JP4569633B2 - 液体クロマトグラフィーによる分析方法及び装置 - Google Patents

Description

本発明は分析しようとする試料を移動相とともに分離用カラムに導入し、そのカラムで分離されて溶出した試料成分を検出器で検出する液体クロマトグラフィーに関するものである。

液体クロマトグラフィーは試料成分の分析技術として広く用いられている。液体クロマトグラフィーはカラム充填剤の表面又はキャピラリー内面に形成された固定相と、充填材の間隙を流れる移動相の二つの相に対する物質の分布状態の差を利用して分離するもので、試料中の各成分はその化学的性質に応じて異なった速度でカラムを通過する。

化学的性質が互いにかけ離れた複数の物質を一斉に分析する場合、分析に要する時間が長くなることがあるが、移動相の組成が変化すると物質の分布状態が変化することから、移動相組成を経時的に変化させて分離状態を維持しつつ分析時間を短縮する移動相組成グラジエント溶出法がしばしば用いられる。

図４に移動相組成グラジエント溶出法を用いた液体クロマトグラフを示す。
移動相１ａ，１ｂを送液するための移動相送液流路２ａ，２ｂ上にそれぞれの送液ポンプ５ａ，５ｂが設けられている。送液ポンプ５ａ，５ｂはモータの回転数を制御することによって送液量を調節する。移動相送液流路２ａ，２ｂはミキサ１１で合流しており、ミキサ１１は移動相１ａと１ｂを混合して分析流路１２に送液するようになっている。分析流路１２には試料注入部７を介して分離カラム１５が設けられ、カラム１５の下流に検出器１９が設けられている。

試料注入部７から注入された試料は、ミキサ１１で混合された移動相により分離カラム１５に導かれて成分ごとに分離され、分離された試料成分は検出器１９で検出される。
送液ポンプ５ａ及び５ｂは制御装置２１によってそれぞれの送液量が制御され、グラジエント溶出法を実現するための所定の送液プログラムに沿って送液量が変化させられる。

このような液体クロマトグラフで、例えば、図５に示されるように、移動相Ａを１００％、移動相Ｂを０％という送液状態から分析を開始し、徐々に移動相Ａの濃度を減らし、移動相Ｂの濃度を増やすように移動相組成を変化させていき、最終的に移動相Ａを０％、移動相Ｂを１００％にすることで、カラム１５での試料の保持力を変化させながら分析する。特に、このように、複数の送液ポンプを用いて、送液ポンプの下流側で複数の移動相を合流させるグラジエント方式は、高圧グラジエント方式と呼ばれている（例えば、特許文献１参照。）。なお、図６で、縦軸のＡ，Ｂの座標はそれぞれＡ液１００％、Ｂ液１００％を示している。横軸は時間である。

特開２００３−９８１６６号公報 金澤秀子「温度応答性クロマトグラフィー」ぶんせき、２００４年６月号、第３０３−３０８頁

しかしながら移動相組成グラジエント溶出法では、検出器が移動相の組成変化に感応してベースラインの変動を引き起こすことがあるので、移動相の条件や検出方法によっては分析に適用できない場合がある。
また、移動相組成グラジエント溶出法のみでは十分にその目的を達成できない場合もある。

一方、温度も物質の分布状態を変化させることから、移動相組成グラジエント溶出法に代替する手段として、カラム周辺の温度を時間的に変化させる温度グラジエント溶出法が提案されている（例えば、非特許文献１参照。）。その方法では、カラム温度を外部から変化させることによりカラム内での移動相温度を変化させている。
しかしながら、その提案の方法では、熱媒体の熱容量、熱媒体やカラム管材質の熱伝導率及び温度差によって熱伝導性が変わるので、迅速かつ正確に温度変化をさせることが難しい。さらに、カラム断面方向に温度勾配が生じてピーク形状の劣化を招きやすいという問題もある。そのため、その提案の温度グラジエント溶出法は広く普及するには至っていない。
本発明の目的は迅速で正確な温度グラジエント溶出法を提供することである。

本発明は、異なる温度の移動相を任意に混合すれば温度調節が速やかに達成されることに着目してなされたものであり、移動相を２つの流路で互いに異なる一定の温度に調節し、それを任意の混合比で混合して断熱されたカラムに流入させることにより目的を達成しようとするものである。

