JP4578825B2

JP4578825B2 - レーザ顕微鏡装置

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Publication number: JP4578825B2
Application number: JP2004049384A
Authority: JP
Inventors: 康成松川
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2004-02-25
Filing date: 2004-02-25
Publication date: 2010-11-10
Anticipated expiration: 2024-02-25
Also published as: JP2005241798A

Description

本発明は、レーザ光を試料に照射し、試料から発する光の光強度を検出し、検出した光強度を数値に変換し、変換された数値を観察するレーザ顕微鏡装置に関するものである。

近年、レーザ光を励起光として蛍光染色された試料に照射し、試料から発する蛍光の光強度を光検出器とＡ／Ｄ変換器（Ａ／Ｄ）とを用いて光子数に変換して光子数をカウントし、このカウントされた光子数を画像化するレーザ顕微鏡装置が多用されている。蛍光の光子数は、励起光の光強度に比例し、励起光の光強度が弱い場合、蛍光の光子数は少なく、Ｓ／Ｎ比の悪い画像が取得される。一方、励起光の光強度が強い場合、蛍光の光子数は多く、Ｓ／Ｎ比の良い画像が取得されるが、励起光の光強度が強すぎる場合、蛍光の光子数が集中して光検出器に入射するマルチフォトンイベントの発生頻度が増大する。このマルトフォトンイベントの発生頻度が増大する場合、光検出器に入射する光子数が光検出器の分解能を超え、蛍光の光子数が正しくカウントされず、蛍光光子数に対応した正確な画像が取得されない。そのため、Ｓ／Ｎ比がよく、かつ正確な蛍光画像を取得するためには、試料に対して適正な光強度のレーザ光を照射する必要がある。そこで、光検出器に入射する光に対して所定の閾値を設定し、この閾値によって光検出器に入射する光を分別し、正確な光子数をカウントする方法が提案されている（特許文献１）。

特開平９−７２７８４号公報

しかしながら、励起光と蛍光との光強度の比例関係は試料ごとに異なり、予めマルチフォトンイベントの発生頻度が増大する励起光の光強度を知ることはできない。そのため、適正な光強度のレーザ光を照射するまでに多大な時間と労力がかかるという問題点があった。

また、試料が生体である場合、適正な光強度を知るために試料に対し長時間レーザ光を照射すると、この長時間のレーザ光の照射によって、この試料が変質してしまうという問題点があった。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、簡易な構成で自動的にかつ短時間に試料に対して適正な光強度のレーザ光を照射できるレーザ顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記の目的を達成するために、本発明のレーザ顕微鏡装置は、レーザ光源から出射したレーザ光を試料に照射し、該レーザ光が照射された試料から発する光を光検出器で検出して前記光の光強度に対応する光電流パルスに変換し、該光電流パルスに基づいて作成した画像信号を画像表示部に画像表示するレーザ顕微鏡装置において、前記光検出器に入射する光子が重なり合うマルチフォトンイベントが、前記画像表示部に表示される１フレームあたりで発生する総数が、第１の閾値を超えるときには、前記試料に照射されるレーザ光の強度を減少させる制御を行い、前記総数が前記第１の閾値よりも小さい第２の閾値未満のときには、前記試料に照射されるレーザ光の強度を増加させる制御を行う制御手段を備えることを特徴とする。

また、本発明のレーザ顕微鏡装置は、上記の発明において、前記制御手段は、前記光検出器で検出した前記光の光強度が所定強度以上である場合にフォトンを検出するフォトン検出手段と、前記フォトン検出手段が連続して所定数前記フォトンを検出した状態である前記マルチフォトンイベントの発生回数をカウントするカウント手段と、を備えることを特徴とする。

また、本発明のレーザ顕微鏡装置は、上記の発明において、前記フォトン検出手段は、前記光強度をサンプリングした値が前記所定強度以上である場合、前記フォトンを検出することを特徴とする。

また、請求項４にかかるレーザ顕微鏡装置は、上記の発明において、前記フォトン検出手段は、前記所定強度以上である前記光強度が所定の時間連続した場合、前記フォトンを検出することを特徴とする。

また、本発明のレーザ顕微鏡装置は、上記の発明において、前記制御手段は、前記マルチフォトンイベントの発生頻度に対応した前記レーザ光の強度に上限値を設け、前記総数が前記第２の閾値未満のときには、前記試料に照射されるレーザ光の強度を増加させ、かつ前記試料に照射されるレーザ光の強度を前記上限値以下に制御する光強度制限手段をさらに備えることを特徴とする。

