JP4566694B2 - Mutant polynucleotide and nucleic acid molecule that can be used for genetic diagnosis of abnormalities in detoxification metabolism caused by CYP2C9 enzyme - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常の遺伝子診断に用いることができる変異型ポリヌクレオチドおよび核酸分子に関する。
FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to mutant polynucleotides and nucleic acid molecules that can be used for genetic diagnosis of abnormal detoxification metabolism by CYP2C9 enzyme.
背景技術
一般に、薬物療法において、薬物は、患者の示す疾患、症状等に応じて投与されるものである。しかしながら、個々の患者の薬物に対する反応性には差違があり、そのような個々人の薬物感受性を予測し、これに応じて薬物を投与することは困難である。
Background Art In general, in drug therapy, drugs are administered according to diseases, symptoms and the like indicated by patients. However, there are differences in the responsiveness of individual patients to drugs, and it is difficult to predict the drug sensitivity of such individuals and to administer drugs accordingly.
通常、投与された薬物は、肝臓の薬物代謝酵素によってより水溶性の物質へと変換され、体外に排出される。このような薬物代謝酵素として、ヘムタンパク質であるシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）が知られており、これは、薬物、ステロイド、発癌物質、毒素などの外因性の化学物質、ならびにステロイド、脂肪酸などの内因性の化合物等の酸化代謝を触媒する。 Usually, an administered drug is converted into a more water-soluble substance by a drug metabolizing enzyme in the liver and excreted from the body. As such a drug-metabolizing enzyme, cytochrome P450 (CYP), a heme protein, is known, which is an exogenous chemical substance such as a drug, a steroid, a carcinogen, a toxin, and an endogenous substance such as a steroid or a fatty acid. It catalyzes the oxidative metabolism of these compounds.
ヒト肝臓中には、２０種以上のＣＹＰの分子種が含まれている。ＣＹＰは多くの薬物の代謝に関与し、薬物の体内での動態を律速している。従って、薬物の薬効と安全性を知るためには、特定の薬物がＣＹＰのどの分子種により代謝されるのか、また、いずれかの分子種の活性を阻害もしくは誘導するか否かについて正確に知ることが重要である。 The human liver contains 20 or more CYP molecular species. CYP is involved in the metabolism of many drugs and controls the kinetics of drugs in the body. Therefore, in order to know the efficacy and safety of a drug, it is necessary to know exactly which molecular species of a specific drug is metabolized by CYP and whether or not the activity of any molecular species is inhibited or induced. This is very important.
遺伝子解析技術の進歩に伴い、薬物に対する特定の患者の反応性とその患者の遺伝子型との関連についての研究が進行している。ＣＹＰ遺伝子については、一塩基多型（ＳＮＰ）によりチトクロームの代謝活性が弱められたり、増強されたりすることが報告されている（非特許文献１：Ingelman-Sundberg M. et al., Trends Pharmacol. Sci. 20, 342-349, 1999）。 With advances in genetic analysis technology, research on the relationship between a specific patient's responsiveness to drugs and the patient's genotype is ongoing. Regarding the CYP gene, it has been reported that cytochrome metabolic activity is weakened or enhanced by single nucleotide polymorphism (SNP) (Non-patent Document 1: Ingelman-Sundberg M. et al., Trends Pharmacol. Sci. 20, 342-349, 1999).
ＣＹＰ遺伝子の一種であるＣＹＰ２Ｃ９遺伝子は、染色体１０ｑ２４に位置し（非特許文献２：Gray I.C. et al., Genomics. 28, 328-332, 1995）、９個のエクソンから構成されている（非特許文献３：de Morais S. et al., Biochem. Biophis. Res. Commun. 194, 194-201, 1993）。この型のＣＹＰは主として肝臓で発現しているが、小腸、腎臓、副腎、精巣等を含む肝臓以外の組織でも発現することが示されている（非特許文献４：Klose T.S. et al., J. Biochem. Mol. Toxicol. 13, 289-295, 1999）。ＣＹＰ２Ｃ９は、現在使用されている薬剤の約１６％の代謝に関与している。このような薬剤としては、抗凝固剤であるワルファリン（Ｓ体）、糖尿病薬であるトルブタミド、グリメピリド、およびグリベンクラミド、抗てんかん薬であるフェニトイン、降圧薬であるロサルタン、ならびにイブプロフェンおよびジクロフェナックをはじめとする多くの非ステロイド性抗炎症薬の代謝に重要な役割を果たしている（非特許文献５：Schwarz U.I., Eur. J. Clin. Invest. 33, 23-30, 2003）。特に、ワルファリン（Ｓ体）やフェニトインは、治療濃度域が狭く、ＣＹＰ２Ｃ９の活性予測が特に重要となる薬剤であり、ＣＹＰ２Ｃ９の活性異常により副作用が引き起こされることが知られている（非特許文献６：Steward D.J. et al., Pharmacogenetics. 7, 361-367, 1997；非特許文献７：Ninomiya H. et al., Ther. Drug Monit. 22, 230-232, 2000）。 The CYP2C9 gene, which is a kind of CYP gene, is located on chromosome 10q24 (Non-patent Document 2: Gray IC et al., Genomics . 28, 328-332, 1995), and is composed of 9 exons (non-patent document). Reference 3: de Morais S. et al., Biochem. Biophis. Res. Commun. 194, 194-201, 1993). Although this type of CYP is mainly expressed in the liver, it has been shown to be expressed in tissues other than the liver including the small intestine, kidney, adrenal gland, testis and the like (Non-patent Document 4: Klose TS et al., J Biochem. Mol. Toxicol. 13, 289-295, 1999). CYP2C9 is involved in the metabolism of about 16% of currently used drugs. Such drugs include warfarin (S form), an anticoagulant, tolbutamide, glimepiride, and glibenclamide, diabetic drugs, phenytoin, an antiepileptic drug, losartan, an antihypertensive drug, and ibuprofen and diclofenac. It plays an important role in the metabolism of many non-steroidal anti-inflammatory drugs (Non-Patent Document 5: Schwarz UI, Eur. J. Clin. Invest. 33, 23-30, 2003). In particular, warfarin (S form) and phenytoin are drugs that have a narrow therapeutic concentration range and are particularly important for predicting the activity of CYP2C9, and it is known that side effects are caused by abnormal activity of CYP2C9 (Non-patent Document 6). : Steward DJ et al., Pharmacogenetics. 7, 361-367, 1997; Non-patent document 7: Ninomiya H. et al., Ther. Drug Monit. 22, 230-232, 2000).
