JP4603888B2 - Ｐ−セレクチンに対する親和性を有しグルコースをベースとする化合物 - Google Patents

Description

本発明は、接着分子ヒトP-セレクチンに対して選択的に結合する糖誘導化合物、P-セレクチン関連疾患の治療用医薬組成物を調製するための前記化合物の使用、前記化合物を含む複合体、医薬担体及び薬物送達システム、並びに、ある化合物がP-セレクチンに対して結合し得るかどうかを決定する方法に関する。

近年、細胞表面接着分子は、細胞増殖、分化、免疫細胞の遊出及び応答、並びに癌の転移を含む多数の細胞過程における重要なメディエーターとして認識されてきている。
接着分子の主要な４つのカテゴリーは、次のように特定されている：免疫グロブリンスーパーファミリー細胞接着分子(CAM)、カドヘリン、インテグリン及びセレクチン。
セレクチンは、現在、次の３つの膜貫通型糖質結合糖タンパク質のファミリーを表している：“内皮”E-セレクチン、“白血球”L-セレクチン、及び“血小板”P-セレクチン。これら３つのセレクチンは、全て二価の陽イオン（例えば、カルシウム）依存性であって、糖質認識モチーフを有する細胞外ドメイン、上皮増殖因子様モチーフ及び補体調節タンパク質に関係する幾つかの小型ドメインを有する。
ヒトP-セレクチン（GMP-140、LECAM-3、PADGEM、CD62及びCD62Pとも呼ばれている）は、血小板及び内皮細胞によって発現されている。これらの細胞の表面にヒトP-セレクチンが発現されると、その最も注目すべき効果は白血球の減速であって、白血球が毛細血管から出て白血球-内皮接着の主要部位を代表する後毛細管後静脈へと入るようにする。この減速過程は白血球のローリングとして観察され、相対的に低い親和性での初期接着を表している。ローリング白血球のしっかりとした接着は、主にインテグリンに介される。

P-セレクチンは、内皮細胞ではヴァイベル-パラーデ体に貯蔵されており、血小板ではα顆粒において見出される。P-セレクチンは、活性化に続いて、種々の炎症性因子又は血栓形成性因子に応答して、数分間以内に細胞表面に固定される。内皮E-セレクチンの主な機能は白血球を後毛細菅後静脈へと補充することであり、一方血小板P-セレクチンも血栓の形成を生じる。P-セレクチンの現在既知な天然リガンドの一つは、白血球表面上で尾足(uropod)に集められて発現されている120 kDaのシアロタンパク質であるPSGL-1（P-セレクチン糖タンパク質リガンド１）である。P-セレクチンの構造及び機能のより詳細な説明は、多数の刊行物において見出される（例えば、J.Panes, Pathophysiology 5：271 (1999）；F. Chamoun et al., Frontiers in Bioscience 5：e103 (Nov. 1, 2000)；及びS.-I.Hayachi, Circulation 102：1710 (2000))。
炎症過程及び炎症性過程は、多数の疾患及び病的状態の病態生理において、主要な役割を果たしている。セレクチンレベルの増加が見出された脳の病的状態であって、よってセレクチン介在性の病態生理学的事象が関与し得るものとしては、重度の外傷性脳損傷、寛解と増悪を繰り返す(relapsing-remitting)多発性硬化症、大脳動脈閉塞、虚血及び脳卒中が挙げられる。セレクチンが役割を果たしていることが示唆されている心臓の病的状態としては、急性心筋梗塞、動脈損傷（例えば血管形成によって引き起こされるもの）及び虚血が挙げられる。同様に、セレクチンは、腎臓の病的状態、例えば虚血及び再灌流障害からの腎損傷並びに腎不全に関与している。更に、セレクチンは、移植臓器拒絶、寒冷性(cold)虚血、出血性ショック、敗血症性ショック、腫瘍転移、慢性炎、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、新脈管形成、播種性血管内凝固症候群、成人呼吸促進症候群及び循環性ショックにおいて役割を果たすようである。

従って、P-セレクチンカスケードを特異的に妨害することによって、内皮細胞及び白血球の活性化に関与する、また具体的にはP-セレクチンの固定化及び発現に関与する、上記状態及び他の病的状態を改善することが実現可能であろう。このことは、例えば、ヒトP-セレクチンに対して選択的に結合するが生理活性を持たないリガンドの投与によって、行うことができる。この方法によって固定化されたP-セレクチンは不活性化されて、白血球誘導性の組織損傷が阻止され得る。P-セレクチンのリガンド又はアンタゴニストがペプチド又は改変ペプチドであるならば、遺伝子治療によって同様な効果が達成される可能性がある。そのような方法によると、治療を必要とする人の体細胞が、P-セレクチンアンタゴニストをコードしているDNA配列を保有する発現ベクターを用いてトランスフェクションされ得る。
P-セレクチンのリガンド又はアンタゴニストは、上記のような疾患及び状態の予防にも使用され得る。更に、前記リガンドは、上記のような疾患のin vivo又はin vitroの診断においても有用であり得る。

近年、そのようなP-セレクチンに対する選択的なリガンドを同定又は作製する種々の試みがなされている。これまでに数多くの物質が試験されたが、それら化合物のいずれかが所望の臨床効果を生じ同時に副作用の点で許容されるということの決定的な証拠は、どの臨床研究も未だ提供していない。
例えば、P-セレクチンに対する抗体が、動物モデルにおいて産生及び試験されて、虚血性再灌流障害から腎臓を保護することが見出されている（H.C.Rabb et al., JASN 5：907, 1997；米国特許第6,033,667号明細書）。別の研究においては、P-セレクチン糖タンパク質リガンド１の組換え可溶型（rPSGL-Ig）が、ネコの血栓症を抑制するのに用いられた（M.J.Eppihimer et al., Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 20：2483, 2000）。国際特許出願第99/41363号パンフレットは、ポドカリキシン(podocalyxin)様タンパク質がセレクチンに結合することを開示している。国際特許出願第00/41711号パンフレットは、ヒトセレクチンファミリーのメンバーに結合する種々の小型ペプチド又はペプチド配列を記載しており、それら配列の多くは、ロイシン又はイソロイシンのユニットを一以上含んでいる。