本発明にかかるレーザ顕微鏡装置は、簡易な構成で自動的にかつ短時間に試料に対して適正な光強度のレーザ光を照射できるという効果を奏する。

以下に添付図面を参照して、この発明にかかるレーザ顕微鏡装置の好適な実施の形態を詳細に説明する。

（実施の形態１）
図１は、この発明の実施の形態１であるレーザ顕微鏡装置１００の概要構成を示す機能ブロック図である。このレーザ顕微鏡装置１００は、レーザ光を出射するレーザ光源１と、出射されたレーザ光の光軸を調整するコリメートレンズ２と、コリメートレンズ２を通過したレーザ光の光強度を調節する減衰器３と、減衰器３で減衰されたレーザ光を反射するダイクロイックミラー４と、ダイクロイックミラー４で反射されたレーザ光を試料８上に走査するガルバノミラー５ａ，５ｂと、ガルバノミラー５ａ，５ｂを通過したレーザ光を対物レンズ７に投影する瞳投影レンズ６と、対物レンズ７に投影されたレーザ光を試料８に集光する対物レンズ７と、試料８から発した蛍光を透過するダイクロイックミラー４と、ダイクロイックミラー４を透過した蛍光を集光する集光レンズ９と、集光レンズ９で集光された蛍光を反射するミラー１０と、ミラー１０で反射された蛍光から蛍光波長以外の光を除去するフィルタ１１と、レーザ光の集光点から発した蛍光のみが通過するピンホール１２と、ピンホール１２を通過した蛍光を入射し、入射した蛍光の光強度に対応した電流信号を出力する光検出器１３と、光検出器１３を動作させる高電圧電源１６と、光検出器１３から出力された電流信号を入力し、電圧信号に変換して出力する電流−電圧変換器（Ｉ−Ｖ）１４と、Ｉ−Ｖ１４から出力された電圧信号を数値化して出力するＡ／Ｄ１５と、Ａ／Ｄ１５から出力された数値を、制御部２０を介して画像表示する画像表示部１９と、ガルバノミラー５ａ，５ｂを制御する走査部１７と、減衰器３を制御する光強度制御部１８と、Ａ／Ｄ１５と走査部１７と光強度制御部１８とを制御する制御部２０とを有している。

図１において、まず、レーザ光源１からレーザ光が出射され、レーザ光は、音響光学波長可変フィルタ等によって実現される減衰器３によって光強度が制御され、試料８に集光する。レーザ光が試料８に集光すると、試料８から、蛍光が発せられ、蛍光は、光電子増倍管等によって実現される光検出器１３に入射する。光検出器１３に入射した蛍光は、蛍光の光強度に対応した光電流パルスに変換されＩ−Ｖ１４に出力される。Ｉ−Ｖ１４に出力された光電流パルスは、光電流パルスに対応した電圧信号に変換されてＡ／Ｄ１５に出力される。Ａ／Ｄ１５に出力された電圧信号は時分割されて数値化されてデジタル信号として制御部２０に出力される。パーソナルコンピュータ等によって実現される制御部２０に出力されたデジタル信号は、画像信号に変換され画像表示部１９に画像表示される。また、制御部２０は、出力されたデジタル信号をもとに適正な光強度を演算し、レーザ光源１から適正な光強度のレーザ光が出射されるように光強度制御部１８を制御する。

ここで、図２，３，４に光検出器１３に入射される蛍光のパルス（光子）と光検出器１３から出力される光電流パルスとの対応関係を示す。まず、図２に示すように、レーザ光の光強度が適正である場合、光子の信号強度は、十分で、かつ離散的となり、光検出器１３に入射する光子数と光検出器１３から出力される光電流パルス数とは対応する。つぎに、図３に示すように、レーザ光の光強度が強い場合、光検出器１３に入射する光子が重なり合うマルチフォトンイベントが発生し、光検出器１３から出力される光電流パルスの波形は、入射する光子を積算した波形となり、結果的に光検出器１３に入射する光子数と光検出器１３から出力される光電流パルス数とは対応しない。また、図４に示すように、レーザ光の光強度が弱い場合、光子の信号強度が不十分となり、光検出器１３のノイズ（暗電流）に埋もれ、暗電流に埋もれた光子は、検出されず、結果的に光検出器１３に入射する光子数と光検出器１３から出力される光電流パルス数とは対応しない。蛍光画像は、光検出器１３から出力された光電流パルス数をもとに作成されるため、Ｓ／Ｎ比のよい正確な蛍光画像が作成されるためには、光検出器１３に入射する光子数と光検出器１３から出力される光電流パルス数とを一致させる必要がある。

図５は、光検出器１３に１光子入射すると、パルス幅１０ｎｓの光電流パルスが出力される場合、光検出器１３に入射する光子数と光検出器１３から出力される光電流パルス数との関係と、光検出器１３に入射する光子数とマルチフォトンイベントの発生確率との関係とを示した図である。図５に示されるように、光検出器１３に入射する単位時間あたりの光子数が約１０⁷個に達するまでは、入射する光子数と出力される光電流パルス数とは対応するが、光検出器１３に入射する単位時間あたりの光子数が約１０⁸個を超えると、マルチフォトンイベントの発生確率が急激に増大し、光検出器１３から出力される単位時間あたりの光電流パルス数は急激に減少する。つまり、光検出器１３に入射する光子数が約１０⁸個を超えると、光検出器１３に入射する光子数と光検出器１３から出力される光電流パルス数とは対応しなくなる。

そこで、光検出器１３に入射する光子数と光検出器１３から出力される光電流パルス数とが対応する範囲内で、レーザ光の光強度を適正に維持するため、画像表示部１９に表示される１画面（１フレーム）を作成するにあたりに発生するマルチフォトンイベントの総数Ｍに対して所定の範囲（Ｍｔｈ２≦Ｍ≦Ｍｔｈ１）を設定する。そして、１フレームを作成するにあたり発生したマルチフォトンイベントの総数Ｍをカウントし、カウントされたマルチフォトンイベントの総数Ｍが所定の範囲（Ｍｔｈ２≦Ｍ≦Ｍｔｈ１）に収束するようにレーザ光の光強度を制御する。