ＣＹＰ２Ｃ９については、これまでに活性変化をもたらす５種の遺伝子多型が知られている（非特許文献８：http://www.imm.ki.se/CYPalleles/）。Ａｒｇ１４４Ｃｙｓのアミノ酸変化を有するＣＹＰ２Ｃ９＊２は、酵素活性の低下をもたらし、そのアレル頻度は、白人で約１０％、黒人で約３％、日本人を含むアジア人種では０％である（非特許文献９：Lee C.R. et al., Pharmacogenetics 12, 251-263, 2002；非特許文献５：Schwarz U.I., Eur. J. Clin. Invest. 33, 23-30, 2003）。Ｉｌｅ３５９Ｌｅｕのアミノ酸変化を有するＣＹＰ２Ｃ９＊３は、ＣＹＰ２Ｃ９＊２よりも大きな酵素活性の低下をもたらし、そのアレル頻度は、白人で約１０％、黒人で約３％、日本人を含むアジア人種では約２％である（非特許文献９：Lee C.R. et al., Pharmacogenetics 12, 251-263, 2002；非特許文献５：Schwarz U.I., Eur. J. Clin. Invest. 33, 23-30, 2003）。Ｉｌｅ３５９Ｔｈｒのアミノ酸変化を有するＣＹＰ２Ｃ９＊４も、酵素活性の低下をもたらし、そのアレル頻度は日本人で０．５％以下である（非特許文献１０：Imai J. et al., Pharmacogenetics 10, 85-89, 2000；非特許文献１１：Ieiri I. et al., Ther. Drug Monit. 22, 237-244, 2000）。ＣＹＰ２Ｃ９＊５および＊６は黒人のみで見いだされており、それぞれ酵素活性の低下をもたらすＡｓｐ３６０Ｇｌｕのアミノ酸変化および酵素活性の喪失を引き起こす一塩基欠失（８１８ｄｅｌＡ）を有しており、その頻度は、黒人でそれぞれ約２％および０．６％である（非特許文献１２：Dickmann L.J. et al., Mol. Pharmacol. 60, 382-387, 2001；非特許文献１３：Kidd R.S. et al., Pharmacogenetics 11, 803-808, 2001）。 Regarding CYP2C9, five types of gene polymorphisms that cause an activity change have been known so far (Non-patent Document 8: http://www.imm.ki.se/CYPalleles/). CYP2C9 * 2, which has an amino acid change of Arg144Cys, causes a decrease in enzyme activity, and the allele frequency is about 10% in whites, about 3% in blacks, and 0% in Asians including Japanese (non-patented) Document 9: Lee CR et al., Pharmacogenetics 12, 251-263, 2002; Non-patent document 5: Schwarz UI, Eur. J. Clin. Invest. 33, 23-30, 2003). CYP2C9 * 3 with the Ile359Leu amino acid change resulted in a greater reduction in enzyme activity than CYP2C9 * 2, with the allele frequency being about 10% for whites, about 3% for blacks, and about 3% for Asians including Japanese. 2% (Non-patent document 9: Lee CR et al., Pharmacogenetics 12, 251-263, 2002; Non-patent document 5: Schwarz UI, Eur. J. Clin. Invest. 33, 23-30, 2003). CYP2C9 * 4 having an amino acid change of Ile359Thr also causes a decrease in enzyme activity, and its allele frequency is 0.5% or less in Japanese (Non-patent Document 10: Imai J. et al., Pharmacogenetics 10, 85- 89, 2000; Non-Patent Document 11: Ieiri I. et al., Ther. Drug Monit. 22, 237-244, 2000). CYP2C9 * 5 and * 6 are found only in blacks, each having an Asp360Glu amino acid change that results in reduced enzyme activity and a single base deletion (818delA) that causes loss of enzyme activity, the frequency of which is It is about 2% and 0.6% in blacks (Non-patent document 12: Dickmann LJ et al., Mol. Pharmacol. 60, 382-387, 2001; Non-patent document 13: Kidd RS et al., Pharmacogenetics 11 , 803-808, 2001).
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子多型の影響について、抗凝固薬ワルファリン（Ｓ体）を例にとると、本剤の１日あたりの投与量は個体によって１００倍以上の差があることが知られている。その個人にとっての過剰量の薬剤を投与されると、体内薬物濃度の上昇により臓器内出血等の副作用が引き起こされる。ワルファリンは通常ラセミ体として投与されるが、薬効はＳ体の方が強く、このＳ体を解毒代謝する酵素はＣＹＰ２Ｃ９である。酵素活性が低くなるＣＹＰ２Ｃ９＊２やＣＹＰ２Ｃ９＊３を有する患者では、副作用の出現頻度が高く、また、必要投与量も低いことが知られている（非特許文献１４：Higashi M.K. et al., JAMA 287, 1690-1698, 2002；非特許文献１５：Scordo M.G. et al., Clin. Pharmacol. Ther. 72, 702-710, 2002）。 Regarding the effect of CYP2C9 gene polymorphism, taking the anticoagulant warfarin (S form) as an example, the daily dose of this drug is known to differ by more than 100 times depending on the individual. When an excessive amount of drug for the individual is administered, side effects such as internal organ bleeding are caused by an increase in drug concentration in the body. Warfarin is usually administered as a racemate, but the medicinal effect is stronger in the S form, and the enzyme that detoxifies and metabolizes this S form is CYP2C9. It is known that in patients with CYP2C9 * 2 and CYP2C9 * 3 that have low enzyme activity, the incidence of side effects is high and the required dosage is low (Non-patent Document 14: Higashi MK et al., JAMA) . 287, 1690-1698, 2002; Non-Patent Document 15: Scordo MG et al., Clin. Pharmacol. Ther. 72, 702-710, 2002).
本発明者らは、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子において、第１２６番目のコドンが翻訳終止コドンとなり、その結果、ＣＹＰ２Ｃ９酵素の機能が欠損すると考えられる遺伝子変異を見出した。この変異を有するヒトにおいては、ＣＹＰ２Ｃ９タンパク質の発現量が減少するため、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による薬物の解毒代謝が抑制される。本発明はこれら知見に基づくものである。 The present inventors have found a gene mutation in the CYP2C9 gene in which the 126th codon is a translation termination codon, and as a result, the function of the CYP2C9 enzyme is considered to be defective. In humans having this mutation, the expression level of CYP2C9 protein is decreased, so that detoxification metabolism of the drug by CYP2C9 enzyme is suppressed. The present invention is based on these findings.
従って、本発明は、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常の遺伝子診断に用いることができる変異型ポリヌクレオチドおよび核酸分子の提供を目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide mutant polynucleotides and nucleic acid molecules that can be used for genetic diagnosis of abnormal detoxification metabolism by CYP2C9 enzyme.
そして、本発明による変異型ポリヌクレオチドは、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、第１２６番目のコドンの終止コドンへの変異を有してなる、ポリヌクレオチドである。 A mutant polynucleotide according to the present invention is a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, wherein the 126th codon has a mutation to a stop codon. It is.
さらに、本発明による核酸分子は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における、第１２６番目のコドンが終止コドンとなる変異を検出しうる核酸分子であって、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子である。 Furthermore, the nucleic acid molecule according to the present invention is a nucleic acid molecule capable of detecting a mutation in the CYP2C9 gene in which the 126th codon is a stop codon, and is a mutant polynucleotide according to the present invention or a complementary polynucleotide thereto. A nucleic acid molecule comprising a nucleotide fragment that hybridizes.
本発明によれば、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における上記変異を検出することにより、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常を予測または診断することができる。これにより、ＣＹＰ２Ｃ９酵素により解毒代謝される薬物を患者に投与する際に、上記変異を有する患者に投与する薬物の量を減少させ、該薬物による副作用を低減させることが可能となる。 According to the present invention, by detecting the mutation in the CYP2C9 gene, an abnormality in detoxification metabolism caused by the CYP2C9 enzyme can be predicted or diagnosed. As a result, when a drug detoxified and metabolized by the CYP2C9 enzyme is administered to a patient, the amount of the drug administered to the patient having the mutation can be reduced, and side effects due to the drug can be reduced.
本明細書において「ＣＹＰ２Ｃ９」とは、シトクロムＰ−４５０に属する酵素であり、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＣＹＰ２Ｃ９酵素は様々な薬物の解毒代謝に関与することが知られており、このような薬物としては、例えば、抗凝固剤であるワルファリン（特にＳ体）、糖尿病薬であるトルブタミド、グリメピリド、およびグリベンクラミド、抗てんかん薬であるフェニトイン、降圧薬であるロサルタン、ならびにイブプロフェンおよびジクロフェナックをはじめとする多くの非ステロイド性抗炎症薬が挙げられる。また、ＣＹＰ２Ｃ９タンパク質を発現するＣＹＰ２Ｃ９遺伝子は、例えば、配列番号１で表されるゲノム配列、および配列番号２で表されるｃＤＮＡ配列を有することが知られている。 In this specification, “CYP2C9” is an enzyme belonging to cytochrome P-450 and is a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. The CYP2C9 enzyme is known to be involved in the detoxification metabolism of various drugs. Examples of such drugs include warfarin (particularly S-form) as an anticoagulant, tolbutamide, glimepiride, and glibenclamide as diabetic drugs. There are many non-steroidal anti-inflammatory drugs, including phenytoin, an antiepileptic drug, losartan, an antihypertensive drug, and ibuprofen and diclofenac. Moreover, it is known that the CYP2C9 gene that expresses the CYP2C9 protein has, for example, a genome sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a cDNA sequence represented by SEQ ID NO: 2.
