JP4648949B2 - 鳥類卵膜を通して物質を注射およびサンプリングするための方法および装置 - Google Patents

Description

＜関連出願＞
本出願は、その開示があたかも全体として記載されているように参照して本明細書に組み込まれる２００４年１０月１３日に提出された米国仮特許出願第６０／６１８，１１０号の利益および前記特許出願に対する優先権を主張する。

＜発明の分野＞
本発明は、一般に卵、およびより特別には、卵に物質を注射する、および／または卵から物質を取り出すための器具に関する。

家禽類孵化場およびその他の卵処理施設では、卵は極めて多数で取り扱われて処理される。用語「処理する工程」は、医薬品、栄養素、ホルモンおよび／またはその他の有益な物質を用いて、胚が卵内に存在する間に（すなわち、インオボ（ｉｎ ｏｖｏ：卵内）で）生きている卵を処理する工程を含む。鳥類卵内への様々な物質のインビボ注射は、孵化後の罹病率および致死率を減少させるため、潜在的成長率もしくは結果として生じる鳥の最終的サイズを増加させるため、そして胚の性別確認に影響を及ぼすためにさえ実施されてきた。生きている卵内へのワクチンの注射は、鳥をインオボで免疫するために効果的に使用されてきた。家禽類産業では、発生中の胚内へ異種核酸分子を導入する（すなわち、トランスジェニック鳥を作製する）ため、または発生中の胚内へ異種細胞を導入する（すなわち、キメラ鳥を作製する）ために、インオボで胚を操作するのがさらに望ましい。

ウイルスのインオボ注射は、ワクチンの調製に使用するための特定ウイルスを増殖させるために利用できる。一部の用途については、例えば、Ｈｅｂｒａｎｋへの米国特許第６，２４４，２１４号に記載されたように、卵からの情報を収集するために胚を含有する卵の内側に感知器具を挿入するのが望ましいことがある。さらに、胚および胚体外物質を含む卵から物質サンプルを取り出すのが望ましいことがある。

インオボ処理物質の実施例およびインオボ注射の方法、ならびに複数の卵を取り扱うための装置は、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．への米国特許第４，４５８，６３０号およびＦｒｅｄｅｒｉｃｋｓｅｎ ｅｔ ａｌ．への米国特許第５，０２８，４２１号に記載されている。

上述したインオボ法の多くは、卵内での針、サンプリング器具または感知器具の正確な位置決めを必要とする。しかし従来型インオボ装置および方法を用いて卵の様々な区画内に針、サンプリング器具、または感知器具を正確かつ反復的に位置決めするのは難しいことがある。したがって、当分野においては、卵の様々な区画および場所の中に、針、感知器具およびサンプリング器具を含むがそれらに限定されない器具を正確かつ反復的に配置する改良された方法に対する必要がある。

上記の考察に照らすと、鳥類卵などの対象に物質を注射する、および／または対象から物質を取り出すための注射装置が提供され、本体部分および先端で終了するテーパ付き部分を有する注射針を含む。チューブは、実質的に注射針との同心関係で注射針に取り付けられて注射針の周囲で伸長している。チューブは、針先端から所定距離に配置された末端部分を有する。チューブ末端部分は、針先端を卵などの対象内へその対象の膜を通して挿入できる距離を制限するためのストッパーとして機能する。注射針とチューブとの間には環状空間が規定されている。物質が環状空間を通って流れるのを防止するために、シーラント物質などの物質が環状空間内に配置される。あるいは、注射針およびチューブは、それによって環状空間を排除するように融合できる。

本発明の他の実施形態によると、円板状の物質（または他の形状の物質）は、注射針先端から所定距離で注射針を取り囲むことができ、対象の膜もしくは他の組織と接触するとストッパーの機能を果たすことができる。円板状の物質は、様々な物質から形成することができ、実質的に任意の形状および立体構造を有していてよい。典型的な円板状の物質は、注射針の周辺に適用される接着性物質のビーズであってよい。

本発明の他の実施形態によると、検出器（例、重量計、ロードセルなど）を利用すると、針に取り付けられたストッパーによって卵の膜上にかけられた力を測定できる。針および／または針および針に取り付けられたストッパーにより膜にかけられた力もまた測定できる。

本発明の他の実施形態によると、装置は、卵殻に開口部を形成するように構成されている管状パンチを含む。針（例、注射針、サンプリング針など）は、パンチを通って、そしてパンチによって形成された卵殻の開口部を通って移動するためにパンチ内に位置決めされる。ストッパーは針に取り付けられ、針が卵内に挿入される距離を制限できるように、針がパンチを通って卵内に移動するとパンチに接触するように構成される。

