JP4627263B2 - ラクトフェリン・ポリペプチド及びその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ラクトフェリン分子中に含まれる、炎症性サイトカインの産生誘導能、ケモカインの産生誘導能などの炎症誘起作用を有する新規ペプチドに関する発明である。
ラクトフェリンは多機能性の糖タンパクで、各種疾患において乳汁、唾液、涙、糞便、尿や血液などの体液中に増加する。また、抗菌作用、抗ウイルス作用、リンパ球の活性化作用、抗腫瘍作用鉄結合性など、生体にとって有益な作用が数多く報告されている（非特許文献１：Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．１９９５．１５．９３−１１０．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．１９９６．４０．２５７−２６２．，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．２００１．５７．２４０−２４９．，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２００２．６４．８７３−８７８．）。そのため、ラクトフェリンを各種疾患に応用する研究が多く成されている。
一方、細菌性疾患で増加するラクトフェリンは、細菌の産生する酵素などにより切断されその作用は失活するものと考えられている（非特許文献２：ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９９６．１４５．２０９−２１４．，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９８．９５．，１２６４１−１２６４６．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３．４７．６０７−６１７．）。
そのため、感染菌による炎症像がラクトフェリンの存在にもかかわらず悪化すると考えられている。また、ウシの細菌性疾患であるウシ乳房炎において、乳汁中に催炎作用を示す「炎症性ラクトフェリン」という分子量３０〜６０ｋＤａのラクトフェリン蛋白群が増加し、炎症を増悪することが報告されている（特許文献１：特開２００３−２８９７４９号公報）。しかしながら、この炎症性ラクトフェリン蛋白群においては、催炎作用を示す詳細な部位も構造も明らかとされておらず、その性状と生理的な作用意義には不明の点が多い。
一方、特許文献２（特開２００４−００２４７１号公報）には、次のペプチドが記載されている。
「Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ」のアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
また、特許文献２には、ウシ・ラクトフェリンを、プロテアーゼにより酵素分解し、酵素分解物から上記ペプチドを採取する技術が記載されている。
「Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ」のアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
また、特許文献２には、ウシ・ラクトフェリンを、プロテアーゼにより酵素分解し、酵素分解物から上記ペプチドを採取する技術が記載されている。
炎症性疾患において体液中に増加するタンパクとして、セリンプロテアーゼの一種である、白血球の産生するエラスターゼがある（Ｃｌｉｎｉｃａ．Ｃｈｅｍｉｃａ．Ａｃｔａ．１９９５．２３９．９１−１０１．）。
エラスターゼは、炎症時には補体成分やグロブリンを分解することが知られている（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９７９．９４．７５−８３．，Ｅｌａｓｔａｓｅ．（Ｒ．Ｐ．Ｍｅｃｈａｍ，ｅｄ）１９８６．Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｉｎ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌｅｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｅｓｓ，２１７−３２０．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９７．１６．３３９０−３３９６．）。
しかしながら、このエラスターゼとラクトフェリンの関与を報告した事例はない。また、細菌性疾患で、細菌の産生する酵素により分解されるラクトフェリンについても、その生理作用は報告されていない。