本発明により検出されるＣＹＰ２Ｃ９遺伝子中の変異は、第１２６番目のコドンが終止コドンとなるもの（以下「Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異」という）である。このような変異としては、例えば、該遺伝子のアミノ酸コード配列中、翻訳開始コドンから数えて第３５３〜３６２残基（配列番号１中では第３５３１〜３５４０残基、配列番号２中では第３５３〜３６２残基）の欠失が挙げられる。ＣＹＰ２Ｃ９タンパク質は４９０個のアミノ酸からなるため、前記変異により、ＣＹＰ２Ｃ９タンパク質の約７４％のアミノ酸残基が欠失することとなる。特に、欠失するＣＹＰ２Ｃ９タンパク質の第１２６〜４９０アミノ酸残基には、酵素活性に必須の基質認識部位およびヘム結合部位が存在するため（Graham EG and Peterson J.A., Arch. Biochem. Biophys. 368, 24-29, 1999；"Guide to cytochrome P450, structure and function" by Lewis D.F.V., published by Taylor and Francis Inc (London)., 2001）、前記変異によりＣＹＰ２Ｃ９タンパク質の機能は消失する。よって、前記変異は、ＣＹＰ２Ｃ９酵素の基質となる薬物の濃度上昇を招くことから、該薬物による副作用を増強するものと考えられる。従って、上記の変異を検出することにより、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常の予測または診断が可能となる。特に、ＣＹＰ２Ｃ９酵素により解毒代謝される薬物の投与前にこの変異を検出することにより、該変異を有する患者に対する薬物の投与量を調節し、副作用の発現を抑制することが可能となる。 The mutation in the CYP2C9 gene detected by the present invention is one in which the 126th codon is a stop codon (hereinafter referred to as “F126STOP mutation”). Examples of such mutation include, for example, residues 353 to 362 in the amino acid coding sequence of the gene (residues 3531 to 540 in SEQ ID NO: 1 and 353 to 353 in SEQ ID NO: 2). 362 residues). Since the CYP2C9 protein consists of 490 amino acids, approximately 74% of the amino acid residues of the CYP2C9 protein are deleted by the mutation. In particular, the 126th to 490th amino acid residues of the deleted CYP2C9 protein have a substrate recognition site and a heme binding site essential for enzyme activity (Graham EG and Peterson JA, Arch. Biochem. Biophys. 368, 24 -29, 1999; "Guide to cytochrome P450, structure and function" by Lewis DFV, published by Taylor and Francis Inc (London)., 2001), the function of the CYP2C9 protein disappears due to the mutation. Therefore, since the mutation causes an increase in the concentration of a drug that is a substrate for the CYP2C9 enzyme, it is considered that the side effect of the drug is enhanced. Therefore, by detecting the mutation described above, it is possible to predict or diagnose an abnormality in detoxification metabolism caused by the CYP2C9 enzyme. In particular, by detecting this mutation before administration of a drug that is detoxified and metabolized by the CYP2C9 enzyme, it is possible to adjust the dose of the drug to a patient having the mutation and suppress the occurrence of side effects.
変異型ポリヌクレオチド
Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異を検出するためには、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、第１２６番目のコドンの終止コドンへの変異を有してなるポリヌクレオチドを標的とすることができる。すなわち、このような変異型ポリヌクレオチドの存在を確認することにより、Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異を検出することができる。
In order to detect the mutated polynucleotide F126STOP mutation, the polynucleotide encoding the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is a polynucleotide comprising a mutation of the 126th codon to a stop codon. Nucleotides can be targeted. That is, the F126STOP mutation can be detected by confirming the presence of such a mutant polynucleotide.
Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する際には、ゲノム中の上記変異型ポリヌクレオチドを標的とすることができる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、検出の標的となる変異型ポリヌクレオチドは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において、第３５３１〜３５４０残基が欠失したヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドとされる。 When detecting the F126STOP mutation, the mutant polynucleotide in the genome can be targeted. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the mutant polynucleotide to be detected is a polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which residues 3531 to 3540 are deleted from the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. Nucleotides.
また、Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する際に、ゲノムにおける上記変異型ポリヌクレオチドの転写産物であるｍＲＮＡに対して生成させたｃＤＮＡを標的とすることもできる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、検出の標的となる変異型ポリヌクレオチドは、配列番号２で表わされるヌクレオチド配列において、第３５３〜３６２残基が欠失したヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。 Moreover, when detecting the F126STOP mutation, it is also possible to target cDNA generated with respect to mRNA that is a transcription product of the mutant polynucleotide in the genome. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the mutant polynucleotide to be detected comprises a nucleotide sequence in which residues 353 to 362 are deleted from the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. It is said.
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても、相補鎖がハイブリダイズした二本鎖であってもよい。 The mutant polynucleotide according to the present invention may be single-stranded or double-stranded with hybridized complementary strands.
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、既述の通り、Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する際の標的として有用であるが、さらには、ＣＹＰ２Ｃ９酵素の活性を増強する化合物をスクリーニングするためにも有用である。 As described above, the mutated polynucleotide according to the present invention is useful as a target for detecting the F126STOP mutation, and is also useful for screening a compound that enhances the activity of the CYP2C9 enzyme.
核酸分子およびこれを用いた解毒代謝異常の予知／検出方法
本発明による核酸分子は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出しうるものであり、該核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる。
Nucleic acid molecule and method for predicting / detecting abnormalities of detoxification using the nucleic acid molecule The nucleic acid molecule according to the present invention can detect the F126STOP mutation in the CYP2C9 gene, and the nucleic acid molecule is a mutant polynucleotide according to the present invention or the It comprises a nucleotide fragment that hybridizes to a complementary polynucleotide.
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子が通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。また、あるヌクレオチド分子にハイブリダイズする核酸分子は、特異的なハイブリダイズが可能であれば、そのヌクレオチド分子に対して完全に相補的である必要はないが、好ましくは、そのヌクレオチド分子に相補的なヌクレオチド分子の全部または一部の配列を含んでなるものとする。 In the present invention, “hybridize” means that the nucleic acid molecule according to the present invention hybridizes to a target nucleotide molecule under normal hybridization conditions, preferably under stringent hybridization conditions, to a nucleotide molecule other than the target nucleotide molecule. Means not hybridized. Stringent conditions can be determined depending on the melting temperature Tm (° C.) of the duplex between the nucleic acid molecule of the present invention and its complementary strand, the salt concentration of the hybridization solution, etc., for example, J. Sambrook , EF Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), and the like. For example, when hybridization is performed at a temperature slightly lower than the melting temperature of the nucleic acid molecule to be used, the nucleic acid molecule can be specifically hybridized to the target nucleotide molecule. In addition, a nucleic acid molecule that hybridizes to a nucleotide molecule need not be completely complementary to the nucleotide molecule as long as specific hybridization is possible, but is preferably complementary to the nucleotide molecule. A complete or partial sequence of such a nucleotide molecule.
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はＤＮＡである。 In the present invention, “nucleic acid molecule” is used to mean DNA, RNA, and PNA (peptide nucleic acid). According to a preferred embodiment of the invention, the nucleic acid molecule is DNA.
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、検出の標的をゲノムとする場合には、本発明による核酸分子は、エクソンにハイブリダイズする部分だけでなく、イントロンにハイブリダイズする部分をも含むことができ、あるいは、これらのどちらか一方のみにより構成されていてもよい。 The nucleotide sequence of the nucleic acid molecule according to the present invention can be appropriately designed by those skilled in the art. For example, when the detection target is a genome, the nucleic acid molecule according to the present invention can include not only a portion that hybridizes to an exon, but also a portion that hybridizes to an intron, or one of these. You may be comprised only by.
