CN103221094B - Mdm2/4及p53相互作用抑制剂的结晶型 - Google Patents

Abstract

本发明涉及(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮的结晶型，其适用于治疗与p53或其变体与MDM2和/或MDM4或其变体之间的相互作用相关的疾病或失调。

Description

MDM2/4及P53相互作用抑制剂的结晶型

介绍

本发明涉及一种(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮硫酸盐的结晶型，其适用于治疗与p53或其变体分别与MDM2和/或MDM4或其变体之间的相互作用(尤其与MDM2和/或MDM4或其变体结合)相关的疾病或失调；一种制备该结晶型的方法；包含该结晶型的药物制剂；该结晶型于治疗疾病或失调(包括治疗和/或预防)的用途及其使用方法；和/或如下所述的相关主题内容。

p53指名称为TP53、p53、TP73、p73、TP63、TP73L、p63的所有基因和/或其所编码的蛋白质。MDM2指名称为MDM2、Mdm2、HDM2、Hdm2的所有基因和/或其所编码的蛋白质。MDM4指名称为MDM4、Mdm4、HDM4、Hdm4、MDMX、MdmX、HDMX、HdmX的所有基因和/或其所编码的蛋白质。

已知蛋白质p53为肿瘤抑制蛋白，其有助于控制细胞完整性并藉由启动(除其他响应以外)生长停滞或细胞凋亡(受控细胞死亡)，避免永久性损伤细胞的增殖。p53的介导作用在于其是可调节诸多调节(例如)细胞周期及细胞凋亡的基因的转录因子。因此，p53是重要的细胞周期抑制剂。此等活性受MDM2(p53肿瘤抑制剂的重要负调控剂)严格控制。“MDM2”(源自致癌基因“鼠双微粒体2”)系指该基因及由该基因所编码的蛋白质的名称。MDM2蛋白系用作识别p53肿瘤抑制剂的N末端转活化域(TAD)且因此介导p53的泛素依赖性降解的E3泛素连接酶，及p53转录活化的抑制剂。

最初自转化小鼠细胞系克隆编码MDM2蛋白的原始小鼠致癌基因。此蛋白的人类同源物随后被识别且有时亦被称为HDM2(表示“人双微粒体2”)。进一步支持MDM2作为致癌基因的作用，已显示若干人类肿瘤及增殖性疾病类型具有增加的MDM2浓度，该等类型尤其包括软组织肉瘤、骨癌(例如骨肉瘤)、乳腺瘤、膀胱癌、李佛美尼(Li-Fraumeni)综合征、脑肿瘤、横纹肌肉瘤及肾上腺皮质癌及类似者。属于MDM2家族的另一蛋白是MDM4(亦被称为MDMX)。

因此，可在诸多增殖性疾病中发现MDM2/p53比例的失调，此系由于(例如)受影响细胞中的突变、多态性或分子缺陷所致。MDM2由于其所述作用而可抑制肿瘤抑制蛋白p53的活性，因此导致p53的肿瘤抑制活性的损失且抑制阻止细胞失控增殖的调节机制。因此，可发生失控增殖，从而导致肿瘤、白血病或其他增殖性疾病。

本文所提及的MDM2/p53相互作用抑制包括本文的MDM2/p53相互作用和/或MDM4/p53相互作用，尤其系Hdm2/p53和/或Hdm4/p53相互作用。

需要一种(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮的结晶型，其可用于提供用于治疗与MDM2/p53相互作用相关的疾病或失调的药物组合物。

发明内容

已发现如本文所述的(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮硫酸盐的结晶型I相比于游离碱无定形，显著改善加工特性，并改善溶解性及稳定性。

具体实施方式

在一实施方式中，提供一种(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮硫酸盐的结晶型。具体说，该硫酸盐是硫酸氢盐。

在另一实施方式中，提供一种(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮硫酸氢盐的结晶型，其具有包括以下峰的粉末X射线衍射图(使用CuKα辐射)：18.8、21.3及22.7°2θ角(误差+/-0.2°)。

在另一实施方式中，本发明提供一种(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮硫酸氢盐的结晶型，其具有与本文图1或图2中所示的粉末X射线衍射图实质上相同的粉末X射线衍射图(使用CuKα辐射)。

在其他不同的实施方式中，本发明提供：

·如本文所定义的结晶型，其用作药物。

·如本文所定义的结晶型，其用于治疗由MDM2和/或MDM4的活性介导的失调或疾病。

·一种如本文所定义的结晶型在制备在个体中治疗由MDM2和/或MDM4的活性介导的失调或疾病的药物中的用途。

·一种药物组合物，其包含治疗上有效量的如本文所定义的结晶型及一或多种药学上可接受的载剂。

·一种调节个体的MDM2和/或MDM4活性的方法，其包括对个体给予治疗上有效量的如本文所定义的结晶型的步骤。

·一种治疗由MDM2和/或MDM4的活性介导的失调或疾病的方法，其包括对个体给予治疗上有效量的如本文所定义的结晶型的步骤。

·如本文所述的结晶型、用途或方法，其中该失调或疾病是增殖性失调或疾病。

·如本文所定义的结晶型，其是与一或多种治疗活性剂组合。

定义

已如上所述，MDM2(尤其当以MDM2或其变体述及时)一般是指名称为MDM2、Mdm2、HDM2、Hdm2的所有基因和/或其所编码的蛋白质、或其变体。MDM4(尤其当以MDM4或其变体述及时)是指名称为MDM4、Mdm4、HDM4、Hdm4、MDMX、MdmX、HDMX、HdmX的所有基因和/或其所编码的蛋白质、或其变体。

具体说，MDM2是指如EMBOJ.10,1565-9,Fakharzadeh等人，1991中所述的MDM2，其变体是指在以下所述的分析系统中仍与p53结合的其变体(例如，由于一或多个(例如，1至430个)氨基酸的缺失、插入和/或交换所产生的剪接变体、同种型、片段、突变体或致癌基因)，其相当于最初所述的较佳至少具有0.5%，更佳至少具有5%、10%、20%、30%、40%或尤其是50%或更多的MDM2对p53的亲和力的全长蛋白质，且与最初所述或以下具体所述的MDM2或HDM2具有至少20%，更佳至少25%的序列相同性。在未另外提及之处，MDM2一般是指如刚才所分别定义的MDM2、Mdm2、HDM2或Hdm2、或其变体。

具体说，MDM4是指如Genomics43,34-42,Shvarts等人，1997中所述的MDM4，其变体是指在以下所述的分析系统中仍与p53结合的其变体(例如，变体由于一或多个(例如，1至430个)氨基酸的缺失、插入和/或交换所产生的剪接变体、同种型、片段、突变体或致癌基因)，其相当于最初所述的较佳至少具有0.5%，更佳至少具有5%、10%、20%、30%、40%或尤其是50%或更多的MDM4对p53的亲和力的全长蛋白质，且与最初所述或以下具体所述的MDM4、MDMX、HDM4或HDM2具有至少20%，更佳至少25%的序列相同性。在未另外提及之处，MDM4一般是指如刚才所分别定义的MDM4、Mdm4、HDM4、Hdm4、MDMX、MdmX、HDMX或HdmX、或其变体。

当述及“其变体”时意指一或多种变体。

如本文所使用，术语“药学上可接受的载剂”包括熟习此项技术者将知晓的任何及所有溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、染料及类似物及其组合(参见(例如)《雷明顿药物科学》（Remington’sPharmaceuticalSciences），第18版，马克印刷公司（MackPrintingCompany），1990，第1289至1329页)。除与该活性成分不兼容的任何习知载剂以外，可预期其在治疗或药物组合物中的用途。

“组合”意指呈一种单位剂型的固定组合，或用于组合给予的部份的套组，其中该式(I)化合物及组合搭配物可同时独立地给予，或在尤其允许组合搭配物显示合作(例如协同)效应的时间间隔内分开给予。

术语本发明化合物的“治疗上有效量”是指将引起个体的生物或医学反应(例如，降低或抑制酶或蛋白质活性、或改善症状、缓解失调、减缓或延迟疾病发展、或预防疾病等)的本发明化合物的含量。在一非限制性实施方式中，术语“治疗上有效量”是指当给予给个体时，对于(1)至少部份缓解、抑制、预防和/或改善(i)由p53/MDM2比例失调所介导，或(ii)与p53/MDM2比例失调相关，或(iii)特征为p53/MDM2比例失调的病症或失调症或疾病；或(2)减少或抑制p53/MDM2相互作用的活性有效的本发明化合物的含量。在另一非限制性实施方式中，术语“治疗上有效量”是指当给予细胞或组织或非细胞生物物质或介质时，对于至少部份减少或抑制p53/MDM2相互作用有效的本发明化合物的含量。

如本文所使用，术语“个体”是指动物。通常该动物是哺乳动物。个体亦是指(例如)灵长类(例如，人类)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟及类似物。在某些实施方式中，该个体是灵长类。在其他实施方式中，该个体是人类。

如本文所使用，术语“抑制”是指减少或抑制特定病症、症状、或失调症、或疾病，或显著降低生物活性或过程的基线活性。

如本文所使用，术语任何疾病或失调的“治疗”或“疗法”在一实施方式中是指改善该疾病或失调(即，减缓或阻止或减少该疾病的发展或至少一种其临床症状)。在另一实施方式中，“治疗”或“疗法”是指缓解或改善至少一种身体参数，其包括彼等无法由患者辨别者。在又一实施方式中，“治疗”或“疗法”是指在身体上(例如，稳定可辨别症状)、生理上(例如，稳定身体参数)或两者上调节该疾病或失调。在又一实施方式中，“治疗”或“疗法”是指预防或延迟该疾病或失调的发作或发生或发展。