エラスターゼは、炎症時には補体成分やグロブリンを分解することが知られている（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９７９．９４．７５−８３．，Ｅｌａｓｔａｓｅ．（Ｒ．Ｐ．Ｍｅｃｈａｍ，ｅｄ）１９８６．Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｉｎ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌｅｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｅｓｓ，２１７−３２０．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９７．１６．３３９０−３３９６．）。
しかしながら、このエラスターゼとラクトフェリンの関与を報告した事例はない。また、細菌性疾患で、細菌の産生する酵素により分解されるラクトフェリンについても、その生理作用は報告されていない。
特許文献２記載のペプチドは、免疫賦活剤であり、炎症誘起活性を有するものではない。
本発明では、炎症性疾患で増加するエラスターゼに着目し、ラクトフェリンが分解されることを明らかとし、分解されたラクトフェリン中に各種炎症性サイトカインやケモカインの産生誘導活性を有するポリペプチドを分離できるようにしたものである。
また、このポリペプチドより、ヒトのラクトフェリンに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドを合成し、この様な炎症誘起活性を有する新規ラクトフェリン・ポリペプチドを見出した。本発明はこの新知見に基づき発明したものである。
本発明では、炎症性疾患で増加するエラスターゼに着目し、ラクトフェリンが分解されることを明らかとし、分解されたラクトフェリン中に各種炎症性サイトカインやケモカインの産生誘導活性を有するポリペプチドを分離できるようにしたものである。
また、このポリペプチドより、ヒトのラクトフェリンに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドを合成し、この様な炎症誘起活性を有する新規ラクトフェリン・ポリペプチドを見出した。本発明はこの新知見に基づき発明したものである。
本発明は、各種炎症性サイトカイン産生誘導活性、各種ケモカイン産生誘導活性、ＮＦκＢの発現増強を有する小分子ラクトフェリン及びペプチド並びにその製造方法を提供することを目的とする。
請求項１に係る発明は、ＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩで表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
本発明のペプチドは、ＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩで表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする。
本発明の各種炎症性サイトカイン産生誘導活性物質は、上述の小分子ラクトフェリン又上述のペプチドのいずれか１つからなることを特徴とする。
本発明の各種ケモカイン産生誘導活性物質は、上述の小分子ラクトフェリン又上述のペプチドのいずれか１つからなることを特徴とする。
本発明のＮＦκＢの発現増強物質は、上述の小分子ラクトフェリン又上述のペプチドのいずれか１つからなることを特徴とする。
本発明の各種ケモカイン産生誘導活性物質は、上述の小分子ラクトフェリン又上述のペプチドのいずれか１つからなることを特徴とする。
本発明のＮＦκＢの発現増強物質は、上述の小分子ラクトフェリン又上述のペプチドのいずれか１つからなることを特徴とする。
本発明のラクトフェリン・ポリペプチドの製造方法は、ヒト乃至ウシ・ラクトフェリンをエラスターゼにより分解後精製して、フェニルアラニン（Ｆ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸配列を含む分子量２５ｋＤａ未満のラクトフェリン・ポリペプチドを採取することを特徴とする。
前記アミノ酸配列はＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩであることを特徴とする。
前記アミノ酸配列はＦＫＤＣＨＬＡ又はＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩであることを特徴とする。
本発明は、炎症性疾患（歯周病）を罹患したヒトの唾液を、５０％飽和硫酸アンモニュウム沈殿法により濃縮後、トリス−塩酸緩衝液で脱塩後、ヒト・ラクトフェリン抗体（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）ＣＮＢ ｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｓｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によりラクトフェリンを精製した。