本発明の他の実施形態によると、装置は、卵殻に開口部を形成するように構成されている管状パンチを含む。管状位置決め部材はパンチ内に相互に（往復できるように）配置され、針（例、注射針、サンプリング針など）は管状位置決め部材の内側に相互に配置される。位置決め部材は、開口部を通して卵内に下げられ、卵の膜（または他の卵内物質）に接触するように構成されている。いったん接触すると、位置決め部材はその下方への移動を停止させ、それが移動できないように適所に固定される。次に針は位置決め部材に対して所定量だけ卵内へ伸長させられ、物質が卵内へ注射される、および／または物質のサンプルが卵から採取される。

本発明の実施形態によると、位置決め部材によって膜にかけられた力を検出できる。

本発明の他の実施形態によると、針は位置決め部材として機能するように構成できる。針は、膜を位置決めする工程中に膜を破裂させるほど鋭くない鈍端を有する。膜と接触させられると、針は、卵内に物質を注射する、および／または卵から物質のサンプルを取り出すために十分な力で、そして所定距離だけ膜に通して押すことができる。

本発明の他の実施形態によると、鳥類の卵から物質をサンプリングするため、および／または鳥類の卵内へ物質を注射するための装置は、卵殻に開口部を形成するように構成されている管状パンチ、パンチ内に相互に配置された管状位置決め部材、および位置決め部材内に相互に配置された針を含む。固定器具はパンチに固定され、卵の膜に相対する適所に位置決め部材を固定するように構成されている。固定器具は、装置ハウジングの末端部分と嵌合的に係合するように構成されているテーパ付き末端部分を有する圧縮フランジである。フランジおよびハウジングが嵌め合い係合すると、フランジは位置決め部材の周囲で圧縮し、パンチに対する位置決め部材の移動を防止する。針は、位置決め部材を越えて卵内へ所定距離だけ伸長させられる。

本発明の実施形態による鳥類の卵に注射する、および／または鳥類の卵をサンプリングする方法は、所定位置に卵を向ける工程と、開口部を卵殻へ導入する工程と、卵殻の開口部を通して器具を伸長させる工程と、針先端によって卵内の膜を穿刺する工程と、針に取り付けられたストッパーが膜に接触するまで針を卵内へ伸長させる工程とを含む。針によって卵内に物質を置く、および／または卵から物質を取り出すことができる。さらに、卵内に伸長された器具と結び付けられた検出器によって卵の内部から情報を入手できる。その後、本器具は卵から抜去される。

本発明の実施形態による卵から尿膜腔液（ａｌｌａｎｔｏｉｃ ｆｌｕｉｄ）などの物質をサンプリングする方法は、気室を上にして卵を方向付ける工程とその殻内に開口部を形成する工程を含む。位置決め器具は、膜（例、漿尿膜（ＣＡＭ））との接触が検出されるまで開口部を通して伸長させられる。サンプリング器具は、所定量だけＣＡＭに通して位置決め器具から伸長させられ、尿膜腔液のサンプルがサンプリング器具によって入手される。

本発明の実施形態は、卵内の任意の場所（例、胚下腔）に器具を位置決めするために使用できる。本器具は、物質を送達するため、および／または物質を獲得するために、そして任意の胚発生段階で利用できる。

以下では、本発明の実施形態が図示されている添付の図面を参照して、本発明をより詳細に記載する。しかし本発明は、多数の様々な形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると見なすべきではなく、むしろこれらの実施形態は、本開示が完全かつ完璧であり、当業者に本発明の範囲を詳細に伝えるように提供する。

同様の番号は、全体を通して同様の要素を指す。図面において、線の太さ、層の厚さ、構成成分、要素もしくは機能は明確にするために誇張されていることがある。破線は、他に特に規定していない限り、任意の機能もしくは作動を例示している。本明細書に言及したすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる。

本明細書において本発明の説明に使用する用語は、特定の実施形態だけを記載する目的のためであり、本発明を限定することは意図されていない。本明細書で使用するように、単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかにそうでないことを示さない限り、複数形を含むことが意図されている。さらに、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および／または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書で使用する場合は、規定された機能、整数、工程、作動、要素、および／または構成成分の存在を規定するが、１つまたは複数の他の機能、整数、工程、作動、要素、構成成分、および／またはそれらの群の存在もしくは付加を排除しないことは理解される。本明細書で使用する用語「および／または」は、関連する列挙した項目の１つまたは複数の任意および全部の組み合わせを含む。本明細書で使用する「Ｘ〜Ｙの間」および「約Ｘ〜Ｙの間」などの言い回しは、ＸおよびＹを含むと解釈されたい。本明細書で使用する「約Ｘ〜Ｙの間」などの言い回しは、「約Ｘ〜約Ｙの間」を意味する。本明細書で使用する「約Ｘ〜Ｙ」などの言い回しは、「約Ｘ〜約Ｙ」を意味する。

