JP4618296B2 - 細胞電気生理センサおよびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞の活動によって発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞内電位あるいは細胞外電位等の細胞電気生理現象を測定するための細胞電気生理センサおよびその製造方法に関する。

電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜のイオンチャンネル活動を測定する標準的な方法として知られており、イオンチャンネルは生理学や病体生理学では重要な役割を有し、重要な薬剤標的となっている。パッチクランプ法は急速にイオンチャンネル機能の研究で標準的なものになったが、しかし未だ高倍率拡大鏡、低振動環境、かつ経験を積んだ熟練作業者を必要とする実験室的な微細操作であり、高いスループットでの測定には適切でないとされていた。最近の研究では、微細構造チップのパッチクランプへの応用が取り上げられ、自動吸引システムで細胞の位置決めや密閉を可能にする微細チップに広く用いられたパッチピペットが取って代わってきている。

このため、微細加工技術を利用した平板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。

特表２００３−５２７５８１号公報は媒体中の物体の電気的測定を行う装置について開示している。この装置では使用時に物体がオリフィスをシールし、これによって電気的に絶縁された第一および第二の空洞部が形成される。その後、第一および第二の空洞部にそれぞれ設置された電極間のインピーダンスの変化によって媒体中の物体の電気的測定を行う。

国際公開第０２／０５５６５３号パンフレットは、基板の上に設けられた細胞保持手段を備えたウエルと、このウエルの電気信号を検出する測定用電極と、基準電極とを備えた細胞外電位測定用デバイスによって細胞外電位を測定する技術を開示している。

Ｔ．Ｓｏｒｄｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ２００４，Ｐ５２１〜５２２（２００４）は、ＳｉＯ₂のメンブレンの内部に設けた２．５μｍの穴に、ヒト培養細胞株の一種であるＨＥＫ２９３細胞を保持させて高い密着性を確保して高精度に細胞外電位を測定する技術を開示している。

平板に作成された貫通孔はガラスピペットにおける先端穴と同様の役割を果たし、高精度な細胞の電気生理現象を記録できるとともに、平板の裏面側からの吸引によって細胞が自動的に引きつけられ、細胞を容易に保持できるという利点を有している。このとき、細胞が高い密着性を持って平板のデバイスの内部に保持されることは、低いバックグラウンドノイズで測定するためには重要な要素である。

しかしながら、上記の従来の技術においては、細胞の密着性に大きな影響を与える平板の形状や表面状態について最適な構造が示されていない。

細胞電気生理センサは、第１面とその反対側の第２面とを有する仕切り板を含むセンサチップと、仕切り板の第１面上に設けられた第１の領域と、仕切り板の第２面上に設けられた第２の領域とを備える。仕切り板には、第１面に開口する第１の開口部と第２面に開口する第２の開口部と壁面を有する貫通孔が形成されている。第１の領域は細胞浮遊液を収容でき、仕切り板の貫通孔の第１の開口部に接している。第２の領域は仕切り板の貫通孔の第２の開口部に接している。仕切り板の第１面での炭素の原子比が仕切り板の第１面の組成の１５原子パーセント以下である。

この細胞電気生理センサは細胞が仕切り板の貫通孔の第１の開口部に強く密着し、効率的に細胞の細胞電位を測定できる。

図１は本発明の実施の形態による細胞電気生理センサ１０１の分解斜視図である。図２は細胞電気生理センサ１０１の上面図である。図３は図２に示す細胞電気生理センサ１０１の線３−３における断面図である。図４は図３に示す細胞電気生理センサ１０１の部分Ａ１の拡大断面図である。図５は細胞電気生理センサ１０１の拡大断面図である。図６は図５に示す細胞電気生理センサ１０１の部分Ａ２の拡大断面図である。細胞電気生理センサ１０１は、センサチップ９と、センサチップ９が埋め込まれたチッププレート３と、チッププレート３の上面３Ａと下面３Ｂにそれぞれ当接するウエルプレート６と流路プレート７とを備える。図４に示すように、センサチップ９は二酸化珪素などの絶縁物よりなる絶縁膜１Ａを表面に有するシリコン基板等の剛体からなる仕切り板１と、仕切り板１の周囲に当接した枠体２からなる。チッププレート３は上面３Ａと下面３Ｂを貫通し連結する貫通孔５が形成されている。センサチップ９は貫通孔５内に接着剤１６によって隙間無く埋め込まれている。

