に対して8時間透析する。この透析を更に3回繰り返す。次いでDNAの濃度を、透析されたDNA試料の濃度を1:10希釈及び1:100希釈したもの(微量注射バッファー中)の260nmでの吸収を測定し、式:二本鎖DNAの260nmでの吸収の1単位(1cmの光路長)=50μg/mlに適用することによって、測定する。次いでDNAの試料を、微量注射のために、微量注射バッファー中で2μg/mlに希釈し、そして0.22μmのMillex−GVフィルタ(ミリポア;カタログ番号SLGV R25 LS)を通して滅菌濾過することによって調製する。
CBA×C57BL/10交雑から得られる受精卵の前核に、前記で精製された〜2plのVgEcR−RXR挿入物を微量注射する。次いで微量注射された卵を偽妊娠の雌に移植し(Kollias et al, 1986の方法を参照のこと)、生まれてきたマウスについてゲノムDNA中に導入遺伝子が存在するかを以下のように分析する。ゲノムDNAを、10日齢の仔マウスから採取された100μlの血液からフェノールクロロホルム法により抽出し、エタノール沈殿することによって調製する。配列番号16と配列番号2のプライマーを使用して、ゲノムDNAに対してPCRを実施し、1594塩基対の産物を導入遺伝子の存在を示す評価として使用する。βグロビン遺伝子(予想される断片サイズ494塩基対)の断片の増幅を、ポジティブコントロールとして、前記の反応のそれぞれにおいて並行して、プライマー5′−CCAATCTGCTCACACAGGATAGAGAGGGCAGG−3′(配列番号11;5′ベータグロビンプライマー)及び5′−CCTTGAGGCTGTCCAAGTGATTCAGGCCATCG−3′(配列番号12;3′ベータグロビンプライマー)を使用して実施する。PCR反応のための増幅条件は、94℃で30秒、60℃で90秒及び72℃で120秒を35サイクル繰り返し、最終延長を72℃で10分間行う。陽性のG0(VgEcR−RXR陽性)初代マウスを親マウスと戻し交雑させ、引き続き子孫(G1)をPCRによって同様に分析する。次いで雄と雌のVgEcR−RXR陽性マウスを交雑させ、そしてホモ接合型マウスが同定されるまで(PCR産物のバンド強度の比較により)ゲノムDNAの試料を前記のように調製、分析する。次いでこれらのマウスを、ホモ接合型のマウス連続継代系列の初代として使用し、これをVgEcR−RXRホモ接合体と呼称する。
エクジソン誘起可能な発現系の制御下にc−mycを発現する遺伝子導入マウスの誘導
c−myc DNA断片の調製
c−mycをコードする配列(GenBankアクセッション番号:X01023)を、マウス脾臓ライブラリー(クロンテック;カタログ番号7134−1)から、以下のPCRプライマー、5′−GTAGCTAGCGCCACCATGCCCCTCAACGTGAACTTC−3′(配列番号3;5′c−mycプライマー)及び5′−GATCTCGAGTTATGCACCAGAGTTTCGAAG−3′(配列番号4;3′c−mycプライマー)を用いてPCR増幅する。次いで1344塩基対のPCR産物を5′と3′のそれぞれでコーディング配列に隣接する位置にあるPCRプライマー中のNheI及びXhoIで消化する。また5′プライマーはNheI部位とc−mycのATG開始コドンとの間にコザックコンセンサス配列をコードしている。1332塩基対の消化されたPCR産物をpIND(インビトロジェン;カタログ番号V705−20)のNheIとXhoIでの消化によるゲル精製された4934塩基対のDNA断片中にクローニングし、6266塩基対の産物を得る。これをpIND−c−mycと呼称する。クローニングされたPCR産物の両鎖を配列決定することによってpIND−c−mycの挿入物を確認する。適切な発現制御エレメントに加えて、5つの雑種E/GRE結合部位、HSpプロモーター、BGHポリAシグナル及び前記の発現、制御エレメントに隣接する25塩基対のベクター配列を含む挿入物を以下のプライマー5′−GTACTAGTTGCCACCTGACGTCGACGGATC−3′(配列番号9;5′pINDプライマー)及び5′−GTACTAGTCTCAGAAGCCATAGAGCCCAC−3′(配列番号10;3′pINDプライマー)を用いてPCR増幅する。次いでこの2124塩基対のPCR産物をSpeIで消化させ、2114塩基対の産物を得て、これをSpeI消化された脱リン酸化されたpcDNA2.1(インビトロジェン;カタログ番号V400−20)にクローニングして、5085塩基対の構築物を得る。これをpcDNA2.1−IND−c−mycと呼称する。このSpeI挿入物の両鎖の配列決定によってPCRの精度を確認する。