P-セレクチンカスケードを阻害する別のアプローチとして、セレクチンファミリーのレクチンドメインに由来する種々のペプチドが、P-セレクチンに対する好中球の接着を阻害することが見出された（例えば、米国特許第6,111,065号明細書及び米国特許第5,916,876号明細書）。それらのペプチドは、おそらく白血球上のP-セレクチン受容体に結合するのであろう。
国際特許出願第94/05269号パンフレットには、P-セレクチン、E-セレクチン及びL-セレクチンといったセレクチンの結合を阻害するペプチドが記載されている。それらのペプチドは、P-セレクチン、E-セレクチン又はL-セレクチンの11〜18アミノ酸配列の一部分をコア領域として有する。更に、国際特許出願第95/31210号パンフレットは、内皮白血球接着分子１(ELAM-1)をはじめとするセレクチンに結合するペプチド及び化合物に関連している。それらのペプチドは、炎症を抑制する目的で、セレクチン（すなわち、特にE-セレクチンであるが、P-セレクチン又はL-セレクチンも含む）に対する白血球の接着を遮断することに用いられている。
本出願人の国際特許出願第03/020753号パンフレット及び係属中の国際特許出願PCT/EP03/07260号には、ペプチドコア領域と、P-セレクチンを認識するのに必要不可欠なある種のコンセンサスモチーフを有する新規な化合物が記載されている。セレクチンに対して親和性を有する他の既知物質の多くとは対照的に、前記化合物は高度なP-セレクチン特異性を有する。前記化合物のin vitro及びin vivoにおける安定性については未だよく知られておらず、多くの治療的又は診断的ペプチドの場合のように、効力を生じさせるためには前記化合物が注射されることが必須である。しかしながら、多くの患者は、特に長期的治療に対して、経口的な投与経路を好む。

ペプチドアプローチの他に、セレクチンがシアリルルイス糖X（sLeX）を認識するという事実も、セレクチン結合活性を有する糖質をベースとするリガンドの開発に向けた多数の努力をもたらしている。例えば、米国特許第5,750,508号明細書は、フコース部分とシアル酸部分とが非糖質リンカーによって分離されているフコース及びシアル酸をベースとする合成リガンドを開示している。国際特許出願第96/09309号パンフレットは、E-セレクチン及びP-セレクチンに対する潜在的リガンドであるオリゴ糖構造体を開示している。国際特許出願98/06730号パンフレットは、ノイラミン酸残基とN-アセチルグルコサミンモノマーとが種々の置換基によって置き換えられている、sLeX誘導体である改変オリゴ糖を記載している。米国特許第5,830,871号明細書は、グリコシドアルデヒド前駆体とジヒドロキシアセトンフォスフェート又はその誘導体との間のアルドール付加反応によって調製され得る、糖質をベースとするセレクチン阻害剤及びsLeX模倣体(mimetic)を開示している。しかしながら、これらの化合物は、P-セレクチンに対し高い選択性を有さない。
従って、血管内皮細胞又は血小板に対する白血球の接着に関係する種々の疾患及び状態を診断、予防及び治療するための医薬組成物を調製するのに用いることができる、P-セレクチンに対し選択的親和性を有する物質の必要性が存在する。また、P-セレクチンを発現している組織への薬物又は遺伝物質のターゲッティング用医薬組成物においてターゲッティング分子又はターゲッティング部分として用いることができるP-セレクチンリガンドの必要性も存在している。更に、そのような物質を、非経口的使用よりも患者に優しい経路で使用するのに適する形態で含んでいる組成物の必要性が存在している。

（発明の概要）
本発明の目的は、ヒトP-セレクチンに対して親和性を有する化合物を提供することである。
特に、本発明の目的は、P-セレクチンのアンタゴニスト又は部分的アンタゴニストとして働く化合物を提供することである。
本発明の別の目的は、P-セレクチンを発現している細胞及び組織へ薬物及び遺伝物質を導く能力を有するターゲッティングリガンドとして働く化合物を提供することである。
本発明の更に別の目的は、このような化合物の使用及びこのような化合物を含む医薬組成物の使用を提示することである。
本発明の他の目的は、次の説明に基いて明らかとなるであろう。

（発明の詳細な説明）
本発明者らは、グルコースをベースとするsLeX模倣体が、P-セレクチンに対する選択的結合に特に有用であることを発見した。E-セレクチン及びL-セレクチンとは異なって、P-セレクチンの結合は、単糖のC-2位置にアキシアルに配向されているヒドロキシル基を必要としていない。
本発明によると、P-セレクチンに対し親和性及び結合性の両方を有し、且つP-セレクチンの強力なモジュレーター又はアンタゴニストとなる可能性を有している、グルコースをベースとする化合物が提供され、それら化合物は、以下の式Iaによって表されるか、又は以下の式Ibによって表されるIaの立体異性体である：

（式中、
Xは、任意の基であって、-O-、-OCH₂-、-S-、-SCH₂-、-NH-又は-NHCH₂-を表し、好ましくは、Xが存在しないか又は-O-を表し；
R¹はQR⁴を表し、このときQは-O-、-NH-、-NH-(C=O)-、-O-(C=O)-、-NH-(C=O)-O-又は-NH-(C=O)-NH-を表し、かつR⁴はH、アルキル部分、芳香族部分又は電子求引部分を含む基を表し；
R²は、少なくとも一価の負電荷を有する部分であり；
R³は、いずれの基であってもよく；
ただし、Qが-O-であり、かつR⁴がHである場合、Xが存在する）。