仕切り板１にシリコン基板を用いるときには、絶縁層１Ａがその表面に設けられているが、ガラス基板、石英基板などの絶縁材料を用いるときには絶縁層１Ａは設ける必要はない。

ウエルプレート６は仕切り板１の貫通孔５に連通するウエル６Ａが形成されている。流路プレート７の上面７Ａには培養液などを流す流路１４が形成されている。流路プレート７の上面７Ａはチッププレート３の下面３Ｂと当接し、流路１４は貫通孔５に連通している。この構成により、細胞電気生理センサ１０１では、仕切り板１により互いに隔てられた領域１７Ａと領域１７Ｂとが形成される。すなわち、領域１７Ａは仕切り板１の上面１１１Ａからウエル６Ａにかけて形成され、仕切り板１とチッププレート３とウエル６Ａは領域１７Ａを形成する部材である。領域１７Ｂは仕切り板１の下面１１１Ｂから流路１４にかけて形成され、仕切り板１とチッププレート３と流路プレート７は領域１７Ｂを形成する部材である。領域１７Ａと領域１７Ｂにはそれぞれ違った溶液を貯留することができる。領域１７Ａは貫通孔４の開口部４Ａに接しており、領域１７Ｂは開口部４Ｂに接している。

チッププレート３の上面３Ａ上で貫通孔５の周囲にＰｔ、Ａｕ、Ａｇ、ＡｇＣｌなどの金属からなる電極１５が形成されている。

仕切り板１には、領域１７Ａと領域１７Ｂとを連通させ、領域１７Ａ、１７Ｂにそれぞれ開口する開口部４Ａ、４Ｂを有する貫通孔４が設けられている。図５および図６に示すように、領域１７Ａに細胞８を含む溶液である細胞浮遊液を貯留し、領域１７Ｂから貫通孔４を通してその溶液を吸引することにより、細胞８は貫通孔４の開口部４Ａに引き寄せられて開口部４Ａで保持される。貫通孔４の大きさは細胞８より小さく設定されている。

細胞８は領域１７Ｂから吸引することにより領域１７Ａで保持される。このとき、図６に示すように細胞８は貫通孔４の開口部４Ａで変形し、細胞膜の一部が仕切り板１の上面１１１Ａおよび貫通孔４の壁面４Ｃに接触する。細胞電気生理センサ１０１においては、仕切り板１の上面１１１Ａおよび貫通孔４の壁面４Ｃは二酸化珪素などの絶縁物による絶縁膜１Ａで被覆しておくことが好ましい。仕切り板１の細胞８と接触する細胞接触面すなわち上面１１１Ａと壁面４Ｃでの炭素の原子比がその面の組成の１５原子パーセント以下に設定されている。なお、実施の形態において、炭素の原子比はＸ−Ｒａｙ Ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＸＰＳ）法によって測定した。ＸＰＳ法は光電子のエネルギーとその数を測定することによって，表面近傍に存在する元素の量やその元素の周囲の環境、すなわち、その元素の化学結合状態を特定する方法である。Ｘ線を仕切り板１の表面に照射し、このＸ線によって励起された原子の光電子を検出することによって、原子の種類・数・化学状態を同定することができる。実施の形態では、照射するＸ線のスポット径を約１００μｍとし、仕切り板１の表面に対して垂直にＸ線を照射し、その表面に対して４５度の角度より光電子を検出した。これにより、表面から約２０ｎｍまでの深さの領域に存在する各原子を測定した。すなわち実施の形態において、表面における原子や分子の数とは、表面から２０ｎｍの深さの領域に存在する原子あるいは分子の数である。