受精卵への注入のために実施例1(マウス卵子に注入するためのDNA断片の調製)に記載のように少量のSpeI挿入物を製造するが、この場合には精製されるべきSpeI断片は2114塩基対である。次いで受精卵にIND−c−mycのSpeI断片を注入し、そして実施例1(VgEcR−RXRについてホモ接合性の遺伝子導入マウス系列の作成)に記載のように、組み込まれたIND−c−mycについてホモ接合性のマウス(IND−c−mycホモ接合体と呼称する)を誘導する。尚、血液由来のゲノムDNA調製物中の挿入物の存在はプライマー5′−ACAGCTTCGAAACTCTGGTGC−3′(配列番号13;5′c−myc導入遺伝子確認プライマー)及び配列番号10を利用して確認し、そして予測された309塩基対のPCR産物がプライマー配列番号2及び5′−CAGCTGCATTCTCCCATCAGC−3′(配列番号16;5′VgEcR−RXR導入遺伝子確認プライマー)を代わりに用いることにより、得られる。
エクジソン誘起可能な発現系の制御下にablを発現する遺伝子導入マウスの誘導
この手順は、実施例2に記載されるc−myc遺伝子導入マウスの誘導について記載されたものと同じであるが、以下の変更がある。ablをコードする配列(GenBankアクセッション番号:V01541)を、アベルソンのマウス白血病ウイルスで感染されたマウスから得られたマウス脾臓ライブラリーから、以下のPCRプライマー、5′−GTAGCTAGCGCCACCATGGAGCCTGGTGGAGTTGGC−5′(配列番号5;5′ablプライマー)及び5′−GATCTCGAGTCAAGCTTGCTGTCCAAGATC−3′(配列番号6;3′ablプライマー)を用いてPCR増幅する。次いで516塩基対のPCR産物をNheI及びXhoIで消化し、そして504塩基対の消化された産物を、NheI及びXhoIでpIND(インビトロジェン;カタログ番号V705−20)を消化してゲル精製された4934塩基対の断片中にクローニングし、5438塩基対のプラスミドを得て、これをpIND−ablと呼称する。クローニングされたPCR産物の両鎖を配列決定することによってpIND−ablの挿入物を確認する。該挿入物を適切な発現制御エレメントと一緒に実施例2に記載のようにpcDNA2.1中にクローニングするが、但し、プライマーの配列番号9及び10を用いてもたらされたPCR産物はSpeI消化後では1296塩基対と1286塩基対である。次いでSpeI消化された産物をSpeIで直鎖化されたpcDNA2.1中にクローニングし、4258塩基対のプラスミドを得て、これをpcDNA2.1−IND−ablと呼称する。次いでVgEcR−RXR/IND−ablと呼称されるホモ接合性の二重遺伝子導入マウスを実施例2に記載されるc−mycに関するものと同様に製造するが、この実施例ではマウスに注入するDNAとしてSpeI IND−abl断片を使用する。血液のゲノムDNA試料中にIND−abl挿入物が存在することは、プライマー5′−AGCTGCCCTGCACCTTTCCTG−3′(配列番号14;5′abl導入遺伝子確認プライマー)及び配列番号10を用いて、733塩基対のPCR産物が得られることで確認される。ポナステロンAの存在下でのabl発現の誘導は実施例2に記載されるようにc−mycと同様に証明される。但し、誘導後のablの発現が増大することを検出するために抗−abl抗体(サンタクルス;カタログ番号13076)が使用される。VgEcR−RXR/IND−ablマウス系統で不死化された脾細胞を生じさせる能力は、VgEcR−RXR/IND−c−myc系統について実施例2に記載される方法と同様に確認される。
エクジソン誘起可能な発現系の制御下にablとc−mycを発現する遺伝子導入マウスの誘導