本発明の化合物は更に、4-オキソ-2,3-ジヒドロキシ-n-ペンチレン基によって特徴付けられており、この基は、単糖鋳型のC-1位置でリンカー基を介して任意に連結されていてもよい。この基は、負電荷を有する置換基R²によってC-5位置で更に改変される。“負電荷を有する置換基”という用語を用いて、ある置換基が生理的条件下で負電荷を有することを意味している。中でも、負電荷を有する好ましい置換基は、リン酸基、ホスホン酸基、カルボキシル基、スルホン酸基を含む置換基である。特に好ましくは、リン酸基である。4-オキソ-2,3-ジヒドロキシ-n-ペンチル基は、直接的に（これは、好ましい選択肢である）、又は酸素原子、OCH₂基、硫黄原子、SCH₂基、NH基若しくはNHCH₂基を介して、その中でも好ましくは酸素原子を介して、単糖の環状構造のC-1位置に取り付けられる。前記２つの好ましい選択肢は、本発明の化合物がC-グルコシド類又はO-グリコシド類の誘導体であり得ることを表す。この点に関しては、以下の反応スキームを参照されたい。

どのような理論的考察によっても制限されることを望まないが、4-オキソ-2,3-ジヒドロキシ-n-ペンチル基が天然リガンドであるシアリルルイスX（sLeX）内のガラクトース部分の２つのヒドロキシル基とN-アセチルノイラミン酸のカルボン酸基とによく似ていることから、本発明の化合物はP-セレクチンとの強力な相互作用を有していると仮定される。
単糖構造のC-6位置において、本発明の化合物は、本明細書中でR³として定義されている置換基を有する。一般的に、R³は、水素原子を含めて、いずれの置換基を表していてもよい。実際上、R³は、機能付与のために必要とされる置換基である。どのような種類の基が存在しているかは、特に重要ではない。前記基は、ヒドロキシル、アミン、アジド、アルデヒド、カルボン酸又はそれらの誘導体であってもよい。本発明の好ましい態様の一つでは、R³が、本発明の化合物の単糖鋳型として役立つグルコース分子のC-6位置に任意に存在していてもよいヒドロキシルである。別の好ましい態様では、R³が-YR⁵部分を表し、このときYは、好ましくは-O-、-CH₂-又は-NH-、最も好ましくは-O-であって、且つR⁵は少なくとも一つの炭素原子を含んでいる。好ましいR⁵基は、直鎖又は分枝のアルキル基又はアリール基、直鎖又は分枝のアラルキル基又はアルカリール基であって、これらの基は窒素原子、酸素原子、リン原子及び硫黄原子のようなヘテロ原子を一つ以上含んでいてもよく、またハロゲン原子、ヒドロキシル基、酸素原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミノ基、置換アミノ基及び他の置換基によって置換されていてもよい。基R⁵は、リンカーYを介する代りに、糖鋳型に直接的に連結されていてもよい。

更に、前記C-6位置は、本発明の化合物のコア構造がスペーサー類又はアンカー部分のような他の機能的部分に連結され得る好ましい反応部位の一つである。C-6は、直接的に又はスペーサーを介して間接的に、本発明の化合物に由来していない他の有効な化合物と連結されて薬物複合体を形成してもよい。あるいはC-6は、コロイド状若しくはミクロ粒子状の薬物担体（例えばリポソーム、ニオソーム、ナノドロップ、ナノ粒子、ナノカプセル、ナノスフェア、マイクロ粒子、デンドリマー、マイクロカプセル、マイクロスフェア、コロイド複合物(colloidal complex)、ミセル、混合ミセル、架橋ミセル、ウイルスベクター若しくは脂質複合物(lipid complex)）に本発明の化合物を固定し得るアンカー部分に連結されてもよい。本明細書で用いるように、固定（する）能力は、アンカー部分と基質（すなわち、コロイド状又はミクロ粒子状薬物担体）との間の共有結合的相互作用及び非共有結合的相互作用の両方を含み、この能力によって、本発明の化合物が基質に連結され得る。
しかしながら、本発明の化合物は、別の有効な化合物若しくは部分（本発明の化合物に由来していないもの）又はアンカー部分に、異なる種類の結合を介して、例えば単糖構造のC-2位置において、結合されていてもよい。このようにして、本発明の化合物は、ターゲッティング手段として用いられて、P-セレクチンを発現している細胞又は組織へ他の有効な化合物又はコロイド状若しくはミクロ粒子状薬物担体を導き得る。従って、別の有効な化合物を、その活性の種類又は作用メカニズムに関係なく、P-セレクチンを発現している細胞及び組織に特異的に送達することが可能である。