なお、本実施の形態では、細胞電気生理現象として細胞電位を測定する。しかしそれに限定せず、イオンチャンネルの特性を測定するのに細胞膜を流れる膜電流、膜抵抗、膜容量など他の細胞電気生理現象も一般的に測定される。

細胞膜の外表面は様々な炭水化物、たんぱく質、多数の水酸基を有する脂質との複雑な混合物なので、センサを製造する際に様々なイオンや分子がセンサの表面に付着する。これら多数の有機物は細胞膜とセンサとの間の水酸結合をブロックする。したがって、仕切り板１の表面から有機物を低減しかつ表面にＯＨ基を形成することにより細胞膜とセンサの表面との間の相互作用を改善し、細胞電位を高精度に速く測定できる。

仕切り板１の表面の親水性を制御することも培養液、細胞外液および細胞内液との親和力を高めるために効果的である。図７は仕切り板１の親水性を示す。仕切り板１の表面に再蒸留水の水滴５１を滴下する。表面と水滴５１の間の接触角Ｄ１は１０°以下であることが好ましい。この条件は必要ではあるが十分ではない。

細胞電気生理センサ１０１では、細胞膜とセンサ１０１の表面との間の水酸結合を強くする目的で仕切り板１の表面での炭素の原子比を少なくしかつ活性水酸基を発生させ、領域１７Ａと領域１７Ｂ間での電流の漏れが少なくなり、少ないバックグラウンドノイズで細胞電位を測定できる。仕切り板１は少なくとも細胞８に接触する細胞接触面すなわち上面１１１Ａの親水性を高くすることによって、細胞８とともに蓄積される培養液あるいは細胞外液あるいは細胞内液は容易に貫通孔４に進入する。そしてその溶液は領域１７Ｂから吸引した際にも領域１７Ｂ側へ十分流れるので、細胞８は確実に貫通孔４の開口部４Ａ付近で保持され、細胞電位を容易に測定できる。仕切り板１の下面１１１Ｂと貫通孔４の壁面４Ｃの親水性を表面１１１Ａと同様に高めておくことがより好ましい。

貫通孔４の壁面４Ｃでの親水性が高いほど上記効果がより大きく得られる。

ここで、細胞電気生理センサ１０１の仕切り板１の細胞接触面すなわち上面１１１Ａから有機物を取り除き、炭素の原子比を表面の組成の１５原子パーセント以下にする方法、および、上面１１１Ａ、下面１１１Ｂおよび貫通孔４の壁面４Ｃの親水性を高める方法について詳細に説明する。

まず、細胞電気生理センサ１０１の製造方法について説明する。

図８〜図１５は細胞電気生理センサ１０１の製造方法を示す断面図である。

まず、図８に示すように、ベースシリコン１０と、ベースシリコン１０上の二酸化珪素膜１１と、二酸化珪素膜１１上の薄板シリコン１２よりなる積層基板６１を準備する。

その後、図９に示すように、フォトリソプロセスにより、薄板シリコン１２および二酸化珪素膜１１の内部に貫通孔４を形成する。

次に、図１０に示すように、薄板シリコン１２の表面１２Ａおよび貫通孔４の内壁４Ｃの表面に二酸化珪素膜１８を形成する。二酸化珪素膜１８の膜厚は０．３μｍ以上、より好ましくは０．５μ以上である。二酸化珪素膜１８は、酸素雰囲気にて１１００℃以上で積層基板６１を加熱する熱酸化法、真空中において微粒子の膜を形成するスパッタリング法、または化学気相成長（ＣＶＤ）法のいずれか一つを用いて形成することが望ましい。特に、熱酸化法では、貫通孔４の内壁４Ｃ、薄板シリコン１２の表面１２Ａに二酸化珪素膜１８を均一に形成することができる。スパッタリング法およびＣＶＤ法では、貫通孔４の内壁４Ｃでの二酸化珪素膜１８の膜厚が薄板シリコン１２の表面１２のそれに比べて薄くなる場合がある。しかし、二酸化珪素膜１８の表面は熱酸化法で形成されたものより平滑になり、親水性がより大きい。