特に規定しない限り、本明細書において使用する全ての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。さらに、一般に使用される辞書に規定されている用語などの用語は、本明細書および関連分野の状況におけるそれらの意味に一致する意味を有すると解釈すべきであり、本明細書に明示的にそのように規定されていない限り理想的もしくは過度に形式的意味で解釈されるべきではないと理解されたい。周知の機能もしくは構造は、簡潔さおよび／または明確さのために詳述されないことがある。

１つの要素がまた別の要素の「上に」、「取り付けられて」、「接続されて」、「結合されて」、「接触して」などと言及される場合は、１つの要素は他の要素の直接上に、取り付けられて、接続されて、結合されて、接触していてよい、または介在要素もまた存在していてよいと理解される。これとは対照的に、１つの要素が、例えばまた別の要素の「直接上に」、「直接取り付けられて」、「直接接続されて」、「直接結合されて」、または「直接接触して」いると言われる場合は、介在要素は存在しない。当業者には、他の機能に「隣接して」配置されている構造もしくは機能についての言及は、隣接機能に重複する、もしくはその下にある部分を有する可能性があることもまた理解される。

「下方」、「より下」、「低い」、「上方」、「上部」などの空間的相対語は、本明細書では図面に例示した１つの要素もしくは機能のまた別の要素もしくは機能との関係を記載するための説明を容易にするために使用することができる。空間的相対語は、図面に描出した方向に加えて使用もしくは操作における器具の相違する方向を含むことが意図されている。例えば、図面の中の器具が逆転すると、他の要素もしくは機能の「下方」もしくは「下の」として記載された要素は、他の要素もしくは機能の「上方」に方向付けられる。そこで、典型的用語「下方」は、「上方」および「下方」の両方の方向を含むことができる。本器具は、別な方向（９０度回転させて、または他の方向）に方向付けることができ、本明細書で使用した空間的相対記述子はそれに合わせて解釈できる。同様に、用語「上向きに」、「下向きに」、「垂直」、「水平」などは、詳細に他のことを指示していない限り、本明細書では説明することを目的に使用されている。

用語「第１」、「第２」などは本明細書では様々な要素、構成成分、領域、層、および／または区域を記載するために使用できるが、これらの要素、構成成分、領域、層、および／または区域はこれらの用語によって限定されてはならない。これらの用語は、１つの要素、構成成分、領域、層もしくは区域を他の要素、構成成分、領域、層もしくは区域から識別するためにのみ使用される。そこで、以下で考察する「第１」要素、構成成分、領域、層、もしくは区域は、本発明の教示から逸脱せずに「第２」要素、構成成分、領域、層、もしくは区域と呼ぶこともできよう。作動（もしくは工程）の順序は、他に特別に記載しない限り、特許請求の範囲もしくは図面に提示した順序に限定されない。

本明細書で使用する用語「鳥類」および「鳥類対象」は、任意の家禽種の雄および雌を含むことが意図されているが、主として卵、肉のために、またはペットとして商業的に育てられる家禽類を含むことが意図されている。したがって、用語「鳥類」および「鳥類対象」は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、インコ、オウム、バタンインコ、オカメインコ、ダチョウ、エミューなどを含むがそれらに限定されない様々な鳥類を含むことが特に意図されている。

本明細書で使用する用語「初期胚」は、産卵時（胚盤葉段階）から始原生殖細胞（ＰＧＣ）が移動するほぼ発達段階までの鳥類胚を指す。特にニワトリ胚に関して、「初期胚」は一般に約胚形成期２０（Ｈ＆Ｈ）胚以前である。ニワトリ胚の発生段階は、当分野においてよく理解され（例えばＴｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｃｈｉｃｋ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｒ．Ｂｅｌｌａｉｒｓ ＆ Ｍ．Ｏｓｍｏｎｄ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９８を参照されたい）、本明細書では詳細に考察する必要はない。

本明細書で使用する用語「胚盤葉」は、当分野において理解されている意味を有する。一般に、胚盤葉は、産卵時から原腸胚形成終了時までの胚を含む。胚盤葉は、時々は当分野におけるまた別の名称である「胚盤（ｇｅｒｍｉｎａｌ ｄｉｓｃまたはｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｉｓｃ）」とも呼ばれる。胚盤葉は、初期胚における卵割中に形成されて原腸胚形成終了時まで遺残細胞の平らな細胞円板であると説明することができる。産卵時までに、胚盤葉の２つの主要な領域である中心に位置する明域および周辺に位置する暗域を視認することができる（Ｔｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｃｈｉｃｋ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｒ．Ｂｅｌｌａｉｒｓ ＆ Ｍ．Ｏｓｍｏｎｄ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９８）。特にニワトリ胚に関しては、胚盤葉は、典型的には産卵時（すなわち、第ＩＸ期もしくは第Ｘ期（ＥＧ＆Ｋ）から約第ＸＩＩＩ期（ＥＧ＆Ｋ））以降の胚であると特徴付けられている。