すなわち、本発明の分析方法は、分析しようとする試料を移動相とともに分離用カラムに導入し、そのカラムで分離されて溶出した試料成分を検出器で検出する液体クロマトグラフィーによる分析方法であり、カラムを断熱状態とすること、移動相を２つの移動相送液流路から供給し混合してカラムに導入すること、その際に、一方の移動相送液流路の移動相温度をカラムで調節しようとする温度範囲の上限温度よりも高い一定温度に設定し、他方の移動相送液流路の移動相温度をカラムで調節しようとする温度範囲の下限温度よりも低い一定温度に設定すること、及び２つの移動相送液流路の流量の調節により移動相の混合比率を時間的に変化させることによりカラム内の移動相の温度を時間的に変化させることを含み、これにより温度グラジエント溶出を行なうものである。

移動相の混合比率の時間的変化には、一定温度から他の一定温度へ段階的に変化させる様式と、低温から高温又は高温から低温へと連続的に変化させる様式がある。本発明は両方の様式を含むものである。段階的に変化させる様式は制御が簡単であるという利点をもつ。一方、混合比率を時間的に連続して変化させる場合にはカラム内に移動相の移動方向に沿った温度勾配を形成することができる。

本発明では、カラムから流出する液の温度も時間的に変化する。そのため、検出器によっては温度によって感度が変化したり、ベースラインが変動したりすることがある。そのような問題を避けることを目的として、カラムから流出する液を一定温度に調節し、その後検出器に導くことが好ましい。

また、カラムに導入される移動相の流量が変化するとピークの保持時間が変化するので、より正確な分析を行うことを目的として、カラムに導入される移動相の流量が一定になるように２つの移動相送液流路の流量を調節することが好ましい。

移動相組成グラジエント溶出法が適用できる場合には、グラジエント溶出法の作用を高めることを目的として、本発明による温度グラジエント溶出法に、２つの移動相送液流路から供給する移動相の組成を時間的に変化させる移動相組成グラジエント溶出法を併用することができる。

本発明の液体クロマトグラフは、分離用カラムと、そのカラムを収容する断熱容器と、送液ポンプ及びカラムで調節しようとする温度範囲の上限温度よりも高い一定温度に設定された恒温器を備えた第１の移動相送液流路と、前記送液ポンプとは異なる送液ポンプ及びカラムで調節しようとする温度範囲の下限温度よりも低い一定温度に設定された恒温器を備え、第１の移動相送液流路で送液される移動相と同じ移動相を送液する第２の移動相送液流路と、第１、第２の移動相送液流路から供給された移動相を混合してカラムに送り出す混合器と、カラムに移動相が供給される流路中に分析しようとする試料を注入する試料注入器と、カラムの下流に配置され、カラムで分離されて溶出した試料成分を検出する検出器と、第１、第２の移動相送液流路の送液ポンプの流量を調節して混合器での移動相の混合比率を時間的に変化させるグラジエントコントローラとを備えている。これにより、カラム内の移動相の温度を時間的に変化させて温度グラジエント溶出を行なう。

グラジエントコントローラが制御する移動相の混合比率の時間的変化には、段階的な変化と連続的な変化とがあるが、カラム内に移動相の移動方向に沿った温度勾配を形成するためには、グラジエントコントローラは混合比率の時間的変化が連続的に行なわれるように第１、第２の移動相送液流路の送液ポンプの流量を調節する。

カラムと検出器の間にカラムからの流出液の温度を一定温度に調節するための恒温器をさらに備えていることが好ましい。
グラジエントコントローラの好ましい形態は、カラムに導入される移動相の流量が一定になるように第１、第２の移動相送液流路の送液ポンプの流量を調節するものである。

第１、第２の移動相送液流路としては、送液する移動相の組成を時間的に変化させる移動相組成グラジエント機構をさらに備えているようにすることができる。
試料注入器が配置される位置は、カラムに移動相が供給される流路中に試料を注入できる位置であればよいが、例えば第１もしくは第２の移動相送液流路、又は混合器とカラムの間の流路である。

調節可能な温度範囲は移動相の組成に依存するが、移動相送液流路の恒温器にはカラムの流れ抵抗に起因する高い圧力がかかっているため、移動相の沸点上昇によって相当の高温域までグラジエント分析することが可能である。