次に、図１１に示すように、ベースシリコン１０側からフォトリソプロセスにより、ベースシリコン１０の表面１０Ａから二酸化珪素膜１１に達するキャビティ１３が形成される。これにより、貫通孔４を有する仕切り板１と枠体２からなるセンサチップ９が得られる。すなわち二酸化珪素膜１１と薄板シリコン１２は仕切り板１として機能し、キャビティ１３が形成されたベースシリコン１０は枠体２として機能する。

以上の工程によって得られたセンサチップ９の仕切り板１の上面１１１Ａすなわち細胞接触面と下面１１１Ｂ、貫通孔４の壁面４Ｃには、通常、有機物を含み空気中に浮遊する粒子が吸着して、仕切り板１の上面１１１Ａや下面１１１Ｂを疎水性にする。

次に、図８〜図１１に示す工程で得られたセンサチップ９に以下の処理を施して、仕切り板１の細胞接触面すなわち上面１１１Ａ、下面１１１Ｂ、壁面４Ｃからこのような有機物を取り除く。仕切り板の表面の炭素の原子比を仕切り板の表面の組成の１５原子パーセント以下に削減する。金属とイオンが表面の親水性を大きくするので留まる。親水性を維持するために水接触角Ｄ１（図７参照）を１０°以下にすべきである。

８０〜１２５℃に熱して温度が管理された濃硫酸（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ）に酸化剤（ｏｘｉｄａｎｔ）を添加して酸化性溶液である硫酸溶液を作製する。この酸化剤としては、過硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ）（ＮＨ₄）₂Ｓ₂Ｏ₈、硝酸（ｎｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）ＨＮＯ₃、もしくはオゾン（ｏｚｏｎｅ）Ｏ₃を用いることが好ましい。なお、過硫酸アンモニウムは固体、硝酸は液体、オゾンは気体で供給されるので、それぞれに適した装置を用いて濃硫酸に添加する。

過硫酸アンモニウムを濃硫酸中に入れると以下の反応が起こり、Ｈ₂Ｓ₂Ｏ₈が生成される。

Ｈ₂ＳＯ₄＋（ＮＨ₄）₂Ｓ₂Ｏ₈→（ＮＨ₄）ＳＯ₄＋Ｈ₂Ｓ₂Ｏ₈
酸化性溶液にセンサチップ９を入れると、仕切り板１の上面１１１Ａ、下面１１１Ｂ、壁面４Ｃを含むセンサチップ９の表面に付着している有機物と以下の反応が起きる。

Ｈ₂Ｓ₂Ｏ₈＋（ＣＨＯ）_X→ＸＣＯ₂＋ＸＨ₂Ｏ＋Ｈ₂ＳＯ₄
ここで（ＣＨＯ）_Xは長さＸのＣＨ基を表す。この反応によってセンサチップ９の表面の有機物が分解する。

酸化剤として過硫酸アンモニウムを用いると、上記の反応で、最終的に生成される副産物として硫酸Ｈ₂ＳＯ₄が生成される。上記の反応において、濃硝酸と酸化剤である過硫酸アンモニウムとの反応、さらにＣＨ基とＨ₂Ｓ₂Ｏ₈との反応が連続して起こることによって最終的に硫酸が生成されるので、硫酸が分解されて消費される量が反応生成物より相対的に少なくなり、硫酸溶液の劣化を少なくすることができ、安定的にセンサチップ９を製造できる。