ところで、１フレームは、複数の画素（ピクセル）の集合によって構成され、さらに１ピクセルは、複数のレーザ光の照射によって得られた光電流パルスの積算から作成されることから、１ピクセルを作成するごとに発生したマルチフォトンイベントの数をカウントし、さらに１フレームを作成するにあたってそれぞれにカウントされた複数のピクセルのマルチフォトンイベントの数を積算すると、１フレームあたりのマルチフォトンイベントの総数Ｍが求められる。マルチフォトンイベントの総数Ｍが求められると、総数Ｍが所定の範囲（Ｍｔｈ２≦Ｍ≦Ｍｔｈ１）に入っているか否かを判断し、総数ＭがＭｔｈ１を超えていれば、レーザ光の光強度を弱くするように修正し、総数ＭがＭｔｈ２未満であれば、レーザ光の光強度を強くするように修正する。このようにして、レーザ光の光強度を適正な範囲に収束させることができる。

つぎに、マルチフォトンイベントのカウント方法について説明する。図６，７は、光検出器１３から出力された光電流パルスとＡ／Ｄ１５から出力されたデジタル信号Ｖｐとの対応関係を示す図である。デジタル信号Ｖｐに対して暗電流に対応する閾値Ｖｔｈを設定すると、図６に示すように、レーザ光の光強度が適正である場合、光検出器１３から出力される光電流パルス数と、閾値Ｖｔｈ以上のデジタル信号Ｖｐの数とは対応する。

一方、図７に示すように、レーザ光の光強度が強い場合、マルチフォトンイベントが発生し、デジタル信号Ｖｐは、連続して閾値Ｖｔｈ以上になる。つまり、デジタル信号Ｖｐが連続して閾値Ｖｔｈ以上である場合、マルチフォトンイベントが発生しているとして、マルチフォトンイベントの発生をカウントする。この実施の形態１では、デジタル信号Ｖｐが２回連続して閾値Ｖｔｈ以上である場合、マルチフォトンイベントが１回発生したとして、マルチフォトンイベントの発生回数を１回カウントする。このような方法によってマルチフォトンイベントをカウントする。

つぎにマルチフォトンイベントの総数Ｍを求め、この総数Ｍをもとにレーザ光の光強度を適正な範囲に収束させる制御を行う制御部２０の動作について説明する。図８は、制御部２０の概要構成を示すブロック図である。この制御部２０は、同期信号を発生させる同期信号発生部２０１と、走査部１７に同期信号を出力するミラー駆動信号生成部２０５と、デジタル信号Ｖｐと閾値Ｖｔｈとを比較する比較部２０６と、デジタル信号Ｖｐが閾値Ｖｔｈ以上である場合の回数をカウントするカウンタ２０７と、閾値Ｖｔｈ以上であるデジタル信号Ｖｐをもとに画像信号を作成する画像演算部２０９と、画像演算部２０９によって演算され、１フレーム分の画像信号を蓄積するフレームメモリ２１０と、フレームメモリ２１０に蓄積された画像信号を制御して画像表示部１９に出力する表示制御部２１１と、比較部２０６によってマルチフォトンイベントと判断された数をカウントするマルチフォトンイベントカウンタ２０８と、マルチフォトンイベントカウンタ２０８とカウンタ２０７と同期信号とによってレーザ光の光強度が適正な範囲に入っているか否かを演算する光強度演算部２１２とを有している。さらに、同期信号発生部２０１は、ピクセルククロック発生部２０２と、水平同期信号生成部２０３と、垂直信号生成部２０５とを有し、ピクセルクロック発生部２０２は、水平同期信号生成部２０３と垂直信号生成部２０５とに同期信号を出力している。

制御部２０は、同期信号発生部２０１が出力した同期信号に同期させてＡ／Ｄ１５に変換クロックを出力し、Ａ／Ｄ１５は、この変換クロックに同期させてデジタル信号Ｖｐを制御部２０に出力する。

比較部２０６は、Ａ／Ｄ１５からデジタル信号Ｖｐを入力すると、デジタル信号Ｖｐと閾値Ｖｔｈとを比較し、デジタル信号Ｖｐが閾値Ｖｔｈ以上である場合、ウンタ２０７とマルチフォトンイベントカウンタ２０８とに出力する。カウンタ２０７は、デジタル信号Ｖｐを画像演算部２０９に出力するとともに、同期信号にしたがって閾値Ｖｔｈ以上であるデジタル信号Ｖｐの数をカウントし、カウントした数を光強度演算部２１２に出力する。画像演算部２０９は、入力したデジタル信号Ｖｐを演算して画像信号に変換し、フレームメモリ２１０に出力する。フレームメモリ２１０は、入力した画像信号を蓄積し、１フレーム分の画像信号を蓄積すると、表示制御部２１１に出力する。表示制御部２１１は、入力した画像信号を表示信号に変換し、画像表示部１９に出力表示する。一方、マルチフォトンイベントカウンタ２０８は、同期信号にしたがって閾値Ｖｔｈ以上であるデジタル信号Ｖｐの数を入力し、２回連続して閾値Ｖｔｈ以上である場合、マルチフォトンイベントを１回カウントし、１フレームの作成あたりにカウントされたマルチフォトンイベントの総数Ｍを光強度演算部２１２に出力する。光強度演算部２１２は、総数Ｍをもとに光強度を演算し、光強度の増減を指示する指示信号を光強度制御部１８に出力する。光強度制御部１８は、指示信号をもとに減衰器１３を制御し、レーザ光の光強度を制御する。

