JP4657201B2 - リバースターンミメティックおよびそれに関連した方法 - Google Patents

Description

本発明は、リバースターンミメティック（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｕｒｎ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）構造体およびこれと関連した化学ライブラリに関する。本発明は、また医学的症状、例えば、癌疾患の治療への適用と、該ミメティックを含む医薬組成物に関する。

治療薬としての潜在的な活性について分子をランダムにスクリーニングすることは、長年にわたって行われており、その結果、多数の重要な薬剤が発見されている。分子生物学および計算機化学の進歩により、「合理的薬剤設計(rational drug design)」と称することに関心が高まっているものの、このような技術は、初期に予測された程には、高速ではなく、または信頼できないことが判明している。それゆえ、最近では、ランダム薬剤スクリーニングに関心が戻っている。この目的のために、コンビナトリアル・ケミストリー・ライブラリの発展に基づく新しい技術および生物学的に活性なメンバーの探索においてこのようなライブラリをスクリーニングすることが特に進歩している。

一般に、コンビナトリアル・ケミストリー・ライブラリは、単に、分子の収集物である。このようなライブラリは、そのライブラリ内の化学種ごとに変わるだけでなく、それらのライブラリメンバーを作成し、かつどのメンバーが対象生体標的と相互作用するかを同定するために使用される方法ごとにも、変わる。この分野は、依然として未成熟であるのに対して、ライブラリを作成しスクリーニングする方法は、既に、極めて多様で精巧になっている。例えば、種々のコンビナトリアル・ケミストリー・ライブラリの最近の概説では、多数のこのような技術を記載しており（Ｄｏｌｌｅ，Ｊ．Ｃｏｍ．Ｃｈｅｍ．，２（３）：３８３〜４３３，２０００）、これには、タグ化および未タグ化のライブラリメンバーの使用が挙げられる（Ｊａｎｄａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７７９〜１０７８５，１９９４）。

初期には、コンビナトリアル・ケミストリー・ライブラリは、一般に、ペプチドまたはヌクレオチド起源のメンバーに限られていた。この目的のために、Ｈｏｕｇｈｔｅｎらの技術は、「二重規定反復(dual-defined iterative)」方法と呼ばれるものの一例を説明しており、この方法は、スプリット合成技術によって、可溶性コンビナトリアルペプチドライブラリを編集する（Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３５４：８４〜８６，１９９１；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜４２１，１９９２；Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．３：４０５〜４１２，１９９３）。この技術により、何千万ものメンバーを含む可溶性ペプチドライブラリが得られた。このようなライブラリは、オピオイドペプチド、例えば、メチオニン−およびロイシン−エンケファリン（Ｄｏｏｌｅｙ ａｎｄ Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５２，１５０９〜１５１７，１９９３）の同定で有効であることが明らかとなっており、また、Ｎ−アシル化ペプチドライブラリは、アセタリン（これは、強力なオピオイドアンタゴニストである）を同定するのに使用されている（Ｄｏｏｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０８１１〜１０８１５，１９９３）。さらに最近では、全てのＤ−アミノ酸オピオイドペプチドライブラリが構築されており、ミュー（“μ”）オピオイドレセプタに対する鎮痛活性についてスクリーニングされている（Ｄｏｏｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：２０１９〜２０２２，１９９４）。

ペプチドおよびヌクレオチド起源のメンバーを含むコンビナトリアル・ライブラリは、非常に有益であるのに対して、依然として、当該技術分野において、異なる起源のメンバーを含むライブラリが必要とされている。例えば、伝統的なペプチドライブラリは、大体において、ライブラリメンバーを作成するために、単に、そのアミノ酸配列を変える。ペプチドの二次構造が生物学的活性に重要であることがよく知られているのに対して、このようなペプチドライブラリは、そのライブラリメンバーに対して、束縛二次構造を与えない。

この目的のために、一部の研究者は、さらに束縛された二次構造を提供しようとして、ジスルフィド架橋でペプチドを環化した（Ｔｕｍｅｌｔｙら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６７−６８，１９９４；Ｅｉｃｈｌｅｒら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．７：３００〜３０６，１９９４）。しかしながら、このような環化ペプチドは、一般に、依然として、極めて可撓性であり、生体利用能に乏しく、それゆえ、成功が限られている。

さらに最近では、生物学的に活性なタンパク質またはペプチドで見られるリバースターンの二次構造を非常によく模倣した非ペプチド化合物が開発されている。例えば、Ｋａｈｎの米国特許第５，４４０，０１３号およびＫａｈｎの公開ＰＣＴ ＷＯ９４／０３４９４、ＰＣＴ ＷＯ０１／００２１０Ａ１およびＰＣＴ ＷＯ０１／１６１３５Ａ２は、リバースターンの三次元構造を模倣する立体配置的に束縛された非ペプチド化合物を開示している。その他、 Ｋａｈｎの米国特許第５，９２９，２３７号およびその部分継続出願である米国特許第６，０１３，４５８号はまた、生物学的に活性なペプチドおよびタンパク質のリバースターン領域の二次構造を模倣する立体配置的に束縛された化合物を開示している。立体配置的に束縛されたリバースターンミメティックの合成および同定ならびにそれらを疾患に適用することは、Ｏｂｒｅｃｈｔにより、十分に検討されている（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４，１〜６８，１９９９）。

立体配置的に束縛されたリバースターンミメティックの合成および同定は、著しく進歩しているものの、当該技術分野において、ペプチドの二次構造を模倣する小分子が依然として必要とされている。また、当該技術分野において、このようなメンバーを含むライブラリだけでなく、生物学的に活性なライブラリメンバーを同定するために、これらのライブラリメンバーを合成し、対象標的、特に、生物標的に対してスクリーニングする技術が必要とされている。

本発明は、また、これらの要求を満たし、さらに、生物学的に活性なペプチドおよびタンパク質のリバースターン領域の二次構造を模倣する立体配置的に束縛された化合物を提供することにより、関連した利点を与える。

Ｗｎｔシグナル伝達経路は、細胞増殖、発癌および発達を含めた種々のプロセスを調節する（Ｍｏｏｎら、１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１３，１５７〜１６２：Ｍｉｌｌｅｒら、１９９９，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８，７８６０〜７８７２：Ｎｕｓｓｅ ａｎｄ Ｖａｒｍｕｓ，１９９２，Ｃｅｌｌ ６９，１０７３〜１０８７：Ｃａｄｉｇａｎ ａｎｄ Ｎｕｓｓｅ，１９９７，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１１，３２８６〜３３０５：Ｐｅｉｆｅｒ ａｎｄ Ｐｏｌａｋｉｓ，２０００ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７，１６０６〜１６０９：Ｐｏｌａｋｉｓ ２０００，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４，１８３７〜１８５１）。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、種々の生物体において、極めてよく研究されている。Ｗｎｔシグナル変換によるＴＣＦ４／β−カテニン媒介転写の活性化は、その生物学的機能において、重要な役割を果たすことが見出されている（Ｍｏｌｅｎａａｒら、１９９６，Ｃｅｌｌ ８６，３９１〜３９９：Ｇａｔら、１９９８ Ｃｅｌｌ ９５，６０５〜６１４：Ｏｒｆｏｒｄら、１９９９ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４６，８５５〜８６８：Ｂｉｅｎｚ ａｎｄ Ｃｌｅｖｅｒｓ，２０００，Ｃｅｌｌ １０３：３１１〜２０）。

Ｗｎｔシグナルなしでは、癌抑制遺伝子である腺腫様結腸ポリポシス（ＡＰＣ）は、セリンキナーゼグリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ）−３βおよびβ−カテニンと同時に相互作用する（Ｓｕら、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２，１７３４〜１７３７：Ｙｏｓｔら、１９９６ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１０，１４４３〜１４５４：Ｈａｙａｓｈｉら、１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，２４２〜２４７：Ｓａｋａｎａｋａら、１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，３０２０〜３０２３：Ｓａｋａｎａｋａ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍ，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４，１４０９０〜１４０９３）。ＧＳＫ−３βによるＡＰＣのホスホリル化は、ＡＰＣとβ−カテニンとの相互作用を調節し、これは、順に、β−カテニンのシグナル伝達機能を調節し得る（Ｂ．Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２，１０２３，１９９６）。Ｗｎｔシグナル伝達は、β−カテニンを安定化し、これにより、核に転位でき、この場所で、リンパ増大因子（ＬＥＦ１）／Ｔ細胞因子（ＴＣＦ４）ファミリーの転写因子のメンバーと相互作用する（Ｂｅｈｒｅｎｓら、１９９６ Ｎａｔｕｒｅ ３８２，６３８〜６４２：Ｈｓｕら、１９９８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８，４８０７〜４８１８：Ｒｏｏｓｅら、１９９９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５，１９２３〜１９２６）。

最近では、ｃ−ｍｙｃ（公知の発癌遺伝子）は、β−カテニン／ＴＣＦ４−媒介転写の標的遺伝子であることが明らかとなっている（Ｈｅら、１９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１ １５０９〜１５１２：Ｋｏｌｌｉｇｓら、１９９９ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９，５６９６〜５７０６）。多くの他の重要な遺伝子は、サイクリンＤ１およびメタロプロテイナーゼ（これらもまた、発癌に関与している）を含めて、ＴＣＦ４／β−カテニン転写経路により調節されることが確認されている（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、１９９９，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８，２８８３〜２８９１：Ｓｈｔｕｔｍａｎら、１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１１，５５２２〜５５２７：Ｔｅｔｓｕ ａｎｄ ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，１９９９ Ｎａｔｕｒｅ，３９８，４２２〜４２６）。

さらに、Ｗｎｔシグナル伝達のいくつかの下流メディエータの過剰発現は、アポトーシスを調節することが発見されている（Ｍｏｒｉｓら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，７９５０〜７９５４：Ｈｅら、１９９９，Ｃｅｌｌ ９９，３３５〜３４５：Ｏｒｆｏｒｄら、１９９９ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４６，８５５〜８６８：Ｓｔｒｏｖｅｌ ａｎｄ Ｓｕｓｓｍａｎ，１９９９，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，２５３，６３７〜６４８）。ヒトの直腸結腸癌細胞におけるＡＰＣの過剰発現は、アポトーシスを誘発し（Ｍｏｒｉｓら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３，７９５０〜７９５４）、β−カテニンの異所発現は、細胞外マトリックスへの付着の損失に関連したアポトーシスを阻害した（Ｏｒｆｏｒｄら、１９９９，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４６，８５５〜８６８）。ＴＣＦ４の優性ネガティブ変異体の発現によるＴＣＦ４／β−カテニン転写の阻害は、Ｗｎｔ−１媒介の細胞生存を阻止し、細胞をアポトーシス刺激（例えば、抗癌剤）に感受性にした（Ｓｈａｏｑｉｏｎｇ Ｃｈｅｎら、２００１，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５２，１，８７〜９６）、また、ＡＰＣ変異は、構成的なスルビビンの発現（周知の抗アポトーシスタンパク質）を可能にすることにより、アポトーシスを阻害する（Ｔａｏ Ｚｈａｎｇら、２００１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６２，８６６４〜８６６７）
Ｗｎｔ遺伝子の変異は、ヒトの癌では発見されていないものの、ＡＰＣまたはβ−カテニンの変異は、大部分の直腸結腸癌の場合と同様に、ＴＣＦ４の不適当な活性化、ｃ−ｍｙｃの過剰発現および新生物成長の発生を引き起こす（Ｂｕｂｉｎｆｅｌｄら、１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５，１７９０〜１７９２：Ｍｏｒｉｎら、１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５，１７８７−１７９０：Ｃａｓａら、１９９９，Ｃｅｌｌ．Ｇｒｏｗｔｈ．Ｄｉｆｆｅｒ．１０，３６９−３７６）。直腸結腸癌の８５％では、癌抑制遺伝子（ＡＰＣ）は、失われるか不活性化され、種々の他の癌でも、同様である（Ｋｉｎｚｌｅｒ ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，１９９６，Ｃｅｌｌ ８７，１５９〜１７０）。ＡＰＣの主要な役割は、Ｗｎｔシグナル変換カスケードの負の調節因子という役割である。この経路の中心的な特徴は、大きいＡｘｉｎベースの複合体（これは、ＡＰＣを含む）との相互作用によるβ−カテニンの細胞質ゾルプールの安定性および局在性の変調を含む。この相互作用により、β−カテニンのホスホリル化が起こり、それにより、それを分解について標的化する。

ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）／ｐ３００は、初期には、まず、転写因子ＣＲＥＢとの関連によって（Ｃｈｒｉｖｉａら、１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６５，８５５〜８５９）、後に、アデノウイルス形質転換タンパク質Ｅ１Ａとの相互作用によって（Ｓｔｅｉｎら、１９９０，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６４，４４２１〜４４２７：Ｅｃｋｎｅｒら、１９９４，Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．，８，８６９〜８８４）、タンパク質相互作用アッセイで同定された。ＣＢＰは、転写活性化補助因子機能を含めた種々の細胞機能に関与している可能性があった（Ｓｈｉｋａｍａら、１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７，２３０〜２３６：Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ，３８３，２２〜２３）。ＣＢＰ／ｐ３００は、ｓｉａｍｏｉｓプロモーター（公知のＷｎｔ標的）のβ−カテニン媒介活性化を増強する（Ｈｅｃｈｔら、２０００，ＥＭＢＯ Ｊ．１９，８，１８３９〜１８５０）。

β−カテニンは、ＣＢＰのＣＲＥＢ結合ドメインと直接相互作用し、そしてβ−カテニンは、ＣＢＰと相乗作用して、ＴＣＦ４／β−カテニンの転写活性化を刺激する（Ｋｅｎ−Ｉｃｈｉ Ｔａｋｅｍａｒｕ ａｎｄ Ｒａｎｄａｌｌ Ｔ．Ｍｏｏｎ，２０００，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４９，２，２４９〜２５４）。

この背景から、Ｗｎｔ経路のＴＣＦ４／β−カテニンおよびＣＢＰ複合体は、細胞増殖、発癌および細胞アポトーシスなどを調節する標的分子として、取り出すことができる。すなわち、ＣＢＰを阻害することにより、ＴＣＦ４／β−カテニン転写経路を阻止する化合物が必要とされている。従って、これは、癌（特に、直腸結腸癌）の治療に使用できる。本発明は、この必要に対処している。

本発明は、生物学的に活性なペプチドおよびタンパク質のリバースターン領域の二次構造を模倣する新しいタイプの立体配置的に束縛された化合物に関する。本発明はまた、このような化合物を含有するライブラリだけでなく、その合成およびスクリーニングを開示している。

本発明の化合物は、以下の一般式（Ｉ）およびそれの立体異性体を有する：

ここで、Ａは、−（ＣＨＲ₃）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは、−（ＣＨＲ₄）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは、−（ＣＨＲ₅）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは、−（ＺＲ₆）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは、−（ＸＲ₇）ｎ−、−（ＣＨＲ₇）−（ＮＲ₈）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ₉）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは、−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ２）−または存在せず、Ｙは、酸素、イオウまたは−ＮＨ−であり、ＸおよびＺは、独立して、窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１である；そしてＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₈およびＲ₉は、同一または異なり、アミノ酸側鎖部分またはその誘導体、該分子の残部、リンカーおよび固体支持体から独立して選択される。

ある実施形態では、Ａが、−（ＣＨＲ₃）−であり、Ｂが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄが、−（ＣＨＲ₅）−であり、Ｅが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇが、−（ＸＲ₇）ｎ−であり、そして本発明の化合物は、以下の一般式（ＩＩ）を有する。

ここで、Ｗ、Ｘ, Ｙおよびｎは、上で定義したとおりであり、そしてＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₅およびＲ₇は、以下の詳細な説明で定義したとおりである。

Ａが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂが、−（ＣＨＲ₄）−であり、Ｄが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅが、−（ＺＲ₆）−であり、Ｇが、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ₉）−である実施形態において、本発明の化合物は、以下の一般式（ＩＩＩ）を有する。

ここで、Ｗ、ＸおよびＹは、上で定義したとおりであり、そしてＺは、窒素またはＣＨであり（ＺがＣＨであるとき、Ｘは、窒素である）、そしてＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₆およびＲ₉は、以下の詳細な説明で定義したとおりである。

Ａが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂが、−（ＣＨＲ₄）−であり、Ｄが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅが、−（ＺＲ₆）−であり、Ｇが、（ＸＲ₇）ｎ−である実施形態において、本発明の化合物は、以下の一般式（ＩＶ）を有する。

ここで、Ｗ、Ｘ, Ｙ およびｎは、上で定義したとおりであり、Ｚは、窒素またはＣＨであり（Ｚが窒素であるとき、ｎは、０であり、そしてＺがＣＨであるとき、Ｘは、窒素であり、そしてｎは、０ではない）、そしてＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₆およびＲ₇は、以下の詳細な説明で定義したとおりである。

本発明はまた、上記式（Ｉ）の化合物を含むライブラリだけでなく、このようなライブラリを合成する方法およびそれをスクリーニングして生体活性化合物を同定する方法に関する。本発明の化合物を含有する組成物もまた、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と組み合わせて、開示されている。

本発明はまた、少なくとも一つの一般式（Ｉ）化合物を含有するライブラ
リを用いて、生物学的に活性な化合物を同定する方法に関する。関連態様において、本発明は、（ａ）第一活性化補助因子および相互作用蛋白質を含有し、この際、前記第一活性化補助因子がＬＸＸＬＬ、ＬＸＸＬＩ、またはＦＸＸＦＦ（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）の結合モチーフを含有する組成物を準備し、（ｂ）前記第一活性化補助因子および前記相互作用蛋白質を試験化合物と結合させ、（ｃ）前記一般式（Ｉ）
を有する化合物の存在下で、前記第一活性化補助因子と前記相互作用蛋白質との間の結合の変性を検出することを含む、結合分析を行う方法を提供する。

本発明はまた、Ｗｎｔシグナル伝達経路と関連した疾患を予防または治療する方法を提供する。本発明の化合物または組成物を用いて治療または予防可能な疾患としては、腫瘍または癌（例えば、ＫＳＨＶ−関連腫瘍）、血管形成術に伴う再狭窄、多嚢胞性腎病、異常血管形成疾患、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、結節硬化症、脱毛、およびアルツハイマー病が挙げられる。該方法は、目的とする結果が得られる有効量で、本発明の化合物または組成物を被験体に投与することを含む。

関連した局面において、本発明は、さらに、神経突起伸長、神経幹細胞の分化、および癌細胞のアポトーシスを促進する方法を提供する。該方法は、本発明の化合物または組成物を所望の結果が得られる有効量で、適切な細胞に投与することを含む。

本発明のこれらの局面および他の局面は、添付の図面および以下の詳細な説明を参照すると、明らかとなる。この目的のために、本明細書中では、種々の参考文献が述べられており、これらは、特定の手順、化合物および／または組成物をさらに詳細に記述しており、その内容は、本明細書中で参考として援用されている。

図１は、本発明のリバースターンミメティックを調製する一般合成概略図である。

図２は、本発明のリバースターンミメティックを調製する一般合成概略図である。

図３は、ＳＷ４８０細胞について本発明の化合物ＡのＩＣ₅₀を測定したグラフであり、ここで、ＳＷ４８０細胞に対する細胞増殖阻害は、そのＩＣ₅₀値を得るために、実施例４で調製された化合物の種々の濃度で、測定された。具体的には、該試験化合物Ａによるホタルおよびレニラルシフェラーゼ活性の阻害の程度を決定した。結果として、ＳＷ４８０細胞増殖に対する該試験化合物ＡのＩＣ₅₀は、表４で開示されているように、見出された。詳細な手順は、実施例６で開示されたものと同じである。

図４．ＰＣ−１２細胞は、コートされた皿で培養し、５０ｎｇ／ｍｌ神経成長因子（ＮＧＦ）中で１０日間分化した（実施例７で開示されたものと同じである）。（Ａ、Ｂ）ベクターが形質転換されたＰＣ−１２細胞（Ａ）およびｗｔＰＳ−１を過剰発現するＰＣ−１２細胞（Ｂ）は、ＮＧＦで１０日後、広範囲な神経突起伸長を示す。（Ｃ）変異ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖを発現するＰＣ−１２細胞は、同一の培養条件下で、有意な神経突起を示さない。（Ｄ、Ｅ）（実施例７で開示されたものと同じである）ＧＡＰ−４３の免疫蛍光分析、神経突起伸長の分子マーカーは、ＰＣ−１２細胞においてベクターが形質転換されたものおよびＰＳ−１／ＷＴの過剰発現（Ｅ）、神経突起においてＧＡＰ−４３に対する強い染色（Ｄ）を示す。（Ｆ）神経突起伸長の欠乏は、変異細胞において弱いＧＡＰ−４３免疫染色に対応している。データは少なくとも２つの独立した実験を示す。（Ｇ）分化した細胞は、Ｔｏｐｆｌａｓｈ、ＴＣＦ／β−カテニンレポーター構築で形質変換された。細胞は、溶解され、ルシフェラーゼ活性は、（実施例７で開示されたものと同様に）、形質転換の６時間後に測定した。データは、３つの独立した実験の平均値（±ＳＤ）を表す。星印は、Ｐ＜０．０５を示す。

