JP4570364B2

JP4570364B2 - 化学発光化合物およびその使用

Info

Publication number: JP4570364B2
Application number: JP2003540620A
Authority: JP
Inventors: フィリップピーミラー; マーサギャリティー
Original assignee: クエストダイアグノスティクスインヴェストメンツインコーポレイテッド
Priority date: 2001-10-31
Filing date: 2002-10-29
Publication date: 2010-10-27
Anticipated expiration: 2022-10-29
Also published as: EP1440314A2; US20040214217A1; WO2003038399A3; US6723851B2; US6994980B2; EP1440314A4; JP2005507942A; US20030092060A1; AU2002353917A1; WO2003038399A2; EP1440314B1

Description

本発明は、１群の新規な化合物に関する。１つの実施態様においては、該新規化合物は、新規な化学発光化合物である。

さらにまた、これら化合物は、これら化合物を化学あるいはバイオ化学アッセイにおいて“シグナル分子”として使用する場合、巨大な利点を提供することを見出した。“シグナル分子”とは、サンプル中の分析物の量を測定するために検出する分子である。驚くべきことに、これら化合物を使用するアッセイ法は、他の化学発光アッセイ法、例えば、現存のアクリジニウムエステルを使用するアッセイ法の感度を数桁の強さで凌ぐ感度を有することを発見した。例えば、現存のアクリジニウムによるイムノアッセイにおける検出限界(LOD)は、10^-15〜10^-19モルの分析物範囲であるのに対し、上記の新規化合物を使用するアッセイにおけるLODは、約10^-16〜10^-19、好ましくは10^-17〜10^-20モルの分析物範囲である。
さらに、本発明の分析物の検出方法は、安全且つ簡単である。例えば、本発明のアッセイ法は、放射性異性体の使用を必要としない。また、これらの方法において使用する上記の新規化合物は、血液および他の臨床検体と高度に適応性である。

本発明によれば、上記の分析物の検出方法は、化合物を分析物および/またはその直近周囲領域と結合させ、そして結合した化合物の量を検出する各工程を含む。
さらに、本発明によれば、上記化合物の分析物および/またはその直近周囲領域との結合は、酵素による触媒作用を受け得る。
さらにまた、本発明によれば、上記の結合化合物は化学発光シグナルを放出し、このシグナルを検出する。１つの実施態様においては、放出された化学発光シグナル量は、サンプル中の分析物の量に直接比例する。
本明細書において説明するすべての特徴または特徴の組合せは、本発明の範囲内に包含される。但し、そのような組合せに含まれる特徴は、いずれも、本発明の概念、本明細書および当業者からして明白であるような相互矛盾がないことを条件とする。本発明のさらなる利点および局面は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。

本発明は、１部において、新規な化合物を分析物検出のためのアッセイにおいて使用できるという知見に基づく。
該新規化合物（化合物A）は、下記の一般式Aを有する：

上記式中、R₁およびR₂は、個々に、結合基、C₁〜C₁₀炭化水素、置換アルキル、非置換アルキル、アリール、ペプチド、（CH₂）_mSO₂、NH(CH₂)_m、（CH₂）_m、下記の

からなる群から選ばれる。R₁は、上記環のいずれの位置にも位置し得る。例えば、R₁は、オルソ、メタまたはパラ位であり得る。R₃は、OH基または下記の

である。R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁、R₁₂、R₁₃およびR₁₄は、上記環のいずれの位置にも存在し得、個々に、H、ヒドロキシド、メチル、（CH₂)_mSO₃、ハライド、ニトロ、-CN、-SO₃、C₁〜C₁₀炭化水素、アルコキシ、-NHC=O(C₁〜C₁₀炭化水素)、-C=O(C₁〜₁₀炭化水素)、C=ONH(C₁〜₁₀炭化水素)、アリール、および環状環構造体からなる群から選ばれ；ｍおよびｎは、個々に、0〜約10であり；ｘは、CH₃SO₄ ^-、OSO₂F^-、Cl^-、Br^-、OSO₂CH₃ ^-およびOSO₂C₄H₉ ^-のような対イオンである。
1つの実施態様においては、R₁は(CH₂)_mSO₂であり、R₂はNH(CH₂)_mである。例えば、上記新規化合物(化合物B)は、下記の一般式を有する：