制御部２０の制御動作の詳細を図９，１０に示すフローチャートを用いて説明する。図９において、１フレームの画像を作成しつつマルチフォトンイベントの総数Ｍを求め、この総数Ｍをもとにレーザ光の光強度を制御する動作について説明する。図１０において、１フレームを構成する複数のピクセルにおける１ピクセル分の画像取得動作とともにマルチフォトンイベントのカウント動作について説明する。

まず、図９において、レーザ顕微鏡装置１００の初期化（ステップＳ１０１）とレーザ光の光強度ＬをＬ_INITにして光強度演算部２１２の初期化（ステップＳ１０２）とを行う。さらに、マルチフォトンイベントカウンタ２０８の初期化を行い、総数Ｍを「０」にする（ステップＳ１０３）。つぎに、カウンタ２０７は、１ピクセル分のデジタル信号Ｖｐの取得処理を行い（ステップＳ１０４）、画像演算部２０８は、１ピクセル分のデジタル信号Ｖｐを演算して画像輝度に変換し（ステップＳ１０５）、フレームメモリ２１０は、画像輝度に変換されたデータを格納する（ステップＳ１０６）。フレームメモリ２１０に格納されたデータが１フレーム分に達しているか否かが判断され（ステップＳ１０７）、格納されたデータが１フレーム分完了されていないと判断された場合（ステップＳ１０７，Ｎｏ）、１ピクセル分のデジタル信号Ｖｐの取得処理に戻り（ステップＳ１０４）、格納されたデータが１フレーム分完了されていると判断された場合（ステップＳ１０７，Ｙｅｓ）、フレームメモリ２１０に格納されている１フレーム分の画像表示を行う（ステップＳ１０８）。

つぎに、光強度演算部２１２は、マルチフォトンイベントの発生回数の総数Ｍが閾値Ｍｔｈ１以下であるか否かを判断する（ステップＳ１０９）。総数Ｍが閾値Ｍｔｈ１以下でない場合（ステップＳ１０９，Ｎｏ）、光強度制御部１８に光強度Ｌを光強度Ｌ−ΔＬに減少する指示出力し（ステップＳ１１１）、総数Ｍが閾値Ｍｔｈ１以下である場合（ステップＳ１０９，Ｙｅｓ）、総数Ｍが閾値Ｍｔｈ２以上であるか否かを判断する（ステップＳ１１０）。総数Ｍが閾値Ｍｔｈ２以上でない場合（ステップＳ１１０，Ｎｏ）、光強度制御部１８に光強度Ｌを光強度Ｌ＋ΔＬに増加する指示出力する（ステップＳ１１２）。光強度制御部１８に光強度を減少する指示出力した場合（ステップＳ１１１）と光強度制御部１８に光強度を増加する指示出力した場合（ステップＳ１１２）とは、レーザ光の光強度が適正ではないので、指示出力したがって再びレーザ光を照射する。一方、総数Ｍが閾値Ｍｔｈ２以上である場合（ステップＳ１１０，Ｙｅｓ）、レーザ光の光強度は、適正であるので、画像取得の終了指示があるまで（ステップＳ１１３）、画像取得を続け、画像取得の終了と判断されると（ステップＳ１１３，Ｙｅｓ）、画像取得は終了される。

つぎに、図１０を用いて、制御部２０が行う１ピクセル分のデジタル信号Ｖｐの取得処理動作について説明する。まず、制御部２０は、カウンタ２０７の初期化を行い、カウント数Ｐを「０」にする（ステップＳ２０１）、つぎに、マルチフォトンイベントカウンタ２０８の初期化を行い、フラグ数ＦＬＡＧを「０」にする（ステップＳ２０２）。つぎに、比較部２０６は、Ａ／Ｄ１５からデジタル信号Ｖｐを入力する（ステップＳ２０３）。比較部２０６は、入力したデジタル信号Ｖｐと閾値Ｖｔｈとの大小を比較し（ステップＳ２０４）、デジタル信号Ｖｐが閾値Ｖｔｈ以上である場合（ステップＳ２０４，Ｙｅｓ）、フラグＦＬＡＧが「１」であるか否かを判断する（ステップＳ２０５）。フラグＦＬＡＧが「１」である場合（ステップＳ２０５，Ｙｅｓ）、つまり連続して２回閾値Ｖｔｈ以上である場合、マルチフォトンイベントが発生したと判断され、マルチフォトンイベントカウンタ２０８は、カウント数Ｍをカウント数Ｍ＋１にする（ステップＳ２０７）。そして、マルチフォトンイベントカウンタ２０８のフラグＦＬＡＧを「１」にする（ステップＳ２０８）。つぎに、１ピクセル分のデジタル信号Ｖｐを蓄積したか否かを判断し（ステップＳ２１０）、１ピクセル分のデジタル信号Ｖｐが蓄積されていない場合（ステップＳ２１０，Ｎｏ）、再びデジタル信号Ｖｐを入力する（ステプＳ２０３）。また、１ピクセル分のデジタル信号Ｖｐが蓄積された場合（ステップＳ２１０，Ｙｅｓ）、処理に戻る。