図５．化合物Ｄは、ＰＣ−１２過剰発現変異ＰＳ−１／２８６Ｖ細胞において、不足した神経分化を表現型の発現上で訂正する。変異細胞を、分化期間途中に、ＮＧＦ以外に１０μＭの化合物Ｄに暴露した（Ｍｉｎｓｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８，１１７１４（２００１））。（Ａ）神経突起伸長および延長は、化合物Ｄで処理時、ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖを過剰発現するＰＣ−１２細胞で観察された。（Ｂ）ＧＡＰ−４３（グリーン）は、変異細胞において顕著に上昇し、また神経突起で見られる。（Ｃ）ＰＣ−１２細胞における神経突起伸長の定量。二つの細胞径よりもさらに大きい神経突起の長さを有する変異細胞数は、ＰＣ−１２細胞におけるベクターで形質転換されたものおよび過剰発現するＰＳ−１／ＷＴの数よりも１０％未満であった。決められた神経突起の長さを有する変異体ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ細胞の数は、１０μＭの化合物Ｄで処理した後、著しく増加した。結果としては、３つの独立した実験の平均値（±ＳＤ）を表す。星印は、Ｐ＜０．０５を示す。

図６．Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２（ＥｐｈＢ２）受容体発現。免疫蛍光分析およびＲＴ−ＰＣＲを行って、（実施例７で開示されたものと同じである）ＥｐｈＢ２受容体発現を見つけた。（Ａ、Ｂ）ＥｐｈＢ２受容体は、ベクターで形質転換されたものおよび過剰発現のＰＳ−１／ＷＴ細胞の神経突起で明確に見られる。染色の強度は、高発現量と相互に関連づける。（Ｃ）これに対して、ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ ＰＣ−１２細胞は、ＥｐｈＢ２受容体発現が著しく減少した。（Ｄ）化合物Ｄで変異細胞を処理すると、ＥｐｈＢ２受容体発現が増加するが、これは、神経突起伸長の点に集中される。（Ｅ）ＥｐｈＢ２受容体発現は、以前に転写段階で制御されることが明らかとなっている（Ｇｕｏら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７，４２１２（１９９７））。レーン１、ベクターで形質転換されたＰＣ−１２細胞、レーン２、過剰発現ＰＳ−１／ＷＴ細胞、レーン３、 過剰発現変異ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ細胞 、レーン４、化合物Ｄで処理された変異細胞。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、過剰発現変異ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ細胞におけるＥｐｈＢ２受容体に対するメッセージが、ベクターで形質転換され、かつ過剰発現のｗｔＰＳ−１ ＰＣ−１２細胞の両方におけるものよりも減少することを示している。１０μＭの化合物Ｄによる処理は、ＥｐｈＢ２メッセージを上方制御する。ＧＡＰＤＨは、内部統制を用いる。

図７．化合物Ｄは、Ｇ₁の細胞を停止させる。ＦＡＣＳ分析は、化合物Ｄ（２５μＭ）（右）またはコントロール０．５％ＤＭＳＯ（左）で、２４時間の間処理されたＳＷ４８０（下パネル）およびＨＣＴ１１６（上パネル）細胞に対して行った。５．５×１０⁶細胞は、プロピジウムヨウ化物（ＰＩ）で固定および着色させた。Ｂ。化合物Ｄは、結腸癌細胞株におけるカスパーゼを選択的に活性化した。正常結腸細胞ＣＣＤ１８Ｃｏ（右グラフ）とともに、ＳＷ４８０およびＨＣＴ１１６（左グラフ）細胞（１０⁵）は、コントロール（０．５％ＤＭＳＯ）または化合物Ｄ（２５μＭ）で処理した。処理２４時間後、細胞を溶解し、カスパーゼ−３／７酵素活性を測定した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）は、処理されたサンプル（化合物Ｄまたはコントロール）からブランク（コントロール、細胞なし）の単位価を引いた後、プロットした。

図８．化合物Ｄは、容量依存的な方法で軟寒天中のコロニー増殖を減少させる。増加する濃度の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（０．５−３２μＭ）および化合物Ｄ（０．２５−５μＭ）は、３重ウエルのＳＷ４８０に添加した（５０００細胞／ウエル）。細胞を洗浄し、軟寒天成長培地に懸濁させた。８日後、コロニーの数（６０μＭ径以上のコロニー）を数え、化合物濃度に対してプロットした。３つの決定の平均値±ＳＥが示された。化合物の不在下でコントロールのコロニー数は、１，６３７±７１であった。

図９．Ａ．化合物Ｃは、ヌードマウスモデルの腫瘍成長を減少させる。Ｂ．化合物Ｃは、ヌードマウスモデルの体重を少し減少させる。

図１０．スルビビン転写活性は、Ｗｎｔ１で上昇調節したものの、化合物Ｄでノウトダウン（ｋｎｏｕｔ−ｄｏｗｎ）した。ルシフェラーゼ活性化の百分率は、Ｗｎｔ１および化合物Ｄの不在下で、あるいは、Ｗｎｔ１、化合物Ｄまたは両方の存在下で、野生型、ＣＢＰ＋／−、およびｐ３００＋／−３Ｔ３細胞で測定された。

図１１．化合物Ａ（右グラフ）および化合物Ｄ（左グラフ）は、ＳＷ４８０細胞のスルビビンルシフェラーゼレポーターの活性を阻害する。スルビビンプロモータの制御下にあるルシフェラーゼ活性を、様々な濃度において化合物Ａまたは化合物Ｄで処理されたＳＷ４８０細胞で測定した。

図１２．ＲＴ−ＰＣＲ分析は、化合物Ｄの処理がスルビビン遺伝子の発現程度を減少させることを示す。

図１３．化合物Ｄは、スルビビンプロモータと様々な蛋白質との結合を減少させる。化合物Ｄ（２５μＭ）またはコントロール（０．５％ＤＭＳＯ）で１８日間処理されたＳＷ４８０細胞に対するＣｈＩＰアッセイを行った。

図１４．化合物Ｄは、翻訳レベルでスルビビン発現を減少させる。ビヒクル（０．５％ＤＭＳＯ）単独、１０μＭもしくは２５μＭ化合物Ｄ、または５μＭ ５−Ｆｕで処理された細胞抽出物のウエスタンブロット分析は、スルビビン６Ｅ４モノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて行った。Ｂ。スルビビン免疫蛍光顕微鏡検査法。培養された化合物を固定し、抗スルビビングリーンで着色した。Ｃ。スルビビン免疫蛍光顕微鏡検査法。化合物Ｄで処理されたＳＷ４８０細胞を固定し、抗スルビビングリーンで着色した。

図１５．化合物Ｄは、スルビビン発現の阻害を通じて、カスパーゼ３活性（但し、カスパーゼ２活性ではない）を活性化する。スルビビン遺伝子を含有する構造物の形質転換の存在下または不在下で培養された細胞は、スタウスポリン（stausporine）（０．５μＭ）、化合物Ｄ（２．５μＭまたは５．０μＭ）、またはこれらの両方で処理した。これらの細胞の中、カスパーゼ２およびカスパーゼ３活性を測定した。

図１６．化合物Ｄは、スルビビン発現の阻害を通じて、細胞死を促進する。スルビビン遺伝子を含有する構造物の形質転換体の存在下または不在下で培養された癌細胞は、スタウスポリン（０．５μＭ）、化合物Ｄ（５．０μＭ）、またはこれらの両方で処理した。これらの細胞の細胞死を測定した。

図１７．化合物Ｄは、Ｇ₀段階の細胞数を増加させる。スルビビン遺伝子を含有する構造物の形質転換体の存在下または不在下で培養された癌細胞は、スタウスポリン（０．５μＭ）、化合物Ｄ（５．０μＭ）、またはこれらの両方で処理した。ＦＣＡＳ分析は、これらの細胞に対して行い、Ｇ₀段階の細胞の百分率を示した。

本発明は、生物学的ペプチドおよびタンパク質のリバースターン領域の二次構造を模倣する立体配置的に束縛された化合物（これはまた、本明細書中にて、「リバースターンミメティック」とも呼ばれている）およびそれに関連した化学ライブラリに関する。

本発明のリバースターンミメティック構造体は、生物学的に活性な薬剤として有用であり、これには、診断薬、予防薬および／または治療薬としての使用が挙げられる（が、これらに限定されない）。本発明のリバースターンミメティック構造体ライブラリは、このような用途の生物学的に活性な薬剤の同定に有用である。本発明を実施する際に、これらのライブラリは、数十から数百、数千（またはそれ以上）の個々のリバースターン構造体（これはまた、本明細書中にて、「メンバー」とも呼ぶ）を含有し得る。

本発明の１つの観点では、以下の式（Ｉ）を有するリバースターンミメティック構造体およびそれの立体異性体が開示されている：

ここで、Ａは、−（ＣＨＲ₃）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは、−（ＣＨＲ₄）−、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄは、−（ＣＨＲ₅）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは、−（ＺＲ₆）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇは、−（ＸＲ₇）ｎ−、−（ＣＨＲ₇）−（ＮＲ₈）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ₉）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｗは、−Ｙ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＳＯ_２）−または存在せず、Ｙは、酸素、イオウまたは−ＮＨ−であり、ＸおよびＺは、独立して、窒素またはＣＨであり、ｎ＝０または１である；そしてＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₈およびＲ₉は、同一または異なり、アミノ酸側鎖部分またはその誘導体、該分子の残部、リンカーおよび固体支持体から独立して選択される。

ある実施形態では、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₈およびＲ₉は、独立して、アミノＣ₂〜₅アルキル、グアニジノＣ₂〜₅アルキル、Ｃ₁〜₄アルキルグアニジノＣ₂〜₅アルキル、ジＣ₁〜₄アルキルグアニジノＣ₂〜₅アルキル、アミジノＣ₂〜₅アルキル、Ｃ₁〜₄アルキルアミジノＣ₂〜₅アルキル、ジＣ₁〜₄アルキルアミジノＣ₂〜₅アルキル、Ｃ₁〜₃アルコキシ、フェニル、置換フェニル（ここで、該置換基は、独立して、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ₁〜₄アルキルアミノ、Ｃ₁〜₄ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ₁〜₄アルキル、Ｃ₁〜₄アルキル、Ｃ₁〜₃アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上から選択される）、ベンジル、置換ベンジル（ここで、該ベンジル上の置換基は、独立して、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ₁〜₄アルキルアミノ、Ｃ₁〜₄ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ₁〜₄アルキル、Ｃ₁〜₃アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上から選択される）、ナフチル、置換ナフチル（ここで、該置換基は、独立して、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ₁〜₄アルキルアミノ、Ｃ₁〜₄ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ₁〜₄アルキル、Ｃ₁〜₄アルキル、Ｃ₁〜₃アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上から選択される）、ビス−フェニルメチル、置換ビス−フェニルメチル（ここで、該置換基は、独立して、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ₁〜₄アルキルアミノ、Ｃ₁〜₄ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ₁〜₄アルキル、Ｃ₁〜₄アルキル、Ｃ₁〜₃アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上から選択される）、ピリジル、置換ピリジル（ここで、該置換基は、独立して、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ₁〜₄アルキルアミノ、Ｃ₁〜₄ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ₁〜₄アルキル、Ｃ₁〜₄アルキル、Ｃ₁〜₃アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上から選択される）、ピリジルＣ₁〜₄アルキル、置換ピリジルＣ₁〜₄アルキル（ここで、該ピリジン置換基は、独立して、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ₁〜₄アルキルアミノ、Ｃ₁〜₄ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ₁〜₄アルキル、Ｃ₁〜₄アルキル、Ｃ₁〜₃アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上から選択される）、ピリミジルＣ₁〜₄アルキル、置換ピリミジルＣ₁〜₄アルキル（ここで、該ピリミジン置換基は、独立して、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ₁〜₄アルキルアミノ、Ｃ₁〜₄ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ₁〜₄アルキル、Ｃ₁〜₄アルキル、Ｃ₁〜₃アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上から選択される）、トリアジン−２−イル−Ｃ₁〜₄アルキル、置換トリアジン−２−イル−Ｃ₁〜₄アルキル（ここで、該トリアジン置換基は、独立して、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ₁〜₄アルキルアミノ、Ｃ₁〜₄ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ₁〜₄アルキル、Ｃ₁〜₄アルキル、Ｃ₁〜₃アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上から選択される）、イミダゾールＣ₁〜₄アルキル、置換イミダゾールＣ₁〜₄アルキル（ここで、該イミダゾール置換基は、独立して、アミノ、アミジノ、グアニジノ、ヒドラジノ、アミダゾニル、Ｃ₁〜₄アルキルアミノ、Ｃ₁〜₄ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ₁〜₄アルキル、Ｃ₁〜₄アルキル、Ｃ₁〜₃アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルフリルまたはヒドロキシルの１個またはそれ以上から選択される）、イミダゾリニルＣ₁〜₄アルキル、Ｎ−アミジノピペラジニル−Ｎ−Ｃ₀〜₄アルキル、ヒドロキシＣ₂〜₅アルキル、Ｃ₁〜₅アルキルアミノＣ₂〜₅アルキル、ヒドロキシＣ₂〜₅アルキル、Ｃ₁〜₅アルキルアミノＣ₂〜₅アルキル、Ｃ₁〜₅ジアルキルアミノＣ₂〜₅アルキル、Ｎ−アミジノピペリジニルＣ₁〜₄アルキルおよび４−アミノシクロヘキシルＣ₀〜₂アルキルからなる群から選択される。

ある実施形態では、ＥのＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₆、およびＧのＲ₇、Ｒ₈およびＲ₉は、同一または異なり、前記化合物の残部を示し、そしてＡのＲ₃、ＢのＲ₄またはＤのＲ₅は、アミノ酸側鎖部分またはその誘導体から選択される。本明細書中で使用する「前記化合物の残部」との用語は、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₈および／またはＲ₉位置でリバースターンミメティック構造体に共有結合した任意の部分、試薬、化合物、支持体、分子、リンカー、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質を意味する。この用語はまた、アミノ酸側鎖部分およびそれらの誘導体を含む。

他の実施形態では、ＡのＲ₃、ＤのＲ₅、ＥのＲ₆、およびＧのＲ₇、Ｒ₈およびＲ₉は、同一または異なり、前記化合物の残部を示し、ＢのＲ₁、Ｒ₂およびＲ₄の１以上もまた、ある観点において、これらの全部は、アミノ酸側鎖を表す。この場合、「前記化合物の残基」との用語は、Ｒ₃、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₈および／またはＲ₉位置でリバースターンミメティック構造体に共有結合した任意の残基、試薬、化合物、支持体、分子、リンカー、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質を意味する。この用語はまた、アミノ酸側鎖部分およびそれらの誘導体を含む。

本明細書中で使用する「前記化合物の残部」との用語は、リバースターンミメティック構造体に共有結合した任意の残基、試薬、化合物、支持体、分子、リンカー、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質を意味する。この用語はまた、アミノ酸側鎖部分およびそれらの誘導体を含む。本発明のある観点において、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₈および／またはＲ₉の少なくとも一つは、化合物の残部を示すことができる。本発明のある観点において、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₄の１以上は、アミノ酸残基またはそれらの誘導体を示す。

本明細書中で使用する「アミノ酸側鎖部分」との用語は、天然に生じるタンパク質中で存在しているアミノ酸側鎖部分を示し、これには、表１で確認した天然に存在するアミノ酸側鎖部分が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の他の天然に存在するアミノ酸側鎖部分には、３，５−ジブロモチロシン、３，５−ジヨードチロシン、ヒドロキシリジン、γ−カルボキシグルタメート、ホスホチロシンおよびホスホセリンが挙げられるが、これらに限定されない。それに加えて、本発明を実施する際には、グリコシル化アミノ酸側鎖もまた使用され得、これには、グリコシル化トレオニン、セリンおよびアスパラギンが挙げられるが、これらに限定されない。

天然に存在するアミノ酸側鎖部分に加えて、本発明のアミノ酸側鎖部分には、また、それらの種々の誘導体を含む。本明細書中で使用するアミノ酸側鎖部分の「誘導体」には、天然に存在するアミノ酸側鎖部分の改変体および／または変形体を含む。例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンのアミノ酸側鎖部分は、一般に、低級アルキル、アリールまたはアリールアルキル部分として、分類され得る。アミノ酸側鎖部分の誘導体には、他の直鎖または分枝、環式または非環式の置換または非置換で飽和または不飽和の低級アルキル、アリールまたはアリールアルキル部分を含む。

本明細書中で使用する「低級アルキル部分」は、１〜１２個の炭素原子を含有し、「低級アリール部分」は、６〜１２個の炭素原子を含有し、そして「低級アラルキル部分」は、７〜１２個の炭素原子を含有する。それゆえ、１実施形態では、このアミノ酸側鎖誘導体は、Ｃ₁〜₁₂アルキル、Ｃ₆〜₁₂アリールおよびＣ₇〜₁₂アリールアルキルから選択され、好ましい１実施形態では、Ｃ₁〜₇アルキル、Ｃ₆〜₁₀アリールおよびＣ₇〜₁₁アリールアルキルから選択される。

本発明のアミノ酸側鎖誘導体は、さらに、低級アルキル、アリールおよびアリールアルキル部分の置換誘導体を含有し、ここで、この置換基は、以下の化学部分の１個またはそれ以上から選択されるが、これらに限定されない：−ＯＨ、−ＯＲ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨ₂、−ＮＨ₂、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−ＳＨ、−ＳＲ、−ＳＯ₂Ｒ、−ＳＯ₂Ｈ、−ＳＯＲおよびハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩを含めて）であって、ここで、Ｒの各存在は、独立して、直鎖または分枝、環式または非環式の置換または非置換で飽和または不飽和の低級アルキル、低級アリールおよび低級アラルキル部分から選択される。さらに、本発明の環式の低級アルキル、アリールおよびアリールアルキル部分には、ナフタレンだけでなく、複素環化合物（例えば、チオフェン、ピロール、フラン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、３−ピロリン、ピロリジン、ピリジン、ピリミジン、プリン、キノリン、イソキノリンおよびカルバゾール）が挙げられる。アミノ酸側鎖部分誘導体には、さらに、低級アルキルおよびアラルキル部分のアルキル部分のヘテロアルキル誘導体が含まれ、これには、アルキルホスホネートおよびアラルキルホスホネートならびにアルキルシランおよびアラルキルシランが含まれるが、これらに限定されない。

代表的なＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₈およびＲ₉部分には、具体的には、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＣＯＲ、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨ₂、−ＣＯＮＲ、−ＣＯＮＲＲ、−ＮＨ₂、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−ＳＯ₂Ｒおよび−ＣＯＳＲを含むが、これらに限定されず、ここで、Ｒの各存在は、上で定義したとおりである。

さらに他の実施形態では、アミノ酸側鎖部分またはその誘導体（またはＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₈およびＲ₉の場合、その化合物の残部）に加えて、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₈またはＲ₉は、この化合物と他の部分または化合物との連結を促進するリンカーであってもよい。例えば、本発明の化合物は、診断アッセイまたはスクリーニングアッセイで使用するために、１種またはそれ以上の公知化合物（例えば、ビオチン）と結合されてもよい。さらに、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₈またはＲ₉は、その化合物を固体支持体（例えば、固相ペプチド合成で使用される支持体）と接合するリンカーであってもよく、あるいは、その支持体それ自体であってもよい。この実施形態では、他の部分または化合物との連結または固体支持体との連結は、好ましくは、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₇、Ｒ₈またはＲ₉位置であり、さらに好ましくは、Ｒ₁またはＲ₂位置である。

Ａが、−（ＣＨＲ₃）−であり、Ｂが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｄが、−（ＣＨＲ₅）−であり、Ｅが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｇが、−（ＸＲ₇）ｎ−である実施形態において、本発明のリバースターンミメティック化合物は、以下の一般式（ＩＩ）を有する：

ここで、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₅、Ｒ₇、Ｗ、Ｘおよびｎは、上で定義したとおりである。好ましい実施形態では、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₇は、化合物の残部であり、そしてＲ₃またはＲ₅は、アミノ酸側鎖部分から選択される。

Ａが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂが、−（ＣＨＲ₄）−であり、Ｄが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅが、−（ＺＲ₆）−であり、Ｇが、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＸＲ₉）−である実施形態において、本発明のリバースターンミメティック化合物は、以下の一般式（ＩＩＩ）を有する。

ここで、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₆、Ｒ₉、ＷおよびＸは、上で定義したとおりであり、そしてＺは、窒素またはＣＨである（ＺがＣＨであるとき、Ｘは、窒素である）。好ましい実施形態では、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₆およびＲ₉は、化合物の残部であり、そしてＲ₄は、アミノ酸側鎖部分から選択される。