VgEcR−RXR/IND−c−myc遺伝子導入マウス(実施例2参照)及びVgEcR−RXR/IND−abl遺伝子導入マウス(実施例3参照)を交配させて、三重ホモ接合性遺伝子導入マウスを得て、これをVgEcR−RXR/IND−abl/c−mycと呼称する。全ての3つの導入遺伝子の存在は、それぞれVgRXR(1594塩基対)、INC−c−myc(309塩基対)及びIND−abl(733塩基対)の存在確認のための以下のプライマー対;配列番号16及び2、配列番号13及び10、並びに配列番号14及び10を使用して、遺伝子導入マウスから採取された血液試料から得られるゲノムDNA試料から規定サイズのPCR産物を生じさせることで確認する。プライマー対の配列番号11及び12は494塩基対のベータグロビン遺伝子産生物を増幅するので、これを前記のPCRのそれぞれでコントロールとして使用し、反応液中にPCR鋳型としてマウスゲノムの存在を確認する。
エクジソン誘起可能な発現系の制御下に誘起可能なSV40ラージT抗原を発現する遺伝子導入マウスの誘導
この手順は、実施例2に記載されるc−myc遺伝子導入マウスの誘導について記載されたものと同じであるが、以下の変更がある。SV40ラージT抗原をコードする配列(GenBankアクセッション番号:AAB59901.1”/db_xref=”GI:332753”)を、SV40ウイルスで感染されたマウスから得られたcDNAライブラリーから、以下のPCRプライマー、5′−GTAGCTAGCGCCACCATGGATAGAGTTCTGAGCAGAG−3′(配列番号7;5′SV40ラージTプライマー)及び5′−GATCTCGAGTCAATAAACTGTGTATTCAGC−3′(配列番号8;3′SV40ラージTプライマー)を用いてPCR増幅する。次いで2382塩基対のPCR産物をNheI及びXhoIで消化し、そして2370塩基対の消化された産物を、NheI及びXhoIでpIND(インビトロジェン;カタログ番号V705−20)を消化してゲル精製された4934塩基対の断片中にクローニングし、7304塩基対のプラスミドを得て、これをpIND−ラージTと呼称する。クローニングされたPCR産物の両方の鎖を配列決定することによってpIND−ラージTの挿入物を確認する。該挿入物を適切な発現制御エレメントと一緒に実施例2に記載のようにpcDNA2.1中にクローニングするが、但し、プライマーの配列番号9及び10を用いてもたらされたPCR産物は3161塩基対であり、これはSpeI消化後に3151塩基対の産物をもたらす。次いで消化された産物をpcDNA2.1中にクローニングし、6122塩基対のプラスミドを得て、これをpcDNA2.1−IND−ラージTと呼称する。次いでVgEcR−RXR/IND−ラージTと呼称されるホモ接合性の二重遺伝子導入マウスを実施例2に記載されるc−mycに関するものと同様に製造するが、この実施例ではSpeI IND−ラージT断片をマウスへ注入する。血液のゲノムDNA試料中にIND−ラージT挿入物が存在することは、プライマー5′−AACTTGGCTCCTCCGATGCTC−3′(配列番号15;5′ラージT導入遺伝子確認プライマー)及び配列番号10を用いて、1069塩基対のPCR産物が得られることで確認される。
エクジソン誘起可能な発現系の制御下にabl、c−myc及びラージT抗原を発現する遺伝子導入マウスの誘導
実施例4で得られたVgEcR−RXR/IND−abl/c−myc三重遺伝子導入マウス及び実施例5で得られたVgEcR−RXR/IND−ラージT二重遺伝子導入マウスを交配させて、四重ヘテロ接合性遺伝子導入マウスと得て、これをVgEcR−RXR/IND−abl/c−myc/ラージTと呼称する。全ての4つの導入遺伝子の存在は、それぞれVgRXR(1594塩基対)、INC−c−myc(309塩基対)、IND−abl(733塩基対)及びIND−ラージT(1069塩基対)の存在確認のための以下のプライマー対;配列番号16及び2、配列番号13及び10、配列番号14及び10、並びに配列番号15及び10、を使用して、遺伝子導入マウスから採取された血液試料から得られるゲノムDNA試料から規定サイズのPCR産物を生じさせることで確認する。プライマー対の配列番号11及び12は494塩基対のベータグロビン遺伝子産生物を増幅するので、これを前記のPCRのそれぞれでコントロールとして使用し、そうして試料におけるPCR鋳型としてのマウスゲノムの存在を確認する。
不死化マウスからの不死化された脾細胞株の誘導