さらに、ヒト・ラクトフェリン（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）をセリンプロテアーゼの一種である、エラスターゼ（ＳＩＧＭＡ，ＵＳＡ）により３７℃で１時間処理し、その後、エラスターゼ阻害剤（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ−ＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）により反応を停止した。
そして、炎症性疾患の検体から得られたラクトフェリンと、エラスターゼ処理したラクトフェリンを、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）二次元免疫電気泳動法によりその泳動像を観察した。
そして、炎症性疾患の検体から得られたラクトフェリンと、エラスターゼ処理したラクトフェリンを、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）二次元免疫電気泳動法によりその泳動像を観察した。
さらに、炎症性疾患検体とエラスターゼ処理ヒト・ラクトフェリンは１５％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）により詠動した。
泳動後、ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ，ＵＳＡ）に転写し、各検体に共通して認められたバンドを切り出した後、Ｎ−末端アミノ酸配列をアミノ酸シークエンサー（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ，ＵＳＡ）により解析した。
そして、各ラクトフェリン・ポリペプチドを作成し、サイトカインならびにケモカインの産生誘導能を各種細胞により解析し、炎症誘起活性を有するペプチドを確定した。
泳動後、ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ，ＵＳＡ）に転写し、各検体に共通して認められたバンドを切り出した後、Ｎ−末端アミノ酸配列をアミノ酸シークエンサー（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ，ＵＳＡ）により解析した。
そして、各ラクトフェリン・ポリペプチドを作成し、サイトカインならびにケモカインの産生誘導能を各種細胞により解析し、炎症誘起活性を有するペプチドを確定した。
なお、特許文献２に記載されているペプチドのアミノ酸配列は、本願発明に係るペプチドのアミノ酸配列とは異なる。
本願発明におけるアミノ酸配列は、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（略記号：ＦＫＤ）を含むペプチドである。また、Ｎ−アミノ酸配列の位置もＣ末領域に近い部分に位置している。
本願発明におけるアミノ酸配列は、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（略記号：ＦＫＤ）を含むペプチドである。また、Ｎ−アミノ酸配列の位置もＣ末領域に近い部分に位置している。
さらに、ＦＫＤは、ヒト・ラクトフェリンでは２箇所、ウシ・ラクトフェリンでは一箇所しか存在しない。
そのため、このＦＫＤを含むラクトフェリン・ポリペプチドが炎症誘起作用を示すものである。
そのため、このＦＫＤを含むラクトフェリン・ポリペプチドが炎症誘起作用を示すものである。
本発明によると、アミノ酸配列（ＦＫＤ）を有している新規ラクトフェリン・ポリペプチドは催炎作用を有する物質であり、「催炎性ラクトフェリン・ポリペプチド」と呼べる物質であった。そして本発明により、従来のラクトフェリンが持つ有益な生理作用の他に、催炎作用を持つドメインの発見は、ラクトフェリンの有効利用、炎症性疾患ならびに各種感染症など、多くの研究分野の進展に大きく寄与する発明である。
ヒトの炎症性疾患の検体とエラスターゼ処理した検体では、検体中のラクトフェリンの小分子化の起こっていることが確認された。また、この際のＣｏｎ Ａ二次元免疫電気泳動像でも、両検体はＣｏｎ Ａ親和性の弱い画分の出現することが判明した。第１図に示す。
エラスターゼ濃度を０．００１ｕｎｉｔ〜１．０ｕｎｉｔまで、段階的に変え反応させたところ、エラスターゼの反応濃度の増加に従い、分子量２０ｋＤａ近辺の小分子のラクトフェリンが増加した。さらに、Ｃｏｎ Ａ二次元免疫電気泳動においてもＣｏｎ Ａ親和性の弱い画分が増加した。この小分子化したラクトフェリンは、ウシ乳房炎乳汁で報告されている、「炎症性ラクトフェリン」蛋白群（分子量３０〜６０ｋＤａ）とは明らかに異なる分子量のものであった。第２図に示す。