本発明による核酸分子は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異の検出において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、前記変異において変更される配列を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。該核酸プローブは、市販のオリゴヌクレオチド合成機等を用いて合成オリゴヌクレオチドとして作製してもよいし、あるいは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製してもよい。 The nucleic acid molecule according to the present invention can be used as a nucleic acid probe in the detection of F126STOP mutation in the CYP2C9 gene. For this purpose, the nucleic acid molecule according to the present invention comprises a nucleotide fragment that hybridizes to a region comprising a variant polynucleotide according to the present invention or a polynucleotide complementary thereto, comprising a sequence altered in said mutation. It is preferable to become. The nucleic acid probe may be prepared as a synthetic oligonucleotide using a commercially available oligonucleotide synthesizer or the like, or may be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like.
本明細書において「変異において変更される配列」とは、Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異を有するＣＹＰ２Ｃ９遺伝子（変異型）と該変異を有さないＣＹＰ２Ｃ９遺伝子（野生型）との間でヌクレオチド配列を比較した場合に、野生型ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子には見られない変異型ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子中のヌクレオチド配列をいう。例えば、Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異が第１２６番目のコドン中のヌクレオチド残基の置換によって引き起される場合には、変異において変更される配列は、置換された残基およびその周辺の配列、特に置換された残基およびこれに隣接する２つの残基とされる。また、Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異が翻訳開始コドンから数えて第３５３〜３６２残基（配列番号１中では第３５３１〜３５４０残基、配列番号２中では第３５３〜３６２残基）の欠失によって引き起される場合には、変異において変更される配列は、欠失した残基の周辺の配列、特に欠失した残基に隣接していた２つの残基とされる。 In the present specification, the “sequence changed in mutation” means that the nucleotide sequence is compared between a CYP2C9 gene having a F126STOP mutation (mutant type) and a CYP2C9 gene not having the mutation (wild type). This refers to a nucleotide sequence in a mutant CYP2C9 gene that is not found in the wild type CYP2C9 gene. For example, if the F126STOP mutation is caused by a substitution of a nucleotide residue in the 126th codon, the sequence altered in the mutation will be the substituted residue and its surrounding sequences, particularly the substituted residue. A group and two adjacent residues. In addition, the F126STOP mutation is caused by deletion of residues 353 to 362 (residues 3531 to 540 in SEQ ID NO: 1 and residues 353 to 362 in SEQ ID NO: 2) counted from the translation initiation codon. In some cases, the sequence altered in the mutation is the sequence surrounding the deleted residue, particularly the two residues adjacent to the deleted residue.
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１５ヌクレオチド以上とすることが好ましく、また、１００ヌクレオチド以下、より好ましくは５０ヌクレオチド以下とすることが好ましい。 When the nucleic acid molecule according to the present invention is used as a nucleic acid probe, the chain length of the nucleic acid molecule is preferably 15 nucleotides or more, and preferably 100 nucleotides or less, more preferably 50 nucleotides or less.
さらに、本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、該核酸分子を適宜標識することが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）が挙げられる。 Furthermore, when the nucleic acid molecule according to the present invention is used as a nucleic acid probe, it is preferable to appropriately label the nucleic acid molecule. As a labeling method, a method of labeling by phosphorylating the 5 ′ end of the oligonucleotide with 32 P using T4 polynucleotide kinase, and a random hexamer oligonucleotide or the like using a DNA polymerase such as Klenow enzyme are used. Examples of the primer include a method of incorporating a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin (random prime method or the like).
また、本発明による核酸分子は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異の検出において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、前記変異において変更される配列を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。 In addition, the nucleic acid molecule according to the present invention can be used as a primer for nucleic acid amplification in the detection of F126STOP mutation in the CYP2C9 gene. For this purpose, the nucleic acid molecule according to the present invention is preferably a nucleic acid amplification method capable of amplifying a region containing a sequence changed in the mutation of the mutant polynucleotide according to the present invention.
本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１５〜１００ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは１７〜３０ヌクレオチドとする。 When the nucleic acid molecule according to the present invention is used as a primer for nucleic acid amplification, the chain length of the nucleic acid molecule is preferably 15 to 100 nucleotides, more preferably 17 to 30 nucleotides.
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子の鎖長は、１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、さらに好ましくは１８〜５０ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する本発明による核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料から上記Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する上で好ましいものである。 According to another preferred embodiment of the present invention, the length of the nucleic acid molecule according to the present invention is 15-100 nucleotides, more preferably at least 17 nucleotides, even more preferably at least 18 nucleotides, even more preferably 18-50 nucleotides. . The nucleic acid molecule according to the present invention having such a chain length is particularly preferable for detecting the F126STOP mutation from a nucleic acid sample containing impurities.
核酸増幅法は、通常、プライマーのペアを用いて実施される。従って、本発明によれば、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出するためのプライマーペアであって、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、前記変異において変更される配列を含む領域を核酸増幅法において増幅しうるプライマーペアが提供される。このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。 The nucleic acid amplification method is usually performed using a pair of primers. Therefore, according to the present invention, a primer pair for detecting the F126STOP mutation in the CYP2C9 gene, wherein a region containing a sequence that is altered in the mutation of the mutant polynucleotide according to the present invention is amplified by a nucleic acid amplification method. Possible primer pairs are provided. As the two primers constituting such a primer pair, the nucleic acid molecule according to the present invention can be used. Such a primer can be appropriately designed by those skilled in the art based on the nucleotide sequence of the region to be amplified. For example, one primer of the primer pair has a 5 ′ terminal sequence in the nucleotide sequence of the amplification target region, and the other primer has a 5 ′ terminal sequence in the nucleotide sequence of the complementary strand of the amplification target region. It can have an array.
本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることにより、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異の有無を検出することができ、これにより、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常を予知、予測、検出または診断することができる。 By using the nucleic acid molecule according to the present invention or the primer pair according to the present invention, it is possible to detect the presence or absence of F126STOP mutation in the CYP2C9 gene, thereby predicting, predicting, detecting or diagnosing abnormalities in detoxification metabolism due to the CYP2C9 enzyme Can do.
具体的には、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアは、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができ、より具体的には、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、前記変異において変更される配列を含む領域を増幅するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて、被検者由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中においてＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する工程を含んでなる、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常を予知、予測、検出または診断する方法が提供される。 Specifically, the nucleic acid molecule according to the present invention or the primer pair according to the present invention can be used as a primer in a nucleic acid amplification method for detecting the F126STOP mutation in the CYP2C9 gene, and more specifically, the mutant type according to the present invention. The polynucleotide can be used as a primer in a nucleic acid amplification method for amplifying a region containing a sequence that is altered in the mutation. Therefore, according to the present invention, using the nucleic acid molecule or primer pair according to the present invention, a nucleic acid amplification method using a nucleic acid sample derived from a subject as a template, and detecting the F126STOP mutation in the obtained amplification product A method for predicting, predicting, detecting or diagnosing an abnormality in detoxification metabolism caused by a CYP2C9 enzyme is provided.
この方法による解毒代謝異常の予測または診断に当たっては、例えば、被験者から血液、末梢血白血球、肝臓、腎臓、副腎、脳、子宮等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出することができる。核酸増幅法およびこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としては、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とする場合には通常のＰＣＲ法等を用いることができ、ｍＲＮＡを鋳型とする場合には、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法等を用いることができる。 In predicting or diagnosing detoxification metabolism abnormality by this method, for example, samples of blood, peripheral blood leukocytes, liver, kidney, adrenal gland, brain, uterus, etc. are collected from the subject, and genomic DNA, mRNA, etc. are collected from the obtained samples. A nucleic acid sample is extracted, and if necessary, cDNA is prepared from mRNA using reverse transcriptase. Using the obtained nucleic acid sample as a template, a nucleic acid amplification method is performed using the nucleic acid molecule or primer pair according to the present invention. By analyzing the nucleotide sequence of the amplified product, the F126STOP mutation in the CYP2C9 gene can be detected. Any method known in the art may be used as the nucleic acid amplification method and the mutation detection method using the nucleic acid amplification method. For example, as a nucleic acid amplification method, a normal PCR method or the like can be used when genomic DNA or cDNA is used as a template, and an RT-PCR method or NASBA method or the like can be used when mRNA is used as a template. Can do.