デジタル信号Ｖｐが閾値Ｖｔｈ未満である場合（ステップＳ２０４，Ｎｏ）、デジタル信号Ｖｐは、ノイズと判断され、フラグＦＬＡＧを「０」にする（ステップＳ２０９）。また、フラグＦＬＡＧが「１」でない場合（ステップＳ２０５，Ｎｏ）、マルチフォトンイベントは、発生していないと判断され、カウンタ２０７は、カウント数ＰをＰ＋１にする（ステップＳ２０６）。そして、フラグＦＬＡＧを「１」に維持する（ステップＳ２０８）。

この実施の形態１では、１フレームを作成するとともに、マルチフォトンイベントの発生回数の総数Ｍを求め、総数Ｍが所定の範囲（Ｍｔｈ２≦Ｍ≦Ｍｔｈ１）に入るようにレーザ光の光強度を制御していた。レーザ光の光強度を試料８に対応した適正な範囲入るように自動的にかつ短時間に制御できるため、Ｓ／Ｎ比がよく、かつ正確な画像が短時間に取得できる。また、標本８に対して無駄なレーザ光の照射が避けられるため、標本８への損傷を防止することができる。

なお、この実施の形態１では、デジタル信号Ｖｐが連続して２回閾値Ｖｔｈを超えた場合、マルチフォトンイベントが１回発生したものとしたが、Ａ／Ｄ１５のサンプリングレート等によって、２回以上の複数回に設定してもよい。また、この実施の形態１では、レーザ光の光強度が適正な範囲に収束しない場合でも画像表示を行うようにしていたが、適正な範囲に収束してから画像表示を行うようにしてもよい。また、閾値Ｖｐ，Ｍｔｈ１，Ｍｔｈ２を試料８、レーザ顕微鏡装置１００の状態に応じて変更できるようにしてもよい。

（実施の形態２）
つぎに、この発明の実施の形態２について説明する。上述した実施の形態１では、マルチフォトンイベントの発生回数の総数Ｍが所定の範囲（Ｍｔｈ２≦Ｍ≦Ｍｔｈ１）に入るように閾値Ｍｔｈ１，Ｍｔｈ２を設定し、総数Ｍが閾値Ｍｔｈ２未満である場合、光強度Ｌを光強度Ｌ＋ΔＬにするようにしてレーザ光の光強度を制御していたが、この実施の形態２では、光強度に上限を設け、レーザ光の光強度がこの上限を超えないようにしている。

図１１は、この発明の実施の形態２である制御部２０Ａの概要構成を示す機能ブロック図である。この制御部２０Ａは、制御部２０に光強度制限部２１３をさらに設けている。光強度制限部２１３は、所定の上限値を設け、光強度演算部２１２で演算された光強度がこの所定の制限値を超えた場合、光強度を増加させないようにしている。なお、図８と同一の構成部分には同一の符号を付している。

図１１において、光強度制限部２１３は、光強度演算部２１２の指示出力を入力し、指示出力が制限値以下である場合は、光強度演算部２１２の指示出力をそのまま光強度制御部１８に指示出力し、光強度演算部２１２から入力した指示出力が制限値を超える場合は、光強度演算部２１２の指示出力を無視するようにしている。

光強度制限部２１３の動作も含めて制御部２０Ａの動作を図１２に示すフローチャートを用いて説明する。図１２において、レーザ顕微鏡装置１００の初期化（ステップＳ３０１）から総数Ｍが閾値Ｍｔｈ１以下であるか否かの判断（ステップＳ３０９）までは、図９におけるレーザ顕微鏡装置１００の初期化（ステップＳ１０１）から総数Ｍが閾値Ｍｔｈ１以下であるか否かの判断（ステップＳ１０９）に対応している。