如本文所使用，如果个体将在生物上、医学上或在生活质量上自该疗法获益，则该个体“需要”此疗法。

除非本文另外指出或文中明确矛盾，否则如本文所使用，术语“一”、“一个”、“该”及本发明中(尤其是权利要求书中)所使用的类似术语应被视为涵盖单数及复数。

除非本文另外指出或文中明确矛盾，否则可以任何适宜的顺序进行本文所述的所有方法。本文所提供的任何及所有实例或示例性语言(例如，“如”)意欲仅更佳阐述本发明且无意限制另外所申请的本发明的范围。

“硫酸盐”可意指硫酸氢盐、或单硫酸盐、或其混合物。

药物组合物

本发明亦关于包含本发明结晶型的药物组合物。因此，本发明提供：

·一种药物组合物，其包含(即，含有或由其组成)如本文所定义的结晶型及一或多种载剂/赋形剂；

·一种药物组合物，其包含治疗上有效量的如本文所定义的结晶型及一或多种药学上可接受的载剂/赋形剂。

本发明提供一种药物组合物，其包括本发明结晶型及药学上可接受的载剂。可将该药物组合物配制成供特定给予途径用，如经口给予、非经肠给予及直肠给予等。此外，可将本发明药物组合物制成固体形式(包括(但不限于)胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂、粉剂或栓剂)或呈液体形式(包括(但不限于)溶液、悬浮液或乳液)。可使该等药物组合物接受习知的药学操作(如灭菌)和/或可含有习知的惰性稀释剂、润滑剂、或缓冲剂、及佐剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂及缓冲剂等。

通常，该等药物组合物是包含活性成分与以下各者的片剂或明胶胶囊：

a)稀释剂，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸；

b)润滑剂，例如，硅石、滑石、硬脂酸、其镁或钙盐和/或聚乙二醇；对片剂而言亦包括：

c)黏合剂，例如，硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯啶酮；如果需要，则包含：

d)崩解剂，例如，淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐或发泡混合物；和/或

e)吸收剂、着色剂、香料及甜味剂。

片剂可根据相关技术中已知的方法经薄膜包衣或肠溶衣包衣。

适用于经口给予的组合物包括有效量的呈片剂、含片、水性或油性悬浮液、可分散粉剂或颗粒剂、乳液、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂形式的本发明化合物。根据制造药物组合物技术中已知的任何方法，制备预期供口服使用的组合物，且此等组合物可含有一或多种选自甜味剂、芳香剂、着色剂及防腐剂的药剂，以提供药物上精致且美味的制剂。片剂可含有与适于制造片剂的药学上可接受的无毒赋形剂混合的活性成分。此等赋形剂是(例如)惰性稀释剂(如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠)；粒化及崩解剂(例如，玉米淀粉、或海藻酸)黏合剂(例如，淀粉、明胶或阿拉伯胶)；及润滑剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸或滑石)。该等片剂未经包衣或藉由已知技术经包衣，以延迟在肠道中的崩解及吸收且藉此提供在更长时间内的持续作用。例如，可使用时间延迟材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。供口服使用的制剂可呈其中将该活性成分与惰性固体稀释剂(例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合的硬明胶胶囊，或呈其中将该活性成分与水或油性介质(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合的软明胶胶囊提供。

某些可注射组合物是等渗水溶液或悬浮液，且栓剂宜自脂肪乳液或悬浮液制备。该等组合物可经灭菌和/或含有佐剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，其亦可含有其他治疗上有用的物质。该等组合物是分别根据习知的混合、粒化或包衣方法制得，且含有约0.1至75%或含有约1至50%的活性成分。

适用于透皮施用的组合物包括有效量的本发明化合物及适宜的载剂。适用于透皮递送的载剂包括可吸收的药学上可接受的溶剂以促进经由主体的皮肤的通道。例如，透皮装置是呈绷带形式，该绷带包括背衬组件、含有该化合物及视情况可选的载剂的储集器、视情况可选的速度控制障壁(用于依控制及预定速率将该化合物长时间递送至主体的皮肤)、及将该装置固定至皮肤的构件。

适用于局部应用(例如，用于皮肤及眼睛)的组合物包括水溶液、悬浮液、药膏、乳霜、凝胶或可喷雾制剂(例如，用于藉由气溶胶或类似者的递送)。此等局部递送系统将尤其适用于皮肤应用，例如，以治疗皮肤癌，例如，供在防晒霜、洗剂、喷雾及类似物中的预防使用。因此，其特别适于以局部使用，包括相关技术中已熟知的化妆品、制剂。此等可含有增溶剂、稳定剂、渗透性增强剂、缓冲剂及防腐剂。

如本文所使用，局部应用亦可涉及吸入或鼻内应用。可在使用或不使用适宜推进剂的情况下，自干粉末吸入器以干粉末形式(单独或呈混合物(例如，与乳糖的干燥掺合物)、或与(例如)磷脂的混合组分颗粒)，或自加压容器、泵、喷射器、喷雾器或雾化器以气溶胶喷雾形式方便地递送其等。

本发明另外提供包含本发明化合物作为活性成分的无水药物组合物及剂型，因为水可促进某些化合物的降解。

可使用无水或低含水成分及低水分或低湿度条件，制备本发明无水药物组合物及剂型。可制备及储存无水药物组合物使得保持其无水性质。因此，使用已知的材料包装无水组合物以避免接触水，使得其可含于适宜的处方药盒中。适宜的包装的实例包括(但不限于)密封箔、塑料、单位剂量容器(例如，小瓶)、泡罩包装及带包装。

本发明另外提供药物组合物及剂型，其包含降低本发明化合物作为活性成分的分解速率的一或多种药剂。此等药剂(本文亦被称为“稳定剂”)包括(但不限于)抗氧化剂(如抗坏血酸)、pH缓冲剂或盐缓冲剂等。

药物用途

在另一方面中，本发明涉及本发明结晶型作为药物的用途。因此，本发明提供：

·如本文所定义的结晶型，其用作药物；

·本发明结晶型，其用于治疗个体的与MDM2和/或MDM4的活性相关的失调或疾病；

·本发明结晶型在制备治疗个体的与MDM2和/或MDM4的活性相关的失调或疾病的药物中的用途；

·如本文所定义的结晶型的用途，其是用于治疗选自以下的增殖性失调或疾病：癌症或肿瘤疾病(如良性或恶性肿瘤)、肉瘤(如脂肉瘤、横纹肌肉瘤或骨癌，例如骨肉瘤)、癌症(如脑癌、肾脏癌、肝癌、肾上腺癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、阴道癌或甲状腺癌)、胶质母细胞瘤、多发性骨髓瘤、胃肠癌(尤其是结肠癌或结肠直肠腺瘤)、头颈部肿瘤、黑色素瘤、前列腺增生、瘤形成、上皮特征的赘生物、白血病或淋巴瘤(如B或T细胞源及在其他器官中的转移)、病毒感染(例如，疱疹、乳头状瘤病毒、HIV、卡波西肉瘤(Kaposi)、病毒性肝炎)；

·一种调节个体的MDM2和/或MDM4活性的方法，其包括对个体给予治疗上有效量的本发明结晶型的步骤；

·一种治疗与MDM2和/或MDM4的活性相关的失调或疾病的方法，其包括对个体给予治疗上有效量的如本文所述的本发明结晶型的步骤；

可如WO98/01467(尤其涉及分析时以引用的方式并入本文中)中所述或较佳如下所述来显示(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮的疗效：

时差式荧光能量转移(TR-FRET)试验

藉由时差式荧光能量转移法(TR-FRET)，测定p53-Hdm2及p53-Hdm4相互作用的抑制。荧光能量转移(或福斯特(Foerster)共振能量转移)描述供体及受体荧光分子之间的能量转移。就此分析而言，使用经C末端生物素基团标记的MDM2蛋白(氨基酸2-188)及MDM4蛋白(氨基酸2-185)与铕标记链霉抗生物素(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的帕金埃尔默公司(PerkinElmer,lnc.,Waltham,MA,USA))的组合作为供体荧光团。由p53衍生的Cy5标记肽Cy5-TFSDLWKLL(p53aa18-26)是能量受体。在340nm下激活供体分子后，MDM2或MDM4与p53肽之间的结合相互作用引起能量转移及在665nm的受体发射波长下的加强回应。由于抑制剂分子结合至MDM2或MDM4的p53结合位点所引起的p53-MDM2或p53-MDM4复合物形成的破坏导致在615nm处的高供体发射。自于时差模式中测定的两个不同荧光信号的原始数据，计算比率FRET分析读出(665nm计数率/615nm计数率x1000)。