本発明の分析方法及び液体クロマトグラフは、移動相を２つの流路で互いに異なる一定の温度に調節し、それを任意の混合比で混合してカラムに流入させるとともに、カラムからの熱の放散を遮断する方法をとっているので、容易にカラム内の移動相の温度を変化させることができ、これまで困難であった迅速な温度グラジエント溶出法が可能になる。
また、従来のように熱媒体を介してカラムを外側から加温したり冷却したりする方法と異なり、カラムの断面方向に温度勾配が生じないので、ピーク形状の劣化を招くこともない。
その結果、本発明では、高速で精度に優れた温度グラジエント溶出法が可能になる。

本発明で混合比率の時間的変化を連続的に行なう場合には、カラム中の移動相の流れ方向に温度勾配が生じるので、その濃縮効果によってカラム内での物質の拡散が抑制され、効率のよい分離を達成することができる。
カラムから流出する液を一定温度に調節し、その後検出器に導くようにすれば、示差屈折計検出器のように温度変化に敏感な検出器であっても使用できるようになる。

カラムに導入される移動相の流量を一定にすると、ピークの保持時間の再現性が向上し、測定精度が向上する。
本発明による温度グラジエント溶出法に移動相組成グラジエント溶出法を併用すれば、より効率的なグラジエント溶出法を実現することができる。

以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。
図１Ａは一実施例の高速液体クロマトグラフの流路図を示す。
この高速液体クロマトグラフは、移動相１に含まれる気体を脱気する脱気装置３を経た移動相流路を分岐して送液する２つの移動相送液流路２ａ，２ｂを備えている。一方の移動相送液流路２ａは送液ポンプ５ａ、試料注入器７及び移動相をカラムで調節しようとする温度範囲の下限温度よりも低い一定温度に設定された恒温器９ａを備えている。他方の移動相送液流路２ｂは送液ポンプ５ｂ及び移動相をカラムで調節しようとする温度範囲の上限温度よりも高い一定温度に設定された恒温器９ｂを備えている。

２つの移動相送液流路２ａ，２ｂは混合器１１に接続されている。混合器１１からの流路１２には試料を成分に分離するための分離用カラム１５が接続され、カラム１５の下流には、恒温器１７を介して、カラム１５で分離されて溶出した試料成分を検出する検出器１９が接続されている。恒温器１７は検出器１９によっては、省略することができる。

混合器１１とカラム１５は、熱の放散が遮断されるように断熱容器１３に収納されている。この図に示すように、恒温器９ａ，９ｂの出口からカラム１５の出口までが断熱容器１３に収納されていることが好ましい。

送液ポンプ５ａ，５ｂはグラジエントコントローラ２１に接続されており、グラジエントコントローラ２１によって移動相送液流路２ａ，２ｂの送液ポンプ５ａ，５ｂの流量が調節され、混合器１１での移動相の混合比率が時間的に変化するように移動相送液流路２ａ，２ｂの送液量が調整される。

恒温器９ａ，９ｂ，１７にはステンレスなどの熱伝導率の高い材質によるチューブが収納され、アルミブロック又は空気を媒体として加熱又は冷却される。混合器１１及びカラム１５、並びにその配管の材質はポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）のような熱伝導率の低いものを用いる。

図１Ａの流路構成において、移動相１は脱気装置３を経ることによって気泡が脱気された後、２つの流路２ａと２ｂに分配される。流路２ａでは送液ポンプ５ａにより、流路２ｂでは送液ポンプ５ｂにより、それぞれグラジエントコントローラ２１によって任意の流量比に設定されて送液される。両流路２ａと２ｂでは、移動相はそれぞれの恒温器９ａ，９ｂで各々異なった温度に調節された後、混合器１１で混合され、カラム１５に供給される。通常は混合後の移動相流量が一定になるように各々の送液ポンプ５ａ，５ｂの流量が設定され、恒温器９ａの温度は調節したい温度の下限値より低く、恒温器９ｂでは調節したい温度の上限値より高く設定される。例えば、カラム１５での移動相の流量を１.０ｍＬ／分とし、３０℃から７０℃の直線的な温度グラジエント溶出を実施する場合、恒温器９ａを２５℃に、恒温器９ｂを７５℃に設定し、送液ポンプ５ａの流量を１分間で０．９ｍＬ／分から０．１ｍＬ／分に向かって変化させ、同時に送液ポンプ５ｂの流量を１分間で０．１ｍＬ／分から０．９ｍＬ／分に向かって変化させる。この流量変化はグラジエントコントローラ２１により制御される。このとき、液体クロマトグラフが理想的な状態で稼動すれば、移動相の温度は１分間で３０℃から７０℃に経時的に直線的に連続して変化することになる。
カラム１５により分離された試料成分は、恒温器１７を経て一定温度に調節され、検出器１９で検出される。