（式中、R₁₀は、メチルまたは(CH₂)₃SO₃である）。

１つの実施態様においては、上記新規化合物は、6ヶ月を超える貯蔵安定性、好ましくは1年を超える貯蔵安定性を有する。例えば、本発明の化合物は、約5〜約7のpHおよび約2〜約8℃の温度で１年以上に亘って保存し得る。
１つの実施様態においては、本発明の化合物は、付着成分およびアクリジニウム誘導体を含み得る。付着成分は、例えば酵素により活性化されて、局所領域に付着し得る成分である。非限定的な付着成分としては、ペニシリン類、セファマイシン類、置換ホスフェート類、ベータ-グラクトピラノシルグリコシド等がある。本発明において使用し得るアクリジニウム誘導体、好ましくはアクリジニウムエステル誘導体の非限定的な例は、以下の米国特許に開示されており、これらの米国特許は、すべて、その全体を本明細書に参考として引用する：Schulenbergの第4,150,134号；Law等の第4,745,181号および第4,918,192号；Chang等の第4,927,769号；Champbell等の第4,946,958号；Arnold, Jr.等の第4,950,613号；Law等の第5,110,932号；Arnold, Jr.等の第5,185,439号；Law等の第5,227,489号；Law等の第5,241,070号；McCapra等の第5,281,712号；McCapra等の第5,284,951号；Beheshiti等の第5,190,936号；McCapra等の第5,321,136号および第5,338,847号；Law等の第5,395,752号；Ramakrishnanの第5,395,938号；Sato等の第5,438,139号；Law等の第5,449,556号；Mattingly等の第5,468,646号；Shah等の第5,468,649号；Zoomer等の第5,521,103号；Law等の第5,538,901号；Mattingly等の第5,543,524号および第5,565,570号；Sato等の第5,594,112号；Lawの第5,595,875号；Law等の第5,656,426号；Lawの第5,656,500号；Lawの第5,663,074号；Lee等の第5,672,475号；Law等の第5,702,887号；Kinkel等の第5,783,696号；およびMattingly等の第5,783,699号。１つの実施態様においては、上記付着成分とアクリジニウム誘導体は、互いに直接結合する。もう１つの実施態様においては、上記付着成分とアクリジニウム成分は、もう１つの分子、即ち、リンカーを介して結合させる。上記リンカーは、R₁のリンカーに類似する分子であり得る。

本発明の新規化合物は、分析物を検出するアッセイにおいて使用し得る。分析物は、任意の化学または生物学的物質であり得る。分析物の非限定的な例としては、ホルモン類、ペプチド類、ミクロ分子類、マクロ分子類、たんぱく質類、細胞組織類およびこれらの混合物等がある。本発明の化合物は、種々のタイプのアッセイ法、例えば、ゲルアッセイ、ブロッティングアッセイ、現場ハイブリッド化アッセイおよび免疫組織化学アッセイのような種々のタイプのアッセイ法においての使用に適応し得る。
広い実施態様においては、サンプル中の分析物を検出する上記方法は、上記化合物を分析物に結合させることを含む。１つの実施態様においては、上記化合物は、分析物周囲の直近領域に結合し得る。
本発明を如何なる理論またはメカニズムにも限定することを望むものではないが、本発明の化合物は、本発明の化合物を酵素、例えばベルオキシダーゼ、好ましくはホースラディッシュベルオキシダーゼ(HRP)に暴露させたとき、分析物並びに分析物周囲直近の他の分子、たんぱく質および領域に結合し得るものと信じている。
１つの実施態様においては、上記酵素を分析物に近接させて、分析物および/または周辺分子および領域との上記化合物の結合を開始させる。例えば、局在化剤(locator)成分を使用して分析物を局在化させ得る。
局在化成分は、分析物に選択的に結合し得る任意の分子または分子群である。例えば、局在化成分は、アプタマーまたは分子インプリントポリマーであり得る。１つの実施態様においては、局在化成分は、抗体または抗体の１部、例えば、分析物に結合し得るFab成分である。本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。ある種の抗原、例えば、パートナー成分に対して特異性の抗体を産生させる種々の方法が当該技術において知られている。例えば、抗体は、パートナー成分あるいはその一部である抗原を注入したウサギから産生させ得る。さらに、合成抗体類も調製し得る(米国特許第4,110,833号を参照されたい；該米国特許の開示は、その全体を参考として本明細書に引用する)。