更なる態様では、本発明の化合物が、P-セレクチンにも結合する一つ以上の他の化合物又は部分と連結される。例えば、本出願人の国際特許出願第03/020753号パンフレット及び係属中の国際特許出願PCT/EP03/07260号では、ペプチド性コア領域とP-セレクチンを認識する特定のコンセンサスモチーフとを有する化合物が開示されており、そのような化合物が本態様において用いられてもよい。その目的のため、それらの化合物は、参照により本発明に含まれるものとする。P-セレクチンに対し親和性を有する、少なくとも一つの本発明の化合物及び少なくとも一つのペプチド性化合物を含んでいる複合体又はコロイド状若しくはミクロ粒子状薬物担体は、高度なP-セレクチン結合を提供するのに特に有用であり得る。このことは、両化合物がP-セレクチン分子の異なる部位に結合することから想定され得る。ペプチドはP-セレクチンの非活性な結合部位に対し親和性を有し、一方、本発明の糖質リガンドはP-セレクチンの活性な部位に対して結合するようにみえる。
本発明の化合物は、単糖構造のC-2に置換基R¹を有することによって、更に特徴付けられる。この置換基R¹は、置換基R³よりはるかに重要である。どのような理論にも拘束されることを望まないが、R¹はP-セレクチンの認識又はP-セレクチンに対する選択性において積極的役割を果たしていると信じられている。R¹はQR⁴を表し、このときQは-O-、-NH-、-NH-(C=O)-、-O-(C=O)-、-NH-(C=O)-O-又は-NH-(C=O)-NH-を表し、好ましくは-NH-(C=O)-を表し、R⁴は少なくとも一つの炭素原子を含むいずれかの置換基を表す。好ましい基R⁴は、直鎖又は分枝のアルキル基又はアリール基、直鎖又は分枝のアラルキル基又はアルカリール基であって、これらの基は窒素原子、酸素原子、リン原子及び硫黄原子のようなヘテロ原子を一つ以上含んでもよく、好ましくは20までの炭素原子、より好ましくは1〜12までの炭素原子を有し、またハロゲン原子、ヒドロキシル基、酸素原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミノ基、置換アミノ基及び他の置換基で置換されていてもよい。特に好ましい態様では、芳香族部分に電子求引基が存在している。最も好ましいR⁴は、H、アルキル部分、芳香族部分又は電子求引性部分である。

芳香族部分は、例えばフェニル基、ナフチル基、クレシル基、トリル基、アントラシル基、フェナンチリル基、ピリジル基、ピラジル基、ピリダジル基又はキノリル基であってもよく、これらの基は任意に置換されていてもよい。好ましくは、R⁴がフェニル基又はナフチル基である。
別の態様では、R⁴が電子求引性部分を含む基である。好ましくは、前記電子求引性部分が、ニトロ、-(C=O)-アルキル、シアノニトリル、-SO₃H、CCl₃又はCF₃からなる基より選択される部分である。より好ましくは、電子求引基がニトロ基である。
基R⁴の選択は、本発明の化合物のP-セレクチン結合活性に有意な影響を有することが見出された。置換基R⁴に依存して、P-セレクチンに対する親和性が実際に増加されて、内因性リガンドsLeXよりも数倍高い親和性に到達し得る。驚くべきことに、芳香族基を含む置換基が特に有用であることが見出された。例えば、R⁴についてフェニル又はナフタレンを選択すると、P-セレクチンに対し特に高い親和性及び選択性を有する化合物がもたらされた。いずれの理論によっても拘束されることを望まないが、R⁴の位置で、π-π相互作用に関与し得る置換基が、P-セレクチンに存在しているチロシン基(Tyr⁹⁴)と実際に結合し得ることが想定され、前記チロシン基はP-セレクチンのCRDドメインに結合したSLeXのガラクトース部分のC-4ヒドロキシル基に極めて近接していることが既に見出されていた（Somers et al., Cell, 103, 467-479, 2000）。よって、R⁴は、好ましくはチロシン基とのπ-π相互作用に関与し得る置換基であって、より好ましくはナフタレン基のフェニルを表す。

本発明の化合物は、種々の異なる合成経路によって調製され得る。上で考察されるように、特定の置換基の選択に依存して、最も有用な反応スキームは互いに異なり得る。好ましい合成経路の一つでは、グルコースが出発物質として用いられて、フィッシャー合成によりO-アリルグルコピラノシドが調製され、それに続くアセチル化及び酸化によってグリコシルアルデヒド類が生成され得る。これらのアルデヒド類は、続いて、アルドラーゼ触媒反応を介して、ジヒドロキシアセトン誘導体に連結される。
グリコシルアルデヒドのジヒドロキシアセトンフォスフェートに対する縮合については、ウサギ筋肉由来のD-フルクトース-1,6-ジフォスフェートアルドラーゼ(RAMA)及びSt.カルノサス(carnosus)由来のフルクトースジフォスフェートアルドラーゼ(FruA)を含む種々の種類のアルドラーゼが酵素触媒として用いられ得る。RAMAは、有機溶媒中における相対的に乏しい安定性と高度な基質特異性とを兼ね備えていることから、アルデヒドアクセプターに対するRAMAの許容度はかなり低い。優れた溶媒安定性及び基質選択性を考慮すると、有機合成に使用されるアルドラーゼ触媒による縮合反応の条件及び基質の範囲をかなり拡張するFruAを使用することが推奨される。実例として、完全にアセチル化されたグリコシルアルデヒド類及びジヒドロアセトンフォスフェート(DHAP)がテトラヒドロフラン(THF)又はジメチルスルホキシド(DMSO)といった有機溶媒と水との混合物中で基質として用いられる場合であっても、縮合が円滑に進行した。
R¹によって表される選択された置換基を導入するために、再び幾つかの合成経路が続けられ得る。例えば、Qが-NH-(C=O)-であるように選択される場合、グルコサミンが出発物質として用いられ得る。グルコサミンは、ショッテン-バウマン条件下で2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル(Troc)誘導体に変換され、続いてアリル化及びアセチル化されて、O-アリルグリコシドが得られ得る。Troc基を除去した後、遊離アミノ基がそれぞれの塩化アシルを用いてアシル化され得る。