在白色1536w微量滴定板(德国富力豪森的瑞纳生物公司(GreinerBio-OreGmbH,Frickenhausen,Germany))中，藉由将100nl稀释于90%DMSO/10%H₂O(3.2%最终DMSO浓度)中的化合物与2μl铕标记链霉抗生物素(最终浓度2.5nM)合并于反应缓冲液(PBS、125mMNaCl、0.001%Novexin(由碳水化合物聚合物组成(Novexin聚合物)，设计为增加蛋白质的溶解度及稳定性；NovexinLtd.,Cambridgeshire,UnitedKingdom)、明胶0.01%、0.2%普罗流尼克(Pluronic)(环氧乙烷与环氧丙烷的嵌段共聚物，德国路德维希港的巴斯夫公司(BASF,Ludwigshafen,Germany))、1mMDTT)中，接着添加0.5μl稀释于分析缓冲液中的MDM2-Bio或MDM4-Bio(最终浓度10nM)，以3.1μl的总体积进行该测试。允许该溶液在室温下预培养15分钟，接着添加0.5μl含于分析缓冲液中的Cy5-p53肽(最终浓度20nM)。在室温下培养10分钟，然后读出该板。为了测定样品，使用具有以下设定值的AnalystGT多模式微量板读数器(MolecularDevices)：分色镜380nm，激发330nm，发射供体615nm及发射受体665nm。藉由使用XL配置来拟合曲线，计算IC₅₀值。若未指出，则试剂是购自美国密苏里州的西格玛化学品公司(SigmaChemicalCo,St.Louis,MO,USA)。

亦存在可显示式(I)化合物的体内抗肿瘤活性的实验。

例如，可使用具有皮下移植的人类骨肉瘤SJSA-1肿瘤的雌性哈兰(Harlan，Indianapolis,Indiana,USA)无胸腺nu/nu小鼠，测定p53/MDM2相互作用抑制剂的抗肿瘤活性。第0天，使该等动物口服_1-氯-2,2,2-三氟乙基二氟甲醚，德国威斯巴登的雅培公司(Abbot,Wiesbaden,Germany)麻醉，在该等动物的左腹皮肤下注射3x10⁶个细胞。当肿瘤达到100mm³的体积时，将该等小鼠随机分组_每组6至8只动物并开始处理。藉由以确定剂量每天经口、静脉内或腹膜内给予含于适宜媒剂中的式(I)化合物两次(或更低频率)，进行该处理2至3周时间。每周用滑尺测量肿瘤两次，且计算该等肿瘤的体积。

除细胞系SJSA-1以外，亦可以相同方式使用其他细胞系，例如：

·HCT116结肠癌细胞系(ATCC编号CCL-247)；

·LNCaP纯系FGC前列腺癌细胞系(ATCC编号CRL-1740)；

·RKO结肠癌细胞系(ATCC编号CRL-2577)；

·HT1080纤维肉瘤细胞系(ATCC编号CCL-121)；

·A375恶性黑色素瘤细胞系(ATCC编号CRL-1619)；

·NCl-H460大细胞肺癌细胞系(ATCC编号HT8-177)；

·JEG-3绒毛膜癌(ATCC编号HTB-36)；

·ZR-75-1乳腺导管癌(ATCC编号CRL-1500)。

(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮游离碱：

p53-Hdm2抑制(TR-FRET)分析的IC₅₀(μM)：0.0008

p53-Hdm4抑制(TR-FRET)分析的IC₅₀(μM)：2.10

如本文所揭示的(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮硫酸氢盐：

p53-Hdm2抑制(TR-FRET)分析的IC₅₀(μM)：0.0019

p53-Hdm4抑制(TR-FRET)分析的IC₅₀(μM)：2.2

组合

在另一方面中，本发明涉及包含如本文所述的(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮的结晶型及一或多种其他活性成分的组合。因此，本发明提供：

·一种组合，具体说是一种药物组合，其包含如本文所述的(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮的结晶型，及一或多种治疗活性剂，尤其是抗增殖剂；

·一种适用于同时或依序给予的组合型药物组合物，其包括如本文所述的(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮的结晶型；治疗上有效量的一或多种组合搭配物，具体说是抗增殖剂；一或多种药学上可接受的赋形剂；

·如本文所定义的组合型药物组合物，其是(i)作为药物，(ii)用于治疗由MDM2和/或MDM4的活性所介导的失调或疾病，(iii)用于一种治疗由MDM2和/或MDM4的活性所介导的失调或疾病的方法。

亦可有利地使用如本文所述的(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮的结晶型与其他抗增殖化合物的组合。此等抗增殖化合物包括(但不限于)芳香酶抑制剂；抗雌激素剂；拓扑异构酶I抑制剂；拓扑异构酶II抑制剂；微管活性化合物；烷基化化合物；组蛋白去乙酰酶抑制剂；诱导细胞分化过程的化合物；环氧合酶抑制剂；MMP抑制剂；mTOR抑制剂，如RAD001；抗肿瘤型抗代谢药物；铂化合物；靶向/减少蛋白质或脂质激酶活性的化合物及其他抗血管生成化合物；靶向、减少或抑制蛋白质或脂质磷酸酶的活性的化合物；性腺释素激动剂；抗雄激素剂；甲硫氨酸氨基肽酶抑制剂；双膦酸盐；生物反应调节剂；抗增殖抗体，如HCD122；肝素酶抑制剂；Ras致癌同型异构物抑制剂；端粒酶抑制剂；蛋白酶体抑制剂；用于治疗血液恶性肿瘤的化合物，如氟达拉滨(fludarabine)；靶向、减少或抑制Flt-3活性的化合物，如PKC412；Hsp90抑制剂，如17-AAG(17-烯丙基氨基格尔德霉素，NSC330507)、17-DMAG(17-二甲基氨基乙氨基-17-去甲氧基-格尔德霉素，NSC707545)、1PI-504、CNF1010、CNF2024、CNF1010(购自ConformaTherapeutics)及AUY922；替莫唑胺(temozolomide)(TEMODAL^TM)；驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂，如SB715992或SB743921(购自GlaxoSmithKline)、或喷他脒(pentamidine)/氯丙嗪(chlorpromazine)(购自CombinatoRx)；PI3K抑制剂，如BEZ235；RAF抑制剂，如RAF265；MEK抑制剂，如ARRY142886(购自阵列先锋制药(ArrayPioPharma))、AZD6244(购自阿斯利康(AstraZeneca))，PD181461(购自辉瑞(Pfizer))；甲酰四氢叶酸、EDG结合剂、抗白血病化合物、核糖核苷酸还原酶抑制剂、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制剂、细胞凋亡调节剂、抗增殖抗体或其他化疗化合物。另外、或者或此外，其等可与其他肿瘤治疗方法组合，该等方法包括手术、电离辐射、光动力疗法、植入物(例如，含有皮质类固醇、激素)；或其等可用作辐射敏化剂。此外，在抗炎和/或抗增殖疗法中，包含与抗炎药的组合。亦可与抗组胺原料药、支气管扩张药、NSAID或趋化因子受体拮抗剂组合。

如本文所使用，术语“芳香酶抑制剂”是指抑制雌激素产生(即，基质雄烯二酮及睾酮分别转化成雌酮及雌二醇)的化合物。该术语包括(但不限于)类固醇(尤其是阿纳托唑(atamestane)、依西美坦(exemestane)及福美司坦(formestane))，及具体说是非类固醇(尤其是胺鲁米特(aminoglutethimide)、洛太米特(roglethimide)、(pyridoglutethimide)、曲洛司坦(trilostane)、睾内酯(testolactone)、酮康唑(ketokonazole)、伏氯唑(vorozole)、法屈唑(fadrozole)、阿那曲唑(anastrozole)及来曲唑(letrozole))。可依(例如)市售形式(例如，商标AROMASIN)给予依西美坦。可依(例如)市售形式(例如，商标LENTARON)给予福美司坦。可依(例如)市售形式(例如，商标AFEMA)给予法屈唑。可依(例如)市售形式(例如，商标ARIMIDEX)给予阿那曲唑。可依(例如)市售形式(例如，商标FEMARA或FEMAR)给予来曲唑。可依(例如)市售形式(例如，商标ORIMETEN)给予胺鲁米特。包含化疗剂(其是芳香酶抑制剂)的本发明组合特别适用于治疗激素受体阳性肿瘤，例如乳腺肿瘤。

如本文所使用，术语“抗雌激素剂”是指在雌激素受体浓度上拮抗雌激素作用的化合物。该术语包括(但不限于)他莫昔芬(tamoxifen)、氟维司群(fulvestrant)、雷洛昔芬(raloxifene)及雷洛昔芬盐酸盐。可依(例如)市售形式(例如，商标NOLVADEX)给予他莫昔芬。可依(例如)市售形式(例如，商标EVISTA)给予雷洛昔芬盐酸盐。氟维司群可如US4,659,516中所揭示地制剂，且可依(例如)其市售形式(例如，商标FASLODEX)给予。包含化疗剂(其是抗雌激素剂)的本发明组合特别适用于治疗雌激素受体阳性肿瘤，例如乳腺肿瘤。

如本文所使用，术语“抗雄激素剂”是指可抑制雄性激素的生物作用的任何物质，且包括(但不限于)比卡鲁胺(bicalutamide)(CASODEX^TM)，其可如US4,636,505中所揭示地制剂。

如本文所使用，术语“性腺释素”包括(但不限于)阿巴瑞克(abarelix)、戈舍瑞林(goserelin)及戈舍瑞林醋酸盐。戈舍瑞林是揭示于US4,100,274中，且可依(例如)其市售形式(例如，商标ZOLADEX)给予。可如(例如)US5,843,901中所揭示地配制阿巴瑞克。

如本文所使用，术语“拓扑异构酶I抑制剂”包括(但不限于)拓扑替康(topotecan)、吉马替康(gimatecan)、伊立替康(irinotecan)、喜树碱(camptothecian)及其类似物、9-硝基喜树碱及大分子喜树碱共轭物PNU-166148(WO99/17804中的化合物A1)。可依(例如)市售形式(例如，商标CAMPTOSAR)给予伊立替康。可依(例如)市售形式(例如，商标HYCAMTIN)给予拓扑替康。