本明細書で使用する用語「注射」および「注射する工程」は、物質を卵もしくは胚内へ送達もしくは放出する方法、物質（すなわち、サンプル）を卵もしくは胚内から取り出す方法、および／または検出器具を卵もしくは胚内へ挿入する方法を含む、器具を卵もしくは胚内へ挿入する方法を含む。

用語「キメラ鳥」もしくは「キメラ胚」は、「ドナー」と呼ばれる各々別の鳥もしくは胚由来の細胞（すなわち、体細胞および／または生殖体）を含有するレシピエント鳥もしくは胚を指す。

用語「トランスジェニック鳥」および「トランスジェニック胚」は、本明細書ではそれらが当分野において一般に理解されている意味によって使用される。トランスジェニック鳥もしくはトランスジェニック胚は、１つまたは複数の細胞中に異種核酸配列を含有している。

本明細書に使用する用語「膜」は、卵内の所望の場所を越えて針が挿入されることを防止できるように、針に取り付けられたストッパーまたはその他のインオボ器具に係合する卵内の組織の任意の層を指す。卵内の典型的な膜には、外卵殻膜、内卵殻膜、漿尿膜、卵黄膜（ＶＭ）、および羊膜が含まれるが、それらに限定されない。

ここで図１Ａを参照すると、本発明の実施形態による、鳥類の卵などの対象に物質を注射する、および／または鳥類の卵から物質を取り出すための注射装置１０が図示されている。図示した注射装置１０は、本体部分１４および先端１２ｂで終了するテーパ付き部分１２ａを有する注射針１２を含む。先端１２ｂは鈍端であってよい、または針ルーメンと連絡しているアパーチャ（図示していない）をその中に有していてよい。針および針内のルーメンは、本発明の当業者によって明確に理解される。先端１２ｂが鈍端であれば、アパーチャは先端に隣接する針の側面に形成され、針ルーメンと連絡している。

チューブ１６は、実質的に注射針との同心関係で注射針１２に取り付けられて注射針の周囲で伸長している。チューブ１６は、針先端１２ｂから所定距離に配置された末端部分１６ａを有する。チューブ末端部分１６ａは、針先端１２ｂを卵などの対象の膜もしくはその他の組織を通して挿入できる距離を制限するためのストッパーとして機能する。

チューブ１６は、針１２を完全に取り囲んで伸長する必要はない。チューブ１６は、本発明の実施形態によると、針１２を部分的にのみ取り囲んでいてよい。

図１Ｂは、本発明の他の実施形態による、鳥類の卵などの対象に物質を注射する、および／または鳥類の卵から物質を取り出すための注射装置１０’を図示している。図１Ｂでは、注射針１２’’は、図示したように極めて細長い本体部分１４’を有する「プルドピペット型」針である。

図１Ａ〜１Ｂに図示した注射針１２、１２’は、当業者には理解されるように様々な方法でチューブ１６に取り付けることができる。例えば、針および取り囲んでいるチューブは、相互に接着させることができる、または任意の様々な既知の方法によって融合させることができる。本発明の実施形態は、注射針１２、１２’およびチューブ１６を付着させる任意の特定方法に限定されない。

図１Ａ〜１Ｂに図示した注射針１２、１２’は、ガラス、金属、およびポリマー材料を含むがそれらに限定されない様々な材料から形成できる。典型的な注射針は、Ｈｕｍａｇｅｎ，Ｉｎｃ．から入手できる。さらに、様々な形状、サイズおよび立体構造を有する注射針は、本発明の実施形態によって利用できる。針は、卵内に物質を注射する、または卵から物質をサンプリングするための、鈍端およびその側面に形成された１つまたは複数のアパーチャもまた有することができる。本発明の実施形態は、図示した注射針１２、１２’に限定されない。注射針１２、１２’を取り囲んでいるチューブ１６は、ガラスおよび金属を含むがそれらに限定されない様々な材料から形成することもできる。

図１Ａ〜１Ｂの図示した実施形態では、環状空間２０が注射針１２、１２’およびチューブ１６の間に規定されている。シーラント物質１２は、図２に示したように、物質が環状空間２０を通って流れるのを防止するために環状空間２０内に配置される。当業者に既知の様々なタイプのシーラント物質は、制限なく利用できる。本発明の実施形態によると、チューブ１６および針１２、１２’は、環状空間が存在しないように融合させることができる。

本発明の実施形態によると、注射針１２、１２’は、約１．９８ｍｍの外径および約１．２ｍｍの内径を有するキャピラリチューブ１６内に配置されている。しかし、本発明の他の実施形態によると、チューブ１６は、制限なく、様々な径、長さ、および他の寸法を有していてよい。