光強度演算部２１２は、総数Ｍが閾値Ｍｔｈ１以下でない場合、（ステップＳ３０９，Ｎｏ）、光強度制御部１８に光強度Ｌを光強度Ｌ−ΔＬに減少する指示出力し（ステップＳ３１１）、総数Ｍが閾値Ｍｔｈ１以下である場合（ステップＳ３０９，Ｙｅｓ）、総数Ｍが閾値Ｍｔｈ２以上であるか否かを判断する（ステップＳ３１０）。総数Ｍが閾値Ｍｔｈ２以上でない場合（ステップＳ３１０，Ｎｏ）、光強度演算部２１２は、光強度の増加分ΔＬを演算し、光制限部２１３に光強度Ｌ＋ΔＬを出力する。光強度制限部２１３は、入力した光強度Ｌ＋ΔＬが制限値Ｌ_LIM以下であるか否かを判断し（ステップＳ３１４）、光強度Ｌ＋ΔＬが制限値Ｌ_LIM以下である場合（ステップＳ３１４，Ｙｅｓ）、光強度制御部１８に光強度Ｌを光強度Ｌ＋ΔＬに増加する指示出力を行う（ステップＳ３１２）。また、光強度Ｌ＋ΔＬが制限値Ｌ_LIM以下でない場合（ステップＳ３１４，Ｎｏ）、光強度Ｌを増加する指示出力を行わない（ステップＳ３１２，Ｎｏ）。光強度制御部１８に光強度Ｌを光強度Ｌ−ΔＬに減少する指示出力した場合（ステップＳ３１１）と光強度制御部１８に光強度を光強度Ｌ＋ΔＬに増加する指示出力した場合（ステップＳ３１２）とは、レーザ光の光強度が適正ではないので、指示出力にしたがって再びレーザ光を照射する。一方、総数Ｍが閾値Ｍｔｈ２以上である場合（ステップＳ３１０，Ｙｅｓ）と光強度Ｌ＋ΔＬが制限値Ｌ_LIM以下でない場合（ステップＳ３１４，Ｎｏ）、レーザ光の光強度を変化させずに画像取得の終了指示が出力されるまで画像取得を続け、画像取得の終了指示が出力されると（ステップＳ３１３，Ｙｅｓ）、画像取得を終了する。

この実施の形態２では、特に試料８が蛍光色素を含む生物標本であるような場合、レーザ光の照射によって試料８が損傷されることを防止することを優先した上で、レ−ザ光の光強度を適正化することができる。

なお、この実施の形態２では、光強度Ｌ＋ΔＬが制限値Ｌ_LIMを超えている場合（Ｌ_LIM＜（Ｌ＋ΔＬ））（ステップＳ２１４，Ｎｏ）、光強度Ｌを変化させないようにしていたが、光強度の増加分ΔＬ１を小さくし、増加した光強度Ｌ＋ΔＬ１が制限値Ｌ_LIMを超えないように光強度Ｌを光強度Ｌ＋ΔＬ１に増加するようにしてもよい。Ｓ／Ｎ比のよい画像が取得でき、かつ試料８に損傷を与えることが防止できるからである。

（実施の形態３）
つぎに、この発明の実施の形態３について説明する。上述した実施の形態１，２では、Ａ／Ｄ１５から出力されるデジタル信号Ｖｐと閾値Ｖｔｈとを比較し、マルチフォトンイベントの発生を分別していたが、この実施の形態３では、Ａ／Ｄ１５をコンパレータに代え、コンパレータに閾値電圧Ｖｔｈ１を入力し、コンパレータから出力されるＴＴＬ信号Ｗｍの時間幅Ｔｍによってマルチフォトンイベントの発生をカウントするようにしている。

図１３は、この発明の実施の形態３であるレーザ顕微鏡装置２００の概要構成を示す機能ブロック図である。このレーザ顕微鏡装置２００は、Ａ／Ｄ１５に代えてコンパレータ２１を配置している。なお、図１と同一の構成部分には同一の符号を付している。

図１３において、コンパレータ２１は、Ｉ−Ｖ１４から光強度に対応した電圧信号を連続的に入力し、所定の閾値電圧Ｖｔｈ１と比較し、電圧信号が閾値電圧Ｖｔｈ１以上である場合、２値化されたＴＴＬ信号Ｗｍを制御部２０Ａに連続的に出力するようにしている。

図１４は、この実施の形態３である制御部２０Ａの概要構成を示す機能ブロック図である。この制御部２０Ａは、コンパレータ２１からＴＴＬ信号Ｗｍを入力し、比較部２０６Ａは、この入力したＴＴＬ信号Ｗｍの時間幅Ｔｍを比較し、マルチフォトンイベントの発生を検出するようにしている。なお、図８と同一の構成部分には同一の符号を付している。

図１４において、比較部２０６Ａは、コンパレータ２１からＴＴＬ信号Ｗｍを入力し、ＴＴＬ信号Ｗｍの時間幅Ｔｍと基準ＴＴＬ信号Ｗｔｈの時間幅Ｔｗとを比較し、時間幅Ｔｍが時間幅Ｔｗ以上である場合、カウンタ２０７が１光子をカウントし、さらに、時間幅Ｔｍが時間幅Ｔｗの２倍以上である場合、マルチフォトンイベントカウンタ２０８がマルチフォトンイベントの発生回数を１カウントする。

図１５は、光検出器１３から電流パルスが出力され、Ｉ−Ｖ１４から電流パルスに対応した電圧信号が出力され、コンパレータ２１から閾値電圧Ｖｔｈ以上であるＴＴＬ信号Ｗｍが出力される状態を示す模式図である。図１５において、コンパレータ２１は、閾値電圧Ｖｔｈ１が入力され、Ｉ−Ｖ１４から入力した電圧信号と閾値電圧Ｖｔｈ１とを比較し、閾値電圧Ｖｔｈ１以上の電圧信号を入力している間、２値化されたＴＴＬ信号Ｗｍを制御部２０Ａに出力している。

