JP4585790B2

JP4585790B2 - 細胞培養足場および細胞培養方法

Info

Publication number: JP4585790B2
Application number: JP2004127341A
Authority: JP
Inventors: 茂樹本津; 正暢楠; 博昭西川
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2004-03-27
Filing date: 2004-03-27
Publication date: 2010-11-24
Anticipated expiration: 2024-03-27
Also published as: JP2005278609A

Description

本発明は、人工的に細胞増殖を制御し、意図した機能を持つ生体組織を再生するのに適した細胞培養足場およびこの細胞培養足場を用いた細胞培養方法に関する。

従来の細胞培養は、均質・一様な培養床、もしくは培養足場上で行われており、集合として見た場合の細胞を特定の形状に誘導すること（選択的培養）、あるいは異なる種類の細胞を制御された状態で混在したまま培養（共培養）することは困難であった。
また、高分子材料中にハイドロキシアパタイト微粒子を分散させた細胞培養用基材も既に提案されている（特許文献１参照）が、この細胞培養用基材の場合もハイドロキシアパタイト微粒子が分散しているので、細胞を特定の形状に誘導すること（選択的培養）、あるいは異なる種類の細胞を制御された状態で混在したまま培養（共培養）することは自由に行えない。

特開平７−２６５０５６号公報

本発明は、上記事情に鑑みて、細胞を特定の形状に誘導すること、異なる種類の細胞を制御された状態で混在したまま培養することが容易な細胞培養足場およびこの細胞培養足場を用いた細胞培養方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明の請求項１に記載の細胞培養足場は、塑性変形可能な材料で形成されている基材と、基材表面にレーザーアブレーション法によって細胞培養したい形状に形成され、ハイドロキシアパタイト薄膜層からなる生体親和部と、基材表面の生体親和部に隣接し、非生体親和性材料または難生体親和性材料からなる非生体親和部と、を備えるものである。

本発明の請求項２に記載の細胞培養方法は、請求項１に記載の細胞培養足場のハイドロキシアパタイト薄膜層の細胞培養不要部分をエッチングにより除去する薄膜除去工程と、薄膜層除去工程後、残ったハイドロキシアパタイト薄膜層を用いて細胞を培養する選択的培養工程と、を備える方法である。

本発明の請求項３に記載の細胞培養方法は、請求項１に記載の複数の細胞培養足場のハイドロキシアパタイト薄膜層に、異なる種類の細胞誘導因子または細胞をそれぞれ吸着させる吸着工程と、吸着工程によって得られた細胞誘導因子または細胞が吸着した複数の細胞足場を、意図する細胞組織のパターンに組み合わせたのち、細胞を培養する共培養工程と、を備える方法である。

本発明において、基材としては、特に限定されないが、たとえば、金属ワイヤ、有機系繊維、ポリＬ乳酸、ポリグリコール酸等の生体吸収性材料などの可撓性あるいは柔軟性に富むものである。また、生体親和部は、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ₁₀（ＰＯ₄）₆ＯＨ）₂）薄膜から構成される。さらに、非親和性材料または難生体親和性材料としては、特に限定されないが、たとえば、シリコーン樹脂、４フッ化エチレン樹脂などが挙げられる。なお、生体親和部は、基材の表面に複層に積層されていても構わないし、基材の面方向に並設されていても構わない。

特定細胞誘導因子としては、特に限定されないが、たとえば、インターロイキンのような細胞誘導因子、またはＢＭＰのような骨誘導因子に代表されるサイトカイン、ヘパリン，ヒアルロン酸のような生理活性分子などが挙げられる。なお、本発明の細胞培養足場と同様な製造方法を用いれば、バイオセンサ、バイオチップ、ＤＮＡチップの作製を行うこともできる。

請求項１の細胞培養足場の製造方法としては、特に限定されないが、たとえば、ハイドロキシアパタイト薄膜をエッチングする方法や、ハイドロキシアパタイト薄膜の表面に非生体親和性または難生体親和性材料からなる膜をフォトレジスト法などにより形成する方法が挙げられる。
請求項２の細胞培養方法において、エッチング方法は、物理エッチングおよび化学エッチングのいずれでも構わない。

請求項１の細胞培養足場は、基材が塑性変形可能な材料で形成されているので、基材とともにハイドロキシアパタイト薄膜層の形状も変形させることができ、より容易に意図した形状に細胞を増殖させることができる。また、その一部が、ハイドロキシアパタイト薄膜層により覆われているため、蛋白質の持つアミノ基、カルボキシル基とアパタイトの持つＣａ ²⁺ ，ＰＯ ₄ ^3- の結合による吸着性を利用して、細胞増殖性に優れている。さらに、ハイドロキシアパタイト薄膜層がレーザーアブレーション法により形成されているので、積層の際に分解したり、変質したりすることがなく、より均質な薄膜層を形成できる。

以下に、本発明を、その実施の形態をあらわす図面を参照しつつ詳しく説明する。
図１は、本発明にかかる細胞培養足場の第１の実施の形態をあらわしている。

図１に示すように、この細胞培養足場１は、金属片、ガラス片、樹脂片等からなる基材１１と、基材１１の表面にレーザーアブレーション法を用いて形成されたハイドロキシアパタイト薄膜層１２とを備えている。
そして、この細胞培養足場１は、たとえば、図２（ａ）に示すように、まず、リソグラフィ技術およびエッチング技術を用いて、不要な部分のハイドロキシアパタイト薄膜層１２を取り除いて、不要な部分は基板１１を露出させる。