如本文所使用，术语“拓扑异构酶II抑制剂”包括(但不限于)蒽环类(如多柔比星(doxorubicin)(包括脂质体制剂，例如CAELYX)、柔红霉素(daunorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)及奈莫柔比星(nemorubicin))、蒽醌类(米托蒽醌(mitoxantrone)及洛索蒽醌(losoxantrone))、及鬼臼素(podophillotoxines)(依托泊苷(etoposide)及替尼泊苷(teniposide))。可依(例如)市售形式(例如，商标ETOPOPHOS)给予依托泊苷。可依(例如)市售形式(例如，商标VM26-BRISTOL)给予替尼泊苷。可依(例如)市售形式(例如，商标ADRIBLASTIN或ADRIAMYCIN)，给予多柔比星。可依(例如)市售形式(例如，商标FARMORUBICIN)，给予表阿霉素。可依(例如)市售形式(例如，商标ZAVEDOS)，给予伊达比星。可依(例如)市售形式(例如，商标NOVANTRON)，给予米托蒽醌。

如本文所使用，术语“微管活性化合物”是指微管稳定化、微管去稳定化化合物及微管聚合反应抑制剂，其包括(但不限于)紫杉醇类，例如紫杉醇(paclitaxel)及多西紫杉醇、长春花生物碱，例如长春花碱(尤其是硫酸长春花碱)、长春新碱(尤其是硫酸长春新碱)、及长春瑞滨(vinorelbine)、盘形德莫利得(discodermolide)、秋水仙碱及埃坡霉素(epothilone)及其衍生物，例如埃坡霉素B或D或其衍生物。可依(例如)市售形式(例如，商标TAXOL^TM)给予紫杉醇。可依(例如)市售形式(例如，商标TAXOTERE)给予多西紫杉醇。可依(例如)市售形式(例如，商标VINBLASTINR.P.)，给予长春花碱。可依(例如)市售形式(例如，商标FARMSTIN)，给予硫酸长春新碱。可如(例如)US5,010,099中所揭示，获得盘形德莫利得。亦包括揭示于WO98/10121、US6,194,184、WO98/25929、WO98/08849、WO99/43653、WO98/22461及WO00/31247中的埃坡霉素衍生物。以埃坡霉素A和/或B尤其佳。

如本文所使用，术语“烷基化化合物”包括(但不限于)环磷酰胺、异环磷酰胺、马法兰(melphalan)或亚硝基脲(BCNU或Gliadel)。可依(例如)市售形式(例如，商标CYCLOSTIN)给予环磷酰胺。可依(例如)市售形式(例如，商标HOLOXAN)给予异环磷酰胺。

如本文所使用，术语“抗肿瘤型抗代谢药物”包括(但不限于)5-氟脲嘧啶或5-FU、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、DNA去甲基化化合物，如5-氮杂胞苷及地西他滨(decitabine)、甲胺蝶呤(methotrexate)及伊达曲沙(edatrexate)、及叶酸拮抗剂(如培美曲塞(pemetrexed)。)可依(例如)市售形式(例如，商标XELODA)，给予卡培他滨。可依(例如)市售形式(例如，商标GEMZAR)，给予吉西他滨。

如本文所使用，术语“铂化合物”包括(但不限于)卡铂(carboplatin)、顺铂(cis-platin)、及顺铂(cisplatinum)及奥沙利铂(oxaliplatin)。可依(例如)市售形式(例如，商标CARBOPLAT)给予卡铂。可依(例如)市售形式(例如，商标ELOXATlN)给予奥沙利铂。

如本文所使用，术语“靶向/降低蛋白质脂质激酶活性或蛋白质或脂质磷酸酶活性的化合物”或“其他抗血管生成化合物”包括(但不限于)蛋白质酪氨酸激酶和/或丝氨酸和/或苏氨酸激酶抑制剂或脂质激酶抑制剂，例如：

a)靶向、降低或抑制血小板源生长因子受体(PDGFR)的化合物，如靶向、降低或抑制PDGFR的活性的化合物，尤其是抑制PDGF受体的化合物，例如，N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，例如，伊马替尼(imatinib)、SU101、SU6668及GFB-111；

b)靶向、降低或抑制成纤维细胞生长因子受体(FGFR)的活性的化合物；

c)靶向、降低或抑制类胰岛素生长因子受体I(IGF-IR)的活性的化合物，如靶向、降低或抑制IGF-IR的活性的化合物，尤其是抑制IGF-I受体的激酶活性的化合物，如彼等揭示于WO02/092599中的化合物，或靶向IGF-I受体或其生长因子的细胞外域的抗体；

d)靶向、降低或抑制Trk受体酪氨酸激酶家族、或蝶素（Ephrin）B4抑制剂的活性的化合物；

e)靶向、降低或抑制Axl受体酪氨酸激酶家族的活性的化合物；

f)靶向、降低或抑制Ret受体酪氨酸激酶的活性的化合物；

g)靶向、降低或抑制Kit/SCFR受体酪氨酸激酶(即，C-kit受体酪氨酸激酶-(PDGFR家族的一部份))的活性的化合物，如，靶向、降低或抑制c-Kit受体酪氨酸激酶家族的活性的化合物，尤其是抑制c-Kit受体的化合物，例如，伊马替尼；

h)靶向、降低或抑制c-Abl家族的成员、其基因融合产物(例如，BCR-Abl激酶)及突变体的活性的化合物，如靶向、降低或抑制c-Abl家族成员及其基因融合产物的活性的化合物，例如，N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，例如伊马替尼或尼洛替尼(nilotinib)(AMN107)；PD180970；AG957；NSC680410；PD173955(购自ParkeDavis)；或达沙替尼(dasatinib)(BMS-354825)；

i)靶向、降低或抑制丝氨酸/苏氨酸激酶的蛋白质激酶C(PKC)及Raf家族的成员、MEK、SRC、JAK、FAK、PDK1、PKB/Akt、及Ras/MAPK家族成员、和/或细胞周期素依赖性激酶家族(CDK)的成员的活性的化合物，其尤其是彼等揭示于US5,093,330中的星形孢菌素衍生物，例如米哚妥林(midostaurin)；其他化合物的实例包括(例如)UCN-01、沙芬戈(safingol)、BAY43-9006、苔藓抑素1(Bryostatin1)、哌立福新(Perifosine)；伊莫福新(llmofosine)；RO318220及RO320432；GO6976；Isis3521；LY333531/LY379196；异喹啉化合物，如彼等揭示于WO00/09495中者；FTI；BEZ235(P13K抑制剂)或AT7519(CDK抑制剂)；

j)靶向、降低或抑制蛋白质-酪氨酸激酶抑制剂的活性的化合物，如靶向、降低或抑制蛋白质-酪氨酸激酶抑制剂的活性的化合物包括甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC^TM)或酪氨酸磷酸化抑制剂。酪氨酸磷酸化抑制剂较佳是低分子量(Mr<1500)化合物、或其药学上可接受的盐，尤其是选自苯亚甲丙二腈类或S-芳基苯丙二腈或双基质喹啉类化合物的化合物，更尤其是选自TyrphostinA23/RG-50810；AG99；TyrphostinAG213；TyrphostinAG1748；TyrphostinAG490；TyrphostinB44；TyrphoStinB44(+)对映体；TyrphostinAG555；AG494；TyrphostinAG556、AG957及阿达福汀(adaphostin)(4-{[(2,5-二羟基苯基)甲基]氨基}-苯甲酸金刚烷基酯；NSC680410，阿达福汀)的任何化合物；

k)靶向、降低或抑制受体酪氨酸激酶的表皮生长因子家族(呈均聚或杂二聚体形式的EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4)及其突变体的活性的化合物，如靶向、降低或抑制表皮生长因子受体家族的活性的化合物尤其是抑制EGF受体酪氨酸激酶家族的成员(例如，EGF受体、ErbB2、ErbB3及ErbB4或结合至EGF或EGF相关的配体)的化合物、蛋白质或抗体，且尤其是彼等一般且具体揭示于WO97/02266(例如，实例39化合物)、或EP0564409、WO99/03854、EP0520722、EP0566226、EP0787722、EP0837063，US5,747,498、WO98/10767、WO97/30034、WO97/49688、WO97/38983，且尤其是WO96/30347(例如，化合物被称为CP358774)、WO96/33980(例如，化合物ZD1839)及WO95/03283(例如，化合物ZM105180)中的化合物、蛋白质或单株抗体；例如，曲妥珠单抗(trastuzumab)(Herceptin^TM)、西妥昔单抗(cetuximab)(Erbitux^TM)、艾瑞莎(Iressa)、它赛瓦(Tarceva)、OSI-774、CI-1033、EKB-569、GW-2016、E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3或E7.6.3、及7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶衍生物(其是揭示于WO03/043541中)；及

l)靶向、降低或抑制c-Met受体的活性的化合物，如靶向、降低或抑制c-Met的活性的化合物，尤其是抑制c-Met受体的激酶活性的化合物，或靶向c-Met的细胞外域或结合至HGF的抗体；

m)靶向、降低或抑制P13K的活性的化合物，如BEZ235或BKM120；

n)靶向、降低或抑制细胞周期素依赖性激酶家族的活性的化合物，如PD0332991。

其他抗血管生成化合物包括具有就其活性而言的另一机制的化合物，例如与蛋白质或脂质激酶抑制无关者，例如，沙立度胺(THALOMID)及TNP-470。

靶向、降低或抑制蛋白质或脂质磷酸酶的活性的化合物是(例如)磷酸酶1、磷酸酶2A的抑制剂、或CDC25，例如，冈田井酸(okadaicacid)或其衍生物。

诱导细胞分化过程的化合物是(例如)视黄酸、α-γ-或δ-生育酚或α-γ-或δ-三烯生育酚。

如本文所使用，术语“环氧合酶抑制剂”包括(但不限于)(例如)Cox-2抑制剂、经5-烷基取代的2-芳基氨基苯基乙酸及衍生物，如塞来考昔(celecoxib)(CELEBREX^TM)、罗非考昔(rofecoxib)(VlOXX^TM)、依托考昔(etoricoxib)、伐地考昔(valdecoxib)或5-烷基-2-芳基氨基苯基乙酸，例如，5-甲基-2-(2'-氯-6'-氟苯胺)苯基乙酸，鲁米考昔(lumiracoxib)。