上に明示されるような本発明の化合物の塩、付加物、溶媒和物及び誘導体の類もまた、本発明の範囲内に含まれる。好ましい態様では、本発明の化合物が、許容される塩基の付加によって形成されている塩の形態である。しかしながら、酸付加塩であってもよい。医薬として許容される酸又は塩基は、具体的に意図される用途を考慮して、当業者により容易に決定され得る。例えば、in vitroの診断用組成物に対して許容される酸及び塩基の全てが、治療用組成物に使用できるわけではない。意図される用途に依存して、医薬として許容される酸としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、グリコール酸、シュウ酸、ピルビン酸、コハク酸、マレイン酸、マロン酸、ケイ皮酸、硫酸、塩酸、臭化水素酸、硝酸、過塩素酸、リン酸及びチオシアン酸といった有機酸及び無機酸が挙げられ、これらはペプチド及びその機能的等価物の遊離アミノ基とアンモニウム塩類を形成する。ペプチド及びその機能的等価物の遊離カルボキシル基とカルボン酸塩を形成する、医薬として許容される塩基としては、エチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミン、イソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、他のモノ-、ジ-及びトリアミン類、並びにアクリルアミン類が挙げられる。更に、医薬として許容される溶媒和物も含まれる。
本発明の更なる側面では、開示化合物の使用に言及する。本発明の化合物は、P-セレクチンに対し選択的に結合することから、P-セレクチンとの相互作用の種類に依存して、結合後に、アンタゴニスト若しくは部分的アンタゴニストとして機能し得るか、又はターゲッティング手段として機能してP-セレクチンを発現している細胞及び組織へ複合物質又は薬物単体システム（例えば、リポソーム若しくはナノ粒子）を導き得る。従って、本発明の化合物は、医薬組成物において有利に使用され得る。本発明によると、そのうえ、上述するような医薬組成物が提供される。

本明細書中で用いられる“医薬組成物”という用語は、治療用組成物及び診断用組成物並びにそれら組成物を含む医薬品及び診断用品を指す。治療用組成物及び医薬品は、改善が望まれる哺乳動物の疾患及び他の病的状態の予防、抑制、減退又は治療に用いられる。診断用品及び診断用組成物は、前記のような疾患のin vivo及びin vitroの診断に用いられる。
本発明の化合物の好ましい用途は、治療用組成物又は医薬品、特にP-セレクチンの活性化又は過剰発現に関係している疾患、不快感又は他の状態のための治療用組成物又は医薬品、例えば、血管内皮及び血小板に対する単球及び好中球といった白血球の接着に関係している疾患及び状態を予防又は改善するための治療的組成物又は医薬品を調製するための使用である。本発明の化合物は、P-セレクチン介在性細胞内シグナル伝達の阻害が望まれる疾患を治療するための組成物にも用いられ得る。
例えば、本発明の化合物を一つ以上含む組成物は、白血球介在性の炎症性過程を制御するのに貢献し得る。活性化した白血球は、正常な組織を損傷し得る毒性分子を放出することが知られている。これらの炎症性応答（その幾つかはP-セレクチン介在性の血小板活性化にも関係している）は、（臓器）移植拒絶、寒冷性虚血、出血性ショック、敗血症性ショック、腫瘍転移、慢性炎、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症、血栓症、再狭窄、新脈管形成、播種性血管内凝固症候群、成人呼吸促進症候群、循環性ショック、重度の外傷性脳損傷、寛解と増悪を繰り返す多発性硬化症、大脳動脈閉塞、虚血、脳卒中、急性心筋梗塞、動脈損傷（例えば、血管形成によって生じるもの）、心筋虚血、虚血及び再灌流による腎臓損傷、並びに腎不全といった様々な病理的状態の一部分である。

別の態様では、本発明の化合物は、診断用組成物又は診断用製品の調製に用いられる。そのような組成物は、上述するような疾患及び状態についてのマーカーとして、体液中のP-セレクチン濃度を定量するためのin vitro試験に用いられ得る。そのような組成物はまた、in vivo画像診断手法にも用いられて、P-セレクチン介在性のアテローム性動脈硬化症、動脈瘤、経皮経腔的冠動脈血管形成術に続く再灌流（PTCA後再灌流）、及び上述のものから選択されるようなP-セレクチンが固定化されている他の病的状態をモニターし得る。この用途に対する選択肢として、本発明の化合物はキレート化剤と結合されてもよく、続いて、選択したモニタリングシステムによって検出し得る等方性ラベルと複合化されてもよい。
本発明の化合物の別の用途は、研究におけるツールとしての使用である。よって、本発明は、ある化合物がP-セレクチン又はP-セレクチンの機能的等価物と結合し得るかどうかを決定する方法にも関係し、前記方法は、被験化合物及び所定量の本発明の化合物を、所定量のP-セレクチン又はP-セレクチンの機能的等価物に接触させること及びそれらと共にインキュベーションすること、続いて本発明の化合物の量を決定することを含む。
より具体的には、本発明の化合物は、P-セレクチン又はP-セレクチンの機能的等価物に対し、分子の結合親和性を試験するのに用いられ得る。この試験方法を行うために、P-セレクチン又はP-セレクチンの機能的等価物は、結合親和性について試験される被験分子と本発明の化合物に接触させられ、一緒にインキュベーションされる。本発明の化合物の結合の減少は、前記被験分子のP-セレクチンに対する親和性を示し得る。