1つの実施態様においては、上記局在化成分は、酵素に直接または間接的に結合させる。酵素類の非限定的な例としては、ペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、オキシレダクターゼ、b-ラクタマーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、オキシダーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼ、およびb-ガラクトシダーゼがある。適切な酵素の選定は、当業者であれば、容易に決定し得ることである。1つの実施態様においては、ベータ-ラクタマーゼを、ペニシリンまたはセファマイシンを含む付着成分を使用するアッセイにおいて使用する。1つの実施態様においては、B-ガラクトシダーゼを、B-ガラクトピラノシルグリコシドを含む付着成分を使用するアッセイにおいて使用する。
1つの実施態様においては、分析物を含むアッセイサンプルを、局在化成分、例えば、1種以上の酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼに結合させた(即ち、標識化した)抗体と一緒に先ずインキュベートする。上記局在化成分を分析物に結合させた後、本発明の化合物を上記サンプルに添加する。上記局在化成分に結合した酵素は、本発明の化合物を、局在化成分を含有する分析物および/または分析物周辺の物質および領域に結合せしめるであろう。好ましくは、本発明化合物の分析物への結合は、塩基条件下で実施する。例えば、上記アッセイは、約7〜約8.5のpHにおいて実施する。
本発明化合物が分析物および/または分析物の直近周囲領域に結合した後に、結合した化合物量を測定する。1つの実施態様においては、結合した化合物量は、サンプル中の分析物量に直接比例する。

1つの実施態様においては、本発明の化合物は、化学発光シグナルを放出する。即ち、サンプルから検出した化学発光放出量は、サンプル中にどの程度の量の分析物が存在するかに直接関連する。1つの実施態様においては、本発明の化合物によるイムノアッセイにおける検出限界は、約10^-15〜約10^-18、好ましくは約10^-16〜10^-19、より好ましくは10^-17〜10^-20モルの分析物範囲である。さらにまた、動的範囲も本発明の化合物においては極めて広く、即ち、本発明化合物による化学発光シグナルの放出は、4〜約6桁の強さに亘って線状であり得る。
1つの実施態様においては、分析物は、結合および/または牽出において固定し得る。例えば、分析物を認識する抗体を有する支持体を使用して、該支持体に分析物を固定し得る。アッセイにおいて使用する適切な支持体としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、置換ポリスチレン(例えば、アミノ化あるいはカルボキシル化ポリスチレン)、ポリアクリルアミド類、ポリアミド類、ポリ塩化ビニル、ガラスビーズ、アガロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフルオライド、表面改質ナイロン等のような合成ポリマー支持体がある。
また、分析物は、ビオチン化抗体/ストレパビジン(strepavidin)コーティング磁石粒子系の使用によっても固定し得る。この場合、局在化成分が分析物に結合した後に、上記ビオチン化抗体が局在化成分に結合する。その後、上記ストレパビジンコーティング磁石粒子が上記ビオチン化抗体を介して局在化成分と複合体化し得る。他の同様な系は、Garrity等の米国特許第09/761,969号に開示されており、該米国特許の開示はその全体を本明細書に参考として引用する。

化合物Bの合成
合成を、アクリジニウムスルホニルクロライド誘導体（2mg、36μモル）をDMF(100uL)およびトリエチルアミン(50uL)中のチラミン(6mg、44μモル)溶液に添加することによって実施した。生成物は、分離用HPLC：C₁₈[60/40アセトニトリル、H₂O(0.1％TFA)]によって分離した。化合物Bは、360nｍおよび18ｍのt_rにおいて測定可能な発光を有していた。

上記化合物のアッセイにおける応用
分析物を含有する100uLのサンプルを、50uLのビオチン化抗体、50uLのHRP標識抗体および20uLのストレプタビジン(streptavidin)コーティング磁石粒子との混合物に添加する。上記ビオチン化抗体は、上記HRP標識抗体と選択的に結合し；上記HRP標識抗体は、分析物と選択的に結合し；上記ストレパビジンコーティング磁石粒子は上記ビオチン化抗体と選択的に結合する。得られる混合物を37℃で20分間インキュベートし、その後、固相を磁力分別し、３回洗浄する。
洗浄した固相を第２の混合物に添加する。この第２混合物は、(1) pH 6.0の水性緩衝液中に約0.2〜約10ug/mLの化合物A、好ましくは化合物Bを含む約20uLの溶液と(2) pH 7.0〜8.4のホウ酸塩緩衝液中に約0.001〜約0.1％の過酸化水素を含む約200uLの溶液とを含む。その後、第２混合物を37℃で約1〜約10分間インキュベートする。第２混合物の固相を磁力分別し、３回洗浄する。
上記化合物の濃度を、好ましくは、上記化合物によって生じた化学発光放出量を検出することによって測定する。上記化合物の濃度は、分析物濃度に直接比例する。上記第２混合物固形相の化学発光は、約0.4Mの硝酸と約0.1％過酸化水素との約200uLの溶液の添加およびその後の1M 水酸化ナトリウム溶液の約200uLの添加によって触発される。シグナルを２秒に亘って集積する。