さらに特定の実施形態では、Ａが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂが、−（ＣＨＲ₄）−であり、Ｄが、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅが、−（ＺＲ₆）−であり、Ｇが、（ＸＲ₇）ｎ−であり、そして本発明のリバースターンミメティック化合物は、以下の一般式（ＩＶ）を有する。

ここで、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｗ、Ｘおよびｎは、上で定義したとおりであり、そしてＺは、窒素またはＣＨである（Ｚが窒素であるとき、ｎは、０であり、そしてＺがＣＨであるとき、Ｘは、窒素であり、そしてｎは、０ではない）。好ましい実施形態では、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₆およびＲ₇は、化合物の残部であり、そしてＲ₄は、アミノ酸側鎖部分から選択される。ある観点において、Ｒ₆またはＲ₇は、ＺおよびＸがＣＨのとき、それぞれ、アミノ酸側鎖部分から選択される。

これらの化合物は、適当な出発成分分子（以下、「成分片」と呼ぶ）を利用することにより、製造され得る。要約すると、式（Ｉ）を有するリバースターンミメティック構造体の合成では、第１および第２成分片をカップリングし、複合第１−第２中間体を形成し、もし必要なら、第３および／または第４成分片をカップリングし、複合第３−第４中間体を形成し（または、もし市販されているなら、単一の第３中間体を使用してもよい）、複合第１−第２中間体および第３−第４中間体（または第３中間体）は、次いで、カップリングされて、例えば、第１−第２−第３−第４中間体（または、第１−第２−第３中間体）を形成し、これを環化して、本発明のリバースターンミメティック構造体が得られる。あるいは、式（Ｉ）のリバースターンミメティック構造体は、個々の成分片を、溶液中にて段階的に、または固相ペプチド合成で一般的に実施されているような固相合成により、いずれかで連続的にカップリングすることにより、製造することができる。

本発明のリバースターンミメティック構造体を調製するための具体的な成分片およびその組立体は、図１に例示されている。例えば、「第一成分片」は、以下の式Ｓ１を有する：

ここで、Ｒ₂は、上で定義したとおりであり、そしてＲは、ペプチド合成で使用するのに適当な保護基である。この保護基は、固相合成を可能にするために、高分子支持体に結合されていてもよい。適当なＲ基には、アルキル基を含み、好ましい実施形態では、Ｒは、メチル基である。図１において、Ｒ基の一つは、高分子（固体）支持体であり、図面において「Ｐｏｌ」と表す。このような第一成分片は、ＣＨ（ＯＲ）₂−ＣＨＯとＨ₂Ｎ−Ｒ₂の還元アミノ化により、または、Ｈ₂Ｎ−Ｒ₂とＣＨ（ＯＲ）₂−ＣＨ₂−ＬＧ（ここで、ＬＧは、離脱基、例えば、ハロゲン（Ｈａｌ）基を意味する）との置換反応により、容易に合成され得る。

本発明の「第二成分片」は、以下の式Ｓ２を有する：

ここで、Ｐは、ペプチド合成で使用するのに適当なアミノ保護基であり、Ｌ₁は、ヒドロキシルまたはカルボキシル活性化基であり、Ｒ₄は、上で定義したとおりである。好ましい保護基には、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、メチルオキシカルボニル（ＭＯＣ）、９Ｈ−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）およびアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）を含む。Ｎ−保護アミノ酸は、市販されている。例えば、ＦＭＯＣアミノ酸は、種々の供給源から入手できる。第二成分片を第一成分片と反応させるために、Ｌ１は、カルボキシル活性化基であり、また、カルボキシル基のカルボキシル活性化基への変換は、カルボキシル基の活性化について、当該分野において公知の方法で容易に達成され得る。適当な活性化カルボン酸には、酸ハロゲン化物（ここで、Ｌ₁は、ハロゲン、例えば塩素または臭素）、酸無水物（ここで、Ｌ₁は、アシル基（例えば、アセチル）である）、反応性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびペンタフルオロフェニルエステル）および他の活性化中間体（例えば、カルボジイミド（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ））を使用するカップリング反応で形成される活性中間体を含む。従って、市販されているＮ−保護アミノ酸は、当業界の技術者に公知の手段によって、カルボキシル活性化基へ変換することができる。

アミノ酸のアジド誘導体を第二成分片として供する場合、このような化合物は、Ｚａｌｏｏｍら（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６：５１７３〜７６，１９８１）で開示された反応により、対応するアミノ酸から製造され得る。

あるいは、本発明の第一成分片は、以下の式Ｓ１’を有し得る。

ここで、Ｒは、上で定義したとおりであり、そしてＬ₂は、脱離基（例えば、ハロゲン原子またはトシル基）である。

本発明の第二成分片は、以下の式Ｓ２’を有し得る。

ここで、Ｒ₂、Ｒ₄およびＰは、上で定義したとおりである。

本発明の「第三成分片」は、以下の式Ｓ３を有し得る：

ここで、Ｇ、Ｅ、Ｌ₁およびＬ₂は、上で定義したとおりである。適当な第三成分片は、種々の供給源から市販されているか、または有機化学における任意の公知方法により製造できる。

図１において、式（Ｉ）の化合物は、Ａは、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｂは
、−（ＣＨＲ₄）−であり、Ｄは、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｅは、−（ＣＲ₆）−である。カルボニル基が位置Ｂにあり、そしてＲ基が位置Ｂにある一般式（Ｉ）の化合物、すなわち、Ａは、−（ＣＨＲ₃）−であり、
Ｂは、−（Ｃ＝Ｏ）−である化合物は、図２に示すように、図１に示すような方法により製造できる。図２はまた、第１−第２中間体片と反応しないうちに、第４成分片を第３成分片に結合させるよりは、第１−第２−第３成分中間体に第４成分片を添加することを例示している。その他、図２は、Ｄは、−（ＣＨＲ₅）−（図１の−（Ｃ＝Ｏ）ではない）であり、Ｅは、−（Ｃ＝Ｏ）（図１の−（ＣＨＲ₆）−ではない）である本発明による化合物の製造を例示している。最終的に、図２は、ＧがＮＲ₇である化合物の製造を例示する。

従って、上で例示したとおり、一般式（Ｉ）を有するリバースターンミメ
ティック構造体は、第１成分片を第２成分片と反応させて複合第１−第２中間体を形成し、続いて、複合第１−第２中間体を順次に第３成分片と反応させて第１−第２−第３−第４中間体を形成し、次いで、この中間体を環化して、リバースターンミメティック構造体を得ることにより、合成され得る。

本発明の代表的な成分片の合成は、製造実施例および加工実施例で記述されている。

式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）のリバースターンミメティック構造体は、それらの成分片を適当に修飾すること以外は、上で開示したモジュラー成分合成と類似の技術により、製造され得る。

本発明のリバースターンミメティック構造体は、生物学的に活性な薬剤（例えば、診断薬、予防薬および治療薬）として有用である。例えば、本発明によるリバースターンミメティック構造体は、温血動物において細胞シグナル伝達転写因子関連ペプチドを調節するのに用いることができ、これは、この動物に、一般式（Ｉ）の化合物の有効量を投与する工程を含む方法により行われる。

さらに、本発明のリバースターンミメティック構造体はまた、温血動物のＰＴＢドメインにペプチドが結合するのを阻害するのに、温血動物のイオンチャンネルおよびＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を変調するのに、および温血動物のサイトカインを変調するのに、有効でもあり得る。

ところで、一般式（Ｉ）の化合物（特に、式（ＶＩ）の化合物）は、Ｗｎｔシグナル伝達経路により変調された疾患（例えば、癌、特に、直腸結腸癌）を阻止または治療するのに有効であることが見出された。

ここで、Ｒ_aは、フェニル基、１個以上の置換基を有する置換フェニル基（ここで、１個以上の置換基は、独立して、アミノ基、アミジノ基、グアニジノ基、ヒドラジノ基、アミダゾニル基、Ｃ₁〜₄アルキルアミノ基、Ｃ₁〜₄ジアルキルアミノ基、ハロゲン、パーフルオロＣ₁〜₄アルキル基、Ｃ₁〜₄アルキル基、Ｃ₁〜₃アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシ基、シアノ基、スルフリル基またはヒドロキシル基の１個またはそれ以上から選択される）、ベンジル基、１個以上の置換基を有する置換ベンジル基（ここで、１個以上の置換基は、独立して、アミノ基、アミジノ基、グアニジノ基、ヒドラジノ基、アミダゾニル基、Ｃ₁〜₄アルキルアミノ基、Ｃ₁〜₄ジアルキルアミノ基、ハロゲン、パーフルオロＣ₁〜₄アルキル基、Ｃ₁〜₃アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシ基、シアノ基、スルフリル基またはヒドロキシル基の１個またはそれ以上から選択される）、または、８〜１１個の環員を有する二環式アリール基であり、これは、窒素、酸素またはイオウから選択される１〜３個のヘテロ原子を有し得る。Ｒ_bは、５〜７個の環員を有する単環式アリール基であり、これは、窒素、酸素またはイオウから選択される１〜２個のヘテロ原子を有し得、その化合物中のアリール環は、ハライド、ヒドロキシル基、シアノ基、低級アルキル基および低級アルコキシ基からなる群から選択される１個以上の置換基を有し得る。Ｒ_cは、飽和または不飽和のＣ₁〜₆アルキル、Ｃ₁〜₆アルコキシ、パーフルオロＣ₁〜₆アルキルであり、そしてＸ₁、Ｘ₂、およびＸ₃は、同一または異なり、独立して、水素、ヒドロキシル、ハライドから選ばれる。

ほかの観点において、本発明の目的は、一般式（ＶＩ）を有する化合物の安全かつ有効な量および薬学的に許容されるキャリアを含有する医薬組成物を提供することにある。この組成物は、Ｗｎｔシグナル伝達経路（特に、ＴＣＦ４−β−カテニン−ＣＢＰ複合体）により変調される障害を処置するのに使用できる。

さらに、本発明は、本発明の上記組成物を使用することにより腫瘍細胞の増殖を阻止する方法；本発明の上記組成物を使用することにより腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する方法；本発明の上記組成物を使用することによりＴＣＦ４−β−カテニン−ＣＢＰ複合体により変調される疾患を治療する方法；ならびに他の抗癌剤（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、タキソール、シスプラチン、マイトマイシンＣ、テガフール、ラルチトレキセド、カペシタビンおよびイリノテカンなど）と共に本発明の組成物を投与することにより癌（例えば、直腸結腸癌）を治療する方法を提供することにある。

本発明の好ましい実施形態では、本発明の化合物は、以下のような（６Ｓ，１０Ｒ）−立体配置を有する：

ここで、Ｒ_aおよびＲ_bは、上で定義した同じ意味を有する。

本発明の別の観点では、本発明のリバースターンミメティック構造体を含むライブラリが開示されている。本発明のライブラリは、一旦、組み立てられると、生体活性を有する個々のメンバーを識別するために、スクリーニングされ得る。これらのライブラリの生体活性メンバーについてのこのようなスクリーニングは、例えば、そのライブラリのメンバーの結合活性を評価する工程またはライブラリメンバーが機能アッセイに対して有する効果を評価する工程を含んでも良い。スクリーニングは、通常、これらのライブラリメンバー（またはライブラリメンバーのサブセット）を目的の標的（例えば、抗体、酵素、レセプタまたは細胞株）と接触させることにより、達成される。ライブラリメンバー（これらは、目的の標的と相互作用できる）は、本明細書中にて、「生体活性ライブラリメンバー」または「生体活性ミメティック」と呼ばれている。例えば、生体活性ミメティックは、抗体またはレセプタに結合できるか、酵素を阻害できるか、または、例えば細胞系に関連した機能応答を誘発またはアンタゴナイズできるライブラリメンバーであってもよい。言い換えれば、本発明のライブラリのスクリーニングは、どのライブラリメンバーが１個以上の目的の生物学的標的と相互作用できるかを決定する。さらに、相互作用が起こるとき、その生体活性ミメティックは、次いで、それらのライブラリメンバーから同定され得る。このライブラリから単一（または限定数）の生体活性ミメティックを同定すると、リバースターンミメティック構造体が得られ、これらは、それ自体、生体活性であり、それゆえ、診断薬、予防薬または治療薬として有用であり、さらに、これらの分野でのリード化合物の同定を著しく促進するのに使用され得る。

本発明のライブラリのペプチドミメティックの合成は、本発明の第一、第二および第三成分片と組み合わせて、公知のペプチド合成技術を使用して、達成され得る。さらに具体的には、立体配置的に束縛されたリバースターンミメティックのＮ−末端および／またはＣ−末端には、アミノ酸配列が付加され得る。この目的のために、これらのミメティックは、固体支持体（例えば、ＰＡＭ樹脂）上で、公知技術（例えば、Ｊｏｈｎ Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊａｎｉｓ Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，III．を参照）により、またはシリル連結樹脂上にて、アルコール結合（Ｒａｎｄｏｌｐｈら、Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：５７１２−１４，１９９５を参照すること）により、合成され得る。

それに加えて、溶液合成技術および固相合成技術の両方の組合せは、本発明のペプチドミメティックを合成するのに利用され得る。例えば、固体支持体は、この配列に立体配置的に束縛されたリバースターンを加える点まで、その直鎖ペプチド配列を合成するのに利用され得る。溶液合成技術により予め合成された適当な立体配置的に束縛されたリバースターンミメティック構造体は、次いで、その固相合成の次の「アミノ酸」として加えられ得る（すなわち、この立体配置的に束縛されたリバースターンミメティックは、Ｎ−末端およびＣ−末端の両方を有するが、その直鎖ペプチドに加えられる次のアミノ酸として、利用され得る）。この配列に、この立体配置的に束縛されたリバースターンミメティック構造体を取り込むと、次いで、追加アミノ酸が加えられ得、その固体支持体に結合されたペプチドが完成する。あるいは、これらの直鎖Ｎ−末端およびＣ−末端保護ペプチド配列は、固体支持体上で合成され、その支持体から除去され、次いで、公知の溶液カップリング技術を使用して、溶液中にて、この立体配置的に束縛されたリバースターンミメティック構造体にカップリングされ得る。

本発明の他の観点では、これらのライブラリを構成する方法が開示されている。伝統的なコンビナトリアル・ケミストリー技術（例えば、Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３〜１２５１，１９９４を参照）により、基本分子足場に試薬を連続的に組み合わせることで、膨大な数の化合物を迅速に調製することが可能となる。コンビナトリアル技術は、天然に生じるアミノ酸から誘導されたペプチドライブラリを構築するのに使用されている。例えば、２０種の適当に保護した異なるアミノ酸の２０種の混合物を取り出し、そして各々を２０種のアミノ酸のうちの１種とカップリングすることにより、４００種（すなわち、２０²）のジペプチドのライブラリが作り出される。この手順を７回繰り返すと、約２６０億（すなわち、２０⁸）のオクタペプチドから構成されるペプチドライブラリが調製される。

具体的には、本発明のライブラリのペプチドミメティックの合成は、公知のペプチド合成技術（例えば、以下のような［４，４，０］リバースターンミメティックライブラリの一般図式）を使用して、達成され得る。

本発明のライブラリのペプチドミメティックの合成は、公知技術により、ＦｌｅｘＣｈｅｍ Ｒｅａｃｔｏｒ Ｂｌｏｃｋ（これは、９６ウェルプレートを有する）を使用して、達成した。上記図式では、「Ｐｏｌ」は、ブロモアセタール樹脂（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）を示し、詳細な手順は、以下で説明する。

（段階１）
ブロモアセタール樹脂（３７ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびＲ₂−アミンのＤＭＳＯ溶液（１．４ｍＬ）を、９６ウェルプレートを有するＲｏｂｂｉｎｓブロック（ＦｌｅｘＣｈｅｍ）に入れた。その反応混合物を、回転オーブン［Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を使用して、６０℃で、１２時間振盪した。この樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。

（段階２）
前記樹脂に、市販のＦｍｏｃアミノ酸（４当量）、ＰｙＢｏｂ（４当量）、ＨＯＡｔ（４当量）およびＤＩＥＡ（１２当量）のＤＭＦ溶液を加えた。その反応混合物を、室温で、１２時間振盪した後、この樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。

（段階３）
反応前にＤＭＦで膨潤した樹脂に、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンを加え、その反応混合物を、室温で、３０分間振盪した。この脱保護工程を再度繰り返し、前記樹脂をＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。前記樹脂に、ヒドラジン酸（４当量）、ＨＯＢｔ（４当量）およびＤＩＣ（４当量）のＤＭＦ溶液を加え、前記反応混合物を、室温で、１２時間振盪した。前記樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。

（段階４ａ（この場合、ヒドラジン酸は、ＭＯＣカーバメートである））
段階３で得た樹脂を、室温で、１８時間にわたって、ギ酸（各ウェルに１．２ｍＬ）で処理した。前記樹脂を濾過で除去した後、濾液を、ＳｐｅｅｄＶａｃ［ＳＡＶＡＮＴ］を使用して、減圧下にて濃縮し、オイルとして生成物を得た。前記生成物を５０％水／アセトニトリルで希釈し、次いで、凍結後に凍結乾燥した。

（段階４ｂ（この場合、Ｆｍｏｃヒドラジン酸を使用して、活性イソシアネートによって尿素を製造する））
反応前にＤＭＦで膨潤した樹脂に、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンを加え、前記反応混合物を、室温で３０分間振盪した。前記脱保護工程を再度繰り返し、前記樹脂をＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。反応前にＤＣＭで膨潤した樹脂に、ＤＣＭ中のイソシアネート（５当量）を加えた。前記反応混合物を室温で１２時間振盪した後、前記樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。前記樹脂を室温で１８時間にわたって、ギ酸（各ウェルに１．２ｍＬ）で処理した。前記樹脂を濾過で除去した後、濾液を、ＳｐｅｅｄＶａｃ［ＳＡＶＡＮＴ］を使用して、減圧下にて濃縮し、オイルとして生成物を得た。前記生成物を５０％水／アセトニトリルで希釈し、次いで、凍結後に凍結乾燥した。

（段階４ｃ（この場合、Ｆｍｏｃヒドラジン酸を使用して、活性カーバメートによって尿素を製造する））
反応前にＤＭＦで膨潤した樹脂に、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンを加え、前記反応混合物を、室温で、３０分間振盪した。前記脱保護工程を再度繰り返し、前記樹脂をＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。反応前にＤＣＭで膨潤した樹脂に、ＤＣＭ中のｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（５当量）およびジイソプロピルエチルアミン（５当量）を加えた。前記反応混合物を室温で１２時間振盪した後、前記樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。前記樹脂に、室温で１２時間にわたって、ＤＣＭ中の第一級アミンを加え、前記樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。反応後、前記樹脂を、室温で１８時間にわたってギ酸（各ウェルに１．２ｍＬ）で処理した。前記樹脂を濾過で除去した後、濾液をＳｐｅｅｄＶａｃ［ＳＡＶＡＮＴ］を使用して、減圧下にて濃縮し、オイルとして生成物を得た。前記生成物を５０％水／アセトニトリルで希釈し、次いで、凍結後に凍結乾燥した。

これらのブロックライブラリを作成するために、製造実施例で説明した手順に従って、重要な中間体ヒドラジン酸を合成した。

表２Ａおよび表２Ｂは、本発明に従って製造できる［４，４，０］リバースターンミメティックライブラリを示し、その代表的な製造は、実施例４で示す。

加えて、本発明のライブラリのペプチドミメティックの合成は、以下のような［４，３，０］リバースターンミメティックライブラリの一般的スキームを使用して、達成され得る。

本発明の二環式テンプレートライブラリのペプチドミメティックの合成は、公知技術により、ＦｌｅｘＣｈｅｍ Ｒｅａｃｔｏｒ Ｂｌｏｃｋ（これは、９６ウェルプレートを有する）を使用して、達成した。上記図式では、「Ｐｏｌ」は、ブロモアセタール樹脂（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）を示し、詳細な手順を、以下で説明する。

（段階１）
ブロモアセタール樹脂（１．６ｍｍｏｌ／ｇ）およびＲ１アミンのＤＭＳＯ溶液（２Ｍ溶液）を、９６ウェルＲｏｂｂｉｎｓブロック（ＦｌｅｘＣｈｅｍ）に入れた。前記反応混合物を、回転オーブン［Ｒｏｂｂｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を使用して、６０℃で１２時間振盪した。前記樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。

（段階２）
前記樹脂に、市販のＦｍｏｃアミノ酸（４当量）、ＰｙＢｏｂ（４当量）、ＨＯＡｔ（４当量）およびＤＩＥＡ（１２当量）のＤＭＦ溶液を加えた。アミノ酸反応混合物を、室温で１２時間振盪した後、前記樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。

（段階３）
反応前にＤＭＦで膨潤した樹脂に、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンを加えた。前記反応混合物を室温で３０分間振盪した後、前記脱保護工程を再度繰り返し、次いで、ＤＭＦ、メタノールで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。前記樹脂に、ヒドラジンカルバモイルクロライド（４当量）、ＨＯＢｔ（４当量）およびＤＩＣ（４当量）のＤＭＦ溶液を加えた。前記反応混合物を室温で１２時間振盪した後、前記樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。