如本文所使用，术语“双膦酸盐”包括(但不限于)伊曲膦酸(etridonic)、氯膦酸(clodronic)、替鲁膦酸(tiludronic)、帕米膦酸(pamidronic)、阿仑膦酸(alendronic)、伊班膦酸(ibandronic)、利塞膦酸(risedronic)及唑来膦酸(zoledronicacid)。可依(例如)市售形式(例如，商标DIDRONEL)给予“伊曲膦酸”。可依(例如)市售形式(例如，商标BONEFOS)给予“氯膦酸”。可依(例如)市售形式(例如，商标SKELID)给予“替鲁膦酸”。可依(例如)市售形式(例如，商标AREDIA)给予“帕米膦酸”。可依(例如)市售形式(例如，商标FOSAMAX)给予“阿仑膦酸”。可依(例如)市售形式(例如，商标BONDRANAT)给予“伊班膦酸”。可依(例如)市售形式(例如，商标ACTONEL)给予“利塞膦酸”。可依(例如)市售形式(例如，商标ZOMETA)给予“唑来膦酸”。

术语“mTOR抑制剂”是指抑制哺乳动物雷帕霉素(rapamycin)靶蛋白(mTOR)及具有抗增殖活性的化合物，如，西罗莫司(sirolimus，Rapamune^TM)、依维莫司(everolimus，Certican^TM或Afinitor^TM)、CCI-779及ABT578。

如本文所使用，术语“肝素酶抑制剂”是指靶向、降低或抑制硫酸肝素降解的化合物。该术语包括(但不限于)PI-88。

如本文所使用，术语“生物反应调节剂”是指淋巴细胞活素或干扰素，例如干扰素γ。

如本文所使用，术语“Ras致癌亚型抑制剂”(例如，H-Ras、K-Ras、或N-Ras)是指靶向、降低或抑制Ras的致癌活性的化合物，例如，“法呢基转移酶抑制剂”，例如L-744832、DK8G557或R115777(Zarnestra)。

如本文所使用，术语“端粒酶抑制剂”是指靶向、降低或抑制端粒酶活性的化合物。靶向、降低或抑制端粒酶活性的化合物尤其是抑制端粒酶受体的化合物，例如端粒霉素(telomestatin)。

如本文所使用，术语“甲硫氨酸氨基肽酶抑制剂”是指靶向、降低或抑制甲硫氨酸氨基肽酶活性的化合物。靶向、降低或抑制甲硫氨酸氨基肽酶活性的化合物是(例如)bengamide或其衍生物。

如本文所使用，术语“蛋白酶体抑制剂”是指靶向、降低或抑制蛋白酶体的活性的化合物。靶向、降低或抑制蛋白酶体的活性的化合物包括(例如)硼替佐米(Bortezomid)(Velcade^TM)及MLN341。

如本文所使用，术语“基质金属蛋白酶抑制剂”或(“MMP”抑制剂)包括(但不限于)胶原蛋白肽拟似物及非肽拟似物抑制剂、四唑衍生物，例如异羟肟酸酯肽拟似物抑制剂巴马司他(batimastat)及其口服生物可利用类似物马立马司他(marimastat)(BB-2516)、普马司他(prinomastat)(AG3340)、美他司他(metastat)(NSC683551)BMS-279251、BAY12-9566、TAA211、MMI270B或AAJ996。

如本文所使用，术语“用于治疗血液恶性肿瘤的化合物”包括(但不限于)FMS样酪氨酸激酶抑制剂，例如靶向、降低或抑制FMS样酪氨酸激酶受体(Flt-3R)的活性的化合物；干扰素、1-b-D-阿糖呋喃胞嘧啶(ara-c)及白消安(bisulfan)；及ALK抑制剂，例如，靶向、降低或抑制退行性淋巴瘤激酶的化合物。

靶向、降低或抑制FMS样酪氨酸激酶受体(Flt-3R)的活性的化合物尤其是抑制Flt-3R受体激酶家族的成员的化合物、蛋白质或抗体，例如，PKC412、TKI258、米哚妥林(midostaurin)、星孢菌素衍生物、SU11248及MLN518。

如本文所使用，术语“HSP90抑制剂”包括(但不限于)靶向、降低或抑制HSP90的内ATP酶活性；经由泛素蛋白酶体途径降解、靶向、降低或抑制HSP90客体蛋白质的化合物。靶向、降低或抑制HSP90的内ATP酶活性的化合物尤其是抑制HSP90的ATP酶活性的化合物、蛋白质或抗体，例如，17-烯丙基氨基、17-去甲氧基格尔德霉素(17AAG)、格尔德霉素(geldanamycin)衍生物；其他格尔德霉素相关的化合物；根赤壳菌素(radicicol)及HDAC抑制剂。实例HSP90抑制剂是AUY922。

如本文所使用，术语“细胞凋亡调节剂”包括(但不限于)靶向、降低或抑制Bcl2家族成员(如ABT-263)及IAP家族成员(如AEG40826)的活性的化合物；或藉由已知或未知作用机制诱导细胞凋亡的化合物(例如，TRAIL抗体、DR5抗体)。

如本文所使用，术语“抗增殖抗体”包括(但不限于)曲妥珠单抗(trastuzumab，Herceptin^TM)、曲妥珠单抗-DM1、尔必得舒(erbitux)、贝伐单抗(bevacizumab，Avastin^TM)、利妥昔单抗(rituximab，Rituxan^TM)、PRO64553(抗CD40)、2C4抗体及HCD122抗体(抗CD40)。抗体意指(例如)完整的单株抗体、多株抗体、由至少2种完整抗体形成的多特异性抗体、及抗体片段(只要其显示所需的生物活性即可)。

为治疗急性骨髓性白血病(AML)，可将本发明固体型与标准白血病疗法，尤其是用于治疗AML的疗法组合使用。具体说，可将该固体型与(例如)法呢基转移酶抑制剂和/或用于治疗AML的其他药物(如，柔红霉素、阿霉素(adriamycin)、Ara-C、VP-16、替尼泊苷、米托蒽醌、去甲氧柔红霉素、卡铂及PKC412)组合给予。

术语“抗白血病化合物”包括(例如)Ara-C(嘧啶类似物，其是脱氧胞苷的2'-α-羟基核糖(阿拉伯糖苷)衍生物)。亦包括次黄嘌呤、6-巯嘌呤(6-MP)及磷酸氟达拉滨的嘌呤类似物。

靶向、降低或抑制组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂活性的化合物(如丁酸钠及辛二酰基苯胺异羟肟酸(SAHA))抑制该等酶(称为组蛋白去乙酰酶)的活性。特定的HDAC抑制剂包括MS275、SAHA、FK228(先前称FR901228)、曲谷抑菌素A(TrichostatinA)、LDH589(揭示于WO02/22577中)及US6,552,065中所揭示的化合物，具体说，N-羟基-3-[4-[[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺、或其药学上可接受的盐及N-羟基-3-[4-[(2-羟乙基){2-(1H-吲哚-3-基)乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺或其药学上可接受的盐(尤其是乳酸盐)。

如本文所使用，术语“生长抑素受体拮抗剂”是指靶向、降低或抑制生长抑素受体的化合物，如奥曲肽(octreotide)及SOM230(帕西瑞肽(pasireotide))。

肿瘤细胞损伤途径是指诸如电离辐射的途径。上文及下文所提及的术语“电离辐射”意指以电磁射线(如X射线及伽马射线)或粒子(如α及β粒子)形式发生的电离辐射。在辐射疗法(但不限于此)中提供电离辐射，且其是相关技术已知。参见Hellman在PrinciplesandPracticeofOncology，Devita等人编辑，第4版，第1卷，第248至275页(1993)中的PrinciplesofRadiationTherapy，Cancer。

如本文所使用，术语“EDG黏合剂”是指一类调节淋巴细胞再循环的免疫抑制剂，如FTY720。

术语“核糖核苷酸还原酶抑制剂”是指嘧啶或嘌呤核苷类似物，其包括(但不限于)氟达拉滨和/或胞嘧啶阿拉伯糖苷(ara-C)、6-硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、克拉屈滨(cladribine)、6-巯基嘌呤(尤其是与ara-C组合抗ALL)和/或喷托他丁(pentostatin)。核糖核苷酸还原酶抑制剂尤其是羟基脲或2-羟基-1H-异吲哚-1,3-二酮衍生物，如Nandy等人，ActaOncologica，第33卷，第8号，第953至961页(1994)中所述及的PL-1、PL-2、PL-3、PL-4、PL-5、PL-6、PL-7或PL-8。