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。 Analysis of the nucleotide sequence of the amplification product obtained by the nucleic acid amplification method can be easily performed by, for example, a direct sequencing method using a sequencing primer. Such methods are well known in the art and can be performed, for example, using commercially available kits.
上記の核酸増幅法とダイレクトシークエンス法とによりＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する場合には、例えば、以下の配列を有するプライマー：
フォワード：5'-GTAGAGACGTGGTATCACCTTG-3'（配列番号１０）；および
リバース：5'-GGTAATGGGAAAAACACTGCT-3'（配列番号１１）
を用いて核酸増幅法を行ない、これらのプライマーをシークエンスプライマーとしてダイレクトシークエンス法を行なうことができる。あるいは、シークエンスプライマーとして以下のプライマーを用いてもよい：
フォワード：5'-AGGAGTTTTCTGGAAGAGG-3'（配列番号２８）；
リバース：5'-GGAAAAACACTGCTCTTTAACTC-3'（配列番号２９）。
When detecting the F126STOP mutation by the nucleic acid amplification method and the direct sequencing method, for example, a primer having the following sequence:
Forward: 5'-GTAGAGACGTGGTATCACCTTG-3 '(SEQ ID NO: 10); and reverse: 5'-GGTAATGGGAAAAACACTGCT-3' (SEQ ID NO: 11)
A nucleic acid amplification method can be performed using a direct sequencing method using these primers as sequence primers. Alternatively, the following primers may be used as sequence primers:
Forward: 5'-AGGAGTTTTCTGGAAGAGG-3 '(SEQ ID NO: 28);
Reverse: 5′-GGAAAAACACTGCTCTTTAACTC-3 ′ (SEQ ID NO: 29).
また、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異において、この変異により特定の制限酵素による認識配列が失われるかまたは生成する場合には、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用する方法、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いて上記の変異を検出することができる。このような方法は、例えば、上述の核酸増幅法において前記制限酵素認識配列を包含する領域を増幅するようなプライマーペアを用い、得られた増幅断片をこの制限酵素で消化した後、得られる断片の数およびそれらの鎖長を調べることにより実施することができる。このような方法は当技術分野において周知であり、当業者であれば、適切な制限酵素、プライマー、増幅反応条件、制限酵素反応条件等を適宜設定することができる。 In addition, in the F126STOP mutation in the CYP2C9 gene, when a recognition sequence by a specific restriction enzyme is lost or generated due to this mutation, a method using a restriction fragment length polymorphism (RFLP), for example, a PCR-RFLP method is used. Can be used to detect the mutations described above. Such a method is obtained by, for example, using a primer pair that amplifies a region including the restriction enzyme recognition sequence in the nucleic acid amplification method described above, digesting the obtained amplified fragment with this restriction enzyme, and then obtaining the fragment. Can be carried out by examining the number of and their chain lengths. Such methods are well known in the art, and those skilled in the art can appropriately set appropriate restriction enzymes, primers, amplification reaction conditions, restriction enzyme reaction conditions, and the like.
さらに、上述のような核酸増幅法によって得られた増幅断片につき、その増幅断片中に何らかの変異が存在するか否かを簡便な方法により調べ、変異を有すると判断されたサンプルについてのみ、Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異の検出を行なうこともできる。 Further, for the amplified fragment obtained by the nucleic acid amplification method as described above, whether or not any mutation exists in the amplified fragment is examined by a simple method, and only for the sample judged to have the mutation, the F126STOP mutation Can also be detected.
上記の簡便法としては、例えば、一本鎖高次構造多型（single-strand conformation polymorphism）を利用した方法（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法：Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313-1318.、Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling.、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275-282）が挙げられる。この方法では、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させ、次いで、この一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、そのゲル上での移動度を、変異を有しない対照サンプルの移動度と比較する。この方法において増幅するＤＮＡ断片の鎖長は２００〜４００ｂｐとすることが好ましい。 As the above simple method, for example, a method using a single-strand conformation polymorphism (PCR-SSCP method: Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats) on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12 (1): 139-146., Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products.Oncogene. 1991 Aug 1; 6 ( 8): 1313-1318., Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling., PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4 (5): 275-282). In this method, the amplified DNA is dissociated into single-stranded DNA, and then this single-stranded DNA is separated on a non-denaturing gel, and the mobility on the gel is compared to the mobility of a control sample without mutation. Compare with The chain length of the DNA fragment amplified in this method is preferably 200 to 400 bp.
上記の簡便法としては、また、変性剤濃度勾配ゲル法（denaturant gradient gel electrophoresis：ＤＧＧＥ法）を用いることもできる。この方法では、増幅したＤＮＡをＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離し、そのゲル上での移動度を、変異を有しない対照サンプルの移動度と比較する。このような方法は当技術分野において公知であり、当業者であれば適切に実施することができる。 As the above simple method, a denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE method) can also be used. In this method, the amplified DNA is separated on a gel with an increasing concentration of DNA denaturant, and the mobility on the gel is compared to the mobility of a control sample without mutation. Such methods are known in the art and can be appropriately performed by those skilled in the art.
本発明による解毒代謝異常の予測または診断法においては、アレル特異的ＰＣＲ法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、プライマーの一方を変異部位に対合できるように設計し、他方を変異部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に変異が存在する場合には増幅産物が得られ、変異が存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより変異の有無を判定することができる。 In the method for predicting or diagnosing detoxification and metabolism abnormality according to the present invention, primers can be designed so that an allele-specific PCR method can be carried out. Specifically, one of the primers can be designed so as to be paired with the mutation site, and the other can be designed so as to be paired with a region not including the mutation site. When the nucleic acid amplification method is performed using the primer pair designed as described above, an amplification product is obtained when a mutation exists in the nucleic acid sample, and an amplification product cannot be obtained when there is no mutation. Therefore, in this case, the presence or absence of the mutation can be determined by detecting the presence or absence of the amplification product.
本発明による核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等による変異の検出にプローブとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子と被検者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常を予知、予測、検出または診断する方法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異の存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。 The nucleic acid molecule according to the present invention can be used as a probe for detection of mutation by a hybridization method or the like. Thus, according to the present invention, the detoxification metabolism by the CYP2C9 enzyme comprises the steps of hybridizing a nucleic acid molecule according to the present invention with a nucleic acid sample from a subject and then detecting the presence of a hybridization complex. A method for predicting, predicting, detecting or diagnosing an abnormality is provided. The presence of the hybridization complex indicates the presence of the F126STOP mutation in the CYP2C9 gene. The method using this hybridization method can also be applied to the amplification product obtained by the method using the nucleic acid amplification method described above.
この方法による解毒代謝異常の予測または診断に当たっては、例えば、被検者から血液、末梢血白血球、肝臓、腎臓、副腎、脳、子宮等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出することができる。核酸試料は必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)を参照することができる。 In predicting or diagnosing detoxification and metabolic disorders by this method, for example, samples of blood, peripheral blood leukocytes, liver, kidney, adrenal gland, brain, uterus, etc. are collected from the subject, and genomic DNA and mRNA are obtained from the obtained samples. The F126STOP in the CYP2C9 gene is prepared by extracting cDNA from the mRNA if necessary, and preparing cDNA from the mRNA using reverse transcriptase and detecting the presence or absence of hybridization with the nucleic acid molecule according to the present invention under stringent conditions. Mutations can be detected. If necessary, the nucleic acid sample can be subjected to a restriction enzyme treatment or the like to have a length suitable for hybridization. Any method known in the art may be used as a hybridization method and a mutation detection method using the hybridization method. For example, techniques such as Southern hybridization and colony hybridization can be used. For these methods, for example, J. Sambrook, EF Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) You can refer to it.