本発明の化合物はまた、医薬組成物におけるターゲッティング分子又は複合体として、P-セレクチンを発現している組織に薬物又は遺伝物質を導くことにも用いられ得る。本発明の化合物は、複合体として、前記組織に送達されるべき有効な分子又は核酸と直接的に連結され得る。あるいは、本発明の化合物が、リポソーム、他の脂質ベシクル、エマルジョンドロップ、ポリマー、ミセル、ナノカプセル、マイクロカプセル、ナノ粒子、マイクロ粒子に組込まれて又はそれらの表面上に固定されて、P-セレクチン発現組織に送達される薬物又は遺伝物質のためのターゲッティング化ビヒクルを得ることができる。
本発明の医薬組成物は、本明細書中に開示されるP-セレクチン親和性を有する化合物を一つ以上と、少なくとも一つの担体又は賦形剤を含むのが好ましい。本明細書で用いられる担体又は賦形剤は、実質的な薬理活性を有していない医薬として許容される物質のいずれか又はそれらの混合物であってもよく、ビヒクル又は補助物質として用いられて、化合物を安定且つ投与し易い剤形に調剤し得る。医薬として許容される賦形剤の例は、主な薬局方全てのモノグラフにおいて見出される。
ある態様では、本発明の医薬組成物は注射剤に調剤及び加工され、好ましくは静脈内又は動脈内といった血管内注射用注射剤であるが、筋肉内用、皮下用、病巣内用、腹腔内用又は他の非経口投与経路用注射剤にも調剤及び加工される。それらの投与経路用の他の薬物製剤を支配する同様の原理は、そのような組成物を調製する方法も当業者に教示するであろう。例えば、非経口的剤形が要求することの一つは、無菌性であることである。他の要求は、アメリカ薬局方第24版中のモノグラフ“General Requirements for Tests and Assays.1. Injections”(1775-1777ページ)に記載されるように、主な薬局方の全てに記載されている。非経口製剤の安定性を増すために、投与され得る前に再構成されるべき乾燥した剤形を提供することが必要とされ得る。そのような剤形の例は、フリーズドライ製剤又は凍結乾燥製剤である。

本発明の化合物は、非経口的な制御放出剤形として投与されて、頻繁な注射を回避し、また治療の有効性及び利便性を向上させることが望まれ得る。そのようなデボー製剤を調製する様々な方法が知られている。持続的な放出は、植込み剤、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロ粒子、マイクロカプセル、乳剤、懸濁剤、油性液剤、リポソーム又は同様な構造物によって提供され得る。
非経口製剤の調製に特に有用な賦形剤は、溶媒、共溶媒、及び液状又は半固体状の担体、例えば滅菌水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ブタンジオール、脂肪油類、短鎖又は中鎖トリグリセリド類、レシチン、ポリオキシエチレンひまし油誘導体類；浸透圧及びpHを調整するための物質、例えば糖類、特にグルコース、糖アルコール類、特にマンニトール、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸、アセテート、フォスフェート、リン酸、塩酸、水酸化ナトリウム等；安定剤、酸化防止剤及び防腐剤、例えばアスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、EDTA、ベンジルアルコール等；他の賦形剤及び凍結乾燥補助剤、例えばアルブミン、デキストリン等である。

あるいは、本発明の医薬組成物は、経口投与用に設計されて、それに合わせて加工されてもよい。実際上、抗体又はペプチドといったP-セレクチンに結合する他の既知化合物を超える本発明の特定な利点の一つは、本発明の化合物はペプチドでないことから胃腸液中で安定である可能性が非常に高いということである。適切な経口剤形としては、錠剤、ハードカプセル剤、ソフトカプセル剤、散剤、顆粒剤、口内崩壊剤形、シロップ剤、滴剤、懸濁剤、発泡錠、チュアブル錠、経口フィルム、凍結乾燥剤形、徐放剤形、制御放出剤形が挙げられる。ある態様では、経口剤形が腸溶性固体剤形であって、本発明の化合物を胃の酸性環境から保護することを提供する。
本発明の化合物は、経粘膜剤形で投与されるのにも好都合であり得る。この投与経路は、非侵襲性であり、患者にも優しい。それと同時に、経口投与と比較して、特に、本発明の化合物が消化器系の分泌液中で安定でない場合又は大きすぎて消化管から効率的に吸収されない場合に、本発明の化合物の生体利用効率の向上をもたらし得る。経粘膜投与は、例えば、鼻、口腔、舌下、歯肉又は膣を経由する剤形が可能である。このような剤形は、既知の技術によって調製することができ、調剤されて、点鼻剤、スプレー式点鼻剤、挿入剤、フィルム剤、パッチ剤、ゲル剤、軟膏剤又は錠剤となり得る。好ましくは、経粘膜剤形に用いられる賦形剤が粘膜付着を提供する物質を一つ以上含み、よって前記剤形と吸収部位との接触時間が延長されて、その結果、吸収の程度が増加し得る。

更なる態様では、本発明の化合物が、計量式吸入器、噴霧器、エアゾールスプレー又は乾燥粉末吸入器を用い、肺経路を介して投与される。適切な製剤類は、既知の方法及び技術によって調製され得る。経皮投与、直腸投与又は眼投与も、幾つかの場合には適し得る。
先進的な薬物送達法又はターゲッティング法を用いて、本発明の化合物をより効率的に送達することが有利であり得る。例えば、経口的投与経路が選択される場合、適切な剤形は生体利用効率増強剤を含んでもよく、前記増強剤は、本発明の化合物の利用効率を増加させるいずれかの物質又はそれらの混合物であってもよい。そのようなことは、例えば、本発明の化合物を分解から保護することによって、例えば酵素阻害剤又は抗酸化剤によって、達成され得る。より好ましくは、前記増強剤が、典型的には粘膜である吸収障壁の透過性を増加させることによって、本発明の化合物の生体利用効率を増加させる。浸透エンハンサーは、様々なメカニズムを解して作用し得る。浸透エンハンサーの幾つかは、粘膜の膜流動性を増加させ、他のものは、粘膜細胞の間のギャップ結合を開ける又は広げる。更に他のものは、粘膜細胞層を覆っている粘液の粘度を減少させる。好ましい生体利用効率エンハンサーは、コール酸誘導体類、リン脂質類、エタノール、脂肪油類、オレイン酸、脂肪酸誘導体類、EDTA、カルボマー類、ポリカルボフィル(polycarbophil)及びキトサンといった両親媒性物質である。
本発明は、本発明の範囲を規定又は制限することを意図しない次の実施例によって、更に詳しく説明される。