酸化性溶液に浸したセンサチップ９を再蒸留水でリンスして酸化性溶液を流し、その後、再蒸留水中でセンサチップを保管する。

酸化性溶液に浸した後でセンサチップ９を水酸化アンモニウム水溶液の中に入れてもよい。水酸化アンモニウム水溶液により仕切り板１の表面の二酸化珪素膜１１、１８の表面がエッチングされる。エッチングにより仕切り板１の表面から有機物がさらに除去される。またこのエッチングにより仕切り板１の表面がより平滑になり親水性がさらに向上する。この処理では、仕切り板１の表面が二酸化珪素もしくはこれを含む材料で形成されていることが好ましい。二酸化珪素は水酸化アンモニウム水溶液によるエッチングレートは小さくて過度にエッチングされない。仕切り板１の表面にシリコンが露出している場合には、水酸化アンモニウム水溶液によりエッチングしすぎないように注意が必要である。仕切り板１をエッチングしすぎると表面の平滑性が失われ、親水性が低下する。なお、水酸化アンモニウム水溶液の代わりに、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムのいずれか一つを含むアルカリ性水溶液を用いてもよい。

上記の処理により、表面より有機物が除去され、センサチップ９は再蒸留水でリンスした後、再蒸留中で保管される。

センサチップ９を酸化性溶液に浸す前に、クロロフォルムとメタノールの混合物の中にセンサチップ９を浸してもよい。これにより、センサチップ９の表面から有機溶媒に溶解する化合物を効果的に除去でき、この後の処理をより効果的にすることができる。また、センサチップ９をクロロフォルムとメタノールの混合物に浸したあとで、再蒸留水でリンスすることが好ましい。再蒸留水でリンスした後でセンサチップ９を酸化性溶液に浸す。

図１２と図１３に、有機物を除去し表面の親水性を向上させる上記の処理の効果を示す。試料Ｓ１〜Ｓ３はセンサチップ９であり、同じ方法で作製した。試料Ｓ1は酸化性溶液で処理されていない。試料Ｓ２は酸化性溶液で処理され、再蒸留水でリンスされている。試料Ｓ３は酸化性溶液で処理されて再蒸留水でリンスされ、水酸化アンモニウム水溶液でエッチングされている。図１２は試料Ｓ1〜Ｓ３の表面上の分子の量を示すＸＰＳスペクトルを示す。

図１３は表面上に見出された多いほうから３つの分子、すなわち炭素、酸素、シリコンの量の比と、各試料の表面の水接触角Ｄ１（図７参照）を示す表である。水接触角Ｄ１は試料の表面の親水性を表す。

試料Ｓ1では表面の組成の１８原子パーセントが炭素であり、接触角Ｄ１は４９．５°である。試料Ｓ1では、仕切り板１の細胞接触面すなわち上面１１１Ａに細胞８は十分保持されない場合がある。

試料Ｓ２では表面の組成の１４原子パーセントが炭素であって、その水接触角Ｄ１は７．８°であり、試料Ｓ1より親水性が非常に高いことを示している。このように、親水性が高いと水が表面によって引っ張られる力（表面張力）が大きくなり、これによって貫通孔４の内部への溶液が容易に導入される。これにより、より高い確率で細胞８を貫通孔４の開口部４Ａへ引き込むことができる。貫通孔４の壁面４Ｃにおける水接触角は測定することが困難であるが、酸化性溶液が貫通孔４の内部に侵入するという現象で表面と同様に親水性が向上しているといえる。試料Ｓ３では表面組成の９原子パーセントだけが炭素であって、その水接触角Ｄ１は３．１°であり、試料Ｓ１、Ｓ２よりさらに親水性が大きいことを示してる。

図１４に示すように、再蒸留水中に保管されたセンサチップ９を取り出し、センサチップ９の表面を部分的に乾燥させて、チッププレート３の貫通孔５の内部に挿入する。

次に、図１５に示すように、チッププレート３の貫通孔５とセンサチップ９に隙間が生じないように、センサチップ９の乾燥した一部と貫通孔５に接着剤１６を塗布する。接着剤１６は紫外線硬化型が作業性の観点から望ましい。紫外線硬化型接着剤は熱硬化型のように熱を加える必要が無く、極めて迅速に硬化反応が終了する。その結果、仕切り板１の特に貫通孔４の付近の部分を長時間空気に露出させることがなく、仕切り板１の親水性を失う可能性が少ない。