図１６にコンパレータ２１に入力される電圧信号の信号強度とコンパレータ２１から出力されるＴＴＬ信号Ｗｍの信号強度との対応関係を示す。コンパレータ２１から出力されるＴＴＬ信号Ｗｍが「１」である時間は、光電流パルス信号が閾値電圧Ｖｔｈ１以上である時間に対応している。そこで、図１７の模式図に示すように、制御部２０Ａの比較部２０６Ａは、基準ＴＴＬ信号Ｗｔｈの時間幅Ｔｗを設定し、この時間幅Ｔｗの２倍以上の時間幅Ｔｍを入力した場合、マルチフォトンイベントが発生したとするようにしている。

制御部２０Ａの制御動作の詳細を図１８，１９に示すフローチャートを用いて説明する。図１８において、１フレームの画面を作成しつつマルチフォトンイベントの総数Ｍを求め、この総数Ｍをもとにレーザ光の光強度を制御する動作について説明する。図１９において、１ピクセルの画像を取得しつつマルチフォトンイベントのカウント方法について説明する。

図１８において、レーザ顕微鏡装置２００の初期化（ステップＳ４０１）からマルチフォトンイベントカウンタ２０８の初期化（ステップＳ４０３）までは、図９におけるレーザ顕微鏡装置１００の初期化（ステップＳ１０１）からマルチフォトンイベントカウンンタ２０８の初期化（ステップＳ１０４）に対応し、フレームメモリ２１０への格納（ステップＳ４０６）から画像取得の終了判断（ステップＳ４１３）までは、図９におけるフレームメモリ２１０への格納（ステップＳ１０６）から画像取得の終了判断（ステップＳ１１３）までに対応している。

図１８において、制御部２０Ａは、マルチフォトンイベントカウンタ２０８の初期化（ステップＳ４０３）を行った後にコンパレータ２１から１ピクセル分のＴＴＬ信号Ｗｍの取得処理（ステップＳ４０４）を行い、画像演算部２０９は、取得した１ピクセル分のＴＴＬ信号Ｗｍから画像輝度に変換する（ステップＳ４０５）。

そこで、１ピクセル分のＴＴＬ信号Ｗｍの取得処理（ステップＳ４０４）について図１９のフローチャートを用いて説明する。制御部２０Ａは、カウンタ２０７の初期化を行い、カウント数Ｐを「０」にし（ステップＳ５０１）、マルチフォトンイベントカウンタ２０８の初期化を行い、フラグ数ＦＬＡＧを「０」にする（ステップＳ５０２）。つぎに、比較部２０６Ａは、コンパレータ２１からＴＴＬ信号Ｗｍを入力する（ステップＳ５０３）。比較部２０６Ａは、入力したＴＴＬ信号Ｗｍの時間幅Ｔｍと基準ＴＴＬ信号Ｗｔｈの時間幅Ｔｗとの長短関係を比較し（ステップＳ５０４）、時間幅Ｔｍが時間幅Ｔｗ以上である場合（ステップＳ５０４，Ｙｅｓ）、フラグＦＬＡＧが「１」であるか否かを判断する（ステップＳ５０５）。フラグＦＬＡＧが「１」である場合（ステップＳ５０５，Ｙｅｓ）、つまり時間幅Ｔｍが時間幅Ｔｗの２倍以上である場合、マルチフォトンイベントが発生したものと判断され、マルチフォトンイベントカウンタ２０８は、カウント数Ｍをカウント数Ｍ＋１にする（ステップＳ５０７）。そして、マルチフォトンイベントカウンタ２０８のフラグＦＬＡＧを「１」にする（ステップＳ５０８）。つぎに、１ピクセル分のＴＴＬ信号Ｗｍを蓄積したか否かを判断し（ステップＳ５１０）、１ピクセル分のＴＴＬ信号Ｗｍが蓄積されていない場合（ステップＳ５１０，Ｎｏ）、再びＴＴＬ信号Ｗｍを入力する（ステプＳ５０３）。また、１ピクセル分のＴＴＬ信号Ｗｍが蓄積された場合（ステップＳ５１０，Ｙｅｓ）、処理に戻る。

ＴＴＬ信号Ｗｍの時間幅Ｔｍが基準ＴＴＬ信号Ｗｔｈの時間幅Ｔｗ未満である場合（ステップＳ５０４，Ｎｏ）、ＴＴＬ信号Ｗｍは、ノイズと判断され、フラグＦＬＡＧを「０」にする（ステップＳ５０９）。また、フラグＦＬＡＧが「１」でない場合（ステップＳ５０５，Ｎｏ）、マルチフォトンイベントは、発生していないと判断され、カウンタ２０７は、カウント数ＰをＰ＋１にする（ステップＳ５０６）。そして、フラグＦＬＡＧを「１」に維持する（ステップＳ５０８）。

この実施の形態３では、コンパレータ２１を用い、コンパレータ２１から出力されるＴＴＬ信号Ｗｍの時間幅Ｔｍによってマルチフォトンイベントの発生をカウントしていた。このようにコンパレータ２１を用いることによって簡易な構成でレーザ光の光強度を適正に制御することができる。