図３は、チューブ１６がストッパーとして作用して卵１内の膜２と接触している結果として卵１内の規定深さへ伸長した注射針１２の先端１２ｂを備える図１Ａの注射装置１０を示している。膜２は、卵の内部に位置する多数の膜のいずれかであってよい。針の先端１２ｂは、卵内の様々な場所のいずれかに位置決めできる。図３に示した場所３は、胚盤葉である。

本発明の他の実施形態によると、図４Ａ〜４Ｂに示したように、円板状の物質３０は、注射針１２の先端１２ｂから所定距離で注射針１２を取り囲むことができ、ストッパーの機能を果たすことができる。図４Ｂに示したように、針１２の卵内への挿入は、円板状の物質３０が膜２に接触すると停止する（例えば、針の下方移動が停止させられる）。円板状の物質３０は、様々な物質から形成することができ、実質的に任意の形状および立体構造を有していてよい。さらに、円板状の物質は、針１２上の実質的に任意の場所に配置できる。典型的な円板状の物質は、注射針１２に（例えば、周囲に、または部分的周囲に）適用される接着性物質のビーズであってよい。

本発明の他の実施形態によると、図５に示したように、力検出器４０を利用すると、ストッパー、針、および／または針およびストッパーによって卵の膜にかけられた力を測定することができる。図示した実施形態では、力検出器４０は、卵１の下に配置された重量計である。ストッパー（例、チューブ１６）が卵１内で膜２と接触すると、下向きの力が重量計５０上で測定される。典型的な重量計は、Ｏｈａｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（ニュージャージー州パインブルック）から入手できる。さらに、針１２が膜２を貫通するために必要な力は、力検出器４０によって測定できる。この力の測定は、オペレータが、卵内に挿入されている針、もしくは他の器具の位置を検出することを可能にする。

または、ロードセルを力検出器４０として利用できる。当業者には理解されるように、増幅および／またはフィルタリング回路は、ロードセルと結び付けて出力を高めて望ましくないノイズを取り除くために利用できる。アナログ／デジタル変換器（例、ＵＳＢ ＬａｂＪａｃｋ Ｕ１２、ＬａｂＪａｃｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、コロラド州レークウッド）を利用すると、何らかのレートで力信号を獲得することができ、時間に対して力信号をグラフ表示するためにはソフトウエアプログラム（例、ＬａｂＶｉｅｗ ７．０、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、テキサス州オースチン）を使用できる。

重量計／ロードセルの使用もまた、エッグフラット内の卵の存在を検出するために利用できる。例えば、針が下げられたのに力が記録／検出されない場合は、卵が存在しないことが分かる。そこで、針を介しての物質の注射は実施されない。

図６Ａ〜６Ｂを参照すると、本発明の実施形態による装置は、卵１の殻内に開口部を形成するように構成されている管状パンチ５０を含むことができる。図示した実施形態では、管状位置決め部材６０はパンチ５０内に相互に配置され、針１２は位置決め部材６０内に相互に配置されている。図６Ａでは、パンチは卵１の殻内に開口部を形成する。図６Ｂでは、パンチは卵１から抜去され、パンチ５０内で相互に可動性である位置決め部材６０は、位置決め部材６０が膜２に接触するまで卵１内へ下方に移動する。接触すると、位置決め部材６０は卵内への下向きの移動を停止させる。図６Ｃでは、位置決め部材６０が適所に固定され、針１２は位置決め部材６０を越えて卵内に所定距離だけ伸長させられている。位置決め部材６０は、様々な方法のいずれかによって適所に固定できる。本発明の実施形態と結び付けて利用できる典型的な注射針−パンチの立体構造は、米国特許第４，９０３，６３５号；第５，１３６，９７９号；およびＲＥ３５，９７３の中に記載されている。

図７は、本発明の特定の実施形態を例示しているフローチャートである。最初にブロック２００を参照すると、鳥類の卵が所定位置に（例えば、卵の鈍端を一般に上向きにする位置に、または卵を横向きに配置して）方向付けられる。卵は、実質的に任意の位置に方向付けることができる。例えば、卵は、貯蔵期間中に（長軸に対して）水平もしくは垂直位置に、またはそれからある角度で方向付けることができる。特定の実施形態では、卵は、注射／サンプリングのために使用する方向と同一方向で貯蔵できる。さらに、卵は、横方向移動および卵の長軸周囲の回転の両方が制限もしくは防止される固定位置（例、器具内）で保持することができる。

開口部は、パンチまたは当業者に既知の他の器具によって卵殻に導入される（ブロック２１０）。本発明の実施形態によると、少なくとも注射部位の周囲の卵の表面は、細菌（もしくは他の）汚染を減少させるために（例えば、アルコールもしくは他の消毒液を用いて）消毒することができる。しかし、注射部位を含む卵を消毒する工程は、本発明の実施形態に関しては必要とされない。