接着剤１６が硬化した後は速やかに、センサチップ９がセットされたチッププレート３を水あるいは水蒸気で満たされた容器の内部に封止して、チッププレート３を水または水蒸気で満たされた環境で保管する。

以上の工程により、仕切り板１の細胞接触面すなわち上面１１１Ａ、下面１１１Ｂ、貫通孔４の内壁４Ｃは水で満たされた状態で、使用まで保存することができる。したがって、非常に小さい漏れ電流で細胞８が強く密着し、効率的に細胞電位を測定できる。

実施の形態による細胞電気生理センサ１０１では、仕切り板１の貫通孔４の開口部４Ａに細胞８を密着させて保持でき、よって、漏れ電流が非常に少ない状態で細胞８の細胞電位を測定できる。これにより、細胞電気生理センサ１０１は細胞８への薬理効果を判定して薬剤のスクリーニングを行うことができるスクリーニング装置に用いることができる。

本発明による細胞電気生理センサは、細胞が強く密着し、効率的に細胞の細胞電位を測定する装置に有用である。

本発明の実施の形態による細胞電気生理センサの分解斜視図 実施の形態による細胞電気生理センサの上面図 図２に示す細胞電気生理センサの線３−３における断面図 実施の形態による細胞電気生理センサの拡大断面図 実施の形態による細胞電気生理センサの拡大断面図 実施の形態による細胞電気生理センサの拡大断面図 実施の形態による細胞電気生理センサの仕切り板の親水性を示す図 実施の形態による細胞電気生理センサの製造方法を説明する断面図 実施の形態による細胞電気生理センサの製造方法を説明する断面図 実施の形態による細胞電気生理センサの製造方法を説明する断面図 実施の形態による細胞電気生理センサの製造方法を説明する断面図 実施の形態による細胞電気生理センサの評価結果を示す図 実施の形態による細胞電気生理センサの評価結果の表を示す図 実施の形態による細胞電気生理センサの製造方法を説明する断面図 実施の形態による細胞電気生理センサの製造方法を説明する断面図

符号の説明

１ 仕切り板
４ 貫通孔
４Ｃ 壁面
９ センサチップ
１７Ａ 領域
１７Ｂ 領域
１８ 二酸化珪素膜

Claims (10)

1. 第１面と前記第１面の反対側の第２面とを有し、前記第１面に開口する第１の開口部と前記第２面に開口する第２の開口部と壁面を有する貫通孔が形成された仕切り板を含むセンサチップと、
   細胞浮遊液を収容でき、前記仕切り板の前記第１面上に設けられて前記貫通孔の前記第１の開口部に接している第１の領域と、
   前記仕切り板の前記第２面上に設けられて前記貫通孔の前記第２の開口部に接している第２の領域と、
   を備え、前記仕切り板の前記第１面での炭素の含有量が原子比で前記仕切り板の前記第１面の組成の１５原子パーセント以下である細胞電気生理センサ。
2. 前記仕切り板の前記貫通孔の前記壁面での炭素が、前記仕切り板の前記貫通孔の前記壁面の組成の１５原子パーセント以下である、請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
3. 前記仕切り板の前記第２面での炭素の含有量が原子比で、前記仕切り板の前記第２面の組成の１５原子パーセント以下である、請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
4. 前記仕切り板の前記第１面において水との接触角が１０°以下である、請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
5. 前記仕切り板の前記貫通孔の前記壁面において水との接触角が１０°以下である、請求項４に記載の細胞電気生理センサ。
6. 前記仕切り板の前記第２面において水との接触角が１０°以下である、請求項４に記載の細胞電気生理センサ。
7. 前記仕切り板は前記第１面に設けられた二酸化珪素膜を含む、請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
8. 前記仕切り板は前記第２面に設けられた二酸化珪素膜を含む、請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
9. 前記仕切り板は前記貫通孔の前記壁面に設けられた二酸化珪素膜を含む、請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
10. 前記センサチップは、前記仕切り板の前記第１面と前記第２面と前記貫通孔の内部が水で満たされた状態で保管される、請求項１に記載の細胞電気生理センサ。

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