（実施例１：化合物３の合成）
触媒量のショウノウスルホン酸の存在下アリルアルコール中で、フィッシャー合成を介して、グルコース（化合物７ａ、図２の反応スキーム参照）をO-アリルグルコピラノシドへ変換した。その未精製混合物をアセチル化して、化合物８ａを得た。化合物８ａをアセトン/H₂OにおいてOsO₄及びN-メチルモルフォリンN-オキシドモノハイドレート(NMO)を用いた処理によって酸化して対応するジオールとし、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを用いて、そのジオールをアルデヒド９ａへと変換した。カラムクロマトグラフィーによる精製の後、所望のα異性体を得た。続いて化合物９ａを、THF及びH₂O（1：3、v/v）混合物でSt.carnosus由来フルクトースジフォスフェートアルドラーゼ(FruA)を用いた酵素触媒によって、ジヒドロキシアセトンフォスフェートに連結した。およそ１日間インキュベーションした後、グリコシルフォスフェート１０ａを良好な収率で得た。保護基のアセチル基の存在により、生成物の精製は非常に容易であって、フラッシュクロマトグラフィーを用いて行った。精製の後、希NaOMe溶液の添加によってアセチル基を定量的に除去し、所望の最終生成物３を得た。
化合物３：¹H NMR(MeOD)：δ4.75-4.70(m, 1H)、4.55(d, 1H, J=12.9Hz)、4.36(d, 1H)、3.80-3.55(m, 8H)。

（比較例：参照化合物２の合成）
グルコース（化合物７ａ）の代りにマンノース（化合物７ｂ）から出発し、化合物３と同様の経路に従って、参照化合物２を調製した。
化合物２：¹H NMR(MeOD)：δ4.81-4.73(m, 1H)、4.67(d, 1H, J=12.7Hz)、4.55(d, 1H, J=12.7Hz)、3.85-3.81(m, 2H)、3.73-3.66(m, 2H)、3.63-3.46(m, 3H)。

（実施例２: P-セレクチンに対する化合物３及び参照化合物２の結合）
化合物３を、文献（G.Weitz-Schmedt et al., Anal. Biochem. 238, 184-190, 1996）に記載されるように、固定化したP-セレクチンに対するSO₃-sLe^a-PAA-ビオチン結合の阻害アッセイで評価して、そのマンノシルアナログ（参照化合物２）の結果と比較した。96ウェルマイクロタイタープレート(高結合性平底(High binding flat bottom)、Costar，Corning，U.S.A.)を、ヤギ抗ヒトIgG 10 g/mLを含むコーティング緩衝液（50 mM NaHCO₃、pH 9.6）で4℃にて一晩コーティングした。続いて、ウェルをアッセイ緩衝液（20 mM HEPES、150 mM NaCl、1 mM CaCl₂、pH 7.4）で洗滌し、ブロッキング緩衝液（3％BSAを含むアッセイ緩衝液）で37℃にて1時間インキュベートした。ウェルをアッセイ緩衝液で洗滌した後、ヒトP-セレクチン/IgG-Fc（0.3 μg/mL）又はCD4/IgG-Fc（ネガティブコントロール）を用いて37℃にて2時間インキュベートした。続いて、ウェルをアッセイ緩衝液で３回洗滌して、0.33 μg/mL HSO₃-Le^a-PAA-ビオチン及び化合物３を含む結合緩衝液（0.1％BSA、0.05％ Tween20を含むアッセイ緩衝液）で37℃にて2時間インキュベートした。ウェルを結合用緩衝液で６回洗滌して、3,3',5,5'-テトラメチルベンジン(TMB)/H₂O₂を加え、室温にて15分間インキュベートした。2M H₂SO₄の添加によって反応を停止させ、450 nmにて吸光度を測定した。この方法によって決定されたとおり、P-セレクチンに対するグルコシル化合物３のEC₅₀は2.0 mMであり、従って参照化合物２のEC₅₀（8.2 mM）よりも有意に低かった。

（実施例３:化合物６ｄ、６ｆ及び６ｉの合成（図１及び図３の反応スキーム参照））
ショッテン-バウマン条件下、グルコサミンを2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル(Troc)誘導体１４に変換した（H.U. Bergmeyer, Methods of enzymatic analysis (1984), Verlage Chemie, Mannheim, Vol. IV p.342-350）。粗生成物を、ショウノウスルホン酸の存在下アリルアルコール中でアリル化し、続いてアセチル化して、α-配向O-アリルグリコシド１５ｄを主要化合物として得た。次に、酢酸中で活性化亜鉛と共にインキュベートすることによってTroc基を除去し、中間生成物のアミン１５ａを得た。続いて、アルカリ性水溶液条件下、同族酸クロリドの添加により、遊離アミン１５ａをアミド１５ｃ及び１５ｆ〜１５ｉに変換した。種々の酸クロリドは、次のように選択した：１５ｃについてはオクタノイルクロリド、１５ｄについては2,2,2-トリクロロエトキシカルボニルクロリド、１５ｆについてはベンゾイルクロリド、１５ｇについてはニトロベンジルクロリド、１５ｈについてはトリフルオロメチルベンジルクロリド、１５ｉについてはナフトイルクロリド。次に、OsO₄及びNMOを用いて、アシル化化合物１５ｃ、１５ｆ〜１５ｉ及びTroc誘導体１５ｄにO-アリル基の穏やかな酸化を行い、続いてNaIO₄による処理を行った。それぞれのアルデヒドが良好な収率で得られ、これらを実施例１に記載するようにFruA触媒下でDHAPと縮合させ、グルコシルフォスフェート１７ｃ、１７ｄ及び１７ｆ〜１７ｉを得た。次に、10 mMナトリウムメトキシド溶液を用いた処理によってアセチル基を除去し、化合物６ｃ、６ｄ及び６ｆ〜６ｉを単離した。