器具は、卵殻の開口部に通して伸長させられる（ブロック２２０）。卵内の膜（もしくは他の組織）は注射針によって穿刺され、針は針に取り付けられたストッパーが卵内への針の下方移動を停止させる膜に接触するまで卵内に伸長させられる（ブロック２２２）。注射針によって物質を卵内に置く、および／または卵から物質を取り出される（ブロック２３０）。センサによって卵の内部から情報を検出することもできる（ブロック２４０）。その後、器具は卵から抜去される（ブロック２５０）。

または、位置決め部材が、位置決め部材の下方移動を停止させる卵内の膜に接触するまで卵殻の開口部に通して伸長させられる（ブロック２２４）。次に位置決め部材が正位置に固定される。針、サンプリング器具および／またはセンサは、針、サンプリング器具および／またはセンサを所望の場所で正確に位置決めするために位置決め部材を越えて所定量だけ伸長させられる。卵内に物質を置く、および／または卵から物質を取り出される（ブロック２３０）。センサによって卵の内部から情報を検出することもできる（ブロック２４０）。その後、器具（位置決め部材および針）は卵から抜去される（ブロック２５０）。

本明細書に記載の方法は、完全手動、完全自動化、または半自動化であってよい。例えば、卵を調製する、および胚を位置決めする工程は、手動方法のためにより適合する可能性がある。卵殻に開口部を導入する、および注射装置を挿入する工程は手動であってよいが、好ましくは自動化されている。

一部の実施形態では、例えば、米国特許第６，０３２，６１２号に記載されているように、複数部位注射もしくはサンプリング器具を使用できる。その他の典型的な送達および／またはサンプリング器具には、米国特許第５，１３６，９７９号；米国特許第４，６８１，０６３号および第４，９０３，６３５号；ならびに米国特許第４，０４０，３８８号、第４，４６９，０４７号、および第４，５９３，６４６号に記載された器具が含まれる。

さらにまた別の実施形態では、米国特許第６，２４４，２１４号に記載された検出器をさらに含む注射装置が、卵内への注射の前もしくは同時に（卵もしくは胚から物質をサンプリングする、および／または卵もしくは胚内へ物質を送達する目的で）胚（例、胚盤葉）もしくは卵の他の部分もしくは区画の位置に関する情報を収集するために使用される。

当業者であれば、例えば商業的養鶏場において本発明の方法を複数の卵に実施する方法を理解する。

図８Ａ〜８Ｂを参照すると、本発明の実施形態による注射装置１０’’は、卵１の殻内に開口部を形成するように構成されている管状パンチ５０を含む。注射針（またはサンプリング器具、検出器など）１２は、パンチ５０内に配置され、パンチを通り、パンチ５０によって形成された卵殻の開口部を通る相互移動のために構成される。ストッパー３０は針１２に取り付けられ、針が卵１内に挿入される距離を制限できるように、針１２がパンチ５０を通って卵１内に移動した場合にパンチ５０の上端５０ａに接触するように構成されている。図８Ａでは、パンチ５０は卵１の殻内に開口部を形成する。図８Ｂでは、パンチ５０は、位置決め部材として機能し、パンチの下方移動が停止させられるとすぐに膜２が接触するまで下方へ伸長する。その後、パンチは適所に固定できる。針１２は、ストッパー３０がパンチ５０の上端５０ａに接触するまで卵１内へ下方移動する。そこで、針１２は、パンチ／位置決め部材によって膜２と接触させられた後に卵内へ所定距離だけ伸長させられる。

典型的な実施形態では、本発明は、初期胚（例、胚盤葉）を含有する卵へ物質を正確かつ繰り返し送達するため、または初期胚自体、例えば胚下腔へ物質を送達するために使用できる。細胞、トランスジェニック細胞、ワクチン、ポリペプチド、成長促進物質、競合的排除培地などの共生培養、抗生物質、遺伝子導入ベクターを含む異種ヌクレオチド配列、ビタミン類、および／または色素などのマーカーなどを含むがそれらに限定されない任意の物質を本発明の実施形態により注射できる。物質は、単独で、または組み合わせて注射できる（例、抗生物質を他の物質の送達とともに含むことができる）。また別の具体的実施例として、所望の場所に対する送達であったかどうかを決定する手段を提供するために、色素もしくは他のマーカーを他の物質とともに含めることができる。

本発明は、当該のヌクレオチド配列を発達中の胚内へ導入するため（好ましくは、ヌクレオチド配列が胚細胞内へ安定的に形質転換される）、すなわち（上記に規定した）トランスジェニック鳥を作製するためにも有益に使用できる。他の実施形態では、本発明は、異種もしくは「ドナー」細胞をレシピエント胚へ導入する（すなわち、上記に規定したように、キメラ胚、および任意でキメラ鳥を作製する）ために使用できる。