（段階４）
反応前にＤＭＦで膨潤した樹脂に、ＤＭＦ中の２５％ピペリジンを加えた。前記反応混合物を室温で３０分間振盪した後、前記脱保護工程を再度繰り返し、次いで前記樹脂をＤＭＦ、メタノールで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。反応前にＤＣＭで膨潤した樹脂に、ＤＣＭ中のＲ₁イソシアネート（５当量）を加えた。前記反応混合物を室温で１２時間振盪した後、前記樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。

（段階５）
前記樹脂を室温で１８時間にわたってギ酸（各ウェルに１．２ｍＬ）で処理した。前記樹脂を濾過で除去した後、濾液を、ＳｐｅｅｄＶａｃ［ＳＡＶＡＮＴ］を使用して、減圧下にて濃縮し、オイルとして生成物を得た。これらの生成物を５０％水／アセトニトリルで希釈し、次いで、凍結後に凍結乾燥した。

表３は、本発明に従って調製され得る［４，３，０］リバースターンミメティックライブラリを示し、その代表的な製造を実施例５で示す。

本発明のさらに他の観点では、生体活性についてライブラリをスクリーニングし、生体活性ライブラリメンバーを単離する方法を提供している。

さらに他の観点では、本発明は結合アッセイを行う方法を提供するものである。この方法は、第一活性化補助因子、相互作用蛋白質、および試験化合物を含めた組成物を準備することを含む。前記第一活性化補助因子のアミノ酸構造は、ＬＸＸＬＬ、ＬＸＸＬＩ、またはＦＸＸＦＦ（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）の結合モチーフを含有する。この方法はまた、化合物の存在による前記第一活性化補助因子と前記相互作用蛋白質との間の結合の変性を検出することと、その後、試験化合物の結合への影響を見つけ出すことをさらに含む。

アッセイは、試験化合物が二つの蛋白質間の結合に及ぼす影響を測定できる方法であれば、いずれの方法で行われてもよい。このようなアッセイが当業界に多く知られており、本発明の方法に用いられ得るが、いわゆる、２ハイブリッドシステムおよびスプリットハイブリッドシステムが挙げられる。

２ハイブリッドシステムとこのシステムを用いてアッセイを行う多くの方法は、例えば米国特許第６、４１０、２４５号に開示されている。スプリットハイブリッドシステムは、例えば、Ｈｓｉｕ−Ｍｉｎｇ Ｓｈｉｕ ら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１３８９６〜１３９０１，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９６；ｏｈｎ Ｄ．Ｃｒｉｓｐｉｎｏ．ら．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，３：１〜２０，Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９９９に開示されている。スプリットハイブリッドシステムにおいて、融合蛋白質が用いられるが、この際、蛋白質Ｘは、ｌｅｘＡ ＤＮＡ結合部位（ｐＬｅｘＡ）に融合され、蛋白質Ｙは、転写活性化剤であるＶＰ１６（ｐＳＨＭ．１−ＬａｃＺ）に融合される。ｌｅｘＡ−ＸおよびＶＰ１６−Ｙ間の相互作用は、テトラサイクリンリプレッサー蛋白質（ＴｅｔＲ）の発現を導く。ＴｅｔＲは、ＨＩＳ３レポーター遺伝子の転写を妨げ、細胞がヒスチジンの欠けている培地で成長できないようにする。蛋白質間相互作用の崩壊は、テトラサイクリンリプレッサーの発現を閉鎖することにより、細胞がそのような培地で成長する能力を回復させるであろう。従って、本発明の化合物は、成長中の細胞に添加されてもよく、若し、その添加が細胞が培地で成長する能力を回復させれば、その化合物は、蛋白質間相互作用の有効な分断剤と認められる。

スプリットハイブリッド系を形成するのに必要な酵母菌としては、Ｓｔａｎｌｅｙ Ｍ．Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ．ら．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５（７）：３８１３〜３８２２，Ｊｕｌｙ １９９５に開示された２ハイブリッド体であるＬｅｘＡ／ＶＰ１６構成物が用いられ得る。スプリットハイブリッドシステムの有用な変更は、Ｔａｋｅｍａｒｕ，Ｋ．Ｉ．ａｎｄ Ｍｏｏｎ，Ｒ．Ｔ．Ｊ．ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４９：２４９〜２５４によって活用された。

他のアッセイ形式もまた適している。ＡＰ−１に対するレポーター遺伝子アッセイ、例えばＥＬＩＳＡが挙げられるが、例えば、ＩＬ−２転写阻害剤を探すために、ＣＤ３およびＣＤ２８で刺激後、Ｔ−細胞株によるＩＬ−２の産生を遮断する。直接結合アッセイ（活性化補助因子とこれらのパートナーとの間）は、表面プラスモン共鳴分光器（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ，ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）またはＥＬＩＳＡによって行うことができる。

転写制御因子としては、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣｌ、ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２ＡおよびＥＲＦ−２が例示されるが、これに制限されるものではない（例えば、Ｒｏｂｙｒ ら．（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９〜３４７；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ ら．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２３：２５５〜２７５；Ｌｅｏ ら．（２０００）Ｇｅｎｅ２４５：１〜１１；Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ−Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４６：７７〜８９；ＭｃＫｅｎｎａ ら．（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３〜１２；Ｍａｌｉｋ ら．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７〜２８３；ａｎｄ Ｌｅｍｏｎ ら．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９〜５０４を参照）。他の転写制御因子としては、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、−６、−７、および−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰならびにＴＲＡＢ１が例示されるが、これに制限されるものではない（例えば、Ｏｇａｗａら．（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：２１〜２９；Ｏｋａｎａｍｉら．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：８７〜９９；Ｇｏｆｆら．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２９８〜３０９；Ｃｈｏ ら．（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：４１９〜４２９；Ｕｌｍａｓｏｎ ら．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：５８４４〜５８４９；Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓ ら．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１〜８；Ｇｏｎｇ ら．（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３〜４４； および Ｈｏｂｏ ら．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ+ｃｉ．ＵＳＡ ９６：１５，３４８〜１５，３５３）。

好ましい実施形態において、前記転写活性化補助因子は、ヒト転写活性化補助因子である。他の好ましい実施形態において、前記転写活性化補助因子は、ヒストン・アセチルトランスフェラーゼ活性を有する活性化補助因子のｐ３００／ＣＢＰファミリーメンバーである。ｐ３００は、例えば、Ｅｃｋｎｅｒ ら．（１９９４）により開示され、ＣＢＰは、ＢａｎｎｉｓｔｅｒおよびＫｏｕｚａｒｉｄｅｓ（１９９６）により開示されている。本発明の目的のために、ｐ３００／ＣＢＰの引用は、ヒトのｐ３００の対立および合成変異体に言及し、他の哺乳動物の変異体およびその対立および合成変異体に言及するのみならず、前記ヒトおよび哺乳動物のｐ３００の形態のフラグメントに言及する。このアッセイの一つの観点において、相互作用蛋白質が、転写因子または第二活性化補助因子である。

このアッセイの一つの観点において、前記相互作用蛋白質は、下記の中のいずれか一つである：ＲＩＰ１４０；ＳＲＣ−１（ＮＣｏＡ−１）；ＴＩＦ２（ＧＲＩＰ−１；ＳＲＣ−２）；ｐ（ＣＩＰ；ＲＡＣ３；ＡＣＴＲ；ＡＩＢ−１；ＴＲＡＭ−１；ＳＲＣ−３）；ＣＢＰ（ｐ３００）；ＴＲＡＰｓ（ＤＲＩＰｓ）；ＰＧＣ−１；ＣＡＲＭ−１；ＰＲＩＰ（ＡＳＣ−２；ＡＩＢ３；ＲＡＰ２５０；ＮＲＣ）；ＧＴ−１９８；およびＳＨＡＲＰ（ＣｏＡＡ；ｐ６８；ｐ７２）。このアッセイの他の観点において、前記相互作用蛋白質は、下記の中のいずれか一つである：ＴＡＬ１；ｐ７３；ＭＤｍ２；ＴＢＰ；ＨＩＦ−１；Ｅｔｓ−１；ＲＸＲ；ｐ６５；ＡＰ−１；Ｐｉｔ−１；ＨＮＦ−４；Ｓｔａｔ２；ＨＰＶ Ｅ２；ＢＲＣＡ１；ｐ４５（ＮＦ−Ｅ２）；ｃ−Ｊｕｎ；ｃ−ｍｙｂ；Ｔａｘ；Ｓａｐ １；ＹＹ１；ＳＲＥＢＰ；ＡＴＦ−１；ＡＴＦ−４；Ｃｕｂｉｔｕｓ；Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｕｓ；Ｇｌｉ３；ＭＲＦ；ＡＦＴ−２；ＪＭＹ；ｄＭａｄ；ＰｙＬＴ；ＨＰＶ Ｅ６；ＣＩＴＴＡ；ＴａＴ；ＳＦ−１；Ｅ２Ｆ；ｊｕｎＢ；ＲＮＡ ヘリカーゼ Ａ；Ｃ／ＥＢＰβＧＡＴＡ−１；Ｎｅｕｒｏ Ｄ；Ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｉｍｉａ；Ｅ１Ａ；ＴＦＩＩＢ；ｐ５３；Ｐ／ＣＡＦ；Ｔｗｉｓｔ；Ｍｙｏ Ｄ；ｐｐ９Ｏ ＲＳＫ；ｃ−Ｆｏｓ；およびＳＶ４０Ｌａｒｇｅ Ｔ。このアッセイの他の観点において、前記相互作用蛋白質は、下記の中のいずれか一つである：ＥＲＡＰ１４０；ＲＩＰ１４０；ＲＩＰ１６０；Ｔｒｉｐ１；ＳＷＩ１（ＳＮＦ）；ＡＲＡ７０；ＲＡＰ４６；ＴＩＦ１；ＴＩＦ２；ＧＲＩＰ１；およびＴＲＡＰ。このアッセイの他の観点において、前記相互作用蛋白質は、下記の中のいずれか一つである：ＶＰ１６；ＶＰ６４；ｐ３００；ＣＢＰ；ＰＣＡＦ；ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ；ＡｔＨＤ２Ａ；ＥＲＦ−２；ＯｓＧＡＩ；ＨＡＬＦ−１；Ｃ１；ＡＰ−１；ＡＲＦ−５；ＡＲＦ−６；ＡＲＦ−７；ＡＲＦ−８；ＣＰＲＦ１；ＣＰＲＦ４；ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ；およびＴＲＡＢ１。本発明のまた他の観点において、前記第一活性化補助因子は、ＣＢＰまたはｐ３００である。

試験化合物は、以下の化合物の中から選択される。例えば、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＶＩ）、および（ＶＩａ）を有する化合物。典型的には、試験化合物は、様々な濃度において検討されるが、これらの濃度は、部分的にはアッセイ条件に応じて選択され、アッセイ条件の例を挙げると、第一活性化補助因子および相互作用蛋白質の濃度である。約０．１から１０μＭ範囲の濃度が典型的である。ある観点において、このアッセイが、二つの蛋白質間の結合相互作用に影響を及ぼす二つの化合物の相対的な効用を評価するということであるが、この二つの化合物の少なくとも一つは本発明による化合物である。より有効な化合物が、化合物構造と化合物活性との間の関係を研究するのに参照化合物となり得る。

本発明のライブラリを、種々の技術および方法により、生体活性についてスクリーニングした。一般に、このスクリーニングアッセイは、（１）ライブラリのミメティックを目的の生体標的（例えば受容体）と接触させて、そのライブラリのミメティックと標的との間の結合を起こすことにより、そして（２）適当なアッセイ（例えば、Ｌａｍら（Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４，１９９１）またはＧｒｉｍｉｎｓｋｉら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１００８〜１０１１，１９９４）により開示された熱量測定アッセイ）（これらの両方は、本明細書中で参考として援用される）により、その結合事象を検出することにより、実行され得る。好ましい実施形態では、これらのライブラリメンバーは、溶液中にあり、その標的は、固相に固定化される。あるいは、このライブラリは、固相に固定化され得、それを溶液中で標的と接触させることにより、調べられ得る。

以下の表４は、本発明のライブラリから選択された生体活性試験用化合物およびそれらのＩＣ₅₀値（これらは、実施例６で記述したように、レポーター遺伝子アッセイで測定される）を示す。

本発明によれば、一般式（Ｉ）の化合物（特に、一般式（ＶＩ）の化合物）は、それがＣＢＰに特異的に結合するために、癌細胞におけるＣＢＰ媒介転写活性を阻害できることが発見されており、それは、ＳＷ４８０細胞のＣＢＰを本発明の化合物で免疫沈降することにより、裏付けられる。

本発明の化合物は、また、ＳＷ４８０細胞でのスルビビン発現を阻害でき、従って、癌細胞の発癌活性を阻害できる。本発明の化合物は、癌細胞を阻害するのに使用でき、それゆえ、細胞増殖を調節するのに有用となる。このような結果を確証して、本発明の化合物は、さらに、ＳＷ４８０細胞でのカスパーゼ−３活性を誘発でき、従って、細胞においてアポトーシス活性を誘発できることを示す。本発明の化合物はまた、細胞においてアポトーシスを誘発するのに有利に使用できる。
癌細胞での発癌活性を確認するために、以下の方法により、インビトロＭＴＳ細胞毒性アッセイを試験した。

（１）細胞毒性試験
ＳＷ４８０細胞またはＨＣＴ１１６細胞を９６ウェルマイクロプレート（１０⁴個の細胞／ウェル）に入れ、そして３７℃で、２４時間インキュベートした。これらの細胞を、２４時間にわたって、種々の濃度のＴＣＦ４化合物で処理した。各ウェルに２０μｌのＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、そして３７℃で、２時間インキュベートした。マイクロプレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して、４９０ｎｍの吸光度を読み取ることにより、細胞生存度を測定し、各濃度での化合物の細胞毒性を算出した。

（２）成長阻害アッセイ
ＳＷ４８０細胞またはＨＣＴ１１６細胞を９６ウェルマイクロプレート（１０⁴個の細胞／ウェル）に入れ、そして３７℃で、２４時間インキュベートした。各ウェルに、２０μｌの［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩］（ＭＴＳ）溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、３７℃で２時間インキュベーションした後の吸光度（ネガティブ・コントロール）を読み取った。次いで、これらの細胞を、４８時間にわたって、種々の濃度のＴＣＦ４化合物で処理した。各ウェルに、２０μｌのＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、そして３７℃で、２時間インキュベートした。マイクロプレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して、４９０ｎｍの吸光度を読み取ることにより、細胞生存度を測定し、各濃度での化合物の細胞毒性を算出した。

選択したライブラリ化合物についての発癌活性の結果を表５に示した。表５の化合物番号は、表４の化合物番号と関係ない。

ほかの観点では、本発明は、一般式（Ｉ）、一般式（ＩＩ）、一般式（ＩＩＩ）、一般式（ＩＶ）または一般式（ＶＩ）の構造を有する化合物を含有する医薬組成物を提供する。これらの組成物は、後述する様々な方法（例えば、癌またはアルツハイマー病の治療）に用いられ得る。

本発明による医薬組成物は、目的とする投与方法に応じて剤形化することができる。投与方法としては、非経口（例えば静脈内）、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与のような投与が例示される。非経口、皮内または皮下投与に用いられる液剤または懸濁剤としては、以下の成分を含んでも良い：滅菌希釈液（例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒）、抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）、キレート剤（例えば、エチルジアミン四酢酸）、緩衝剤（酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩）、および等張化剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。その他、ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調節することができる。非経口剤は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスもしくはプラスチック製複数回投与バイアルに封入することができる。

注射用に適した医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液と、滅菌注射液または分散液の即時調整用製剤のための滅菌粉末とを含む。静脈内投与の場合、適切なキャリアとしては、生理食塩水、静菌水、クレモフォア（Cremophor） ＥＬ（商標）（ＢＡＳＥ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を挙げられる。いかなる場合でも、前記組成物は、滅菌状態でなければならず、また容易に注射可能な程度に流動性でなければならない。製造および貯蔵の状態下で安定でなければならず、バクテリアおよび真菌などの微生物に汚染されずに保存されなければならない。前記キャリアとしては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液相ポリエチレングリコールなど）、そしてこれらの適合した混合物を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆物の使用により、分散液の場合に必要な粒径の維持により、また界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール）により達成することができる。多くの場合、組成物中に等張化剤（例えば、糖、ポリアルコール、（例えば、マニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム））を含有することが好ましい。注射用組成物の遅延吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を前記組成物に含有させることにより行われる。

滅菌注射剤は、必要に応じて、上述した成分の単独または組合せと共に、適切な溶媒中に、必要な量で、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）または（ＶＩ）の構造を有する化合物である活性化合物を混入させた後、濾過による滅菌により調製することができる。一般に、分散液は、上述したものから必要な他の成分と分散媒体とを含有する滅菌媒介体中に活性化合物を混入させて調製する。滅菌注射剤の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥させて、予め滅菌−濾過された溶液からの追加の所望の成分および活性成分の粉末を調製するものである。

経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用キャリアを含有する。これらは、ゼラチンカプセル中に封止され、あるいは錠剤中に押し込まれることができる。経口治療の投与目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に混入されることができ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で用いられ得る。経口組成物はまた、うがい薬で用いるための流動性キャリアを用いて調製することができ、ここで、流動キャリア中の前記化合物は、経口的に適用され、ヒュっと音を出したり、吐かれたりまたは飲み込まれたりする。薬学的に適合性な結合剤および／または補助剤物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチは、以下の成分または類似性質の化合物のいずれかのものを含有することができる：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガカント、またはゼラチン）、賦形剤（例えば、デンプン、ラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、プリモゲル（Primogel）、またはコーンスターチ）、滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロッツ（Sterotes））、流動促進剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）、甘味剤（例えば、スクロース、サッカリン）、または香料添加剤（例えば、ペパーミント、メチルサリチル酸、またはオレンジ・エッセンス）を含有することができる。

吸入投与の場合、化合物は、適切な噴射剤（例えば、二酸化炭素などのガス）または噴霧剤を含有する、加圧容器またはディスペンサーからエアゾールスプレーの形態で供給される。

全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によることができる。経粘膜または経皮投与の場合、浸透しようとするバリアに好適な浸透剤が剤形に用いられる。このような浸透剤は、一般に当該分野において公知となっており、また例えば、経粘膜投与の場合、洗剤、胆汁塩、フシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは座薬の使用により達成される。経皮投与の場合、活性化合物は、一般に当該分野において公知となっており、軟膏、膏薬またはクリームの形態に剤形化される。

化合物はまた、座薬（例えば、カカオ脂およびグリセリドなどの通常の座薬の基剤とともに）または直腸投与のための停留浣腸剤の形態に調製することができる。

１実施形態において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化した運搬システムを含む、制御された放出剤形のように、身体からの速い除去に対して前記化合物を保護するキャリアと共に調製される。生分解性、生体適合性高分子、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸が用いられ得る。このような剤形の調製方法は、当該分野における技術者にとっては自明なことである。材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から入手することができる。リポソーム懸濁剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染された細胞を標的にされたリポソームを含む）はまた、薬学的に許容可能なキャリアとして用いられ得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に開示されたように、当該分野の技術者にとって公知の方法により調製することができる。

投与の容易性および用量の均一性のために、投与量単位の形態で経口的または非経口的組成物を剤形化することがさらに有利である。ここで用いられる投与量単位の形態とは、治療対象の患者のための単一容量に好適な物理的に区別された単位を意味し、それぞれの単位は、必要な薬学的キャリアと関連して所望の治療効果を得るために、計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の用量単位の形態についての明細書は、前記活性化合物の独特な特徴、達成しようとする特別な治療効果、および個々の治療のためそのような活性化合物を混合する技術に固有な制限により指示されるか、あるいはこれらによって直接依存する。

このような化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（母集団の５０％が致死する容量）およびＥＤ５０（母集団の５０％において治療的に有効な容量）を測定するための、細胞培養または実験動物の標準的製薬手続きによって決定することができる。毒性と治療効果間の用量比は治療指数であり、また、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率で表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が用いられ得るが、感染されなかった細胞に可能な損傷を最小化するために、感染された組織の部位にこのような化合物を運び、これによって副作用を減らす運搬システムをデザインするために注意を払わなければならない。

細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトに使用される投与量の範囲を公式化するのに用いてもよい。このような化合物の投与量は、毒性が殆どまたは全くないＥＤ５０を含む循環する濃度の範囲内とすることが好ましい。投与量は、使用された剤形および投与経路に応じて、この範囲内で変化することができる。本発明の方法で用いられるいかなる化合物に対しても、治療に有効な用量を、最初は、細胞培養アッセイから算定することができる。用量は、循環血漿濃度を達成するために、動物モデルにおいて公式化することができるが、これは、細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大抑制の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む。このような情報は、ヒトに有用な用量をさらに正確に決定するために用いられる。血漿濃度は、例えば、ＨＰＬＣによって測定することができる。