本発明による核酸分子をハイブリダイゼーション法による変異の検出においてプローブとして用いる場合、本発明による核酸分子を基板上に固定したＤＮＡチップを作製し、このＤＮＡチップと被験者由来の核酸試料とをハイブリダイゼーション条件下で接触させ、ハイブリダイゼーションの有無を検出してもよい。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子を基板上に固定してなる、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出しうるＤＮＡチップ、さらには、このＤＮＡチップを用いてＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する工程を含んでなる、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝の異常を予知、予測、検出または診断する方法が提供される。本発明において基板に結合させるプローブの鎖長は特に制限されないが、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは１５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１７〜２５ヌクレオチドとする。このようなＤＮＡチップを用いて変異を検出する技術は当技術分野において周知であり（ポストシークエンスのゲノム科学、第１巻「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１２８−１３５、２０００年）、当業者であれば、本発明による核酸分子を用いて適切なＤＮＡチップを作製し、このＤＮＡチップを用いてＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出することができる。 When the nucleic acid molecule according to the present invention is used as a probe in the detection of a mutation by a hybridization method, a DNA chip is prepared by immobilizing the nucleic acid molecule according to the present invention on a substrate, and the DNA chip and a nucleic acid sample derived from a subject are subjected to hybridization conditions. The presence or absence of hybridization may be detected by contacting under. Therefore, according to the present invention, a DNA chip capable of detecting the F126STOP mutation in the CYP2C9 gene, wherein the nucleic acid molecule according to the present invention is immobilized on a substrate, and a step of detecting the F126STOP mutation using this DNA chip are further provided. A method for predicting, predicting, detecting or diagnosing an abnormality in detoxification metabolism by a CYP2C9 enzyme is provided. In the present invention, the chain length of the probe to be bound to the substrate is not particularly limited, but is preferably 15 to 100 nucleotides, more preferably 15 to 50 nucleotides, and still more preferably 17 to 25 nucleotides. Techniques for detecting mutations using such DNA chips are well known in the art (Post Sequence Genome Science, Volume 1, “Strategy for SNP Gene Polymorphism”, Kenichi Matsubara, Yoshiyuki Tsuji, Nakayama Shoten, p128 -135, 2000), a person skilled in the art can make a suitable DNA chip using the nucleic acid molecule according to the invention and detect the F126STOP mutation using this DNA chip.
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出する場合には、また、本発明による核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。 When detecting the F126STOP mutation in the CYP2C9 gene, a primer extension method using the nucleic acid molecule according to the present invention as a primer can also be used. The primer extension method is known to those skilled in the art, and the procedure for the procedure and the specific nucleotide sequence of the primer to be used can be easily determined by those skilled in the art.
本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法として知られる方法が用いられる。 According to a preferred embodiment of the present invention, a method known as SNaPshot ™ method or Pyrosequencing method is used as the primer extension method.
ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法においては、変異部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその３’末端に付加するヌクレオチドが前記変異部位に対合するものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被検者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴＰ）を用いることにより、伸長反応は、上記の変異部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、変異部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。 In the SNaPshot TM method, a primer that is adjacent to a mutation site and that is used to pair a nucleotide added to its 3 ′ end by an extension reaction with the mutation site. Using such a primer, a primer extension reaction is performed using a nucleic acid sample from a subject as a template. By using ddNTP (dideoxyNTP), the extension reaction corresponds to the above mutation site. When one nucleotide to be incorporated is completed. The incorporated nucleotide is easily identified by pre-labeling with a fluorescent label or the like, and therefore the nucleotide at the mutation site is identified. Such methods are known to those skilled in the art, and the procedures for the operation and the specific nucleotide sequences of the primers used can be easily determined by those skilled in the art.
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（Ahmadian A et al., Anal. Biochem. vol. 280, pp103-110, (2000)）においては、被検者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、４種のｄＮＴＰを１種ずつ反応させる。ｄＮＴＰのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）が遊離し、遊離したＰＰｉはスルフリラーゼと反応してＡＴＰを生成させ、このＡＴＰによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のｄＮＴＰを加えたときに発光が起こった場合には、そのｄＮＴＰに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、ｄＮＴＰが用いられるため、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法で用いられるような変異部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。 In the Pyrosequencing method (Ahmadian A et al., Anal. Biochem. Vol. 280, pp103-110, (2000)), during the extension reaction of primers using a nucleic acid sample from a subject as a template, One dNTP is reacted at a time. When any of dNTPs is incorporated, an equal amount of pyrophosphate (PPi) is liberated, and the liberated PPi reacts with sulfurylase to produce ATP, which causes luciferase reaction and luminescence. Therefore, when light emission occurs when a specific dNTP is added, it becomes clear that the nucleotide corresponding to the dNTP has been incorporated, and thereby the nucleotide of the target site in the nucleic acid sample is identified. In this method, since dNTP is used, it is not necessary to use a primer adjacent to the mutation site as used in the SNaPshot TM method, and a primer separated by several bases may be used. Such methods are known to those skilled in the art, and the procedures for the operation and the specific nucleotide sequences of the primers used can be easily determined by those skilled in the art.
さらに、本発明による核酸分子をプローブおよび／またはプライマーとして使用する遺伝子型決定法（タイピング法）により、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出することもできる。遺伝子型決定法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプローブおよび／またはプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記の遺伝子型決定法としては、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法として知られる方法が用いられる。 Furthermore, the F126STOP mutation in the CYP2C9 gene can also be detected by a genotyping method (typing method) using the nucleic acid molecule according to the present invention as a probe and / or primer. Genotyping methods are known to those skilled in the art, and the procedures for the procedures and the specific nucleotide sequences of the probes and / or primers used can be easily determined by those skilled in the art. According to a preferred embodiment of the present invention, a method known as TaqMan PCR method is used as the genotyping method.
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法（Livak KJ. Genet. Anal. vol.14, pp143-149, (1999)）においては、変異部位のヌクレオチドを含む領域に対して、変異型アレルおよび野生型アレルのそれぞれに特異的にハイブリダイズする２種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付され、さらに３’末端がリン酸化されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、被検者由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲ用プライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができる。また、２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれのクエンチャーとともに当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはＦＡＭとＶＩＣの組合せを用いる。このＰＣＲ反応においては、まず、各アレルにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。従って、この方法によれば、各アレルの存在量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、被検者の変異部位における遺伝子型が容易に決定される。 In the TaqMan PCR method (Livak KJ. Genet. Anal. Vol.14, pp143-149, (1999)), the mutant allele and the wild-type allele are specific for the region containing the nucleotide at the mutation site. Two types of probes that hybridize, each with a different fluorescent labeling substance attached to the 5 ′ end, a quencher (quenching substance) for the fluorescent label attached to the 3 ′ end, and further phosphorylated at the 3 ′ end These probes (TaqMan probes) are used, and these are added to a PCR reaction solution to perform a PCR reaction using a nucleic acid sample derived from the subject as a template. As the TaqMan probe and the PCR primer, the nucleic acid molecule according to the present invention can be used, and the specific nucleotide sequence thereof can be appropriately determined by those skilled in the art. The two kinds of fluorescent labeling substances may be any combination that can be distinguished from each other, and such a combination of fluorescent labeling substances can be used together with each quencher, and those known to those skilled in the art can be used. And a combination of VICs. In this PCR reaction, the TaqMan probe is first hybridized to each allele, and when the extension reaction from the primer reaches the hybridization region, the fluorescently labeled substance is released by the action of Taq DNA polymerase. Since the released fluorescent labeling substance is not affected by the quencher, it emits fluorescence. Therefore, according to this method, each fluorescence having an intensity corresponding to the abundance of each allele can be observed, whereby the genotype at the mutation site of the subject can be easily determined.
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異の検出に用いることのできる他の方法としては、質量分析法による方法（Griffin TJ and Smith LM, Trends Biotechnol. vol. 18, pp77-84, (2000)）、Ｉｎｖａｄｅｒ法（Lyamichev V et al., Nat. Biotechnol. vol. 17, pp292-296, (1999)；「遺伝子医学」vol.4, No.1, メディカルドゥ社発行、pp44-51およびpp68-72 (2000)）が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、遺伝子の変異を検出しうる方法であれば、いかなる方法を用いることもできる。 Other methods that can be used to detect the F126STOP mutation in the CYP2C9 gene include mass spectrometry (Griffin TJ and Smith LM, Trends Biotechnol. Vol. 18, pp77-84, (2000)), Invader method (Lyamichev V et al., Nat. Biotechnol. Vol. 17, pp292-296, (1999); "Gene Medicine" vol.4, No.1, published by Medical Do, pp44-51 and pp68-72 (2000)) Although not limited to these, any method can be used as long as it is a method capable of detecting gene mutation.