脾臓(他の組織あるいは細胞種も同様に使うことができるが、それには例えば扁桃、リンパ節、咽頭扁桃、虫垂、パイエル板、気管支関連リンパ組織、骨髄、粘膜関連リンパ組織又は循環β−リンパ球などが含まれる)を、頸椎脱臼により屠殺された不死化マウス(Jat et al. (1999) 米国特許第5,866,759号; Jat et al. (1997) 米国特許第5,688,692号)から採取する。必要であれば、25ゲージ針付きシリンジを使用して、RPMI−1640(シグマ;カタログ番号R0883)ですすいで細胞を組織から緩慢に解離させる。次いで該細胞を2つの小分画に分け、そして2つの別個の50mlフラスコ(グライナー;カタログ番号690175)中に入れる。両者のフラスコは、2mMのグルタミン(ライフテクノロジーズ;カタログ番号25030−024)、10%の仔ウシ血清(ライフテクノロジーズ;カタログ番号16000−036)及び100単位のペニシリン/100μg/mlのストレプトマイシン(ライフテクノロジーズ;カタログ番号15140−114)を含む10mlのRPMI−1640を含有する。1つのフラスコは33℃/5%CO2でインキュベートするが、もう一方は37℃/5%CO2で保持する。tsA58の許容温度(33℃)で増殖する細胞は不死化され、そして更に継代できる。
実施例2、3、4、5及び6で製造される、エクジソン誘起可能な発現系の制御下に、c−mycを発現する遺伝子導入動物、ablを発現する遺伝子導入動物又はc−myc及びablを発現する遺伝子導入動物又はSV40ラージT抗原を発現する遺伝子導入動物又はc−myc、abl及びSV40ラージT抗原を発現する遺伝子導入動物からの、標準的なマウス免疫工程を利用する、所望の特異性を有する抗体を分泌する不死化された脾細胞株の誘導
対象抗原によるマウスの免疫
実施例2、3、4、5又は6で作成された遺伝子導入マウスを対象抗原で、当業者に公知の標準的プロトコールに従って免疫する。抗原はマウスと異種の任意の分子であってよいが、通常はタンパク質又は小ペプチドである。小ペプチドを免疫原として使用するときには、該ペプチドの免疫原性を改善するために、これをスカシ貝ヘモシアニン(KLH)のような抗原キャリヤータンパク質と化学的に結合させてもよい。KLHと小ペプチドとを結合させるには多くの方法が存在する。通常の経路は、ペプチドのN末端又はC末端のいずれかに唯一のシステイン残基を操作し、そして該ペプチドを、ジスルフィド結合を介して当業者に公知の方法を利用してKLHに結合させることである。
抗体分泌細胞をFACSによって選別するために、対象の抗原を適切な蛍光体で標識する必要がある。セルソーターにおいて利用できる、ソートする試料の“励起”と“発光”ののための波長の種類により、蛍光標識の種類が選別される。例としては、励起極大〜494nm及び蛍光極大〜519nmを有するフルオレセインで抗原による標識があげられる。このように特異的な結合特性を有する抗体を分泌する細胞及び適当な細胞表面免疫グロブリンを提示する細胞は、特異的な抗原又は単一抗原のエピトープを、様々な励起蛍光特性を有する種々の蛍光体で標識することによって、別々に単離される。蛍光体の選択肢は、セルソーターの検出システムの試料中の異なる蛍光体を識別する能力によって、決定される。
尾採血サンプルのELISA試験により対象の抗原に対する十分な応答が達成されることが示されたら、そのマウスから脾臓を採取する。更に屠殺の2日前に最終免疫化を実施する。マウスは頸椎脱臼によって屠殺され、そして皮膚はエタノールで滅菌される。他の全ての操作は滅菌条件下に実施される。脾臓を取り出し、そして該組織の長手方向に沿って切断する。25ゲージ針を用いて、10mlのRPMI培地を使用し、脾臓から細胞を洗出する。10mlの細胞懸濁液を回収し、そしてこの工程を繰り返す。細胞を1000gで3分間遠心分離し、そして20mlのRPMI中に再懸濁し、次いで再び1000gで3分間遠心分離する。次いで細胞を40mlのDMEM/5μMのポナステロンA中に再懸濁する。この工程で脾細胞を後の使用のために凍結させてよい(Bennick et al. 1991; Marusich 1988)。蛍光標識された抗原を細胞懸濁液に添加し、これを緩やかに回転する台上で37℃において1時間インキュベートして、フローサイトソーター、例えばベクトン−ディキンソン社のFACSCalibur、において分析をする。標識された抗原は、対象の蛍光標識された抗原を特異的に認識する細胞表面免疫グロブリンを発現するリンパ球を決定する細胞表面受容体に結合する。