次に、この高速液体クロマトグラフィーをさらに具体的に説明する。
カラム１５には、例えば、逆相クロマトグラフィー用カラムShim-PackＦＣ−ＯＤＳ（登録商標）（内径３ｍｍ、長さ１００ｍｍ）が用いられる。ただし、カラム１５はカラム管としてＰＥＥＫなどの熱伝導率の低い材質が用いられていれば、どのようなものであってもよい。

また、検出器１９には吸光度検出器、蛍光検出器、示差屈折計検出器、蒸発光散乱検出器などを使用でき、必要であれば質量分析計をさらに接続してもよい。
移動相には、一例として、水とアセトニトリルの混合液を用いる。ただし、移動相は分析すべき物質に応じて選択するものであって、その種類や温度、ｐＨなどに何らの制約はない。

図１Ｂは他の実施例を示したものである。図１Ａの実施例と比較すると、試料注入器７の位置が異なっている。この実施例では試料注入器７は流路１２中で混合器１１とカラム１５の間に配置されている。
試料注入器７はまた、恒温器９ａ又は９ｂと混合器１１の間に配置してもよい。

測定条件は次の通りである。
（１）分析条件
カラム： Shim-PackＦＣ−ＯＤＳ（登録商標）（内径３ｍｍ、長さ１００ｍｍ）
移動相： 水とアセトニトリルの混合液（容量比で１対１）
流量 ： １.０ｍＬ／分
温度 ： ３０℃から７０℃までの１分間の温度グラジエント

（２）検出条件
検出器： 吸光度検出器
検出波長：２６０ｎｍ

図１Ａの高速液体クロマトグラフを使用して、この測定条件でメチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン及びブチルパラベンを含むアルキルパラベン混合標準試料を分析した結果のクロマトグラムを図２に示す。横軸は時間、縦軸は検出強度を示す吸光度（ｍＡＵ）である。温度は３０℃から７０℃に向かって時間に対して直線的に上昇している。

この結果によれば、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン及びブチルパラベンが１分以内に溶出し、しかも互いに良好に分離されている。このように、本発明の温度グラジエント溶出法によって迅速に分離されていることがわかる。

さらに他の実施例を図３Ａ及び図３Ｂを参照しながら説明する。
これらの実施例は、本発明の温度グラジエント溶出法に移動相の組成を時間的に変化させる移動相組成グラジエント機構をさらに備えたものである。

移動相１ａ，１ｂはそれぞれ流量調整可能な弁４ａ，４ｂを備えた流路６ａ，６ｂに接続されている。流路６ａ，６ｂは脱気装置３ａを経て、分岐された２つの移動相流路２ａ，２ｂに接続されている。弁４ａ，４ｂもグラジエントコントローラ２１に接続され、移動相１ａ，１ｂの組成が時間的に調節される。
移動相流路２ａ，２ｂ及びそれらから下流の構成は図１Ａ，１Ｂと同じである。

図３Ａ，３Ｂの流路構成において、移動相１ａ，１ｂは弁４ａ，４ｂの開口比に従って所定流量比に設定され、混合された後の移動相は脱気装置３により脱気された後、混合され、２つの移動相流路２ａ，２ｂに分配される。その後は、図１Ａ，１Ｂの実施例と同じく温度グラジエントが実行される。

図３Ａ，３Ｂに示す流路構成の場合、例えば移動相１ａと１ｂの組成による分配係数が大きく異なり、さらに温度による分配係数も大きく異なる場合、両方の性質の相乗効果によって分配係数がさらに大きく異なるという効果がある。そのため、よりグラジエント効果が大きいクロマトグラフィーを提供することができる。

一実施例の高速液体クロマトグラフを示す流路図である。 他の実施例の高速液体クロマトグラフを示す流路図である。 一実施例による温度グラジエント溶出を行なったときのクロマトグラフを示す波形図である。 さらに他の実施例の高速液体クロマトグラフを示す流路図である。 本発明のさらに他の実施例の高速液体クロマトグラフを示す流路図である。 従来の移動相組成グラジエント機構を備えた高速液体クロマトグラフを示す流路図である。 移動相組成グラジエント動作における移動相組成変化を示すグラフである。