本発明による解毒代謝異常の予測または診断法において、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異が存在すると評価されたサンプルは、ＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝機構が作動しにくいものと判断することができる。従って、Ｆ１２６ＳＴＯＰ変異を有すると評価された被験者はＣＹＰ２Ｃ９酵素による解毒代謝を受ける薬物に対して感受性が高いものと判断され、その被験者に対する前記薬物の投与量を予め調節することが可能となる。これにより、前記被験者における前記薬物による副作用を低減することが可能となる。また、本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。 In the method for predicting or diagnosing detoxification and metabolism abnormality according to the present invention, a sample evaluated as having the F126STOP mutation in the CYP2C9 gene can be judged to be difficult to operate the detoxification metabolism mechanism by the CYP2C9 enzyme. Therefore, a subject evaluated to have the F126STOP mutation is judged to be highly sensitive to a drug that undergoes detoxification metabolism by the CYP2C9 enzyme, and the dose of the drug to the subject can be adjusted in advance. Thereby, it becomes possible to reduce the side effect by the said drug in the said test subject. Further, according to the present invention, it is possible to diagnose before birth and immediately after birth.
以上のような解毒代謝異常の予測または診断のために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる。本発明によるキットはさらに、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子におけるＦ１２６ＳＴＯＰ変異を検出するための具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。 In order to predict or diagnose the detoxification and metabolism abnormality as described above, necessary reagents can be combined into a kit. Thus, a kit according to the invention comprises a nucleic acid molecule according to the invention and / or a primer pair according to the invention. The kit according to the present invention may further contain reagents, reaction vessels, instructions, etc. depending on the specific method for detecting the F126STOP mutation in the CYP2C9 gene.
さらに、本発明によれば、ＣＹＰ２Ｃ９酵素の解毒代謝活性を増強する化合物のスクリーニング方法が提供される。該方法は、（ａ）本発明による変異型ポリヌクレオチドを発現する細胞を用意する工程、（ｂ）該細胞に被験化合物を接触させる工程、（ｃ）被験化合物を接触させた細胞におけるＣＹＰ２Ｃ９酵素活性を検出する工程、および（ｄ）被験化合物を接触させない細胞におけるＣＹＰ２Ｃ９酵素活性と比較して、工程（ｃ）で検出された活性を増加させる化合物を選択する工程、を含んでなる。 Furthermore, according to the present invention, a method for screening a compound that enhances the detoxifying metabolic activity of the CYP2C9 enzyme is provided. The method comprises (a) preparing a cell that expresses a mutant polynucleotide according to the present invention, (b) contacting the test compound with the cell, (c) CYP2C9 enzyme activity in the cell contacted with the test compound And (d) selecting a compound that increases the activity detected in step (c) as compared to the CYP2C9 enzyme activity in cells not contacted with the test compound.
本発明によるスクリーニング方法において用いられる細胞は特に制限されるものではないが、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ等に由来する細胞が挙げられる。また、前記細胞により発現される本発明による変異型ポリヌクレオチドは、内因性のポリヌクレオチドであってもよいし、あるいは、発現可能な形で該細胞に導入された外因性のポリヌクレオチドであってもよい。外因性の本発明によるポリヌクレオチドを発現する細胞は、例えば、該ポリヌクレオチドが挿入された発現ベクターを該細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。 The cells used in the screening method according to the present invention are not particularly limited, and examples thereof include cells derived from humans, monkeys, mice, rats, cows, pigs, dogs and the like. In addition, the mutant polynucleotide according to the present invention expressed by the cell may be an endogenous polynucleotide, or an exogenous polynucleotide introduced into the cell in an expressible form. Also good. A cell expressing an exogenous polynucleotide according to the present invention can be prepared, for example, by introducing an expression vector into which the polynucleotide is inserted into the cell. The expression vector can be prepared by general genetic engineering techniques.
被検化合物としては、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、およびペプチドなどの単一化合物、ならびに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。 Examples of test compounds include single compounds such as natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, and peptides, compound libraries, gene library expression products, cell extracts, cell culture supernatants, fermentations, and the like. Examples include microbial products, marine organism extracts, plant extracts, and the like.
前記細胞への被験化合物の接触は、例えば、該細胞の培養物に被験化合物を添加することによって行なうことができる。被験化合物がタンパク質の場合には、該タンパク質を発現するベクターを該細胞へ導入し、これを発現させることもできる。 The test compound can be contacted with the cells by, for example, adding the test compound to a culture of the cells. When the test compound is a protein, a vector that expresses the protein can be introduced into the cell and expressed.
ＣＹＰ２Ｃ９酵素の活性は、ＣＹＰ２Ｃ９酵素により解毒代謝される薬物、例えば、グリメピリド、フェニトイン、ワルファリン（Ｓ体）、ジクロフェナック等を酸化する活性を測定することにより検出することができる。例えば、ワルファリン（Ｓ体）は、ＣＹＰ２Ｃ９酵素により酸化されて７−ヒドロキシル化物に変換される。また、ジクロフェナックは、ＣＹＰ２Ｃ９酵素により酸化されて４’−ヒドロキシル化物に変換される。このような活性の測定方法については、例えば、Takahashi K.ら（Pharmacogenetics 10, 95-104, 2000）を参照することができる。 The activity of the CYP2C9 enzyme can be detected by measuring the activity of oxidizing drugs detoxified and metabolized by the CYP2C9 enzyme, such as glimepiride, phenytoin, warfarin (S form), diclofenac and the like. For example, warfarin (S form) is oxidized by the CYP2C9 enzyme and converted to a 7-hydroxylated product. Diclofenac is also oxidized by the CYP2C9 enzyme and converted to a 4'-hydroxylated product. For a method for measuring such activity, reference can be made to, for example, Takahashi K. et al. (Pharmacogenetics 10, 95-104, 2000).
本発明によるスクリーニング方法においては、測定されたＣＹＰ２Ｃ９活性が、被験化合物の非存在下において測定した場合の活性と比較して上昇した化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、糖尿病薬グリメピリド、抗てんかん薬フェニトイン、抗凝固薬ワルファリン（Ｓ体）、抗炎症薬ジクロフェナック、および降圧薬ロサルタン等の、ＣＹＰ２Ｃ９酵素により解毒代謝される治療薬を投与する際に併用することにより、それらの治療薬による副作用を抑制するのに有用である。 In the screening method according to the present invention, a compound in which the measured CYP2C9 activity is increased as compared with the activity measured in the absence of the test compound is selected. Compounds selected in this way include therapeutic agents that are detoxified and metabolized by the CYP2C9 enzyme, such as the antidiabetic drug glimepiride, the antiepileptic drug phenytoin, the anticoagulant warfarin (S form), the anti-inflammatory drug diclofenac, and the antihypertensive drug losartan. When used in combination, it is useful for suppressing side effects caused by these therapeutic agents.
本発明によるスクリーニング方法によって取得される化合物は、分子自体を被検者に投与することも可能であるが、一般的に公知の製剤学的方法により製剤化して投与することも可能である。化合物は、例えば、経口投与の場合には、錠剤、散剤、カプセル剤、懸濁液剤等とすることができ、経皮投与の場合には、ハップ剤等とすることができる。投与方法は、治療効果や予防効果を示し得る限り特に制限はなく、例えば、経口投与、経皮投与、注射による血中投与等が考えられる。これらの化合物がＤＮＡである場合には、該ＤＮＡを生体内に投与する際には、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター、リポソーム等の非ウイルスベクター、または剥き出しのＤＮＡの形態で利用することができる。ＤＮＡの投与方法としては、in vivo法およびex vivo法を例示することができる。 The compound obtained by the screening method according to the present invention can be administered to the subject of the molecule itself, but can also be formulated and administered by a generally known pharmaceutical method. For example, in the case of oral administration, the compound can be a tablet, powder, capsule, suspension, etc., and in the case of transdermal administration, it can be a haptic agent. The administration method is not particularly limited as long as it can exhibit a therapeutic effect and a preventive effect. For example, oral administration, transdermal administration, blood administration by injection, and the like can be considered. When these compounds are DNA, they are administered in vivo in the form of viral vectors such as retroviruses, adenoviruses, Sendai viruses, non-viral vectors such as liposomes, or bare DNA. Can be used. Examples of DNA administration methods include in vivo methods and ex vivo methods.