あるいは対象の抗原を分泌するが細胞表面抗原は提示しない細胞を、蛍光標識されかつビオチン化された抗原を使用するGray他(1995)により記載された方法によって選別することもできる。対象となる単一の細胞を、組織培養用96ウェルマイクロタイタープレート(0.1mlのRPMI/10%の仔ウシ血清/5uMのポナステロンAを1ウェルあたりに含有する)の単一のウェル中に接種する。次いでそのマイクロタイタープレートを37℃及び5%CO2でインキュベートし、その後数日間にわたり細胞の増殖を観察する。3日おきに又は細胞コロニーが約50〜70%の集密度になるまでに、培地を0.1mlの新しいRPMI/10%の仔ウシ血清/5uMのポナステロンAと交換する。この時点で、20μlの細胞上清を、所望の特異性を有する抗体の存在について試験する。かかる試験は前記のELISA試験の形態を採用できるが、あるいは抗体の最終的な用途に非常に近いより高度なアッセー法、例えばシンチレーション近接アッセー、蛍光アッセー又は蛍光偏光アッセーを使用することもできる。次いで目的にあうクローンをマイクロタイタープレートから6ウェルプレート、次いでT75フラスコ中でRPMI/10FCS/5μMのポナステロンA中で継代培養する。更に必要とされる十分な抗体を得るために継代培養を、フラスコ中又はバイオリアクター規模でのいずれかで実施できる。更に、必要であればFACSを使用して、細胞上に存在する表面IgGとは無関係に、全てのβ−リンパ球を同定することもできる。このことは、蛍光標識された抗β細胞特異的mAb、例えば抗−B220、CD19、sIgM、sIgD、sIgG、CD23、CD19、CD40、CD79a、CD79b、MHCクラスII(Hardy et al. 1991; Allman et al. 1993; Erickson et al. 1996)を使用して達成できる。この手法は、蛍光標識された抗原をβ−リンパ球に結合させること又はGray他(1995)によって記載される方法に従って対象の抗体を分泌する単一の細胞を保持する微小滴に結合させることと組み合わせて使用しできる。
マウスの免疫工程を用いない:実施例2、3、4、5及び6に記載されるような、エクジソン誘起可能な発現系の制御下に、c−mycを発現する遺伝子導入動物、ablを発現する遺伝子導入動物又はc−myc及びablを発現する遺伝子導入動物又はSV40ラージT抗原を発現する遺伝子導入動物又はc−myc、abl及びSV40ラージT抗原を発現する遺伝子導入動物からの、所望の特異性を有する抗体を分泌する不死化された脾細胞株の誘導
脾細胞(又は他の抗体分泌細胞)を、(実施例8に記載される方法;脾細胞の採取に従って)VgEcR−RXR/IND−c−myc(実施例2参照)、VgEcR−RXR/IND−abl(実施例3参照)、VgEcR−RXR/IND−abl/c−myc(実施例4参照)、VgEcR−RXR/IND−ラージT(実施例5参照)又はVgEcR−RXR/IND−abl/c−myc/ラージT(実施例6)の細胞系統のそれぞれのナイーブマウス(免疫されていない)から採取する。前記の任意の系統から得られる不死化された脾細胞株を、対象とする抗体を分泌するかを指標にして、実施例8に記載の方法(抗原の標識と脾細胞の採取)により選別する。あるいは脾細胞を後の使用のために採取後に凍結させることもできる(Bennick et al. 1991; Marusich 1988)。従って、大量のナイーブ脾細胞(幾つかの脾臓由来)を後の使用のために幾つかの小分画として凍結させることにより、細胞スクリーニングの手法が単純化される。なぜなら、次の実験の際には、1バイアルの細胞の溶融を必要とするのみであり、新たなマウスの屠殺、そして細胞試料の調製を必要としないからである。
マウス免疫工程を用いての、実施例7に記載されるような不死化マウスから所望の特異性を有する抗体を分泌する不死化された脾細胞株の誘導
不死化マウスを実施例8に記載される方法(対象の抗原でのマウスの免疫)に従って対象の抗原で免疫する。適切な免疫応答が検出されたら、実施例8に記載される方法(抗原の標識と脾細胞の採取)に従って抗原を標識し、かつ脾細胞を採取する。但し、細胞培養はポナステロンAの存在下及び33℃で実施する。
マウス免疫工程を用いない、実施例7に記載されるような不死化マウスから所望の特異性を有する抗体を分泌する不死化された脾細胞株の誘導