如本文所使用，术语“S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制剂”包括(但不限于)US5,461,076中所揭示的化合物。

具体说，亦包括彼等揭示于下列中的化合物、蛋白质或VEGF单株抗体：WO98/35958(例如，1-(4-氯苯氨基)-4-(4-吡啶甲基)酞嗪或其药学上可接受的盐(例如琥珀酸盐))、或WO00/09495、WO00/27820、WO00/59509、WO98/11223、WO00/27819及EP0769947中者；彼等如Prewett等人，CancerRes，第59卷，第5209至5218页(1999)；Yuan等人，ProcNatlAcadSciUSA，第93卷，第14765至14770页(1996)；Zhu等人，CancerRes，第58卷，第3209至3214页(1998)；及Mordenti等人，ToxicolPathol，第27卷，第1号，第14至21页(1999)中所述者；WO00/37502及WO94/10202中者；如O'Reilly等人，Cel，第79卷，第315至328页(1994)中所述的血管抑素(ANGIOSTATIN)；如O'Reilly等人，Cel，第88卷，第277至285页(1997)中所述的内皮抑素(ENDOSTATIN)；邻氨基苯甲酰胺；ZD4190；ZD6474；SU5416；SU6668；贝伐单抗；或抗VEGF抗体或抗VEGF受体抗体，例如，rhuMAb及RHUFab；VEGF适体，例如，哌加他尼(Macugon)；FLT-4抑制剂、FLT-3抑制剂、VEGFR-2lgG1抗体、Angiozyme(RPI4610)及贝伐单抗(Avastin^TM)。

如本文所使用，“光动力疗法”是指使用某些被称为光敏化化合物的化学品以治疗或预防癌症的疗法。光动力疗法的实例包括利用如(例如)VISUDYNE^TM及卟吩姆(porfimer)钠的化合物的疗法。

如本文所使用，“血管生成抑制性类固醇”是指阻断或抑制血管生成的化合物，如(例如)阿奈可他(anecortave)、去炎松(triamcinolone)、氢化可的松(hydrocortisone)、11-α-表氢可的松、脱氧皮醇(cortexolone)、17α-羟孕酮、皮质脂酮、脱氧(肾上腺)皮质酮、睾酮，雌酮及地塞米松(dexamethasone)。

含有皮质类固醇的植入物是指诸如(例如)氟轻松(fluocinolone)、地塞米松的化合物。

“其他化疗化合物”包括(但不限于)植物生物碱类、激素化合物及拮抗剂；生物反应调节剂，较佳是淋巴细胞活素或干扰素；反义寡核苷酸或寡核苷酸衍生物；shRNA或siRNA；或混杂化合物或具有其他或未知作用机制的化合物。

由代码、一般或商标名称所识别的活性化合物的结构可自标准纲要“默克索引(TheMerckIndex)”的实际版或自数据库(例如，专利国际(PatentsInternational)(例如，IMSWorldPublications))获得。

本发明中参考文献的引用皆不应被理解为承认所引用的参考文献是将负面影响本发明的可专利性的现有技术。

可如相关技术中所述，制备并给予可与本文所述的(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮的结晶型组合使用的上述化合物。

给药

本发明亦提供一种药物制剂，其包含如本文所述的(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮的结晶型及至少一种药学上可接受的载剂。

可单独或与一或多种其他治疗化合物组合给予本文所述的该结晶型，可能的组合疗法是呈固定组合形式、或本发明化合物及一或多种其他治疗(包括预防)化合物的给予是交错或彼此独立地提供、或固定组合及一或多种其他治疗化合物的组合给予。除此以外或另外，可将该固体形式与化疗、辐射疗法、免疫疗法、光疗法、外科介入术或此等的组合组合给予，以尤其用于肿瘤治疗。如上所述，长期疗法同样可作为其他治疗策略中的辅助疗法。其他可能的疗法是保持患者在肿瘤退化后的状态的疗法，或甚至是化学预防疗法(例如在处于风险中的患者中)。

该活性成分的剂量取决于各项因素，其包括该患者的类型、种类、年龄、体重、性别及医学失调；待治疗的失调的严重度；投药途径；该患者的肾及肝功能；所使用的特定化合物。一般技术的医师、临床医师或兽医可容易确定及处方有效量的所需药物，以预防、反击或阻止该失调的发展。达到产生疗效的范围内的药物浓度的最佳精度需要基于药物至靶位点的可用性的动力学的方案。

待给予给温血动物(例如，约70kg体重的人类)的如本文所述的(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮的结晶型的剂量较佳是约3mg至约15g/人/天，更佳是约10mg至约3g/人/天，仍更佳是约50mg至1.5g/人/天，其是不分开以1次剂量或以较佳分成2至4次(例如，2或3次)可具有(例如)相同大小的单剂量给予。通常，儿童接受成人剂量的一半。

可藉由任何习知途径，尤其是非经肠(例如，呈可注射容易或悬浮液形式)、经肠(例如，经口，(例如)呈片剂或胶囊形式)、局部(例如，呈洗剂、凝胶、药膏或乳霜的形式，或呈鼻内或栓剂形式)，给予该固体型。局部给予是(例如)至皮肤。局部给予的另一形式是给予至眼睛。可以习知方法，藉由与药学上可接受的载剂或稀释剂混合，制造与至少一种药学上可接受的载剂或稀释剂组合且包含本发明化合物的药物组合物。

本发明亦涉及一种药物组合物，其包含有效量(尤其是有效治疗上述疾病中一者的量)的如本文所述的(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮的结晶型，及适用于局部、经肠(例如，经口或直肠)或非经肠给予且可是无机或有机、固体或液体的一或多种药学上可接受的载剂。尤其可存在用于经口投药的片剂或明胶胶囊，其包括活性成分与稀释剂(例如，乳糖、葡萄糖、甘露醇、和/或甘油)、和/或润滑剂和/或聚乙二醇。片剂亦可包含黏合剂，例如，硅酸镁铝、淀粉(如玉米、小麦或大米淀粉)、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯啶酮，且如果需要，则包含崩解剂，例如，淀粉、琼脂、海藻酸或其盐(如海藻酸钠)、和/或发泡剂混合物、或吸附剂、染料、调味剂及甜味剂。亦可使用呈非经肠可给予组合物形式或呈输注溶液形式的本发明药物上活性化合物。该等药物组合物可经灭菌和/或可包含赋形剂，例如，防腐剂、稳定剂、润湿化合物和/或乳化剂、增溶剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。本发明药物组合物(如果需要，可包含其他药理活性物质)是以本身已知的方式(例如，藉由习知的混合、造粒、掺和、溶解或冻干制程)制得，且包含约1%至99%(尤其是约1%至约20%)的活性成分。

实施例106：(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲 基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮

将磷酸钾(4.44g，20.29mmol)注入可密封的反应烧瓶中，排空并在170℃下加热15min。在室温下，该反应烧瓶经氩气再充满，且依序添加中间物75.6(3.64g，10.15mmol)、中间物106.1(5.48g，12.18mmol)、二烷(75ml)及(+/-)-反式-1,2-二氨基环己烷(0.37ml，3.04mmol)。在真空下，小心排空该反应烧瓶(2x)，且经氩气再充满(2x)，及添加碘化铜(I)(0.586g，3.04mmol)。在95℃下，搅拌该反应混合物22.5h。在EtOAc(3x)与水(3x)之间萃取该混合物。用盐水清洗有机相，并在Na₂SO₄上干燥，过滤并蒸发至干。藉由反相预备性HPLC，接着正相管柱层析(用100%EtOAc至20%MeOH/EtOAc洗脱)纯化残留物，获得TFA盐，将其在EtOAc(2x)与1MNaHCO₃水溶液(1x)之间萃取。用盐水清洗有机相，且在Na₂SO₄上干燥，过滤并蒸发至干，获得呈白色固体的标题化合物(1.59g，2.41mmol，23.8%)：HPLC：^Et_Ret=4.57min；LC-MS：m/z659.2[M+H]⁺；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)0.88-1.01(m,2H)1.05-1.14(m,2H)1.16(d,J=5.86Hz,3H)1.21(d,J=6.25Hz,3H)1.48-1.62(m,1H)1.73(dd,4H)2.14-2.27(m,1H)2.65(t,J=5.47Hz,2H)2.76(s,3H)2.85(s,3H)3.02(s,2H)3.06-3.20(m,4H)3.54(d,1H)3.71(s,3H)3.87(d,J=19.53Hz,1H)4.39-4.47(m,1H)5.92(s,1H)6.54(d,2H)6.81(s,1H)6.87(d,2H)7.02(s,1H)7.33(s,4H)。