例えば、特定の実施形態において、本発明の適当な医薬組成物は、単位剤形で経口投与に適切なもの、例えば、約１ｍｇ〜約１ｇの本発明の化合物を含有する錠剤またはカプセル剤である。ほかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、静脈内注射、皮下注射または筋肉内注射に適当なものである。患者は、例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇの本発明の化合物の静脈内用量、皮下用量または筋肉内用量を受け得る。この静脈内用量、皮下用量および筋肉内用量は、ボーラス注射により、与えられ得る。あるいは、この静脈内用量は、一定時間にわたる連続注入により、与えられ得る。あるいは、患者は、毎日非経口用量にほぼ等しい毎日経口用量を受け、その組成物は、１日あたり、１〜４回で、投与される。

以下の表は、ヒトにおける治療用途または予防用途のために、この化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩を含有する代表的な製薬剤形を示す。
［表］

一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、または（ＶＩ）の化合物を含有する医薬組成物は、Ｗｎｔシグナル伝達経路が変調した障害、具体的に、癌、より具体的には、直腸結腸癌を治療するのに使用できる。
本発明の一観点では、本発明は、δおよびμオピオイドレセプタへの放射性標識化エンケファリン誘導体の結合を阻害する化合物を提供する。従って、本発明のリバースターンミメティックは、レセプタ作用薬および潜在性鎮痛薬として用いられ得る。
本発明の別の観点では、本発明は、腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供する。このような方法は、腫瘍細胞の成長を阻害する有効量で、一般式（Ｉ）を有する化合物、特に、一般式（ＶＩ）の化合物を、腫瘍を有する患者（例えば、哺乳動物被検体）に投与する工程を含む。化合物または組成物は、腫瘍の大きさが治療しなかったものよりも、化合物または組成物の治療を受けた患者において統計的に顕著に小さい場合、腫瘍の成長を阻害する。

腫瘍成長に対する本発明による特定な化合物または組成物の阻害効果は、当該分野において公知となった任意の適宜方法により特徴づけられてもよい。例えば、スルビビン発現に対する化合物または組成物の効果を測定することができる。スルビビン発現を下方制御する化合物または組成物は、腫瘍成長に対する阻害効果をおそらく示す。その他、腫瘍細胞株を用いたアッセイ（例えば、ＳＷ４８０細胞を用いた軟寒天アッセイ）および腫瘍成長の動物モデル（例えば、腫瘍細胞を移植したヌードマウスおよび Ｍｉｎマウスモデル）はまた、実施例において詳述するように、所定の化合物または組成物の腫瘍の成長に対する阻害効果を評価するのに用いられ得る。腫瘍成長に対する他の例示的な動物モデルまたは異種移植片は、乳癌（Ｇｕｏら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：４６７８〜８４，２００２；Ｌｕら，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．５７：１８３〜９２，１９９９）、膵癌（Ｂｏｕｖｅｔら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：１５３４〜４０，２００２）、卵巣腫瘍（Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４９：９３〜１００，２００２；Ｂａｏら，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．７８：３７３〜９，２０００）、黒色腫（Ｄｅｍｉｄｅｒｍら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：２２９４〜３００，２００１）、直腸結腸癌（Ｂｒｏｗｎら，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．４５：１５７８〜８４，２０００；Ｔｓｕｎｏｄａら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９：１１４９〜５２，１９９９；Ｃａｏら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：２６７〜７４，１９９９：Ｓｈａｗｌｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：２０１〜８，１９９５；ＭｃＧｒｅｇｏｒら，Ｄｉｓ．Ｃｏｌｏｎ．Ｒｅｃｔｕｍ．３６：８３４〜９，１９９３；Ｖｅｒｓｔｉｊｎｅｎら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：１１９３〜２００，１９８８）、肝細胞癌（Ｌａｂｏｎｔｅら，Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．１８：７２〜８５，２０００）、および胃癌（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８５：２４３〜７，２０００）に関するものを含む。

腫瘍成長を阻害する化合物または組成物は、例えば、腫瘍が残留する組織に応じて、適切な経路を経て腫瘍を有する患者に投与することができる。適切な用量は、上述したように、当該分野において公知となった知識および技術を用いて決定することができる。腫瘍成長に対する化合物または組成物の治療効果はまた、当該分野において公知となった方法を用いてモニターされ得る。様々な方法としては、例えば、結腸鏡検査、Ｓ状結腸鏡検査、生体検査、コンピュータ断層撮影法、超音波、磁気共鳴映像法、および陽電子放出断層撮影法を含み、直腸結腸癌の進行および／または成長を監視するのに用いられ得る。卵巣癌の進行および／または成長を監視する方法としては、例えば、超音波、コンピュータ断層撮影法、磁気共鳴映像法、胸部Ｘ線、腹腔鏡検査法、組織検査が挙げられる。
本発明の関連する観点では、本発明は癌の治療または予防方法を提供する。このような方法は、被験体の癌を治療または予防する有効量で、一般式（Ｉ）を有する化合物または組成物、特に、一般式（ＶＩ）を有する化合物または組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む。癌の治療は、癌の進行（例えば、癌の成長および転移）を減少または除去することを含むものと理解される。癌の予防は、癌の開始を防止または遅延することを含むものと理解される。様々な類型の癌が、本発明によって治療または予防され得る。これらには、肺癌、乳癌、直腸結腸癌、胃癌、膵癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、および白血病を含むが、これらに制限されるものではない。
治療を必要とする患者としては、様々な類型の癌に罹ったヒトもしくは非ヒト霊長類または他の動物であってもよい。予防を必要とする患者としては、癌が発生する危険のあるヒトもしくは非ヒト霊長類または他の動物であってもよい。癌を診断し、また癌の危険が大きい個々の患者をスクリーニングする方法は、当該分野において公知となっており、また本発明で用いられ得る。例えば、直腸結腸癌は、糞便潜血検査、Ｓ状結腸鏡検査、結腸鏡検査、空気注腸造影、および仮想結腸鏡検査によって診断することができる。直腸結腸癌の危険が高い個々の患者は、一つ以上の直腸結腸癌の危険因子、例えば、強い家族歴の直腸結腸癌またはポリープ、公知となった家族歴の遺伝性直腸結腸癌症候群、個人歴の腺腫性ポリープ、および個人歴の慢性炎症性大腸炎を有する。

癌の治療または予防に有用な一般式（Ｉ）の化合物は、当該分野において公知となった適切な方法により同定することができる。上述したように、腫瘍成長の阻害効果のための化合物を選択するのに使用される方法がまた用いられ得る。投与経路、所定の化合物の投与量、治療の効果は、当該分野において公知となった知識および技術を用いて決定することができる。このような決定において考慮すべき因子としては、例えば、治療する癌の類型および段階が挙げられる。

癌の治療および予防に有用な一般式（Ｉ）の化合物は、抗腫瘍薬との組合せで投与することができる。抗腫瘍薬は、腫瘍成長を阻害する化合物を参照する。例示的な抗腫瘍薬としては、フルオロラウシル；５−フルオロ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン（５−ＦＵ）、タキソール、シスプラチン、マイトマイシンＣ、テガフール、ラルチトレキセド、カペシタビン、およびイリノテカンが挙げられる（Ａｒａｎｇｏら，Ｃａｎｓｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１，２００１ ４９１０〜４９１５）。抗腫瘍薬との組合せで投与された一般式（Ｉ）の化合物は、必ずしも化合物および抗腫瘍薬が同時に投与されることを必要としない。化合物および薬剤は、一度に、これらの両方が同一の癌細胞に対して効果を及ぼす限り、独立して投与してもよい。

本発明のさらに他の関連する観点では、本発明は癌細胞のアポトーシスを誘発する方法を提供する。このような方法は、これらの細胞のアポトーシスを誘発する有効量で、一般式（Ｉ）、特に（ＶＩ）の化合物を癌細胞に接触させる工程を含む。アポトーシスを行う癌細胞の数が、化合物の不在下よりも、化合物の存在下で統計的に顕著に多い場合、化合物はアポトーシスを誘発する。このような化合物は、培養された癌細胞株、異種移植片、または動物癌モデルを使用して、当該分野において公知となった方法（例えば、カスパーゼ活性および／または細胞死を測定）により同定することができる。好ましくは、前記化合物は、正常細胞よりも、癌細胞においてアポトーシスを誘発するのにさらに活性である。様々な組織起源の癌細胞が、本発明により治療可能である。

本発明の別の観点では、Ｗｎｔシグナル伝達経路が変調した障害を治療する方法が開示され、該方法は、患者に、一般式（Ｉ）を有する化合物、特に、一般式（ＶＩ）の化合物の安全有効量を投与する工程を含む。本発明の化合物を含有する医薬組成物もまた、この目的に使用できる。このことに関連して、本発明では、一般式（Ｉ）を有する化合物、特に、一般式（ＶＩ）の化合物またはそれらを含有する医薬組成物が、ＴＣＦ４−β−カテニン−ＣＢＰ複合体（これは、Ｗｎｔシグナル伝達経路に関連した癌細胞の過剰発現を開始する原因となると考えられている）が変調した障害を治療するのに使用できることが見出されている。それゆえ、一般式（Ｉ）を有する化合物 、特に、一般式（ＶＩ）の化合物を使用して、ＴＣＦ−４−βカテニン−ＣＢＰ複合体が変調した障害を治療する方法を提供することは、本発明の別の観点である。

本発明は、スルビビン発現を阻害する化合物および方法をまた提供する。スルビビンは、ＴＣＦ／β−カテニン経路の標的遺伝子であり、より具体的には、ＴＣＦ／β−カテニン／ＣＢＰ経路の標的遺伝子である。これは、蛋白質のＩＡＰ（アポトーシス蛋白質の抑制剤）ファミリーのメンバーである。スルビビンと関連した生物学的活性は、細胞サイクル入口と出口を調節するＧ₂／Ｍにおいて高度に発現；細胞サイクル相によって微小管、中心体（centrosome）、セントロメア、中心体（midbody）と関連；カスパーゼ（例えば、カスパーゼ３、７および９）との直接または間接の相互作用を通じた抗アポトーシスとを含む。癌と関連して、スルビビンは、腫瘍細胞に広範囲かつ高度に発現されるが、正常組織細胞では、殆どまたは全く発現されない。また、腫瘍がスルビビンを発現した癌患者は、全体的な生存率が減少することが観察された。さらに、スルビビンの発現程度は、他の癌のマーカー、例えば、Ｋｉ６７、ＰＮＣＡ、ｐ５３、ＡＰＣなどと相互関連されている。

スルビビン発現への本発明による特定の化合物の影響は、当該分野において公知となった方法によって特徴づけられる。このような方法は、転写または翻訳レベルにおいてスルビビン発現を特徴付ける方法を含む。転写レベルでのスルビビン発現を特徴づける例示的な方法は、ｃＤＮＡ微小配列、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）、スルビビンプロモータによって推進されたレポーター活性のアッセイである。翻訳レベルでのスルビビン発現を特徴づける例示的な方法は、ウエスタンブロット分析、免疫化学およびカスパーゼ活性である。これらの例示的な方法の詳細は、下記実施例において見いいだされるであろう。

上述したように、本発明は、スルビビン発現を阻害する方法を提供する。このような方法は、スルビビン発現を阻害する有効量で、本発明の化合物をスルビビン発現細胞に接触させる工程を含む。細胞内のスルビビン発現が、化合物の不在下よりも、化合物の存在下で減少する場合、その化合物はスルビビン発現を阻害する。スルビビン発現細胞は、例えば、肺癌、乳癌、胃癌、膵癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、神経膠腫、黒色腫、直腸結腸癌、リンパ腫、および白血病からのまたは中の細胞を発現させる腫瘍細胞を含む。化合物をスルビビン発現細胞に接触させる工程は、インビトロ、生体外、インビボにおいて行うことができる。スルビビン発現を阻害するのに有用な化合物を、同定することができ、また、本発明による特定の化合物の効果は、上述したように当該分野において公知となった適切な方法によって特徴づけられる。

本発明の化合物は、スルビビンの発現を阻害することが明らかとなっている。Ｂｌａｎｃ−Ｄｒｕｄｅら、Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８：９８７（２００２）は、スルビビンが平滑筋細胞アポトーシスの重要な制御因子であり、これは、病理学的血管壁再構築で重要であることを明らかにしている。従って、本発明の他の観点は、血管形成術に関連した再狭窄を治療または予防する方法を提供し、該方法は、それが必要な被験体に、本発明のリバースターンミメティックの安全有効量を投与する工程を含む。１実施形態では、本発明は、再狭窄を治療し、すなわち、再狭窄に罹った被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると、再狭窄の重症度、範囲または程度などが少なくなる。他の実施形態では、本発明は、再狭窄を予防し、すなわち、新規または追加の再狭窄を発症すると予測されている被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると、予想される再狭窄の重症度、範囲または程度などが少なくなる。任意に、この被験体は、哺乳動物被験体である。

本発明の化合物は、ＴＣＦ／β−カテニン転写を阻害することが明らかとなっている。Ｒｏｄｏｖａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２９５７７（２００２）は、ＰＫＤ−１プロモータがβ−カテニン／ＴＣＦ経路の標的であることを明らかにしている。従って、本発明の他の観点は、腎多嚢胞病を治療または予防する方法を提供し、該方法は、それが必要な被験体に、本発明のリバースターンミメティックの安全有効量を投与する工程を含む。１実施形態では、本発明は、腎多嚢胞病を治療し、すなわち、腎多嚢胞病に罹った被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると、腎多嚢胞病の重症度、範囲または程度などが少なくなる。他の実施形態では、本発明は、腎多嚢胞病を予防し、すなわち、新規または追加の腎多嚢胞病を発症すると予測されている被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると、予想される腎多嚢胞病の重症度、範囲または程度などが少なくなる。任意に、この被験体は、哺乳動物被験体である。

本発明の化合物は、Ｗｎｔシグナル伝達の発現を阻害することが明らかとなっている。Ｈａｎａｉら、Ｊ：Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．１５８：５２９（２００２）は、公知の抗血管原性因子であるエンドスタチンがＷｎｔのシグナル伝達を阻害することを明らかにしている。従って、本発明の他の観点は、異常血管形成疾患を治療または予防する方法を提供し、該方法は、それが必要な被験体に、本発明のリバースターンミメティックの安全有効量を投与する工程を含む。１実施形態では、本発明は、異常血管形成疾患を治療し、すなわち、異常血管形成疾患に罹った被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると、異常血管形成疾患の重症度、範囲または程度などが少なくなる。他の実施形態では、本発明は、異常血管形成疾患を予防し、すなわち、新規または追加の異常血管形成疾患を発症すると予測されている被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると、異常血管形成疾患の予想される重症度、範囲または程度などが少なくなる。任意に、この被験体は、哺乳動物被験体である。

本発明の化合物は、Ｗｎｔシグナル伝達の発現を阻害することが明らかとなっている。Ｓｅｎら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ）９７：２７９１（２０００）は、関節リウマチ疾患に罹った哺乳動物がＲＡ滑膜組織においてＷｎｔおよびＦｚの高い発現を示すことを明らかにしている。従って、本発明の他の観点は、関節リウマチを治療または予防する方法を提供し、該方法は、それが必要な被験体に、本発明のリバースターンミメティックの安全有効量を投与する工程を含む。１実施形態では、本発明は、関節リウマチ疾患を治療し、すなわち、関節リウマチ疾患に罹った被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると、関節リウマチ疾患の重症度、範囲または程度などが少なくなる。他の実施形態では、本発明は、関節リウマチ疾患を予防し、すなわち、新規または追加の関節リウマチ疾患を発症すると予測されている被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると、関節リウマチ疾患の予想される重症度、範囲または程度などが少なくなる。任意に、この被験体は、哺乳動物被験体である。

本発明の化合物は、Ｗｎｔシグナル伝達の発現を阻害することが明らかとなっている。Ｕｔｈｏｆｆら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１９：８０３（２００１）は、（クローン病患者と比較して）潰瘍性大腸炎では、乱れたおよびｆｚ（Ｗｎｔ経路分子）の差次的上方制御が起こることを明らかにしている。従って、本発明の他の観点は、潰瘍性大腸炎を治療または予防する方法を提供し、該方法は、それが必要な被験体に、本発明のリバースターンミメティックの安全有効量を投与する工程を含む。１実施形態では、本発明は、潰瘍性大腸炎を治療し、すなわち、潰瘍性大腸炎に罹った被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると、潰瘍性大腸炎の重症度、範囲または程度などが少なくなる。他の実施形態では、本発明は、潰瘍性大腸炎を予防し、すなわち、新規または追加の潰瘍性大腸炎を発症すると予測されている被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると、潰瘍性大腸炎の予想される重症度、範囲または程度などが少なくなる。任意に、この被験体は、哺乳動物被験体である。

本発明の化合物は、Ｗｎｔ経路のＴＣＦ／カテニンのシグナルを阻害することが明らかとなっている。従って、本発明の他の観点は、結節硬化症（ＴＳＣ）を治療または予防する方法を提供し、該方法は、それが必要な被験体に、本発明のリバースターンミメティックの安全有効量を投与する工程を含む。ＴＳＣを有する被験体は、典型的に脳、心臓、腎臓、および他の組織において多発性局所性病変を示す（例えば、Ｇｏｍｅｚ，Ｍ．Ｒ．Ｂｒａｉｎ Ｄｅｖ．１７（ｓｕｐｐｌ）：５５〜５７（１９９５））。哺乳類細胞の研究は、ＴＳＣ１（ハマルチンを発現する）およびＴＳＣ２（ツベリンを発現する）の過剰発現が、細胞増殖を負に調節し、また、Ｇ₁／Ｓ停止を誘発することが明らかとなっている（例えば、Ｍｉｌｏｌｏｚａ，Ａ．ら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９：１７２１〜１７２７（２０００））。他の研究は、ハマルチンおよびツベリンが β−カテニン分解複合体のレベルで作用し、また、より具体的には、これらの蛋白質がβ−カテニン分解複合体に加わることにより、β−カテニンの安定性および活性を負に調節することが明らかとなっている（例えば、Ｍａｋ，Ｂ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（８）：５９４７〜５９５１．（２００３））。β−カテニンは、膜結合型カドヘリンファミリのメンバーとの結合を通じて細胞粘着に関与し、また、Ｗｎｔ／Ｗｉｎｇｌｅｓｓ経路の主要な成分として、細胞増殖および細胞分化に関与する９５−ｋＤａ蛋白質である（例えば、Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｄ．Ｌ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：６７２〜６７８（２００１））。この経路の間違い調節は、ヒトおよび齧歯動物において腫瘍を発生させることが明らかとなっている。本発明は、β−カテニンの活性および、特に他の蛋白質とのその相互作用を調節する化合物を提供し、従って、ＴＳＣの治療に使用される化合物を提供する。１実施形態では、本発明は、ＴＳＣを治療し、すなわち、ＴＳＣに罹った被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると、ＴＳＣの重症度、範囲または程度などが少なくなる。他の実施形態では、本発明は、ＴＳＣを予防し、すなわち、新規または追加のＴＳＣを発症すると予測されている被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると、ＴＳＣの予想される重症度、範囲または程度などが少なくなる。任意に、この被験体は、哺乳動物被験体である。

本発明の化合物は、Ｗｎｔシグナル伝達の発現を阻害することが明らかとなっている。カポジ肉腫関連ヘルパス・ウィルス（ＫＳＨＶ）潜伏関連核抗原（ＬＡＮＡ）は、原発性滲出液リンパ腫（ＰＥＬ）および多中心性キャッスルマン病のようなカポジ肉腫（ＫＳ）およびβ−細胞腫瘍を含めた全てのＫＳＨＶ関連腫瘍において発現される。Ｆｕｊｉｍｕｒｏ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９（３）：３００〜３０６（２００３）は、ＬＡＮＡが、外見上では、負の調節ＧＳＫ−３βの再分配によって、β−カテニンの安定化作用を果たすことを明らかにしている。本発明は、β−カテニン蛋白質相互作用、例えば、β−カテニン／ＴＣＦ複合体の形成を阻害する化合物および方法を提供する。従って、本発明の化合物は、β−カテニン／ＴＣＦ複合体のＬＡＮＡ−誘発性蓄積および少なくとも部分的なＫＳＨＶ感染の結果を妨げる。従って、本発明の他の観点は、カポジ肉腫関連ヘルパス・ウィルス（ＫＳＨＶ）の感染による症状を治療または予防する方法を提供する。そのような症状には、カポジ肉腫（ＫＳ）および原発性滲出液リンパ腫（ＰＥＬ）を含めたＫＳＨＶ関連腫瘍を含む。該方法は、それが必要な被験体に、本発明のリバースターンミメティックの安全有効量を投与する工程を含む。１実施形態では、本発明は、ＫＳＨＶ関連腫瘍を治療し、すなわち、ＫＳＨＶ関連腫瘍に罹った被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると、腫瘍の重症度、範囲または程度などが少なくなる。他の実施形態では、本発明は、ＫＳＨＶ関連腫瘍を予防し、すなわち、新規または追加のＫＳＨＶ関連腫瘍を発症すると予測されている被験体に本発明のリバースターンミメティックを投与すると、ＫＳＨＶ関連腫瘍の予想される重症度、範囲または程度などが少なくなる。任意に、この被験体は、哺乳動物被験体である。