脾細胞を実施例8に記載される方法(脾細胞の採取)に従ってナイーブマウス(免疫されていない)から採取するが、但し、細胞培養はポナステロンAの不存在下及び33℃で実施する。所望の細胞のクローン選択は実施例8に記載される方法(抗原の標識と脾細胞の採取)に従ってセルソーターを使用して実施するが、但し、細胞培養はポナステロンAの不存在下及び33℃で実施する。あるいは脾細胞を後の使用のために採取後に凍結させることもできる(Bennick et al. 1991; Marusich 1988)。従って大量のナイーブ脾細胞(幾つかの脾臓由来)を後の使用のために幾つかの小画分としてで凍結させると、スクリーニング法が単純化される。なぜなら、次の実験は1バイアルの細胞の溶融を必要とするのみであり、新たなマウスの屠殺、そして細胞試料の調製を必要としないからである。
実施例2、3、4、5及び6で製造される、エクジソン誘起可能な発現系の制御下に、c−mycを発現する遺伝子導入動物、ablを発現する遺伝子導入動物又はc−myc及びablを発現する遺伝子導入動物又はSV40ラージT抗原を発現する遺伝子導入動物又はc−myc、abl及びSV40ラージT抗原を発現する遺伝子導入動物又は実施例7に記載される不死化マウスから、これらのマウスをp53腫瘍抑制遺伝子の完全欠失変異体であるマウスと交配させてホモ接合性にした後に、実施例8、9、10及び11に記載される方法体系を利用する、所望の特異性を有する抗体を分泌する不死化された脾細胞株の誘導
Jacks他(1994)に記載されるホモ接合性p53完全欠失変異体を実施例2〜7に記載される任意の1種の遺伝子導入マウスと交配し、二重のホモ接合する。次いで所望の特異性を有する抗体を分泌する細胞を適切な実施例8、9、10又は11に記載されるように得る。
実施例8、9、10、11及び12に記載される方法体系及び実施例2、3、4、5、6、7又は12に記載される遺伝子導入マウスを利用する、ヒト化された抗体を提供する遺伝子導入マウスの誘導
ヒト化されたモノクローナル抗体を、実施例2(VgEcR−RXR/IND−c−myc)、実施例3(VgEcR−RXR/IND−abl)、実施例4(VgEcR−RXR/IND−abl/c−myc)、実施例5(VgEcR−RXR/IND−ラージT)、実施例6(VgEcR−RXR/IND−abl/c−myc/ラージT)、実施例7(不死化マウス)又は実施例12(実施例2〜7と同様であるが、p53−/−)のいずれかに記載される遺伝子導入マウスの1つと、免疫グロブリンをコードする配列の全て又は一部が等価のヒトの配列で交換されているマウスとの交配によって作成できる。2種の選択されたマウス系統を交配させ、そして子孫の血液から採取されたゲノムDNAから得られるDNAのPCR分析を行い、スクリーニングすることで、子孫が両者の遺伝子導入初代マウスから提供される所望の遺伝情報を有することを確認する。実施例2、3、4、5、6又は7に記載されるマウスと交配させるのに使用できるヒト化された免疫グロブリン配列を有するマウスの例は、例えばAbgenixゼノマウスTM(Green et al. 1994; Mandez et al. 1997; Kucherlapati et al. (2000) ヒト化ゼノマウスから得られるヒト抗体, 米国特許第6,150,584号; Kucherlapati et al. (2000) 異種抗体の産生. 米国特許第6,114,598号)及びメダレックスHuMabマウス(Lonberg et al. (2001) 米国特許第6,300,129号)である。次いで、マウスを免疫する工程を行う又は行わないのいずれかの後に、エクジソンプロモーターの制御下に癌遺伝子を発現させることによって不死化を達成する実施例8又は9に記載される方法、あるいは、マウス免疫を行うか又は行わないかの選択の後に、不死化マウスから抗体を得る実施例10及び11に記載される方法、の何れかによってモノクローナル抗体を得る。
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配列
配列番号1
5′VgEcR−RXRプライマー
5′−GTACTAGTAGGGATTTTGGTCATGGCTAG−3′
配列番号2
3′VgEcR−RXRプライマー
5′−GTACTAGTCAGCTGGTTCTTTCCGCCTCAG−3′
配列番号3
5′c−mycプライマー