中间体106.1：4-(4-{[(4-碘苯基)甲基氨基]甲基}反式-环己基)-1-甲基哌嗪-2- 酮

在0℃下，将HCl的4M二烷溶液(105ml，418mmol)添加至含于二烷(52.3ml)中的中间物106.2(13.3g，20.9mmol)的溶液中。在室温下，搅拌该反应混合物0.5h。浓缩该溶液，并将该残留物溶于MeOH(157ml)中，在0℃下，滴加三乙胺(27.3ml，196mmol)，且在室温下搅拌该混合物1h。浓缩该反应混合物，并在EtOAc(2x)与1MNaHCO₃水溶液(1x)之间萃取该残留物。用盐水清洗有机相，并在Mg₂SO₄上干燥，过滤，并蒸发至干。将该处理物质悬浮于Et₂O(50ml)中，且在搅拌及超音波处理30min之后，将其在滤纸上过滤，用Et₂O(50ml)清洗，且在高度真空下干燥，以获得白色粉末(8.11g，18.0mmol，86%)。HPLC：^Et_Ret=4.035min；LC-MS：m/z442.1[M+H]⁺；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)0.84-1.02(m,2H)1.02-1.12(m,2H)1.52-1.60(m,1H)1.60-1.84(m,4H)2.16-2.27(m,1H)2.65(t,J=5.47Hz,2H)2.76(s,3H)2.85(s,3H)3.02(s,2H)3.10(d,J=7.03Hz,2H)3.14-3.20(m,2H)6.47(d,2H)7.37(d,2H)。

中间体106.2:[[2-(叔丁氧基羰基-甲基-氨基)-乙基]-(4-{[(4-碘-反式-环己基)-氨基]-乙酸甲酯

在0℃下，将NaBH(OAc)₃(13.7g，64.7mmol)分批添加至含于DCM(108ml)中的中间物105.3(9.45g，21.6mmol)、甲基-(2-氧代-乙基)-氨基甲酸第三丁酯(4.11g，23.7mmol)及AcOH(3.7ml，64.7mmol)的悬浮液中。在室温下搅拌1h之后，将饱和NaHCO₃水溶液小心添加至该反应混合物中至pH8，接着用DCM萃取(2x)。在Mg₂SO₄上干燥有机相，过滤，并蒸发，获得粗制标题中间物(13.3g，20.9mmol，97%，具有90%纯度)。该物质是无需进一步纯化而用于下一步骤中。HPLC：^Et_Ret=5.32min；LC-MS=m/z574.3[M+H]⁺。

中间体105.3:(4-{[(4-碘-苯基)-甲基-氨基]-甲基}-反式-乙酸甲酯

在-10℃下，将碳酸钾(14.3g，103mmol)及2-溴乙酸甲酯(4.77ml，51.7mmol)依序添加至含于DMF(300ml)中的中间物105.4(16.9g，49.2mmol)的溶液中。在-10℃至10℃下，搅拌该悬浮液4.5h。用EtOAc稀释该反应混合物，用水及盐水清洗有机相，且在Na₂SO₄上干燥，过滤并蒸发至干。藉由正相管柱层析(用100%DCM至100%EtOAc洗脱)纯化该残留物，获得呈棕色油的标题化合物(9.45g，21.6mmol，43.8%)。HPLC：^Et_Ret=4.22min；LC-MS=m/z417.0[M+H]⁺。

中间体105.4:(反式-4-氨基-环己基甲基)-(4-碘-苯基)-甲基-胺.

在0℃下，将TFA(114ml，1484mmol)滴加至含于DCM(300ml)中的中间物77.1(21.9g，49.5mmol)的溶液中。在室温下，搅拌该反应混合物30min，随后在真空下浓缩。用EtOAc稀释该残留物，并在0℃下藉由添加2MNaOH调整至pH9。将该等相分离，并用EtOAc萃取水层。用水及盐水清洗有机层，在Na₂SO₄上干燥，并过滤。在真空中浓缩，获得呈灰色固体的标题化合物(16.9g，47.8mmol，97%)。HPLC：^Et_Ret=3.92min；LC-MS：m/z345.1[M+H]⁺。

中间体77.1:(4-{[(4-碘-苯基)-甲基-氨基]-甲基}-反式-环己基)-氨基甲酸叔丁酯

在室温下，将AcOH(0.199ml，3.48mmol)、甲醛(37%水溶液，0.259ml，3.48mmol)及NaBH(OAc)₃(737mg，3.48mmol)依序添加至含于DCM(15ml)中的中间物75.7(748mg，1.74mmol)的溶液中。在室温下搅拌该反应混合物2h，随后用DCM稀释，且用2MNaCO₃水溶液清洗(2x)。在NaSO₄上干燥有机相，过滤且蒸发至干。藉由Combi-FlashCompanion^TM(Iscoinc.)管柱层析(SiO₂；梯度洗脱，庚烷/AcOEt98:2→7:3)纯化所得的粗制物质，以获得呈无色固体的标题化合物(584mg，1.31mmol，76%)。TLC：R_F=0.36(庚烷/ACOEt3:1)；HPLC：^At_Ret=2.76min；LC-MS：m/z445.4[M+H]⁺；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)：0.90-1.13(m,4H),1.36(s,9H),1.48-1.66(m,3H),1.69-1.81(m,2H),2.87(s,3H),3.08-3.21(m,1H),3.12(d,J=7.1,2H),6.45-6.54(m,2H),6.68(d,J=8.1,1H),7.34-7.43(m,2H)。

中间体75.7:{4-[(4-碘-苯基氨基)-甲基]-反式-环己基}-氨基甲酸叔丁酯

在室温下，将AcOH(0.523ml，9.13mmol)、(4-甲酰基-环己基)-氨基甲酸第三丁酯(1.14g，5.02mmol)及NaBH(OAc)₃(1.94g，9.13mmol)依序添加至含于DCM(25ml)中的4-碘-苯胺(1g，4.57mmol)的溶液中。在室温下，搅拌该反应混合物1h，随后用Et₂O稀释，且依序用2MHCl水溶液及2MNa₂CO₃水溶液清洗。在Na₂SO₄上干燥有机相，过滤且蒸发至干。藉由Combi-FlashCompanion^TM(Iscoinc.)管柱层析(SiO₂；梯度洗脱，庚烷/AcOEt95:5→1:1)纯化所得的粗制物质，以获得呈无色固体的标题化合物(1.56g，3.62mmol，79%)。TLC：R_F=0.72(庚烷/AcOEt1:1)；HPLC：^At_Ret=2.64min；LC-MS：m/z431.4[M+H]⁺；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)：0.87-1.03(m,2H),1.03-1.17(m,2H),1.32-1.48(m,1H),1.37(s,9H),1.70-1.86(m,4H),2.76-2.86(m,2H),3.08-3.25(m,1H),5.77-5.89(m,1H),6.34-6.46(m,2H),6.59-6.71(m,1H),7.24-7.35(m,2H)。

中间体75.6:(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮

在室温下，搅拌含于1.25MHCl的MeOH溶液(128ml)中的中间物75.5(3.96g，7.98mmol)的溶液30min。将该反应混合物蒸发至干，且将所得残留物溶于MeOH(40ml)中。在室温下，添加Et₃N(5.56ml，39.9mmol)，随后搅拌该混合物15min，且蒸发至干。藉由Combi-FlashCompanion^TM(Iscoinc.)管柱层析(SiO₂；梯度洗脱，[庚烷/DCM1:1]/TBME9:1→100%TBME)纯化所得的粗制物质，以获得呈灰白色固体的标题化合物(2.51g，7.24mmol，91%，ee92%)。TLC：R_F=0.13(庚烷/DCM/TBME1:1:2)；HPLC：^At_Ret=2.03min；LC-MS：m/z346.4[M+H]⁺；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)：1.16(d,J=6.1,3H),1.21(d,J=6.1,3H),3.36(d,J=19.8,1H),3.51(d,J=19.8,1H),3.72(s,3H),4.40(spt,J=6.1,1H),5.55(d,J=3.4,1H),6.79(s,1H),6.84(s,1H),7.26-7.33(m,2H),7.35-7.42(m,2H),8.49(d,J=39,1H)。

中间体75.5:{2-[(S)-(4-氯-苯基)-((S)-2-甲基-丙-2-亚磺酰氨基)-甲基]-4-异丙氧基-5-甲氧基-苯基}-乙酸乙基酯.

将中间物75.3(10.97g,28.6mmol)及无水THF(50ml)注入250-ml烧瓶中，随后在真空下排空，且用氩气再充满(3x)。在室温下，依序添加中间物75.4(15.75g，57.2mmol)及四氟硼酸双(乙腈)(1,5-环辛二烯)铑(I)(1.09g，2.86mmol)，且在60℃下加热所得的橙色悬浮液并搅拌2h。在60℃下，再添加四氟硼酸双(乙腈)(1,5-环辛二烯)铑(I)(1.09g，2.86mmol)，且再搅拌该混合物4h。将该反应混合物冷却至室温，用AcOEt稀释，且用水清洗。在Na₂SO₄上干燥有机相，过滤并蒸发至干。藉由Combi-FlashCompanion^TM(Iscoinc.)管柱层析(SiO₂；梯度洗脱，庚烷/AcOEt95:5→3:7)纯化所得的粗制物质，以获得呈褐色树脂的标题化合物(3.96g，7.98mmol，28%)。TLC：R_F=0.29(庚烷/AcOEt1:1)；HPLC：^At_Ret=2.70min；LC-MS：m/z496.3[M+H]⁺；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)：1.10-1.19(m,15H),1.23(d,J=5.9,3H),3.57(d,J=16.4,1H),3.68(d,J=16.1,1H),3.73(s,3H),3.93-4.05(m,2H),4.37-4.45(m,1H),5.62(d,J=6.1,1H),5.82(d,J=6.1,1H),6.82(s,1H),6.94(s,1H),7.25-7.30(m,2H),7.36-7.41(m,2H)。

中间体75.4:(4-氯-苯基)-三甲基-锡烷.