化合物６ｃ：¹H NMR(MeOD)：δ4.67(d, 1H, J=13.1Hz)、4.48(d, 1H, J=12.8Hz)、4.20(d, 1H, J=5.8Hz)、3.95-3.45(m, 9H)、2.18-2.14(m, 2H, C=OCH₂オクタノイル)、1.28(s, 8H, 4×CH₂)、0.88(m, 3H, CH₃)。
化合物６ｄ：¹H NMR(MeOD)：δ5.03(d, 1H, J=3.6Hz, H-1)、4.70(d, 1H, J=12.7Hz)、4.53(d, 1H, J=12.7Hz)、4.23-4.11(m, 2H)、3.93-3.85(m, 3H)、3.77-3.63(m, 5H)、3.48-3.42(m, 2H)。
化合物６ｆ：¹H NMR(MeOD)：δ7.87-7.41(m, 5H, 芳香環CH)、4.98(d, 1H, J=3.6 Hz, H-1)、4.69(d, 1H, J=12.7Hz)、4.51(d, 1H, J=12.7Hz)、4.15(dd, 2H, J=10.8, 3.6Hz)、3.86-3.63(m, 7H)、3.42(t, 1H, J=9.2Hz)。
化合物６ｈ：¹H NMR(MeOD)：δ7.93(d, 2H, J=8.1Hz, 芳香環CH)、7.75(d, 2H, J=8.2Hz, 芳香環CH)、4.84-4.64(m, 4H)、3.98-3.92(m, 3H)、3.74-3.57(m, 3H)、3.40-3.39(m, 2H)。
化合物６ｉ：¹H NMR(MeOD)：δ7.93-7.55(m, 7H, 芳香環CH)、4.90-4.61(m, 4H)、4.02-3.49(m, 8H)。

（実施例４: P-セレクチンに対する化合物６ｄ、６ｆ及び６ｉの結合）
化合物６ｄ、６ｆ及び６ｉのP-セレクチンに対する結合を、実施例２で説明する同一の阻害アッセイを用いて評価した。見出されたEC₅₀値は、化合物６ｃについては4.5 mM、化合物６ｄについては3.7 mM、化合物６ｆについては0.90 mM、化合物６ｉについては0.32 mMであった。化合物６ｈは5 mMにて36％の阻害を示した。

参照化合物２及び本発明の幾つかの好ましい化合物の構造式を示す。 参照化合物２及び本発明の化合物３の合成経路を示す。 本発明の化合物６ｃ、６ｄ及び６ｆ〜６ｉの合成経路を示す。

Claims (16)

1. Ｐ−セレクチンに対し親和性及び／又は選択性を有する、以下の式Ｉａによって表される化合物、
   

   

   又は以下の式Ｉｂによって表される前記化合物の立体異性体：
   

   

   （式中、
   Ｘは、−Ｏ−、−ＣＨ₂ Ｏ−、−ＣＨ ₂ −、−Ｓ−、−ＣＨ₂ Ｓ−、−ＮＨ−又は−ＣＨ₂ ＮＨ−を表し；
   Ｒ¹はＱＲ⁴を表し、このときＱは−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を表し、かつＲ⁴は直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基又はアリール基、又は直鎖若しくは分岐鎖のアラルキル基若しくはアルカリール基を表し、上記基は１以上のヘテロ原子を有していてもよく；上記基は置換されていてもよく；
   Ｒ²は、リン酸基、ホスホン酸基、カルボキシル基、スルホン酸基であり；
   Ｒ³は、ＯＨ又はＹＲ⁵を表し、このときＹは−Ｏ−、−ＣＨ₂−又は−ＮＨ−であり、かつＲ⁵は直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、又はアリール基、又は直鎖若しくは分岐鎖のアラルキル基若しくはアルカリール基を表し、上記基は１以上のヘテロ原子を有していてもよく；上記基は置換されていてもよい）。
2. Ｘが−ＣＨ ₂ Ｏ−を表す、請求項１記載の化合物。
3. Ｑが−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−を表す、請求項１又は２に記載の化合物。
4. Ｒ²がリン酸基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
5. Ｒ³がＯＨを表す、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
6. Ｒ⁴が、ニトロ、−（Ｃ＝Ｏ）−アルキル、シアノ、−ＳＯ₃Ｈ、ＣＣｌ₃又はＣＦ₃からなる基より選択される基により置換されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
7. Ｒ⁴がフェニル基又はナフタレン基である、請求項１から５のいずれか１項に記載の化合物。
8. Ｒ ⁵ が、直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、又はアリール基、又は直鎖若しくは分岐鎖のアラルキル基若しくはアルカリール基であり、上記基は１以上のヘテロ原子を有していてもよく、上記基は置換されていてもよく該化合物をコロイド状又は微粒子状の薬物担体に固定し得る。
9. Ｒ ⁵ が、Ｐ−セレクチンに対する親和性を有するペプチド又はペプチド模倣部分である、請求項８記載の化合物。
10. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物を含有する医薬組成物。
11. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物を含有する診断用組成物。
12. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物を含有するＰ−セレクチンに対するアンタゴニスト。
13. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物を含有する、Ｐ−セレクチンを発現している細胞又は組織へ医薬的に有効な化合物を送達するターゲッティング薬。
14. Ｐ−セレクチンの活性化又は過剰発現に関係する疾患又は状態を診断、予防又は抑制するための医薬品の製造における、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物の使用。
15. 医薬として許容される担体中に、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物、その誘導体、その塩、その複合体、その溶媒和物又はその多量体を含む、医薬組成物。
16. ある化合物がＰ−セレクチン又はＰ−セレクチンの機能的等価物に対して結合し得るかどうかを決定する方法であって、
    被験化合物及び所定量の請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物を、所定量のＰ−セレクチン又はＰ−セレクチンの機能的等価物と接触させること、及びそれらを一緒にインキュベートすること；及び
    続いて請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物の量を決定すること；
    を含む前記方法。

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