5′−GTAGCTAGCGCCACCATGCCCCTCAACGTGAACTTC−3′
配列番号4
3′c−mycプライマー
5′−GATCTCGAGTTATGCACCAGAGTTTCGAAG−3′
配列番号5
5′ablプライマー
5′−GTAGCTAGCGCCACCATGGAGCCTGGTGGAGTTGGC−3′
配列番号6
3′ablプライマー
5′−GATCTCGAGTCAAGCTTGCTGTCCAAGATC−3′
配列番号7
5′SV40ラージTプライマー
5′−GTAGCTAGCGCCACCATGGATAGAGTTCTGAGCAGAG−3′
配列番号8
3′SV40ラージTプライマー
5′−GATCTCGAGTCAATAAACTGTGTATTCAGC−3′
配列番号9
5′pINDベクタープライマー
5′−GTACTAGTTGCCACCTGACGTCGACGGATC−3′
配列番号10
3′pINDベクタープライマー
5′−GTACTAGTCTCAGAAGCCATAGAGCCCAC−3′
配列番号11
5′ベータグロビンプライマー
5′−CCAATCTGCTCACACAGGATAGAGAGGGCAGG−3′
配列番号12
3′ベータグロビンプライマー
5′−CCTTGAGGCTGTCCAAGTGATTCAGGCCATCG−3′
配列番号13
5′c−myc導入遺伝子確認プライマー
5′−ACAGCTTCGAAACTCTGGTGC−3′
配列番号14
5′abl導入遺伝子確認プライマー
5′−AGCTGCCCTGCACCTTTCCTG−3′
配列番号15
5′ラージT導入遺伝子確認プライマー
5′−AACTTGGCTCCTCCGATGCTC−3′
配列番号16
5′VgEcR−RXR導入遺伝子確認プライマー
5′−CAGCTGCATTCTCCCATCAGC−3′
Claims (34)
- 不死化された抗体分泌細胞を製造する方法であって、
(a)1以上の導入遺伝子を発現可能な抗体分泌細胞であり、刺激の不存在下では非不死化状態にあり、刺激に曝されるとその1以上の導入遺伝子により不死化状態に変化することができる細胞を有する生殖細胞系遺伝子導入ホモ接合型非ヒト動物を用意すること、
(b)該生殖細胞系遺伝子導入ホモ接合型非ヒト動物から抗体分泌細胞を抽出すること、かつ
(c)その抗体分泌細胞を刺激に曝し、それによりその抗体分泌細胞を1以上の導入遺伝子により不死化すること
を特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法により不死化された抗体分泌細胞を製造し、そして該細胞から抗体を収集することを特徴とする抗体の製造方法。
- モノクローナル抗体を産生する不死化細胞のクローン集団を製造する方法であって、
(a)1以上の導入遺伝子を発現可能であり、刺激の不存在下に非不死化状態であり、そして該細胞を刺激に曝すとその1以上の導入遺伝子により不死化状態に変化させることができる抗体分泌細胞を有する生殖細胞系遺伝子導入ホモ接合型非ヒト動物を用意すること、
(b)該生殖細胞系遺伝子導入ホモ接合型非ヒト動物から抗体分泌細胞を抽出すること、
(c)その抗体分泌細胞を刺激に曝し、それによりその抗体分泌細胞をその1以上の導入遺伝子により不死化させること、
(d)抗体を産生する不死化された抗体分泌細胞を選別すること、かつ
(e)その不死化された抗体分泌細胞から不死化細胞のクローン集団を製造すること
を特徴とする方法。 - 抗体分泌細胞における導入遺伝子の発現が誘起可能なプロモーターの制御下にあり、かつ刺激によりプロモーターの活性及び導入遺伝子の発現が調節可能である、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 刺激によりプロモーター活性及び導入遺伝子の発現を促進する、請求項4に記載の方法。
- 刺激によりプロモーター活性及び導入遺伝子の発現を阻害する、請求項4に記載の方法。
- 抗体分泌細胞における導入遺伝子の産生物が刺激の存在下で不死化を促進し、かつ刺激の不存在下では不死化を促進しない、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 導入遺伝子が癌遺伝子である、請求項1から5又は請求項7のいずれかに記載の方法。
- 癌遺伝子がラージT抗原の遺伝子である、請求項8に記載の方法。
- 生殖細胞系遺伝子導入ホモ接合型非ヒト動物が不死化マウスである、請求項1から5又は請求項7から9のいずれかに記載の方法。