ヒトの炎症性疾患の検体と、エラスターゼ処理した検体に共通して認められたラクトフェリン・ドメインは、第１図に示した通りである。この内、ヒトならびにウシで、Ｎ−末端側にあるドメインは既に抗菌活性や、腫瘍細胞に対するアポトーシス活性が報告されているアミノ酸配列を含んでいた。また、ヒトのドメインではＮ−末端アミノ酸配列の中ほどに位置するドメインには、免疫抑制作用を有するミニドメインの一部が含まれていた。
これより下流に位置する他の二つのドメインは未報告のものであった。第３図に示す。
これより下流に位置する他の二つのドメインは未報告のものであった。第３図に示す。
これらラクトフェリン・ドメインのうち、既にその作用が報告されているドメインを除外し、エラスターゼ処理したヒト・ラクトフェリンと炎症性疾患分泌液中のラクトフェリンに共通して認められた、分子量２０〜２５ｋＤａの主たる二つのラクトフェリン分子は、アミノ酸配列の解析結果から、Ｎ−末領域に位置することが判明した。そして、この二つのドメインからペプチドを作成し、その生理作用について解析した。作成したポリペプチドは表１に示した通りである。
これら作成ポリペプチドは、健康なヒトの抹消血を、ヘパリンナトリウムを用いて採血し、リンフォライトＨ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，Ｃａｎａｄａ）を用いた比重遠心法によりリンパ球を分離し、これを用いて各種サイトカインならびにケモカイン産生誘導能と、細胞内転写因子であるＮＦκＢｐ６５の発現誘導能を解析した。ヒトのサイトカイン（ＩＬ−６とＴＮＦα；Ｔｅｃｈｎｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）、ケモカイン（ＩＬ−８とＭＣＰ−１；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）およびＮＦκＢ（ＴｒａｎｓＡＭ ＮＦ κ Ｂ ｆａｍｉｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｓｓａｙ ｋｉｔ；Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ，Ｃｏ．，ＵＳＡ）の測定は酵素抗体法により測定した。
エラスターゼ処理ヒト・ラクトフェリン中から分離し作成したポリペプチドのうち、ＨｕＰｅｐ１．とＨｕＰｅｐ４．で、炎症性サイトカインのＩＬ−６の産生誘導能が確認された。また、これらのポリペプチドでは、炎症時に血液中に増加するＩＬ−８とＭＣＰ−１の産生誘導能や、これらサイトカインやケモカインの産生誘導をつかさどる、細胞内転写因子のＮＦκＢｐ６５の発現増強も確認された。このＨｕｐｅｐ１．ならびにＨｕＰｅｐ４．は、ＦＫＤのアミノ酸配列が共通していた。図４に示す。
本発明において見出された、エラスターゼにより分解された、ヒトのラクトフェリン中に含まれる、ＦＫＤのアミノ酸配列を含む新規ラクトフェリン・ポリペプチドは、ヒトでは２箇所あった。そして、この新規ラクトフェリン・ポリペプチドは、細胞内の転写因子であるＮＦκＢの発現を増強し、細胞障害作用などを示すサイトカインや、白血球の遊走化活性を示すケモカインの産生を誘導し、炎症を引き起こす物質であった。さらに、ＮＦκＢは一酸化窒素（ＮＯ）、アラキドン酸代謝産物や各種酵素などの炎症メディエーターの産生を誘導することが知られている。そのため、本発明で見出された新規ラクトフェリン・ポリペプチド、これら炎症メディエーターの産生誘導能を示すことは容易に想定される、新規のラクトフェリン・ポリペプチドである。また、この新規ポリペプチドは、エラスターゼ以外のプロテアーゼによってラクトフェリン分子が分解され、出現することが可能と考えられる。この、ＦＫＤを含むアミノ酸配列はウシのラクトフェリン中にも一箇所（Ｎ末端より３００番目から３０２番目）あり、ヒトのラクトフェリンで確認されたポリペプチドと近い位置に存在する。また、エラスターゼなどのプロテアーゼにより切断されるアミノ酸も近傍に位置している。そのため、これらプロテアーゼにより分解され得るものと考えられる。すなわち、ヒト以外でも、同様のアミノ酸配列（ＦＫＤ）を有している、ウシを始めとした動物由来のラクトフェリンからも、同様の炎症誘起作用を有する新規ラクトフェリン・ポリペプチドは分離可能である。
本発明によると、アミノ酸配列（ＦＫＤ）を有している新規ラクトフェリン・ポリペプチドは催炎作用を有する物質であり、「催炎性ラクトフェリン・ポリペプチド」と呼べる物質であった。そして本発明により、従来のラクトフェリンが持つ有益な生理作用の他に、催炎作用を持つドメインの発見は、ラクトフェリンの有効利用、炎症性疾患ならびに各種感染症など、多くの研究分野の進展に大きく寄与する発明である。
Claims (1)
- ＧＱＫＤＬＬＦＫＤＳＡＩで表されるアミノ酸配列からなるペプチド 。
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