在-10℃下，将含于Et₂O中的溴化4-氯苯基镁的1M溶液(92ml，92mmol)历时40min缓慢添加至含于THF中的氯化三甲基锡的1M溶液(92ml，92mmol)中，使得该温度不超过0℃。添加之后，将冷浴移除，且在室温下搅拌所得悬浮液1h。添加NH₄Cl的饱和水溶液(14ml)，接着添加水，直至沉淀物完全溶解。将该混合物转移至分液漏斗中，并用Et₂O萃取(3x)。在NaSO₄上干燥合并的有机部份，过滤并蒸发至干。藉由Combi-FlashCompanion^TM(Iscoinc.)管柱层析(SiO₂；用环己烷等溶度洗脱)纯化所得的粗制物质，以获得呈无色油的标题化合物(24.47g，89mmol，97%)。TLC：R_F=0.76(环己烷/AcOEt95:5)；HPLC：^At_Ret=3.25min；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)：0.31(s,9H)7.32-7.36(m,2H)7.41-7.45(m,2H)。

中间体75.3:(4-异丙氧基-5-甲氧基-2-{[(E)-(S)-2-甲基-丙-2-亚磺酰亚氨基]-甲基}-苯基)-乙酸乙基酯.

在0℃(冰浴)下，将Ti(OEt)₄(27.3ml，130mmol)添加至含于DCM(200ml)中的中间物75.2(9.14g，32.6mmol)及(S)-(-)-2-甲基-2-丙烷亚磺酰胺(5.93g，48.9mmol)的溶液中。在回流下加热该反应混合物，搅拌5h，随后冷却至室温，且藉由小心添加水(14.7ml)骤冷。经由硅藻土垫过滤所得的白色沉淀物，用DCM清洗该滤饼，且随后将滤液蒸发至干。藉由Combi-FlashCompanion^TM(Iscoinc.)管柱层析(SiO₂；梯度洗脱，庚烷/AcOEt95:5→1:1)纯化所得的粗制物质，以获得呈黄色油的标题化合物(11.07g，28.9mmol，89%)。TLC：R_F=0.40(庚烷/AcOEt1:1)；HPLC：^At_Ret=2.35min；LC-MS：m/z384.5[M+H]⁺；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)：1.17(t,J=7.1,3H)1.15(s,9H)1.27(d,J=6.1,6H)3.83(s,3H)3.94-4.07(m,4H)4.58-4.66(m,1H)7.04(s,1H)7.50(s,1H)8.49(s,1H)。

中间体75.2:(2-甲酰基-4-异丙氧基-5-甲氧基-苯基)-乙酸乙基酯.

在0℃(冰浴)下，将SnCl₄(1MDCM溶液，95ml，95mmol)历时45min缓慢添加至含于DCM(350ml)中的中间物75.1(11.94g，47.3mmol)及二氯甲氧基甲烷(8.56ml，95mmol)的溶液中。添加之后，在0℃下再搅拌该反应混合物45min，随后倒入水，并用DCM萃取(2x)。用2MNa₂CO₃水溶液清洗有机相，随后，在Na₂SO₄上干燥，过滤并蒸发至干。藉由Combi-FlashCompanion^TM(IscoInc.)管柱层析(SiO₂；梯度洗脱，庚烷/AcOEt95:5→1:1)纯化所得的粗制物质，以获得呈黄色油的标题化合物(11.13g，39.7mmol，84%)，其放置后结晶成灰白色固体。TLC：R_F=0.50(庚烷/AcOEt1:1)；HPLC：^At_Ret=1.93min；LC-MS：m/z281.4[M+H]⁺；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)；1.18(t,J=7.1,3H)1.28(d,J=6.1,6H)3.84(s,3H)4.01(s,2H)4.07(q,J=7.1，2H)4.56-4.68(m,1H)7.03(s,1H)7.45(s,1H)9.93(s,1H)。

中间体75.1：(4-异丙氧基-3-甲氧基-苯基)-乙酸乙基酯

在60℃下，加热含于DMF(100ml)中的乙基(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-乙酸乙酯(11.22g，53.4mmol)及K₂CO₃(22.13g，160mmol)的混合物。添加2-碘丙烷(9.06ml，91mmol)，且在60℃下，强力搅拌该混合物5h。将该反应混合物冷却至室温，用AcOEt稀释，并用水清洗。将水相分离，且用AcOEt进一步萃取。在Na₂SO₄上干燥合并的有机部份，过滤，并蒸发至干。藉由Combi-FlashCompanion^TM(IscoInc.)管柱层析(SiO₂；梯度洗脱，庚烷/AcOEt98:2→3:1)纯化所得的粗制物质，以获得呈无色油的标题化合物(11.94g，47.3mmol，89%)。TLC：R_F=0.44(庚烷/AcOEt7:3)；HPLC：^At_Ret=2.14min；LC-MS：m/z253.4[M+H]⁺；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)：1.28(t,J=7.1,3H),1.38(d,J=6.1,6H),3.56(s,2H),3.87(s,3H),4.17(q,J=7.1,2H),4.50(h,J=6.1,1H),6.77-6.89(m,3H)。

制备实施例106化合物的硫酸盐的结晶型I的方法

A：浆液法

溶剂：异丙醇

(1)首先，将约5mg的原料药溶于100μlIPA中。

(2)将364μl0.025N硫酸极缓慢地添加至该溶液中，此允许在60℃搅拌期间缓慢沉淀。

(3)在室温下，搅拌该悬浮液过夜。

(4)藉由离心移除上清液。

(5)在40℃真空烘箱中干燥固体产物，且藉由XRPD(X射线粉末衍射)进行研究。扩大该工艺的规模，且使用XRPD另外对大规模样品进行特征分析。获得结晶型I。

在室温下，使用配备有自动样品改变器、θ-θ测角器、自动光束发散狭缝、二次单色仪及闪烁计数器的BrukerAXSGMBHD8Discover粉末X射线衍射仪(CuKα辐射)，收集X射线衍射数据。藉由在一玻璃过滤器中轻轻挤压该化合物，制备用于分析的样品。该样品在旋转的同时受铜Kα1X-射线(波长=1.54184埃)辐射，其中以40kV/40mA操作该x射线管。使用以连续模式(设定为在5度至45度的2θ范围内的120秒计数/0.02度步进)运行的测角器进行分析。将所获得的峰与硅参照标准物反向对准。

仪器名称：X射线衍射仪

型号：D8Discover

制造商：BrukerAXSGMBH

波长：1.54184_Cu

发生器设定值：40.00KV，40.00mA

单色仪

检测器：HI-STAR

帧尺寸：1024像素，107.79mm

实验方法

2θ开始值：5.0度

2θ结束值：45.0度

像素重迭：20%

积分步进：0.02度

扫描时间：120秒

温度：室温

表A：实施例106硫酸盐晶型I的XRPD数据（A：浆液法）

B:反溶剂法

溶剂：异丙醇

(1)首先，将约5mg的原料药溶于91μl0.025N硫酸IPA中。

(2)在55至60℃下，添加反溶剂甲基第三丁基醚，以使该化合物在搅拌期间沉淀。

(3)在55至60℃下，搅拌该悬浮液过夜。

(4)藉由离心移除上清液。

(5)在40℃真空烘箱中，干燥固体产物过夜，且藉由XRPD研究。扩大该制程的规模，且使用XRPD另外对大规模样品进行特征分析。获得结晶型I。

使用此方法，形成(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮硫酸氢盐单水合物。

表B：实施例106硫酸盐晶型I的XRPD数据（B：反溶剂法）

熟习晶体学者应了解，表及图式中所记录的各个峰的相对强度可由于诸多因素(如，X射线束中的晶体定向作用、及分析物质的纯度)而变化。峰位置亦可由于样品重量的变化而偏移，但仍是实质上相同。

据信所形成的硫酸盐是硫酸氢盐。

本发明亦涉及如本文所述的实例106硫酸盐结晶型I的制法。

图1揭示使用浆料法所获得的实施例106硫酸盐结晶型I的X射线粉末衍射数据。

图2揭示使用反溶剂法所获得的实施例106硫酸盐结晶型I的X射线粉末衍射数据。

Claims (11)

1.一种(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮硫酸盐的结晶型。

2.如权利要求1的(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮硫酸盐的结晶型，其中该硫酸盐系硫酸氢盐。

3.如权利要求2的(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮硫酸氢盐的结晶型，使用CuKα辐射时，其具有包括以下峰的粉末X射线衍射图：18.8、21.3及22.7°2θ角，其误差为+/-0.2°。

4.如权利要求2的(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮硫酸氢盐的结晶型，使用CuKα辐射时，其具有与本文图1中所示的粉末X射线衍射图实质上相同的粉末X射线衍射图。

5.如权利要求2的(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧代-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮硫酸氢盐的结晶型，使用CuKα辐射时，其具有与本文图2中所示的粉末X射线衍射图实质上相同的粉末X射线衍射图。

6.权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的结晶型在制备在个体中治疗由MDM2和/或MDM4的活性介导的失调或疾病的药物中的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述失调或疾病是增殖性失调或疾病。

8.权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的结晶型在制备用于调节个体的MDM2和/或MDM4活性的药物中的用途。

9.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的结晶型及一或多种药学上可接受的载剂。

10.一种组合物，其包含如权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的结晶型及一或多种治疗活性剂。

11.一种如权利要求10的组合物，其包含如权利要求1、2、3、4或5中任一项所述的结晶型及一或多种治疗活性剂，及一或多种药学上可接受的载剂。