図９を参照すると、本発明の実施形態による、卵から物質（例、尿膜腔液など）をサンプリングする方法が示されている。卵は気室を上に向けて方向付けられ（ブロック３００）、開口部がその殻内に導入される（ブロック３１０）。卵の操作および卵殻での開口部の形成は当業者に周知であり、本発明の実施形態による様々な方法で遂行できる。

位置決め器具は、膜（例、漿尿膜（ＣＡＭ））との接触がされるまで卵殻の開口部に通して伸長させられる（ブロック３２０）。位置決め器具の移動が停止させられ、次に好ましくは様々な既知のいずれかの方法によって適所に固定される。位置決め器具は、卵殻に開口部を形成するために利用されるパンチ内に収容できる。しかし、本発明の実施形態は、そのような立体構造に限定されない。位置決め器具は、ＣＡＭなどの膜と接触するように、そしてサンプリング／注射／検出器具がそれから伸長するのを許容するように構成されている限り、実質的に任意の形状および立体構造を有していてよい。

膜との接触は、膜上にかけられた力によって検出される。図５に関して上記で記載のように、力検出器を利用すると、位置決め器具によって膜にかけられた力を測定できる。膜にかけられた力は、重量計、ロードセルもしくは任意の他の力または圧感知器具によって測定できる。膜との接触からの力は、膜は約３０ｇを越える力では破裂する可能性があるので、約３０ｇを越えてはならない。

本発明の実施形態によると、サンプリング器具は、膜に通して位置決め器具から所定量だけ伸長させられ（ブロック３３０）、尿膜腔液のサンプルがサンプリング器具によって入手される（ブロック３４０）。サンプリング器具は、当業者には理解されるように、卵から尿膜腔液を引き出すために構成されている針であってよい。例えば、針は、鈍先端および針の先端に隣接する部分内に形成されたアパーチャで終了する軸方向に伸長するルーメンを有していてよい。尿膜腔（もしくは他の）液は、ルーメンを真空にさせるとアパーチャを介してルーメンに引き入れることができる。鈍端は、ルーメンが物質で詰まるのを防止する。

サンプリング器具が伸長させられる距離は、典型的には約３ｍｍ〜約５ｍｍである。しかし、他の距離および距離範囲が可能である。本発明の実施形態によると、サンプリング器具は、上述したように、サンプリング器具を膜に通して挿入できる距離を制限するストッパーを含むことができる。本発明の他の実施形態によると、注射器具もしくは検出器具は、固定された位置決め器具から卵内へ伸長させることができる。

本発明の実施形態は、血液、羊水、および尿膜腔液を含むがそれらに限定されない任意のタイプの液体を鳥類の卵から入手するために有益である。

本発明の実施形態は、鳥類の卵から尿膜腔液を入手するために特に有益である。群、群年齢、貯蔵期間および他の因子における変動に伴って、ＣＡＭの所在位置および完全性は極度に変動する可能性がある。したがって、針が設定深さへ移動する従来型方法によって尿膜腔液のサンプルを入手する工程は、不良および／または変動性のサンプリング精度を生じさせることが多い。本発明の実施形態は、積極的にＣＡＭを配置するので、したがって尿膜腔液内、ならびに血液もしくは羊水などの他のタイプの液体内でのサンプル針の正確な位置決めを保証する。

ここで図１０Ａ〜１０Ｆを参照すると、本発明の実施形態による、鳥類の卵から物質をサンプリングする、および／または鳥類の卵に物質を注射するための注射装置１００が図示されている。図示した装置１００は、卵１の殻内に開口部を形成するように構成されている管状パンチ５０を含む。図示した実施形態では、管状位置決め部材６０はパンチ５０内に相互に配置され、針１２は位置決め部材６０内に相互に配置されている。固定器具１０２はパンチ５０に固定され、卵１の膜２に相対する適所に位置決め部材６０を固定するように構成されている。図示した固定器具１０２は、装置１００のハウジング１０４のテーパ付き末端部分１０４ａと嵌合的に係合するように構成されているテーパ付き末端部分１０２ａを有する圧縮性フランジである。フランジ１０２およびハウジング１０４が嵌め合い係合すると、フランジは位置決め部材６０の周囲で圧縮し、パンチ５０に対する位置決め部材６０の移動を防止する。本発明の実施形態は、位置決め部材６０を固定するための図示したフランジ１０２に限定されない。位置決め部材６０を固定するためには、制限なく、様々なタイプの器具を利用できる。

図１０Ａでは、装置１００は、パンチ５０が卵１の殻内に開口部を形成する（図１０Ｂ）ように、下方へ移動している。図１０Ｃでは、パンチ５０内で相互に可動性である位置決め部材６０は、位置決め部材６０が膜２に接触するまで卵１内へ下方に移動する。接触すると、位置決め部材６０は卵内へのその下向きの移動を停止させ、膜２の上部で「自由浮動」する。用語「自由浮動する」は、位置決め部材６０が膜２上で静止し、位置決め部材６０には他の荷重が全くかけられないことを意味する。