- 抗体分泌細胞における導入遺伝子の産生物が刺激の不存在下では不死化を阻害し、かつ刺激の存在下では不死化を阻害しない、請求項1から4又は請求項6のいずれかに記載の方法。
- 導入遺伝子が腫瘍抑制遺伝子である、請求項11に記載の方法。
- 抗体分泌細胞における導入遺伝子の産生物が細胞において腫瘍抑制機能を阻害する、請求項1から5又は請求項7から9のいずれかに記載の方法。
- 導入遺伝子がmdm2である、請求項13に記載の方法。
- 導入遺伝子がcreレコンビナーゼを含み、腫瘍抑制機能が腫瘍抑制遺伝子に起因し、かつ腫瘍抑制遺伝子又はその機能的部分がloxp部位に隣接している、請求項13に記載の方法。
- 導入遺伝子の産生物が、腫瘍抑制遺伝子の発現を阻害できるアンチセンスRNA又はリボザイムRNAを含む、請求項13に記載の方法。
- 腫瘍抑制遺伝子又は腫瘍抑制機能がp53を含む、請求項12から16のいずれかに記載の方法。
- 癌遺伝子が、myc、abl、bcl−2、v−rel、ras、パピローマウイルスE6タンパク質、パピローマウイルスE7タンパク質、アデノウイルスE1A、PIM1、RhoH/TTF又はPAX5を含む、請求項8に記載の方法。
- 生殖細胞系遺伝子導入ホモ接合型非ヒト動物が、腫瘍抑制遺伝子を欠損した抗体分泌細胞を含む、請求項1から18のいずれかに記載の方法。
- 請求項1から19のいずれかに記載の方法であって、該方法が工程(b)の前に生殖細胞系遺伝子導入ホモ接合型非ヒト動物を抗原で免疫化する更なる工程を含む方法。
- 工程(d)が、抗原を認識する抗体を産生する抗体分泌細胞を選別することを含む、請求項3から20のいずれかに記載の方法。
- 工程(d)が蛍光標識細胞選別法(FACS)を含む、請求項3から21のいずれかに記載の方法。
- 生殖細胞系遺伝子導入ホモ接合型非ヒト動物を免疫化しない、請求項1から19のいずれかに記載の方法。
- 刺激が温度変化を含む、請求項1から23のいずれかに記載の方法。
- 刺激が化学的刺激を含む、請求項1から24のいずれかに記載の方法。
- 抗体分泌細胞がBリンパ球を含む、請求項1から25のいずれかに記載の方法。
- 抗体がヒト化抗体である、請求項1から26のいずれかに記載の方法。
- 請求項1から27のいずれかに記載の方法であって、抗体分泌細胞を生殖細胞系遺伝子導入ホモ接合型非ヒト動物から抽出した後、かつ該抗体分泌細胞を刺激に曝す前又は後に、0℃以下の温度で抗体分泌細胞を貯蔵する更なる工程を含む方法。
- モノクローナル抗体を製造する方法であって、請求項3から28のいずれかに記載の方法によって不死化細胞の集団を製造し、かつ該不死化細胞の集団からモノクローナル抗体を製造することを特徴とする方法。
- 請求項3から28のいずれかに記載の方法によって得られる不死化された抗体分泌細胞のクローン集団。
- 生殖細胞系遺伝子導入ホモ接合型非ヒト動物に由来する単離された不死化された抗体分泌細胞であって、該細胞は1以上の導入遺伝子を発現し、刺激の存在下ではその1以上の導入遺伝子により不死化状態を維持することができ、かつ刺激の不存在下では非不死化状態に変化することができる細胞。
- モノクローナル抗体を産生する不死化された抗体分泌細胞の単離されたクローン集団であって、請求項31に記載の不死化された抗体分泌細胞の集団を含む集団。
- 不死化された抗体分泌細胞の製造のための生殖細胞系遺伝子導入ホモ接合型非ヒト動物の使用であって、該生殖細胞系遺伝子導入ホモ接合型非ヒト動物は1以上の導入遺伝子を発現可能な抗体分泌細胞を有し、かつその抗体分泌細胞は刺激の不存在下では非不死化状態にあり、そして該細胞を刺激に曝すとその1以上の導入遺伝子により不死化状態に変化することができる使用。
- 抗体の製造のための生殖細胞系遺伝子導入ホモ接合型非ヒト動物の使用であって、該生殖細胞系遺伝子導入ホモ接合型非ヒト動物は1以上の導入遺伝子を発現可能な抗体分泌細胞を有し、かつその抗体分泌細胞は刺激の不存在下では非不死化状態にあり、そして該細胞を刺激に曝すとその1以上の導入遺伝子により不死化状態に変化することができ、該生殖細胞系遺伝子導入ホモ接合型非ヒト動物を使用して抗体産生可能な不死化された抗体分泌細胞を得るのに使用できる使用。
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