本発明を種々の特定の実施例および実施態様に関連して説明してきたが、本発明はこれらに制限されるものでないこと並びに本発明は特許請求の範囲において様々に実施し得ることを理解すべきである。

Claims

下記の一般式Aを有する化合物：

（式中、R₁は、（CH₂)_mSO₂であり、R₂はNH(CH₂)_mであり；
R₃は、下記の

であり；
R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁、R₁₂、R₁₃およびR₁₄は、個々に、H、ヒドロキシル、メチル、-（CH₂)_mSO₃H、ハロゲン、ニトロ、-CN、C₁〜C₁₀炭化水素、アルコキシ、-NHC=O(C₁〜C₁₀炭化水素)、-C=O(C₁〜₁₀炭化水素)、-C=ONH(C₁〜₁₀炭化水素)、およびアリールからなる群から選ばれ；
ｍは、0〜10であり；
X^-は、CH₃SO₄ ^-、OSO₂F^-、Cl^-、Br^-、OSO₂CH₃ ^-およびOSO₂C₄H₉ ^-からなる群より選択される対イオンである）。
分析物を検出するアッセイにおいて使用する、請求項１記載の化合物。
分析物に結合することができる、請求項１記載の化合物。
該分析物が支持体に固定されている、請求項３記載の化合物。
１年以上の貯蔵安定性を有する、請求項１記載の化合物。
下記の一般式Bを有する化合物：

（式中、R₁₀は、メチルまたは-（CH₂)_mSO₃Hであり、m=3であり、
X^-は、CH₃SO₄ ^-、OSO₂F^-、Cl^-、Br^-、OSO₂CH₃ ^-およびOSO₂C₄H₉ ^-からなる群より選択される対イオンである）。
化合物に分析物を結合させ、そして該化合物によって生ずる化学発光シグナルを検出することにより化合物を検出する各工程を含み、該化合物が下記の一般式を有することを特徴とする分析物の検定方法：

（式中、R₁は、（CH₂)_mSO₂であり、R₂はNH(CH₂)_mであり、；
R₃は、下記の

であり；
R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁、R₁₂、R₁₃およびR₁₄は、個々に、H、ヒドロキシル、メチル、-（CH₂)_mSO₃H、ハロゲン、ニトロ、-CN、C₁〜C₁₀炭化水素、アルコキシ、-NHC=O(C₁〜C₁₀炭化水素)、-C=O(C₁〜₁₀炭化水素)、-C=ONH(C₁〜₁₀炭化水素)、およびアリールからなる群から選ばれ；
ｍは、0〜10であり；
X^-は、CH₃SO₄ ^-、OSO₂F^-、Cl^-、Br^-、OSO₂CH₃ ^-およびOSO₂C₄H₉ ^-からなる群より選択される対イオンである）。
前記化合物が、下記の一般式Bを有する、請求項７記載の方法：

（式中、R₁₀はメチルまたは-（CH₂)_mSO₃Hであり、m=3であり、
X^-は、CH₃SO₄ ^-、OSO₂F^-、Cl^-、Br^-、OSO₂CH₃ ^-およびOSO₂C₄H₉ ^-からなる群より選択される対イオンである）。
該分析物が支持体に固定されている、請求項７記載の方法。
該結合工程を塩基条件下において実施する、請求項７記載の方法。
前記結合工程を7〜8.5のpHにおいて実施する、請求項７記載の方法。
前記結合工程が前記化合物を酵素と反応させる工程を含む、請求項７記載の方法。
前記化合物の検出工程が前記化合物によって生ずるシグナルを検出することを含む、請求項７記載の方法。