さらになお図１０Ｃを参照すると、ハウジング１０４はさらに下方移動し、フランジ１０２と係合し（図１０Ｄ）、パンチ５０に対して位置決め部材６０を固定する。ハウジング１０４は、図１０Ｅに示したように、次にそれに係合したフランジ１０２とともに上方へ移動する。そこで、フランジ１０２、パンチ５０および位置決め部材６０は、１ユニットとして上方へ移動する。図１０Ｆに示したように、ハウジングが所定量だけ上昇させられると、位置決め部材６０は、もはや膜２と接触関係にはない。針１２は、位置決め部材６０を越えて卵内へ所定距離だけ伸長させられる。図示した実施形態では、ストッパー１０６は位置決め部材６０に取り付けられている。針１２は、それに結び付けられたストッパー１０８をさらに含む。針１２が卵内へ下向きに移動すると、針ストッパー１０８は、針１２の下方移動を停止させる位置決め部材ストッパー１０６に係合する。ストッパー１０６、１０８は、針１２が卵内に所定量だけ挿入されるのを可能にするように構成されている。

上記は本発明の例示であり、それを限定すると見なされてはならない。本発明の少数の典型的実施形態が記載されているが、当業者であれば、本発明の新規の教示および長所から実質的に逸脱せずに典型的実施形態において多数の修飾が可能であることを容易に理解する。したがって、すべてのそのような修飾は、特許請求の範囲に規定された本発明の範囲内に含まれることが意図されている。本発明は、本明細書に含まれる特許請求の範囲の同等物とともに、以下の特許請求の範囲によって規定される。

本発明の実施形態による、注射装置の側面図である。 線２−２に沿った図１Ａの注射装置の断面図である。 卵の中に挿入された図１Ａの注射装置および膜と接触した関係にあるストッパーを備える、卵の断面図である。 本発明のまた別の実施形態による、それに取り付けられたストッパーを有する注射針の斜視図である。 膜と接触した関係にあるストッパーを備えた、卵の中に挿入された図４Ａの注射装置卵の断面図である。 本発明の他の実施形態による、卵の中に挿入された図１Ａの注射装置および力検出器と接触した関係にある、卵の断面図である。 本発明の実施形態による、パンチ内に相互に配置された位置決め部材および位置決め部材内に相互に配置された針を有する装置の側断面図である。 本発明の特定の実施形態を例示しているフローチャートである。 ストッパーを備える注射針を有する注射装置の側断面図であり、針は卵殻に開口部を形成するように構成されている管状パンチによって取り囲まれ、パンチは図８Ａでは卵殻の開口部を形成し、注射針は図８Ｂでは卵内に挿入される。 本発明の特定の実施形態を例示しているフローチャートである。 本発明の実施形態による、パンチ内に相互に配置された位置決め部材および位置決め部材内に相互に配置された針を有する装置の側断面図である。

Claims (6)

1. 卵内に器具を挿入する方法であって、
   鳥類卵を所定位置に方向付ける工程と、
   前記卵殻に開口部を導入する工程と、
   前記卵殻の開口部に通して器具を伸長させる工程と、ここで、前記器具は、
   先端を含む針と、
   前記針先端から所定距離で前記針に取り付けられたストッパーであって、卵の膜を通して前記針先端を卵内へ挿入できる距離を制限するストッパーと
   を含み、
   前記注射針先端で膜を穿刺し、前記ストッパーが前記膜に接触するまで前記針先端を前記卵内へ伸長させる工程と
   を含む方法。
2. 前記器具が、
   （ｉ）送達器具であり、前記方法が、前記穿刺する工程の後に、前記送達器具を通して物質を放出させて前記物質を卵内に置く工程をさらに含む；
   （ｉｉ）サンプリング器具であり、前記方法が、前記穿刺する工程の後に、前記卵から物質のサンプルを取り出す工程をさらに含む；又は、
   （ｉｉｉ）検出器具であり、前記方法が、前記穿刺する工程の後に、前記卵の内部から検出器具情報を用いて情報を検出する工程をさらに含む
   を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記卵が胚盤葉を含有し、前記器具が前記卵殻の開口部を通して前記胚盤葉内の場所へ伸長させられる、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ストッパーが円板状の物質を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 前記ストッパーが前記針と実質的同心関係で前記針に取り付けられて前記針の周囲で伸長しているチューブを含み、前記チューブが前記針先端から所定距離で位置決めされた末端部分を有し、前記チューブ末端部分が、前記針先端を卵の膜を通して卵内に挿入できる距離を制限するストッパーとして機能する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 卵殻に開口部を導入する工程が、管状パンチを用いて開口部を形成する工程を含み、卵殻の開口部を通して器具を伸長させる工程が、前記パンチを通して、次に前記卵殻に形成された開口部を通して前記注射針を移動させる工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。

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