つぎに、この不要な部分のハイドロキシアパタイト薄膜層１２を取り除いた細胞培養足場１ａに、特定細胞誘導因子を滴下したのち、洗浄を行い、図２（ｂ）に示すように、細胞培養足場１ａのハイドロキシアパタイト薄膜層１２部分のみに、特定細胞誘導因子を吸着させる。
そして、この特定細胞誘導因子を吸着させた細胞培養足場１ｂに図２（ｃ）に示すように、細胞Ｚを吸着させて培養すると、図２（ｄ）に示すように、ハイドロキシアパタイト薄膜層１２に沿って細胞Ｚが増殖し、たとえば、神経回路網形成などを行うことができる。

図３は、本発明にかかる細胞培養足場の第２の実施の形態をあらわしている。
図３に示すように、この細胞培養足場２は、上記第１の実施の形態と同様の基材２１表面に、生体親和性が異なるハイドロキシアパタイト薄膜層２２、２３がその厚み方向に積層されている。

そして、この細胞培養足場２は、たとえば、図４（ａ）に示すように、まず、リソグラフィ技術およびエッチング技術を用いて、上層のハイドロキシアパタイト薄膜層２３の不要部分を取り除いて、下層のハイドロキシアパタイト薄膜層２２を所望パターンで露出させたのち、両ハイドロキシアパタイト薄膜層２２、２３に特定細胞誘導因子を吸着させる。そして、図４（ｂ）に示すように、ハイドロキシアパタイト薄膜層２２部分に細胞Ｘ、ハイドロキシアパタイト薄膜層２３部分に細胞Ｙを吸着させれば、図４（ｃ）に示すように、ハイドロキシアパタイト薄膜層２２部分に細胞Ｘのみが増殖し、ハイドロキシアパタイト薄膜層２３部分に細胞Ｙのみが増殖した細胞組織を得ることができる。

図５および図６は本発明にかかる細胞培養足場の第３の実施の形態をあらわしている。
図５に示すように、この細胞培養足場３は、金属ワイヤ、有機系繊維、生体吸収性材料などの可撓性あるいは柔軟性に富む線状をした基材３１の周面のハイドロキシアパタイト薄膜層３２が形成され、図６（ａ）に示すように、線状あるいは紐状になっている。

そして、この細胞培養足場３は、図６（ｂ）に示すように、細胞誘導因子Ａを吸着させた細胞培養足場３ａを作製するとともに、図６（ｃ）に示すように、細胞誘導因子Ｂを吸着させた細胞培養足場３ｂを作製したのち、図６（ｄ）に示すように、細胞培養足場３ａおよび細胞培養足場３ｂを細胞培養したいパターンに組み合わせ、図６（ｅ）に示すように、意図する細胞組織４を得ることができる。即ち、複数の細胞を共培養することができる。

本発明は、上記の実施の形態に限定されない。たとえば、上記の実施の形態では線状の可撓性あるいは柔軟性に富む細胞培養足場を用いて複数の細胞を共培養するようにしていたが、板状やブロック状の細胞培養足場を異なる細胞誘導因子を吸着させた状態で、モザイク状に並べたり、積み重ねたりして共培養を行うこともできる。

本発明にかかる細胞培養足場の第１の実施の形態を模式的にあらわす断面図である。図１の細胞培養足場の細胞培養方法の１例を工程順に説明する説明図である。本発明にかかる細胞培養足場の第２の実施の形態を模式的にあらわす断面図である。図３の細胞培養足場の細胞培養方法の１例を工程順に説明する説明図である。本発明にかかる細胞培養足場の第３の実施の形態を模式的にあらわす断面図である。図５の細胞培養足場の細胞培養方法の１例を工程順に説明する説明図である。

１，２，３細胞培養足場
１１，２１，３１基材
１２，２２，２３，３２ハイドロキシアパタイト薄膜層
Ｘ，Ｙ，Ｚ細胞

Claims

塑性変形可能な材料で形成されている基材と、
基材表面にレーザーアブレーション法によって細胞培養したい形状に形成され、ハイドロキシアパタイト薄膜層からなる生体親和部と、
基材表面の生体親和部に隣接し、非生体親和性材料または難生体親和性材料からなる非生体親和部と、
を備える細胞培養足場。
請求項１に記載の細胞培養足場のハイドロキシアパタイト薄膜層の細胞培養不要部分をエッチングにより除去する薄膜除去工程と、
薄膜層除去工程後、残ったハイドロキシアパタイト薄膜層を用いて細胞を培養する選択的培養工程と、
を備える細胞培養方法。
請求項１に記載の複数の細胞培養足場のハイドロキシアパタイト薄膜層に、異なる種類の細胞誘導因子または細胞をそれぞれ吸着させる吸着工程と、
吸着工程によって得られた細胞誘導因子または細胞が吸着した複数の細胞足場を、意図する細胞組織のパターンに組み合わせたのち、細胞を培養する共培養工程と、
を備える細胞培養方法。