ＬＥＦ／ＴＣＦ ＤＮＡ結合蛋白質は、活性化したβ−カテニン（Ｗｎｔシグナルの生成物質）と共に作用して、下流標的遺伝子を転写活性化する。ＤｓａＣｕｐｔａ，Ｒ．およびＦｕｃｈｓ，Ｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２６（２０）：４５５７〜６８（１９９９）は、細胞運命の変化と分化が起こった場合、毛髪発生およびサイクリングにおいて特定時間に活性化したＬＥＦ／ＴＣＦ複合体の重要性を明らかにしている。さらに、皮膚形態形成において、β−カテニンは、毛嚢形成、マウスでの「毛皮」表現型の原因となる、その過剰発現において必須的であることが明らかとなっている（Ｇａｔ，Ｕ．ら，Ｃｅｌｌ ９５：６０５〜６１４（１９９８）およびＦｕｃｈｓ，Ｅ．Ｈａｒｖｅｙ Ｌｅｃｔ，９４：４７〜４８（１９９９）。また、参照、Ｘｉａ，Ｘ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１０８６３〜１０８６８（２００１））。本発明の化合物は、Ｗｎｔシグナルの発現を阻害し、また、β−カテニン複合体の形成を妨げることが明らかとなっている。従って、本発明は、それが必要な被験体に、本発明のリバースターンミメティックの安全有効量を投与することを含む、毛髪の成長を調節する方法を提供し、ここで、前記量は、被験体において毛髪の成長を調節するのに有効である。任意に、この被験体は、哺乳動物被験体である。

本発明は、アルツハイマー病を治療または予防するのに有用な化合物を提供する。アルツハイマー病（ＡＤ）は、進行性痴呆のある神経変性病である。この疾患は、脳における三つの主な構造変化、すなわち、ｉ）細胞内蛋白質沈着物（また、神経原線維変化、ＮＥＦとして知られている）、ｉｉ）栄養失調の神経炎で取り囲まれているアミロイド斑と呼ばれる細胞外蛋白質沈着物、ｉｉｉ）神経びまん性を伴う。

本発明の化合物または組成物は、プレセニリン−１変異に起因する神経分化の欠陥を治癒し、また、神経前駆体集団がアルツハイマーの脳で神経に分化する数または速度を少なくすることができる。プレセニリンは、その作用が、ノッチおよびアミロイド前駆体蛋白の輸送、ターンオーバーおよび開裂と関連した膜貫通蛋白質である。プレセニリン−１（ＰＣ−１）におけるミスセンス変異は、早期発症の家族性アルツハイマー病と関連している（Ｆｒａｓｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．６７，８９（２００１））。本発明の化合物は、ＰＣ−１家族性アルツハイマー変異の個々の患者のみならず、一般のアルツハイマー病患者にとっても適用可能である。

その他、本発明は、それが必要な被験体に、本発明のリバースターンミメティックの安全有効量を投与することを含むアルツハイマー病の治療または予防方法であって、前記量は、被験体においてアルツハイマー病を治療または予防するのに有効であるアルツハイマー病の治療または予防方法を提供する。アルツハイマー病の治療は、アルツハイマー病の症状特性の徴候を減少または除去するか、あるいはこの疾患の進行を遅延させることを含むものと理解される。アルツハイマー病の予防は、この疾患の発病を予防または遅延させることを含むものと理解される。

治療を必要とする被験体は、アルツハイマー病の様々な段階にあるヒトもしくは非ヒト霊長類また他の動物であってもよい。アルツハイマー病の診断方法としては、神経心理学的措置、機能的画像化措置、生物学的マーカー、および頭脳組織の検死が挙げられ、当該分野において公知となっている（例えば、Ｄｉｎｓｍｏｒｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｏｓｔｅｏｐａｔｈ，Ａｓｓｏｃ．９９（９ Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ１〜６，１９９９；Ｋｕｒｚら，Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ．Ｓｕｐｐｌ．６２：１２７〜３３，２００２；Ｓｔｏｒｅｙら，Ｆｒｏｎｔ Ｖｉｏｓｃｉ．７：ｅ１５５〜８４，２００２；Ｍａｒｉｎら，Ｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ，５７：３６〜４０，２００２；Ｋｒｉｌ ａｎｄ Ｈａｌｌｉｄａｙ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．４８：１６７〜２１７，２００１：Ｇｕｒｗｉｔｚ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：３８６，２０００；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｓｐａｈｎ ａｎｄ Ｈｏｃｋ．Ｅｕｒ．Ａｒｃｈ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４９ Ｓｕｐｐｌ．３：３７〜４２；Ｆｏｘ ａｎｄ Ｒｏｓｓｏｒ，Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏ．（Ｐａｒｉｓ）１５５ Ｓｉｐｐｌ．４：Ｓ３３〜７，１９９９）。予防を必要とする被験体は、アルツハイマー病が発症する危険性のあるヒトもしくは非ヒト霊長類また他の動物、例えば、この疾患の原因である特定の遺伝子（例えば、アミロイド前駆体蛋白、プレセニリン−１、およびプレセニリン−２をエンコードする遺伝子）および／またはこの疾患への発病に伴って生じる遺伝子（例えば、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子 ）の変異を有する個々の患者であってもよい（Ｒｏｃｃｈｉら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．６１：１〜２４，２００３）。

一般式（Ｉ）の構造を有する化合物は、当該分野において公知となった適切な方法によってアルツハイマー病を治療または予防するために、その活性をスクリーニングされてもよい。このようなスクリーニングは、最初は、インビトロ培養細胞（例えば、実施例８におけるＰＣ−１２細胞）を使用して行うことができる。プレセニリン−１変異によって生じる神経分化の欠陥を治癒することができる化合物は、アルツハイマー病に対する様々な動物モデルを使用してさらにスクリーニングすることができる。あるいは、一般式（Ｉ）の構造を有する化合物は、アルツハイマー病の動物モデルにおいて直接試験することができる。多くのモデルシステムが、当該分野において公知となっており、また本発明において使用され得る（Ｒｏｗａｎら，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３５８：８２１〜８，２００３；Ｓａｎｔ’Ａｎｇｅｌｏら，Ｎｅｕｒｅｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２８：１００９〜１５，２００３；Ｗｅｉｎｅｒ Ｈａｒｖ．Ｒｅｖ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ４：３０６〜１６，１９９７）。アルツハイマー病の治療または予防に対する選択された化合物の効果は、アルツハイマー病の進行を分析するために、当該分野において公知となった方法によって、特徴づけまたは監視することができるが、これらの方法には、該疾患の診断について上述したものを含む。

本発明はまた、神経突起伸長を促進する方法を提供する。該方法は、神経突起伸長を促進する有効量で、一般式（Ｉ）による化合物を神経に接触させる工程を含む。該方法は、神経変性疾患（例えば、緑内障、黄斑変性、パーキンソン病、およびアルツハイマー病）および神経系の損傷を治療するのに有用である。神経細胞の神経突起の長さが、化合物の不在下よりも、化合物の存在下で統計的に顕著に長ければ、その化合物は、神経突起伸長を促進する。このような化合物は、インビトロ培養細胞（例えば、ＰＣ−１２細胞、神経芽細胞種Ｂ１−４細胞）（Ｂｉｔａｒら，Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．２９８：２３３〜４２，１９９９；Ｐｅｌｌｉｔｔｅｒｉら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．４５：３６７〜７６，２００１；Ｓａｔｏｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５８：５０〜３，１９９９：Ｈｉｒａｔａ ａｎｄ Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３２：４１５〜２５，１９９７：Ｃｈａｕｖｅｔら，Ｇｌｉａ １８：２１１〜２３，１９９６：Ｖｅｔｔｅｒ ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：１６８〜７８，１９９４；Ｋｏｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０；４７４８〜５２，１９９３；Ｓｋｕｂｉｔｚら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１３７〜４８，１９９１；Ｏ’Ｓｈｅａら，Ｎｅｕｒｏｎ ７：２３１〜７，１９９１；Ｒｙｄｅｌ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：１２５７〜６１，１９９８）を使用するか、あるいは、外植片（Ｋａｔｏら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．３１：１４３〜７，１９８３；Ｖａｎｈｅｍｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：７７６〜８２，１９９０；Ｃａｒｒｉら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：５６７〜７８，１９９４）を使用して同定することができる。本発明による化合物で神経細胞を接触させることは、インビトロまたはインビボにおいて行うことができる。得られた処理した神経細胞は、インビトロで生成されれば、必要とする組織に移植することができる（Ｌａｃｚａら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．１１：１４５〜５４．２００３；Ｃｈｕら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ ３４３：１２９〜３３，２００３；Ｆｕｋｕｎａｇａら，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ８：４３５〜４１，１９９９）。

本発明はまた、神経幹細胞の分化を促進する方法も提供し、前記方法は、神経幹細胞の分化を促進するのに有効な量で、一般式（Ｉ）による化合物を神経幹細胞に接触させる工程を含む。該方法は、神経変性疾患（例えば、緑内障、黄斑変性、パーキンソン病、およびアルツハイマー病）および神経系の損傷を治療するのにも有用である。「神経幹細胞」は、適切な条件下で、神経細胞、星状細胞、または乏突起膠細胞に分化できる、クローン化可能細胞、未分化細胞、多能性細胞を意味する。神経幹細胞が化合物の不在下よりも、化合物の存在下で統計的に顕著に高い分化程度を示すと、その化合物は神経幹細胞の分化を促進する。このような化合物は、インビトロ培養幹細胞または動物モデルと関係したアッセイを用いて確認され得る（Ａｌｂｒａｎｃｈｅｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５：７２５〜３０，２００３；Ｄｅｎｇら，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８２：３７３〜８２，２００３；Ｍｕｎｏｚ−Ｅｌｉａｓら，Ｍｕｎｏｚ−Ｅｌｉａｓら，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：４３７〜４８，２００３；Ｋｕｄｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６６：２８９〜９５，２００３；Ｗａｎら，Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．Ｊ．１１６：４２８〜３１，２００３；Ｋａｎｗａｍｏｒｉｔａら，Ｈｕｍ．Ｃｅｌｌ １５：１７８〜８２，２００２：Ｓｔａｖｒｉｄｉｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３１；４５〜９，２００３：Ｐａｃｈｅｒｎｉｋら，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｎｕｔｒ．Ｄｅｖ．４２：３１７〜２６，２００２；Ｆｕｋｕｎａｇａら，同上）。神経幹細胞は、培養された幹細胞、その源組織から新たに分離した幹細胞またはその源生物体内の幹細胞であってもよい。従って、本発明による化合物を神経幹細胞に接触させることは、インビトロ（培養したまたは新たに分離した幹細胞の場合）またはインビボ（その源生物体内の幹細胞の場合）で行ってもよい。得られた分化した神経細胞は、インビトロで生成されると、必要とする組織に移植されてもよい（Ｌａｃｚａら，同上；Ｃｈｕら，同上；Ｆｕｋｕｎａｇａら，同上）。このような組織は、外傷または神経変性病に罹った脳組織または他の神経組織を含む。

以下の実施例は、本発明の化合物、組成物および使用方法を説明するが、これに制限されるものではない。
製造実施例１
（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−Ｒ₃−ヒドラジノ）−酢酸の製造）
（１）Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチルヒドラジンの製造

２Ｌの二口丸底フラスコに、ガラス製ストッパーおよびカルシウムチューブを取り付けた。硫酸メチルヒドラジン（２０ｇ、１３９ｍｍｏｌ、Ｒ₃はメチル）のＴＨＦ（３００ｍＬ）溶液を加え、ＤｉＢｏｃ（３３ｇ、１５３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液を加えた。激しく攪拌しつつ、２時間にわたって、滴下漏斗を経由して、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５００ｍＬ）を滴下した。６時間後、Ｆｍｏｃ−Ｃｌ（３９ｇ、１５３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液をゆっくりと加えた。得られた懸濁液を、０℃で、６時間攪拌した。その混合物を酢酸エチル（ＥＡ，５００ｍＬ）で抽出し、その有機層を保持した。この溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧下にて蒸発させた。精製することなく、次の段階に進んだ。
１Ｌの二口丸底フラスコに、ガラス製ストッパーおよびカルシウムチューブを取り付けた。先の工程の生成物のＭｅＯＨ（３００ｍＬ）溶液を加え、氷浴中にて磁気攪拌しつつ、滴下漏斗を経由して、濃ＨＣｌ（３０ｍＬ、１２Ｎ）をゆっくりと加え、そして一晩攪拌した。その混合物をＥＡ（１０００ｍＬ）で抽出し、その有機層を保持した。この溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧下にて蒸発させた。その残留物をｎ−ヘキサンおよびＥＡで再結晶して精製して、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチルヒドラジン（３２．２ｇ、８３％）を得た。

（２）（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチル−ヒドラジノ）−酢酸ｔ−ブチルエステルの製造

１Ｌの二口丸底フラスコに、ガラス製ストッパーおよび還流冷却器（これは、カルシウムチューブに接続されている）を取り付けた。Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチル−ヒドラジン（２０ｇ、７５ｍｍｏｌ）のトルエン（３００ｍＬ）溶液を加えた。ブロモ酢酸ｔ−ブチル（２２ｇ、１１１ｍｍｏｌ）のトルエン（５０ｍＬ）溶液をゆっくりと加えた。ＣＳ₂ＣＯ₃（４９ｇ、１４９ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。激しく攪拌しつつ、ＮａＩ（１１ｇ、７４ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。その反応混合物を、還流温度で、１日にわたって攪拌した。生成混合物を濾過し、ＥＡ（５００ｍＬ）で抽出した。この溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧下にて蒸発させた。その生成物をクロマトグラフィー（これは、ヘキサン：ＥＡ＝２：１の溶液を使う）で精製して、（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチル−ヒドラジノ）−酢酸ｔ−ブチルエステル（１９．８ｇ、７０％）を得た。

（３）（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチル−ヒドラジノ）−酢酸の製造

１Ｌの二ッ口丸底フラスコに、ガラス製ストッパーおよび還流冷却器（これは、カルシウムチューブに接続されている）を取り付けた。（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチル−ヒドラジノ）−酢酸ｔ−ブチルエステル（２０ｇ、５２ｍｍｏｌ）を加えた。氷水浴中にて激しく攪拌しつつ、ＨＣｌ溶液（１５０ｍＬ、ジオキサン中の４Ｍ溶液）をゆっくりと加えた。その反応混合物を、室温で、１日間攪拌した。その溶液を、減圧下にて、４０℃で、完全に濃縮した。飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液（１００ｍｌ）を加え、その水層をジエチルエーテル（１００ｍＬ）で洗浄した。０℃で、濃ＨＣｌをゆっくりと滴下した（ｐＨ２〜３）。その混合物を抽出し、その有機層を保持した（５００ｍＬ、ＭＣ）。この溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧下にて蒸発させた。その残留物をｎ−ヘキサンおよび酢酸エチルで再結晶化して精製して、（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−メチル−ヒドラジノ）−酢酸（１２ｇ、７２％）を得た。

製造実施例２
（Ｎ−Ｍｏｃ−Ｎ’−Ｒ₇−ヒドラジノ）−酢酸の製造
（１）（Ｎ’−メトキシカルボニル−ヒドラジノ）−酢酸エチルエステルの製造

ＭＯＣ−ＮＨ−ＮＨ₂（５０ｇ、０．５５ｍｏｌ）をＤＭＦ（３００ｍｌ）に溶解し、次いで、その反応容器に、ブロモ酢酸エチル（６８ｍｌ、０．５５５ｍｏｌ）、炭酸カリウム（７７ｇ、０．５５５ｍｏｌ）を加えた。その混合物を、５０℃で、５時間温めた。その反応が完結した後、この混合物を濾過し、そしてＥｔＯＡｃで希釈し、ブラインで洗浄した（３回）。その粗生成物をカラム（溶離液：ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝４／１）で精製して、７２の無色オイルを得た。

（２）［Ｎ−Ｒ₇−Ｎ’−メトキシカルボニル−ヒドラジノ］−酢酸エチルエステルの調製

前記エチルエステル（１０ｇ、０．０５ｍｏｌ）、炭酸カリウム（６．９ｇ、０．０５ｍｏｌ）およびＲ₇−ブロマイド（１４．１ｇ、０．０６ｍｏｌ）をＤＭＦ（２００ｍｌ）に溶解し、その混合物を、５０℃で、５時間温めた。その反応が完結した後、この混合物を濾過し、そしてＥＡで希釈し、そしてブラインで洗浄した（３回）。その粗生成物をクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝４／１）で精製した。

（３）［Ｎ−Ｒ₇−Ｎ’−メトキシカルボニル−ヒドラジノ］−酢酸

アルキル化エチルエステル（９．５ｇ、０．０３ｍｏｌ）をＴＨＦ／水（１／１、ｍｌ）に溶解し、そして０℃で、２Ｎ ＮａＯＨ（２８．３ｍｌ）溶液を加えた。その混合物を、室温で、２時間攪拌した。出発物質のエステルがＵＶで検出されなくなった後、この溶液をＥＡで希釈し、次いで、分離した。水層を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ３〜４まで酸性化し、化合物をＤＣＭで抽出した（３回）。合わせた有機層をＭｇＳＯ₄で乾燥し、そして蒸発させて、黄色固形物を得た。

（実施例１）

（１）Ｎ^β−Ｍｏｃ−Ｎ^α−ベンジル−ヒドラジノグリシンの製造：

この化合物は、文献手順に従って製造した。（Ｃｈｅｇｕｉｌｌａｕｍｅら、Ｓｙｎｌｅｔｔ ２０００，３，３３１）。

（２）１−メトキシカルボニル−２，８−ジベンジル−６−メチル−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジンの製造
ブロモアセタール樹脂（６０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびベンジルアミンのＤＭＳＯ（２．５ｍＬ、２Ｍ）溶液を、ネジキャップ付きバイアルに入れた。その反応混合物を、回転オーブン［Ｒｏｂｂｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を使用して、６０℃で、１２時間振盪した。その樹脂を濾過により集め、そしてＤＭＦで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄して、第１成分片を得た。

この樹脂に、Ｆｍｏｃ−アラニン（４当量、市販されている、第２成分片）、ＨＡＴＵ［ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ］（４当量）およびＤＩＥＡ（４当量）のＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）溶液を加えた。その反応混合物を、室温で、４時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで洗浄した。

この樹脂に、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを加えた。この反応混合物を、室温で、８分間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで洗浄した。

前記で製造した樹脂に、Ｎ^β−Ｍｏｃ−Ｎ^α−ベンジル−ヒドラジノグリシン（４当量、製造実施例２の化合物（３）、ここで、Ｒ₇はベンジル、第三成分片）、ＨＯＢＴ［Ａｄｖａｎｃｅｄ ｈｅｍＴｅｃｈ］（４当量）およびＤＩＣ（４当量）のＤＭＦ溶液を加えた。その反応混合物を、室温で、３時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＭｅＯＨで洗浄した。この樹脂を、室温で、減圧下にて乾燥した。

この樹脂を、室温で、１８時間にわたって、ギ酸（２．５ｍｌ）で処理した。この樹脂を濾過で除去した後、その濾液を減圧下にて濃縮して、オイルとして、生成物を得た。

（実施例２）

（１）Ｎ’−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−ヒドラジノカルボニルクロライドの製造

ＣＨ₂Ｃｌ₂（１５ｍｌ）中のＮ−メチルヒドラジンカルボン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（１０７ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）とＮａＨＣＯ₃飽和水溶液１５ｍｌとの氷冷二相混合物を、単一部分としてトルエン（１．０３ｍｌ、２ｍｍｏｌ）中の１．９３Ｍのホスゲンを加えつつ、迅速に攪拌した。この反応混合物を３０分間攪拌し、その有機相を集め、その水相をＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ₄で乾燥し、濾過し、そして減圧下にて濃縮して、泡沫状固形物として、カルバモイルクロライド１２８ｍｇ（９７％）を得た。［注意：ホスゲン蒸気は、非常に毒性である。フード内で使用すべし］。この生成物を、さらに精製することなく、以下の固相合成で使用した。

（２）２，５−ジメチル−７−ベンジル−３，６−ジオキソ−ヘキサヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，５−ａ］ピラジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造
ブロモアセタール樹脂（３０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびベンジルアミンのＤＭＳＯ（１．５ｍＬ、２Ｍ）溶液を、ネジキャップ付きバイアルに入れた。その反応混合物を、回転オーブン［Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を使用して、６０℃で、１２時間振盪した。その樹脂を濾過により集め、そしてＤＭＦで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄して、第１成分片を得た。