なお、この実施の形態３では、ＴＴＬ信号Ｗｍの時間幅Ｔｍが基準ＴＴＬ信号Ｗｔｈの時間幅Ｔｗの２倍以上である場合、マルチフォトンイベントが１回発生したものとしたが、基準ＴＴＬ信号Ｗｔｈの時間幅Ｔｗを変化させてもよいし、マルチフォトンイベントの発生が検出される時間幅Ｔｗの倍数を変えるようにしてもよい。また、実施の形態２に説明したように光強度制限部を設け、レーザ光の光強度に制限を設けて制御してもよい。

この発明の実施の形態１にかかるレーザ顕微鏡装置の機能ブロック図である。この発明の実施の形態１にかかる光検出器に入射する光子と光検出器から出力される光電流パルスの対応を示す模式図である。この発明の実施の形態１にかかる光検出器に入射する光子と光検出器から出力される光電流パルスの対応を示す模式図である。この発明の実施の形態１にかかる光検出器に入射する光子と光検出器から出力される光電流パルスの対応を示す模式図である。この発明の実施の形態１にかかる光検出器に入射する光子数と光検出器から出力される光電流パルス数と、光検出器に入射する光子数とマルチフォトンベントの発生確率とを示す模式図である。この発明の実施の形態１にかかる光検出器から出力される光電流パルスとＡ／Ｄから出力されるデジタル信号との対比を示す模式図である。この発明の実施の形態１にかかる光検出器から出力される光電流パルスとＡ／Ｄから出力されるデジタル信号との対比を示す模式図である。この発明の実施の形態１にかかる制御部の機能ブロック図である。この発明の実施の形態１にかかる制御部の動作を示すフローチャートである。この発明の実施の形態１である制御部の動作を示すフローチャートである。この発明の実施の形態２にかかる制御部の機能ブロック図である。この発明の実施の形態２にかかる制御部の動作を示すフローチャートである。この発明の実施の形態３にかかるレーザ顕微鏡装置の機能ブロック図である。この発明の実施の形態３にかかる制御部の機能ブロック図である。この発明の実施の形態３にかかるコンパレータを説明する機能ブロック図である。この発明の実施の形態３にかかるコンパレータの入出力信号の対比を示す模式図である。この発明の実施の形態３にかかる基準のＴＴＬ信号とマルチフォトンが検出されたＴＴＬ信号との比較を示す模式図である。この発明の実施の形態３にかかる制御部の動作を示すフローチャートである。この発明の実施の形態３にかかる制御部の動作を示すフローチャートである。

符号の説明

１レーザ光源
２コリメートレンズ
３減衰器
４ダイクロイックミラー
５ａ，５ｂガルバノミラー
６瞳投影レンズ
７対物レンズ
８試料
９集光レンズ
１０ミラー
１１フィルタ
１２ピンホール
１３光検出器
１４Ｉ−Ｖ
１５Ａ／Ｄ
１６高電圧電源
１７走査部
１８光強度制御部
１９画像表示部
２０，２０Ａ制御部
２１コンパレータ
２０１同期信号発生部
２０２ピクセルクロック発生部
２０３水平同期信号生成部
２０４垂直同期信号生成部
２０５ミラー駆動信号生成部
２０６，２０６Ａ比較部
２０７カウンタ
２０８マルチフォトンカウンタ
２０９画像演算部
２１０フレームメモリ
２１１表示制御部
２１２光強度演算部
２１３光強度制限部
１００，２００レーザ顕微鏡装置

Claims

レーザ光源から出射したレーザ光を試料に照射し、該レーザ光が照射された試料から発する光を光検出器で検出して前記光の光強度に対応する光電流パルスに変換し、該光電流パルスに基づいて作成した画像信号を画像表示部に画像表示するレーザ顕微鏡装置において、
前記光検出器に入射する光子が重なり合うマルチフォトンイベントが、前記画像表示部に表示される１フレームあたりで発生する総数が、第１の閾値を超えるときには、前記試料に照射されるレーザ光の強度を減少させる制御を行い、前記総数が前記第１の閾値よりも小さい第２の閾値未満のときには、前記試料に照射されるレーザ光の強度を増加させる制御を行う制御手段を備えることを特徴とするレーザ顕微鏡装置。
前記制御手段は、
前記光検出器で検出した前記光の光強度が所定強度以上である場合にフォトンを検出するフォトン検出手段と、
前記フォトン検出手段が連続して所定数前記フォトンを検出した状態である前記マルチフォトンイベントの発生回数をカウントするカウント手段と、
を備えることを特徴とする請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置。
前記フォトン検出手段は、前記光強度をサンプリングした値が前記所定強度以上である場合、前記フォトンを検出することを特徴とする請求項２に記載のレーザ顕微鏡装置。
前記フォトン検出手段は、前記所定強度以上である前記光強度が所定の時間連続した場合、前記フォトンを検出することを特徴とする請求項２に記載のレーザ顕微鏡装置。
前記制御手段は、前記マルチフォトンイベントの発生頻度に対応した前記レーザ光の強度に上限値を設け、前記総数が前記第２の閾値未満のときには、前記試料に照射されるレーザ光の強度を増加させ、かつ前記試料に照射されるレーザ光の強度を前記上限値以下に制御する光強度制限手段をさらに備えることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載のレーザ顕微鏡装置。