符号の説明

１，１ａ，１ｂ 移動相
２ａ，２ｂ 移動相送液流路
３ 脱気装置
５ａ，５ｂ 送液ポンプ
７ 試料注入器
９ａ，９ｂ，１７ 恒温器
１１ 混合器
１２ 分析流路
１３ 断熱器
１５ カラム
１９ 検出器
２１ グラジエントコントローラ

Claims (12)

1. 分析しようとする試料を移動相とともに分離用カラムに導入し、そのカラムで分離されて溶出した試料成分を検出器で検出する液体クロマトグラフィーによる分析方法おいて、
   前記カラムを断熱状態とすること、
   移動相を２つの移動相送液流路から供給し混合して前記カラムに導入すること、その際に、一方の移動相送液流路の移動相温度を前記カラムで調節しようとする温度範囲の上限温度よりも高い一定温度に設定し、他方の移動相送液流路の移動相温度を前記カラムで調節しようとする温度範囲の下限温度よりも低い一定温度に設定すること、及び
   前記２つの移動相送液流路の流量の調節により移動相の混合比率を時間的に変化させることにより前記カラム内の移動相の温度を時間的に変化させることを含み、
   これにより温度グラジエント溶出法を行なう分析方法。
2. 前記混合比率の時間的変化を連続的に行なうことにより前記カラム内に移動相の移動方向に沿った温度勾配を形成する請求項１に記載の分析方法。
3. 前記カラムから流出する液を一定温度に調節した後に前記検出器に導く請求項１又は２に記載の分析方法。
4. 前記カラムに導入される移動相の流量が一定になるように前記２つの移動相送液流路の流量を調節する請求項１から３のいずれかに記載の分析方法。
5. 前記２つの移動相送液流路から供給する移動相の組成を時間的に変化させる移動相組成グラジエント溶出法と併用する請求項１から４のいずれかに記載の分析方法。
6. 分離用カラムと、
   前記カラムを収容する断熱容器と、
   送液ポンプ及び前記カラムで調節しようとする温度範囲の上限温度よりも高い一定温度に設定された恒温器を備えた第１の移動相送液流路と、
   前記送液ポンプとは異なる送液ポンプ及び前記カラムで調節しようとする温度範囲の下限温度よりも低い一定温度に設定された恒温器を備え、第１の移動相送液流路で送液される移動相と同じ移動相を送液する第２の移動相送液流路と、
   第１、第２の移動相送液流路から供給された移動相を混合して前記カラムに送り出す混合器と、
   前記カラムに移動相が供給される流路中に分析しようとする試料を注入する試料注入器と、
   前記カラムの下流に配置され、カラムで分離されて溶出した試料成分を検出する検出器と、
   第１、第２の移動相送液流路の送液ポンプの流量を調節して前記混合器での移動相の混合比率を時間的に変化させるグラジエントコントローラと、を備え、
   これにより前記カラム内の移動相の温度を時間的に変化させて温度グラジエント溶出法を行なう液体クロマトグラフ。
7. 前記カラム内に温度勾配を形成するために、前記グラジエントコントローラは前記混合比率の時間的変化が連続的に行なわれるように第１、第２の移動相送液流路の送液ポンプの流量を調節するものである請求項６に記載の液体クロマトグラフ。
8. 前記カラムと検出器の間にカラムからの流出液の温度を一定温度に調節する恒温器をさらに備えている請求項６又は７に記載の液体クロマトグラフ。
9. 前記グラジエントコントローラは前記カラムに導入される移動相の流量が一定になるように第１、第２の移動相送液流路の送液ポンプの流量を調節するものである請求項６から８のいずれかに記載の液体クロマトグラフ。
10. 第１、第２の移動相送液流路は送液する移動相の組成を時間的に変化させる移動相組成グラジエント機構をさらに備えている請求項６から９のいずれかに記載の液体クロマトグラフ。
11. 前記試料注入器は第１又は第２の移動相送液流路に配置されている請求項６から１０のいずれかに記載の液体クロマトグラフ。
12. 前記試料注入器は前記混合器とカラムの間の流路に配置されている請求項６から１０のいずれかに記載の液体クロマトグラフ。

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