この樹脂に、Ｆｍｏｃ−アラニン（３当量、市販されている、第２成分片）、ＨＡＴＵ［ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ］（３当量）およびＤＩＥＡ（３当量）のＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）溶液を加えた。その反応混合物を、室温で、４時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで洗浄した。このようにして、第２成分片を第１成分片に加えた。

この樹脂に、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを加えた。この反応混合物を、室温で、８分間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで洗浄した。

前記で製造した樹脂に、前記工程（１）で得たＮ’−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−ヒドラジノカルボニルクロライド（５当量、複合第３および第４成分片）、ＤＩＥＡ（５当量）のＤＣＭ溶液を加えた。その反応混合物を、室温で、４時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで洗浄した。

この樹脂に、ＤＭＦ（樹脂１ｇに対して１０ｍｌ）中の２０％ピペリジンを加えた。この反応混合物を、室温で、８分間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで洗浄した。

この樹脂を、室温で、４時間にわたって、ＤＣＭ中のイソシアン酸ベンジル（４当量）およびＤＩＥＡ（４当量）の混合物で処理した。次いで、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＭｅＯＨで洗浄した。この樹脂を、室温で、減圧下にて乾燥した。

この樹脂を、室温で、１４時間にわたって、ギ酸で処理した。この樹脂を濾過で除去した後、その濾液を減圧下にて濃縮して、オイルとして、生成物を得た。

実施例３
（２，５，７−トリメチル−３，６−ジオキソ−ヘキサヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，５−ａ］ピラジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造）
ブロモアセタール樹脂を、ベンジルアミン溶液の代わりにメチルアミン溶液と反応させることを除いては、実施例２と同じ手順に従って、表題化合物を製造する。

実施例４
（２−メチル−５−（ｐ−ヒドロキシフェニルメチル）−７−ナフチルメチル−３，６−ジオキソ−ヘキサヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，５−ａ］ピラジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造）
ブロモアセタール樹脂（３０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびナフチルメチルアミンのＤＭＳＯ（１．５ｍＬ、２Ｍ）溶液を、ネジキャップ付きバイアルに入れた。その反応混合物を、回転オーブン［Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を使用して、６０℃で、１２時間振盪した。その樹脂を濾過により集め、そしてＤＭＦで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄して、第１成分片を得た。

この樹脂に、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ（３当量）、ＨＡＴＵ［ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ］（３当量）およびＤＩＥＡ（３当量）のＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）溶液を加えた。その反応混合物を、室温で、４時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで洗浄した。このようにして、第２成分片を第１成分片に加えた。

この樹脂に、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを加えた。この反応混合物を、室温で、８分間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで洗浄した。

前記で製造した樹脂に、Ｎ’−Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチル−ヒドラジノカルボニルクロライド（５当量）、ＤＩＥＡ（５当量）のＤＣＭ溶液を加えた。その反応混合物を、室温で、４時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで洗浄した。

この樹脂に、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン（樹脂１ｇに対して１０ｍｌ）を加えた。この反応混合物を、室温で、８分間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで洗浄した。

この樹脂を、室温で、４時間にわたって、ＤＣＭ中のイソシアン酸ベンジル（４当量）およびＤＩＥＡ（４当量）の混合物で処理した。次いで、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＭｅＯＨで洗浄した。この樹脂を、室温で、減圧下にて乾燥した。

この樹脂を、室温で、１４時間にわたって、ギ酸で処理した。この樹脂を濾過で除去した後、その濾液を減圧下にて濃縮して、オイルとして、生成物を得た。

実施例５
（２−メチル−６−（ｐ−ヒドロキシフェニルメチル）−８−ナフチル−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミドの製造）
ブロモアセタール樹脂（６０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ／ｇ）およびナフチルアミンのＤＭＳＯ（２．５ｍＬ、２Ｍ）溶液を、ネジキャップ付きバイアルに入れた。その反応混合物を、回転オーブン［Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を使用して、６０℃で、１２時間振盪した。その樹脂を濾過により集め、そしてＤＭＦで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。

この樹脂に、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ（４当量）、ＨＡＴＵ［ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ］（４当量）およびＤＩＥＡ（４当量）のＮＭＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）溶液を加えた。その反応混合物を、室温で、４時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで洗浄した。

この樹脂に、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを加えた。この反応混合物を、室温で、８分間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで洗浄した。

前記で製造した樹脂に、Ｎ^β−Ｆｍｏｃ−Ｎ^α−ベンジル−ヒドラジノグリシン（４当量）、ＨＯＢＴ［Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ］（４当量）およびＤＩＣ（４当量）のＤＭＦ溶液を加えた。その反応混合物を、室温で、３時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦで洗浄し、次いで、ＤＣＭで洗浄した。この樹脂に、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン（樹脂１ｇに対して１０ｍｌ）を加えた。この反応混合物を、室温で、８分間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＤＭＦで洗浄した。

この樹脂を、室温で、４時間にわたって、ＤＣＭ中のイソシアン酸ベンジル（４当量）およびＤＩＥＡ（４当量）の混合物で処理した。次いで、その樹脂を濾過により集め、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、次いで、ＭｅＯＨで洗浄した。この樹脂を、減圧下にて、室温で、乾燥し、その樹脂を、室温で、１８時間にわたって、ギ酸（２．５ｍｌ）で処理した。この樹脂を濾過で除去した後、その濾液を減圧下にて濃縮して、オイルとして、生成物を得た。

実施例６
ＳＷ４８０細胞に対するＩＣ₅₀の測定およびその細胞株での細胞毒性試験についてバイオアッセイ
この実施例で用いた試験化合物（化合物Ａ）は、実施例４で調製した。

ａ．（レポーター遺伝子アッセイ）
ＳＷ４８０細胞を、スーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）（商標）トランスフェクト試薬（Ｑｉａｇｅｎ，３０１３０７）を使って、トランスフェクトした。トランスフェクトの前日に、細胞を簡単にトリプシン処理し、そしてトランスフェクトの日に５０〜８０％集密になるように、６ウェルプレート（５×１０⁵個の細胞／ウェル）にプレートした。

４マイクログラム（ＴＯＰＦｌａｓｈ）および１マイクログラム（ｐＲＬ−ｎｕｌｌ）のＤＮＡを、無血清培地１５０μｌで希釈し、スーパーフェクト（商標）トランスフェクト試薬３０μｌを加えた。このＤＮＡ−スーパーフェクト混合物を、室温で、１５分間インキュベートし、次いで、さらに３時間のインキュベーション中にて、この複合体に、１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ（１ｍｌ）を加えた。複合体が形成した一方、細胞を抗体なしでＰＢＳで２回洗浄した。

このＤＮＡ−スーパーフェクト（商標）トランスフェクト試薬の複合体を細胞に適用した後、３７℃で、５％ＣＯ₂で、３時間インキュベートした。インキュベーション後、１０％ＦＢＳを有する回収培地を加えて、最終容量を１．１８ｍｌにした。３時間のインキュベーション後、これらの細胞を収集し、そして９６ウェルプレート（３×１０⁴個の細胞／ウェル）に再び播種した。３７℃で、５％ＣＯ₂で、一晩インキュベーションした後、これらの細胞を、２４時間にわたって、試験化合物Ａで処理した。最後に、その活性をルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｅ１９６０）で検査した。

図３は、ＳＷ４８０細胞に対する上記化合物ＡのＩＣ₅₀の測定結果を図示している。

ｂ．スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ
以下で列挙した細胞に対する上記化合物Ａの成長阻害効果を、スルホローダミンＢアッセイにより測定した。９６ウェルプレートの各ウェルに、１００μｌの培地中のＳＷ４８０細胞をプレートし、そして２４時間付着させた。これらのウェルに化合物Ａを加えて、所望の最終濃度にし、それらのプレートを、３７℃で、４８時間インキュベートした。次いで、各ウェルに冷（４℃）１０％トリクロロ酢酸１００μｌを穏やかに加えることにより、これらの細胞を固定し、続いて、４℃で、１時間インキュベートした。プレートを脱イオン水で５回洗浄し、そして風乾した。次いで、１５分間にわたって、ウェルに、ＳＲＢ溶液（１％酢酸（ｖ／ｖ）中で０．４％のＳＲＢ（ｗ／ｖ））１００μｌを加えることにより、これらの細胞を染色した。染色後、これらのプレートを、１％酢酸で５回、素早く洗浄して、未結合染料を除去し、そして風乾させた。結合した染料を、これらのプレートを読み取る前に、１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ塩基（ｐＨ１０．５）で可溶化した。モレキュラーデバイスを使って、５１５ｎｍの波長で、プレート読み取り装置にて、その光学密度（ＯＤ）を読み取った。成長の阻害は、相対生存度（対照の％）で示し、そしてＧＩ₅₀は、ログ／プロビット変換後の濃度応答曲線から計算した。

表６は、実施例４で得た化合物Ａのインビトロ細胞毒性（ＳＲＢ）アッセイデータを示す。表６の数値は、μｇ／ｍｌである。

実施例７
Ｍｉｎマウスモデル
本発明の選択された化合物（化合物Ｂおよび化合物Ｃ）は、これらの抗癌剤として効能を評価するために、Ｍｉｎマウスモデルにおいて評価した。

Ｍｉｎマウスモデルは、これらの種類の効能を試験するために、広く用いられるモデルである。様々な処理後、これらのマウスの小腸と結腸に形成されるポリープの数を測定した（表７）。データは、両化合物共に約３００ｍｐｋで投与される場合、ビヒクルのみで処理したコントロールマウスに比べてｍｉｎマウスにおいてポリープの数が減少したことを示す。

実施例８
プレセニリン−１変異に起因する神経細胞分化におけるＣＢＰ／β−カテニン相互作用救助欠陥の化学遺伝子の抑制
下記化合物（化合物Ｄ）が、この実施例において使用された：

材料および方法
プラスミド．ＴＯＰＦＬＡＳＨおよびＦＯＰＦＬＡＳＨレポーター構築物を、ＤＨ５α適格細胞に、標準プロトコルによって形質転換した。トランスフェクションアッセイに用いられたプラスミドは、ＥｎｏｄＦｒｅｅ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて分離および精製した。

ＰＣ−１２細胞培養。ＰＣ−１２細胞は、１０％ウマ血清、５％ウシ胎仔血清、４．５ｇ／Ｌブドウ糖、２ｍＭＬ−グルタミン、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１０μｇ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンが加えられたＲＰＭＩ１６４０において維持された。

細胞分化．細胞培養皿は、一晩中、０．２５ｍｇ／ｍｌコラーゲン（Ｃｏｈｅｎｓｉｏｎ，ＣＡ）、１０μｇ／ｍｌポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および１２μｇ／ｍｌのポリエチレンアミン（ＩＣＮ，Ｌａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）でプレコートした。細胞は、コートされた皿において１５，０００細胞／ｃｍ²で培養され、５０ｎｇ／ｍｌの神経成長因子（ＮＧＦ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む、減少した血清（１％ウシ胎仔血清）の培地において、１０日間インキュベートして、神経様表現型に分化した。ＮＧＦを含む培地は、２〜３日毎に交換した。

化合物Ｄによる処置．β−カテニン／ＣＢＰ相互作用の小分子抑制剤である化合物Ｄを、ＤＭＳＯにストック濃度１００ｍＭで溶解した。分化したＰＣ−１２／Ｌ２８６Ｖ細胞は、４時間の間、この化合物の増加する濃度で処置した。この処置期後、トランスフェクションが開始された。細胞分化実験のために、化合物Ｄが全体分化時期を通じてＮＧＦと共に１０μＭの濃度で加えられた。

トランスフェクション。ＰＣ−１２細胞は、６０−ｍｍ皿で培養して分化した。１０日間の分化期末に、細胞は６０−ｍｍ皿当たり２μｇのレポーター構築物であるＴＯＰＦＬＡＳＨおよびＦＯＰＦＬＡＳＨで遺伝子導入された。トランスフェクションは、スーパーフェクト（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてメーカの指示に従って行われた。

ルシフェラーゼ分析．トランスフェクションの６時間後、１００μｌの細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で細胞を溶解し、微小遠心管に掻き入れた。その後、管を１２０００ｒｐｍで暫く（約１０秒間）遠心分離して、細胞残屑のペレットが得られた。ルシフェラーゼ活性は、２０μｌの細胞溶解物および１００μｌのルシフェラーゼ定量法（Ｐｒｏｍｅｇａ）からの基質について測定した。ルシフェラーゼ活性は、Ｐａｃｋａｒｄ ＬｕｍｉＣｏｕｎｔ．（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて測定した。ルシフェラーゼの定量は、３重に行われ、少なくとも３回の独立した実験で繰り返された。

免疫蛍光検査．細胞を、１０，０００細胞／ｃｍ²の密度で、６−ウエル培養皿中の滅菌コートされた２２×２２ｍｍカバースリップにプレートした。上述したように、１０日間の分化が開始された。分化した細胞は、その後−２０℃で１５分間メタノールで固定された。続けて、これをＰＢＳ＋０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１５分間インキュベートした。カバースリップを、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２受容体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＧａｐ−４３（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）に対する抗体と共に、３７℃で４０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で連続洗浄した後、ＦＩＴＣに共役した二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を適用した。全てのスライドイメージが、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ６００直立顕微鏡に装着されたＮｉｋｏｎ ＰＣＭ２０００レーザ走査共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用して得られた。

神経突起伸長の定量．細胞計数を、６つの無作為に選択された顕微鏡視野（１０ｘ）で行った。それぞれの視野において、細胞の総数のみならず、細胞体の長さよりも２倍大きい神経突起を見せる細胞が測定された。そのような伸長の細胞数は、細胞の全数の割合として表した。数値は、３つの独立した実験からの重複から得られたものである。

ＲＴ−ＰＣＲ。ＥｐｈｒｉｎＢ２（ＥｐｈＢ２）受容体に対するｍＲＮＡレベルを分析するために、総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．ＭＤ）を用いて分化した細胞から分離した。２μｇ ＲＮＡが、任意の６量体（５０ｎｇ）を有する全容積２０μｌ中において、スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）II逆転写システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−ＧＩＢＣ
Ｏ−ＢＲＬ）を用いて、メーカの指示に従い逆転写された。ＰＣＲを、５μｌ ｃＤＮＡ、１００ｐｍｏｌのプライマー、１００μＭ ｄＮＴＰｓ、１Ｘ Ｔａｑ 緩衝液、および１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を有する５０μｌ容積中で行った。反応混合物は、８０℃で１０分間加熱し、その後、Ｔａｑを入れた。ｃＤＮＡｓを、２５（ＥｐｈＢ２受容体）または１５（ＧＡＰＤＨ）サイクル間増幅した。増幅の１回転は、９４℃で１分で構成され、６０℃で２分、および７２℃で２分からなり、最終延長時間は、７２℃で１０分である。ＰＣＲ生産物は、２％ゲルで臭化エチジウムによって染色され、電気泳動で分析されて目に見えるようにした。ＥｐｈＢ２受容体のＰＣＲプライマーは、５’−ＣＡＣＴＡＣＴＧＧＡＣＣＧＣＡＣＧＡＴＡＣ−３’および５’−ｔｃｔａｃｃｇａｃｔｇｇａｔｃｔｇｇｔｔｃａ−３’を用いた。ＧＡＰＤＨのためのプライマー対は、５’−ＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＴＧＴＣＧＴＧＧＡ−３’および５’−ＡＣＡＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴ−３’であった。

結果
ラットＰＣ−１２細胞は、神経堤系統に由来し、神経成長因子（ＮＧＦ）処置で神経突起を有する交感神経様神経細胞に分化を被る（Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｔｉｓｃｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７３，２４２４（１９７６））。ＰＣ−１２細胞基盤モデルを用いて、早期発症のＦＡＤ関連ＰＣ−１変異であるＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖの、ＴＣＦ／β−カテニンに媒介された転写および神経分化に対する影響が特徴づけられた。ＴＣＦ／β−カテニン／ＣＢＰで媒介される転写を特定的にブロッキングすると、神経分化におけるＰＳ−１によって誘導された欠陥が軽減することが証明された。

野生型ＰＳ−１（ＰＳ−１／ＷＴ）または変異ＰＳ−１（ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ）のうちどちらか一方を安定的に過剰発現させるＰＣ−１２細胞およびベクターのみをトランスフェクトさせたコントロール細胞株（Ｇｕｏら，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，８，３７９（１９９６））が、コラーゲン、ポリ−Ｌ−リジンおよびポリエチレンアミンをコートした皿にプレートされた。５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを１０日間処理することにより、分化が誘導された。過剰発現されるＰＳ−１／ＷＴ細胞またはベクターがトランスフェクトされた細胞は、広範囲な軸索形成を示すのに対して（ＡＴＣＣからのＰＣ−１２細胞クローンと類似している）、ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異細胞は、ただ、短くて太い軸索形成のみを示した（図４Ａ−Ｃ）。しかも、ベクターがトランスフェクトされたＰＣ−１２コントロールおよびＰＳ−１／ＷＴ細胞は、神経分化マーカーＧＡＰ−４３の広範囲な発現を示すのに対して（Ｇｏｒｇｅｌｓら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．８３，５９（１９８７））（図４のＤ、Ｅ）、ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ細胞は本質的にこのマーカーがなかった（図４のＦ）。

ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異の、標準的なＷｎｔ／β−カテニンシグナルに対する効果を評価するために、我々は、ＮＧＦ処理されたＰＣ−１２細胞を、ＴＯＰＦｌａｓｈ、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナルレポーター構築物で一時的にトランスフェクトさせた（Ｍｏｒｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５，１７８７（１９９７））。図４のＦに示すように、過剰発現されるＰＳ−１／ＷＴ細胞は、ベクターコントロール細胞と比べて、同じ水準のＴＣＦ／β−カテニンシグナルを有する。しかしながら、ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異細胞は、ＴＯＰＦｌａｓｈの発現が顕著に（１０倍）増加することを示した。対照的に、負の制御レポーター構築物であるＦＯＰＦｌａｓｈは有意な差を示さなかった。

ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異細胞中の調節が困難なＴＣＦ／β−カテニンシグナルが、分化の欠陥および神経突起伸長の原因であると仮定された。この仮定を試験するために、ＴＣＦ／β−カテニンシグナルの特定の小分子抑制剤である化合物Ｄを用いた（Ｅｍａｍｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，ｉｎ ｐｒｅｓｓ）。この小分子は、選択的に、β−カテニン／ＣＢＰ相互作用を妨害するものの、β−カテニン／ｐ３００の相互作用は妨げず、ＴＣＦ／β−カテニン転写のサブセットを遮断する。ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異細胞を１０μＭの化合物ＤおよびＮＧＦで処理すると、ＴＣＦ／β−カテニンレポーター遺伝子転写が減少し、過剰発現されるＰＳ−１／ＷＴ細胞で見られるように（図５Ａ、Ｂ）、未処理の細胞と比べて（図４Ｃ）、本質的に正常である神経突起伸長および分化を導いた（図５Ａ）。また、化合物Ｄで処理したＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異は、ＰＳ−１／ＷＴおよびベクターがトランスフェクトされた細胞に着色されたものと同様の強度のＧＡＰ−４３を示した（図４Ｂ）。化合物Ｄが処理された変異細胞が、ベクターコントロールまたはＰＳ−１／ＷＴ細胞のと同様の神経突起を示すことを証明するために、細胞体の長さの二倍より大きい神経突起を有する細胞数を数えた。化合物Ｄで処理すると、神経突起を有する細胞の百分率を、ベクターがトランスフェクトされたものおよび過剰発現されるＰＳ−１／ＷＴ細胞のものと同様な水準に実質的に増加させる（図５Ｃ）。ＴＣＦ／β−カテニン／ＣＢＰによって媒介される転写を妨げると、ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異体に起因する神経突起伸長および神経分化での多くの表現型の欠陥を修正させるという結論が得られた。

Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２受容体（ＥｐｈＢ２）は、シナプス形成に関係しており（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２，１５５（２００１））、Ｅｐｈｒｉｎ Ａファミリーは、最近になって、海馬状隆起樹状突起棘形態学で役割を果たすことが明らかになった（Ｍｕｒａｉら，Ｎａｔ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６，１５３（２００３））。集中したＥｐｈＢ２発現が観察されたが、これは、ベクターおよびＰＳ−１／ＷＴがトランスフェクトされた細胞において神経プロセスと共に位置決めされたのに対して（図６Ａ、Ｂ）、ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異細胞は、非常に弱くて拡散したＥｐｈＢ２シグナルを示した（図６Ｃ）。ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異細胞における増加されたＴＣＦ／β−カテニンシグナルは、ＲＴ−ＰＣＲに示すように、それ自身が減少したＥｐｈＢ２発現を示した（図６Ｅ、レーン３）。また、１０μｍの化合物Ｄの添加は、これらの細胞においてＥｐｈＢ２発現のみならず（図６Ｄ）、ＥｐｈＢ２メッセージの増加をもたらした（図６Ｅ、レーン４）。これらの結果は、Ｂａｔｌｌｅらによるデータと一致しており（Ｂａｔｌｌｅら，Ｃｅｌｌ １１１，２５１（２００２））、彼らは、最近、ＥｐｈＢ２／ＥｐｈＢ３受容体およびこれらのリガンドＥｐｈｒｉｎ Ｂ１の発現が、結腸陰窩中で、ＴＣＦ／β−カテニン転写を通じて逆に調整されることと、適切な調節が、適切な細胞増殖、分化、分類において重要であることを明らかにした。我々は、ＰＳ−１／Ｌ２８６Ｖ変異が増加したＴＣＦ／β−カテニンシグナルを通じて、ＥｐｈＢ２受容体の発現を減少させ、これは、化合物Ｄで媒介されるβ−カテニン／ＣＢＰ相互作用の阻害によって修正されることに関する証拠を提示する。

実施例９
化合物Ｄは、Ｇ１／Ｓ段階停止を引き起こし、カスパーゼ活性を活性化させる
フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）
ＦＡＣＳ分析のために、大体、５×１０⁶の化合物Ｄで処理された細胞またはベクター処理された細胞が、７０％冷却されたエタノールによって固定され、最小限３０分間−２０℃で保管した。細胞は、１Ｘ ＰＢＳで一回洗浄し、プロピジウムヨウ化物（ＰＩ）溶液（８５μｇ／ｍｌプロピジウムヨウ化物、０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０，１０ｍｇ／ｍｌ ＲＮＡｓｅ）と一緒に室温で３０分間インキュベートした。各サンプルにおいて、１０，０００個の染色された細胞を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＥＰＩＣＳ ＸＬ−ＭＣＬフローサイトメトリーを用いて得ており、細胞サイクルの別の段階にある細胞の百分率は、Ｅｘｐｏ３２ＡＤＣソフトウェア（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉａｍｉ，Ｆｌｏｒｉｄａ，３３１９６）によって決定された。

カスパーゼ３活性アッセイ
ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６、およびＣＣＤ１８Ｃｏ細胞が、ウエル当たり１０⁵細胞（９６ウエルプレート）で処理前、２４時間の間プレートされた。各ウエルに、２５μＭの化合物Ｄまたはコントロール（０．５％ＤＭＳＯ）が加えられた。処理後、２４時間で細胞は溶解され、カスパーゼ−３／７活性キット（Ａｐｏ−Ｏｎｅ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｃａｓｐａｓｅ−３／７ ａｓｓａｙ，＃Ｇ７７９０５，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてカスパーゼ活性を測定した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）は、実験測定値からブランク（コントロール、細胞なし）の単位価を引いて得られた。

化合物Ｄは、Ｇ₁／Ｓ段階停止を引き起こし、カスパーゼ活性を活性化させる
サイクリンＤ１遺伝子の発現の阻害は、細胞サイクルのＧ₁／Ｓ段階での停止を引き起こすことが明らかとなっている（Ｓｈｉｎｔａｎｉら，「唾液腺の腺様嚢胞癌におけるＲＢ経路（Ｒｂ−ｐ１６ＩＮＫ４Ａ−ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１）の稀な変更」、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０：２１６９〜７５（２０００））。ＨＣＴ１１６（図７Ａ、上パネル）およびＳＷ４８０（図７Ａ、下パネル）細胞は、２４時間の間、化合物Ｄ（２５μＭ）（図７Ａ、右）またはコントロール（０．５％ＤＭＳＯ）（図７Ｂ、左）で処理された。細胞は、次いで、プロピジウムヨウ化物（ＰＩ）で染色され、ＦＡＣＳ細胞蛍光計数器でＤＮＡ含量を分析した。予想通り、コントロール細胞（図７Ａ、左）は、正常にサイクリングするのに対して、化合物Ｄで処理された細胞（図７Ａ、右）は、細胞周期のＧ₁／Ｓ段階での蓄積が増加することが示された。そこで、化合物Ｄが、Ｇ₁段階で細胞を停止させたと言える。

カスパーゼは、システインプロテアーゼであり、一般に、アポトーシスの刺激によって誘発される細胞の一定の集団内で活性化する。ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６、および野生型のコロニー細胞（ＣＣＤ１８Ｃｏ細胞）におけるアポトーシス誘起を評価するために、細胞を化合物Ｄ（２５μＭ）またはコントロール（０．５％ＤＭＳＯ）のどちらか一方を２４時間の間処理し、次いで、カスパーゼ−３／７活性を分析した。

図７Ｂに示すように、化合物Ｄは、ＣＣＤ１８Ｃｏ細胞と比べて、ＳＷ４８０およびＨＣＴ１１６細胞におけるカスパーゼ−３／７経路を特定的かつ顕著に活性化させる。

実施例１０
化合物Ｄは、形質転換した直腸結腸細胞の増殖を減少させる
軟寒天アッセイ
軟寒天コロニー形成アッセイを、ＳＷ４８０細胞で前述された手続き（Ｍｏｏｄｙら，「血管活性腸管ペプチド拮抗薬は、非小細胞肺癌細胞の成長を阻害する」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：４３４５〜４９（１９９３））を少し変形して実施した。

６ウエルプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｓｋｉｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の各ウエル（３５ｍｍ）は、ウシ胎仔血清１０％を含有するＤＭＥＭ培地中の０．８％ボトム寒天１ｍｌでコートされた。これが、固化した後、各ウエルに、０．４％のトップ寒天、１０％のウシ胎仔血清、２倍濃縮された化合物、および５，０００個の単一生存細胞を含有するＤＭＥＭ培地１ｍｌを加えた。前記培養は、３７℃で、湿気のある５％ＣＯ₂中でインキュベートした。軟寒天でのコロニーは、毎日モニターし、８日間のインキュベーション後に写真を撮った。６０μｍ径を超えるコロニーの数を数えた。

化合物Ｄは、形質転換した直腸結腸細胞の増殖を減少させる
軟寒天コロニー形成アッセイを、化合物Ｄ（０．２５−５μＭ）および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（０．５−３２μＭ）で処理されたＳＷ４８０細胞を用いて行った。図８Ａに示すように、化合物Ｄはコロニー形成数において、投与量に相関関係があることが認められる。化合物Ｄおよび５−ＦＵのＩＣ₅₀値は、それぞれ０．８７±０．１１μＭおよび１．９８±０．１７μＭであった。このため、化合物Ｄは、カスパーゼ活性を増加させており、β−カテニンシグナルを活性化させる変異によって形質転換した直腸結腸細胞のインビトロ増殖を減少させた。

実施例１１
化合物Ｃは、ヌードマウスモデルにおける腫瘍成長を減少させる
ＳＷ６２０細胞（９×１０⁶細胞／マウス）を０日目にヌードマウスの皮下に移植した。マウスに１日目から化合物Ｃを一日おきに３００ｍｇ／ｋｇずつ４回腹腔内注射した後、２１日目まで一日おきに２００ｍｇ／ｋｇずつ腹腔内注射した。化合物Ｃは、ベクターコントロールマウスと比べて、処理されたマウスで腫瘍成長を減少させ（図９Ａ）、ベクター対照マウスと比べて、処理されたマウスの体重を少し減少させた（図９Ｂ）。

実施例１２
化合物Ｄは、スルビビン発現を阻害する
化合物Ｄのスルビビン発現に対する効果は、転写および翻訳レベルで研究された。転写レベルで用いられた方法には、ｃＤＮＡ微小配列分析、ＲＴ−ＰＣＲ、スルビビン・レポーター活性のアッセイ、およびクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を含む。翻訳レベルで用いられた方法には、ウエスタンブロット分析、免疫化学を含む。

スルビビンプロモータの制御下にあるルシフェラーゼを含むプラスミドが構成されて、野生型、ＣＢＰ＋／−、またはｐ３００＋／−３Ｔ３細胞へトランスフェクトされた。その結果である図１０は、Ｗｎｔ１が３種類の細胞の全てにおいてスルビビン遺伝子の発現を刺激することを示すのに対して、化合物Ｄは、スルビビン遺伝子の発現を縮小させ、これらの細胞でのＷｎｔ１によるスルビビン遺伝子発現の刺激を減少させることを示している。同様に、化合物Ｄおよびその類似体（化合物Ａ）は、ＳＷ４８０細胞のスルビビン発現を阻害することを示した（図１１）。

リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）分析を、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＳＴ）に備えられたプロトコルによって行った。ＲＴ−ＰＣＲ反応のための全てのＲＮＡ鋳型を、化合物Ｄ（２５μＭ）またはコントロール（０．５％ＤＭＳＯ）で処理した細胞から、処理２４時間後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。ＲＴ−ＰＣＲ反応に用いられたプライマーは、５’−ＡＧＣＣＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣ−３’および５’−ＧＣＡＣＴＴＴＣＴＴＣＧＣＡＧＴＴＴＣＣ−３’である。表８は、分析の結果を示す。０．５未満の比率は、化合物Ｄの処理による遺伝子発現の有意な減少を示すのに対して、１．５以上の比率は、遺伝子発現の有意な増加を示す。約１の比率は、変化なしを意味する。表８および図１２に示すように、スルビビン遺伝子の発現は、コントロールと比べて化合物Ｄの存在下で著しく減少した。

化合物Ｄ（２５μＭ）または対照体（０．５％ＤＭＳＯ）で処理されたＳＷ４８０細胞に対するＣｈＩＰアッセイを行った。図１３に示すように、スルビビンプロモータは、コントロール処理細胞において、ＣＢＰ、β−カテニン、Ｔｃｆ４およびアセチル化ヒストンによって発生した。化合物Ｄによる処理は、これらの全ての蛋白質のスルビビンプロモータとの結合を減少させた。

翻訳レベルにおいて、スルビビン発現に対する化合物Ｄの効果を特徴づけるため、ビヒクル（０．５％ＤＭＳＯ）単独、１０μＭもしくは２５μＭの化合物Ｄ、または５μＭの５−Ｆｕで処理された細胞抽出物に対して、スルビビン６Ｅ４モノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、ウエスタンブロット分析を行った。その結果は（図１４Ａ）、化合物Ｄの両濃度の全て、および５−Ｆｕによる処理は、スルビビン蛋白質の量を減少させたことを示す。両濃度の化合物Ｄの処理は、５−Ｆｕと一緒に処理したよりも、さらに効率よくスルビビン発現を減少させ、化合物Ｄを高濃度（すなわち、２５μＭ）で処理することがさらに効果的であった。

化合物Ｄの翻訳レベルでのスルビビン発現に対する効果は、免疫蛍光顕微鏡検査法を用いてさらに調査された。化合物Ｄの不在下で、スルビビンは、有糸分裂紡錘体に位置しているが、これは、スルビビンが染色体分離に関係するという概念と一致する（図１４Ｂ）。このような発現パターンは、ＳＷ４８０細胞を化合物Ｄで処理した後、スルビビン蛋白質が殆どまたは全く探知されなかった（図１４Ｃ）。

実施例１３
様々な化合物のスルビビンおよびＴＣＦ４発現に対する効果
一般式（Ｉ）を有する様々な化合物のスルビビンおよびＴＣＦ４発現に対する効果が特徴づけられた。その結果を、表９に示す。

実施例１４
化合物Ｄは、スルビビン発現を阻害して、アポトーシスを促進する
化合物Ｄのアポトーシスに対する効果およびその効果におけるスルビビンの役割を決定するために、化合物Ｄまたはコントロールで処理された培養された腫瘍細胞中のカスパーゼ２および３の活性を測定した。その結果（図１５）は、（１）化合物Ｄ（２．５μＭまたは５．０μＭ）は、カスパーゼ３活性を活性化させるものの、カスパーゼ２の活性を活性化させてはいない；（２）スタウスポリン（０．５μＭ）は、カスパーゼ２および３の活性を両方増加させた；（３）スタウスポリンおよび化合物Ｄの共同処理は、カスパーゼ３の活性を共同作用して刺激したものの、カスパーゼ２の活性を共同作用として刺激してはいない；そして（４）スルビビン遺伝子でトランスフェクトさせた場合、スタウスポリンまたは化合物Ｄの処理によって誘導されたカスパーゼ３の活性化、およびスタウスポリンおよび化合物Ｄの共同処理によるカスパーゼ３の活性の共同作用刺激を減少させたことを示す。前記結果は、化合物Ｄがスルビビン遺伝子の発現を抑制することによって、カスパーゼ３の活性を刺激することを示唆する。

化合物Ｄのアポトーシスに対する効果およびその効果におけるスルビビンの役割を調べるために、スタウスポリン（０．５μＭ）、化合物Ｄ（５．０μＭ）、またはこれらの両方で処理された培養された腫瘍細胞の細胞死を測定した。その結果（図１６）は、化合物Ｄおよびスタウスポリン両方共に細胞死を促進させ、スルビビン遺伝子でトランスフェクトさせた場合、スタウスポリン、化合物Ｄ、または両方で処理によって誘導された細胞死の増加を減少させたことを示す。前記結果は、化合物Ｄが、スルビビン遺伝子の発現を抑制することによって、アポトーシスを促進することを示唆する。

化合物Ｄの細胞周期に対する効果およびその効果におけるスルビビンの役割を調べるために、スルビビン遺伝子を含む構成体でトランスフェクトされたもの、またはされなかった培養され、かつスタウスポリン（０．５μＭ）、化合物Ｄ（５．０μＭ）、またはこれらの両方で処理した腫瘍細胞に対して、ＦＣＡＳ分析を行った。その結果（図１７）は、化合物Ｄおよびスタウスポリンが共にＧ₀段階の細胞数を増加させ、細胞内でスルビビンの過剰発現は、スタウスポリン、化合物Ｄ、またはこれらの両方で処理した効果を減少させたことを示す。前記結果において、化合物Ｄが細胞周期に影響を及ぼすことは、少なくとも部分的にはスルビビン遺伝子の発現を抑制することによって行われるということを示唆する。

以上、本発明の特定の実施の形態について説明したが、本発明の要点および範囲を逸脱しない限り、様々な変形が可能である。従って、本発明は、添付した請求の範囲によってのみ制限されるものである。

米国特許出願第１０／０８７，４４３号（２００２年３月１日出願）、および米国特許出願第０９／９７６，４７０号（２００１年１０月１２日出願）を含めて、明細書および／または書誌事項に言及された前記全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国出願、外国特許出願、および非特許公開は、本明細書中で援用される。

本発明の特定な実施形態がここに説明目的で記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変形がなされてもよいことが、前述から理解できるであろう。したがって、本発明は、添付の請求の範囲を除いて限定されない。

図１は、本発明のリバースターンミメティックを調製する一般合成概略図である。 図２は、本発明のリバースターンミメティックを調製する一般合成概略図である。 図３は、ＳＷ４８０細胞について本発明の化合物ＡのＩＣ₅₀を測定したグラフである。 図４は、ＰＣ−１２細胞における神経突起伸長に関する図である。 図５は、ＰＣ−１２過剰発現変異ＰＳ−１／２８６Ｖ細胞における神経突起伸長に関する図である。 図６は、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２（ＥｐｈＢ２）受容体発現を示す図である。 図７は、化合物Ｄが、Ｇ₁の細胞を停止させることを示すグラフである。 図８は、化合物Ｄが、容量依存的な方法で軟寒天中のコロニー増殖を減少させることを示すグラフである。 図９は、化合物Ｃがヌードマウスモデルに当てる影響を示すグラフである。 図１０は、３Ｔ３細胞におけるスルビビンレポーター遺伝子に対するＷｎｔ１刺激を示すグラフである。 図１１は、化合物Ａおよび化合物ＤがＳＷ４８０細胞のスルビビンルシフェラーゼレポーターの活性に及ぼす影響を示すグラフである。 図１２は、化合物Ｄの処理がスルビビン遺伝子の発現程度を減少させることを示す図である。 図１３は、化合物Ｄが、スルビビンプロモータと様々な蛋白質との結合を減少させることを示す図である。 図１４は、化合物Ｄが、翻訳レベルでスルビビン発現を減少させることを示す図である。 図１５は、化合物Ｄが、スルビビン発現の阻害を通じて、カスパーゼ３活性を活性化することを示すグラフである。 図１６は、化合物Ｄが、スルビビン発現の阻害を通じて、細胞死を促進することを示すグラフである。 図１７は、化合物Ｄが、Ｇ₀段階の細胞数を増加させることを示すグラフである。

Claims (19)

1. 以下の一般式（Ｉ）を有する化合物。
   

   

   ここで、Ａは、−（ＣＨＲ₃）−または−（Ｃ＝Ｏ）−であり、
   Ｂは、−（ＣＨＲ₄）−であり、
   Ｄは、−（Ｃ＝Ｏ）−であり、
   Ｅは、−（ＺＲ₆）−であり、
   Ｇは、−（ＸＲ₇）−であり、
   Ｗは、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−であり、
   Ｘは、窒素であり、
   Ｚは、ＣＨであり、
   Ｒ₁は、２−プロピニル、ベンジル、または置換ベンジルであり（ここで、該ベンジル上の置換基は、独立して、パーフルオロＣ_1-4アルキルまたはハロゲンの１個またはそれ以上から選択される）；
   Ｒ₂は、ベンジル基；または１以上の置換基を有する置換ベンジル基（前記１以上の置換基は、アミノ、Ｃ_1-4アルキルアミノ、Ｃ_1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ_1-4アルキル、Ｃ_1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノおよびヒドロキシル基の１個またはそれ以上から独立して選択される）であり；
   Ｒ₃は、水素であり；
   Ｒ₄は、ベンジル基、または１以上の置換基を有する置換ベンジル基（前記１以上の置換基は、アミノ、Ｃ_1-4アルキルアミノ、Ｃ_1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ_1-4アルキル、Ｃ_1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノおよびヒドロキシル基の１個またはそれ以上から独立して選択される）であり；
   Ｒ₆は、水素であり；
   Ｒ₇は、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6アルケニルまたはＣ_1-6アルキニルである。
2. 化合物が、以下の一般式（ＶＩ）を有する請求項１に記載の化合物。
   

   

   ここで、Ｒ_aは、フェニル基、または１以上の置換基を有する置換フェニル基（前記１以上の置換基は、アミノ、Ｃ_1-4アルキルアミノ、Ｃ_1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ_1-4アルキル、Ｃ_1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノおよびヒドロキシル基の１個またはそれ以上から独立して選択される）であり；
   Ｒ_bは、フェニル基、または置換フェニル基（ここでベンジル上の置換基は、パーフルオロＣ_1-4アルキルまたはハロゲンの１個またはそれ以上から独立して選択される）であり；
   Ｒｃは、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6アルケニルまたはＣ_1-6アルキニルであり；
   Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃は、同一または異なっていてもよく、水素およびヒドロキシルから独立して選択される。
3. Ｒａが、フェニル基、または１以上の置換基を有する置換フェニル基（前記１以上の置換基は、アミノ、Ｃ_1-4アルキルアミノ、Ｃ_1-4ジアルキルアミノ、ハロゲン、パーフルオロＣ_1-4アルキル、Ｃ_1-3アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノおよびヒドロキシル基の１個またはそれ以上から独立して選択される）であり、
   Ｒｂが、フェニルである
   請求項２に記載の化合物。
4. Ｒｃが、メチル、アリルまたはプロピニルである請求項２または３に記載の化合物。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の安全有効量および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
6. 腫瘍の成長を阻害するための医薬組成物であって、前記組成物が、請求項５に記載の組成物。
7. 前記腫瘍が、癌性である請求項６に記載の組成物。
8. 記腫瘍が、直腸結腸癌である請求項６または７に記載の組成物。
9. 抗腫瘍薬をさらに含む請求項６〜８のいずれかに記載の組成物。
10. 前記抗腫瘍薬が、５−ＦＵ、タキソール、シスプラチン、マイトマイシンＣ、テガフール、ラルチトレキセド、カペシタビン、およびイリノテカンからなる群より選択される請求項９に記載の組成物。
11. スルビビン発現を阻害するための医薬組成物であって、請求項５に記載の組成物。
12. ＴＣＦ４発現を阻害するための医薬組成物であって、請求項５に記載の組成物。
13. 以下の式を有する化合物。
    

    
14. 請求項１３に記載の化合物の安全有効量および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
15. プレセニリン−１変異に起因する神経細胞分化におけるＣＢＰ／β−カテニン相互作用救助欠陥の化学遺伝子を抑制するための請求項１４に記載の組成物。
16. カスパーゼ活性を阻害するための請求項１４に記載の組成物。
17. 形質転換した直腸結腸細胞の増殖を抑制するための請求項１４に記載の組成物。
18. 哺乳類において腫瘍成長を減少させるための請求項１４に記載の組成物。
19. スルビビン発現を阻害するための医薬組成物であって、請求項１４に記載の組成物。

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