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
例１：ヒトゲノムＤＮＡ中のＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のエクソン配列の解析
ヒトＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のゲノム配列（ＮＣＢＩアクセス番号：ＮＴ＿０３００５９．１２）に基づき、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の全領域にわたる２つの領域をそれぞれ特異的に増幅するための２種類のプライマーペアを、以下のとおり設計した。
Example 1: Analysis of exon sequence of CYP2C9 gene in human genomic DNA Based on the genomic sequence of human CYP2C9 gene (NCBI access number: NT_030059.12.), To specifically amplify two regions over the entire region of CYP2C9 gene, respectively Two types of primer pairs were designed as follows.
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子全領域増幅用プライマーセット(Z-Taq Primer)：
（１）エクソン１からエクソン５までの領域を増幅するためのプライマーペア
CYP2C9ZF1：5'-CTATGAAGCTAATCAAGACAGTGTGC-3'（配列番号４）
CYP2C9ZR1：5'-GATGTTTACGCCTTATCTGATAGACAC-3'（配列番号５）
（２）エクソン６からエクソン９までの領域を増幅するためのプライマーペア
CYP2C9ZF2：5'-CTGTGTAGTTTCTCTAGCTATGGC-3'（配列番号６）
CYP2C9ZR2：5'-GATGTTCATGTACACCTGTATCC-3'（配列番号７）
CYP2C9 gene whole region amplification primer set (Z-Taq Primer):
(1) Primer pair for amplifying the region from exon 1 to exon 5
CYP2C9ZF1: 5'-CTATGAAGCTAATCAAGACAGTGTGC-3 '(SEQ ID NO: 4)
CYP2C9ZR1: 5'-GATGTTTACGCCTTATCTGATAGACAC-3 '(SEQ ID NO: 5)
(2) Primer pair for amplifying the region from exon 6 to exon 9
CYP2C9ZF2: 5'-CTGTGTAGTTTCTCTAGCTATGGC-3 '(SEQ ID NO: 6)
CYP2C9ZR2: 5'-GATGTTCATGTACACCTGTATCC-3 '(SEQ ID NO: 7)
まず、上記のプライマーペア（各０．２μＭ）とZ-Taq（1.25 units；Takara Shuzo, Kyoto, Japan）を用いて、６０人の日本人に由来するゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ）について、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の全長をＰＣＲにより増幅した。この際の反応液の全量は１００μｌとし、ＰＣＲの条件は、「９８℃で５秒間、５５℃で５秒間および７２℃で１９０秒間」を２５サイクルとした。 First, using the above primer pairs (each 0.2 μM) and Z-Taq (1.25 units; Takara Shuzo, Kyoto, Japan), the total length of the CYP2C9 gene was analyzed for genomic DNA (200 ng) derived from 60 Japanese. Was amplified by PCR. The total amount of the reaction solution at this time was 100 μl, and PCR conditions were 25 cycles of “98 ° C. for 5 seconds, 55 ° C. for 5 seconds and 72 ° C. for 190 seconds”.
次に、ヒトＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のゲノム配列（ＮＣＢＩアクセス番号：ＮＴ＿０３００５９．１２）に基づき、各エクソンを増幅するためのプライマーペアを、以下のとおり設計した。 Next, based on the genomic sequence of human CYP2C9 gene (NCBI access number: NT — 030059.12.), A primer pair for amplifying each exon was designed as follows.
エクソン増幅用プライマーセット（Ex-Taq Primer）：
（１）エクソン１を増幅するためのプライマーペア
2C9Ex1F2：5'-CTCCAACCAAGTACAGTGAA-3'（配列番号８）
2C9Ex1R1：5'-GAATCTAACATGCAAAGACCC-3'（配列番号９）
（２）エクソン２および３を増幅するためのプライマーペア
2C9Ex2-3F1：5'-GTAGAGACGTGGTATCACCTTG-3'（配列番号１０）
2C9Ex2-3R2：5'-GGTAATGGGAAAAACACTGCT-3'（配列番号１１）
（３）エクソン４を増幅するためのプライマーペア
2C9Ex4F3：5'-TTGGTTCCTCTCTACTGGTTC-3'（配列番号１２）
2C9Ex4R2：5'-GCAGAAAAAACATTGATGAGGGAG-3'（配列番号１３）
（４）エクソン５を増幅するためのプライマーペア
2C9Ex5F1：5'-CTGGTTAGAATTGATCCTCTG-3'（配列番号１４）
2C9Ex5R1：5'-GGTAGTTTATATTTCTGTGGGCTC-3'（配列番号１５）
（５）エクソン６を増幅するためのプライマーペア
2C9Ex6F2：5'-AAGAGCCTGATGAATGGAAT-3'（配列番号１６）
2C9Ex6R1：5'-ACTACAGATGGGATTTGGC-3'（配列番号１７）
（６）エクソン７を増幅するためのプライマーペア
2C9Ex7F1：5'-GACTTACCCATGCCCCTTTG-3'（配列番号１８）
2C9Ex7R2：5'-ATCTGGAGAACACACACTGC-3'（配列番号１９）
（７）エクソン８を増幅するためのプライマーペア
2C9Ex8F1：5'-GTTGCATCCAAGTATCCAAG-3'（配列番号２０）
2C9Ex8R1：5'-CCAACCTATATTTCAGCTTTCTC-3'（配列番号２１）
（８）エクソン９を増幅するためのプライマーペア
2C9Ex9F1：5'-CTCATCCATCCATTCATTCATG-3'（配列番号２２）
2C9Ex9R1：5'-CTCTAACACTCACCCAAAATAGC-3（配列番号２３）
Exon amplification primer set (Ex-Taq Primer):
(1) Primer pair for amplifying exon 1
2C9Ex1F2: 5'-CTCCAACCAAGTACAGTGAA-3 '(SEQ ID NO: 8)
2C9Ex1R1: 5'-GAATCTAACATGCAAAGACCC-3 '(SEQ ID NO: 9)
(2) Primer pair for amplifying exons 2 and 3
2C9Ex2-3F1: 5'-GTAGAGACGTGGTATCACCTTG-3 '(SEQ ID NO: 10)
2C9Ex2-3R2: 5'-GGTAATGGGAAAAACACTGCT-3 '(SEQ ID NO: 11)
(3) Primer pair for amplifying exon 4
2C9Ex4F3: 5'-TTGGTTCCTCTCTACTGGTTC-3 '(SEQ ID NO: 12)
2C9Ex4R2: 5'-GCAGAAAAAACATTGATGAGGGAG-3 '(SEQ ID NO: 13)
(4) Primer pair for amplifying exon 5
2C9Ex5F1: 5'-CTGGTTAGAATTGATCCTCTG-3 '(SEQ ID NO: 14)
2C9Ex5R1: 5'-GGTAGTTTATATTTCTGTGGGCTC-3 '(SEQ ID NO: 15)
(5) Primer pair for amplifying exon 6
2C9Ex6F2: 5'-AAGAGCCTGATGAATGGAAT-3 '(SEQ ID NO: 16)
2C9Ex6R1: 5'-ACTACAGATGGGATTTGGC-3 '(SEQ ID NO: 17)
(6) Primer pair for amplifying exon 7
2C9Ex7F1: 5'-GACTTACCCATGCCCCTTTG-3 '(SEQ ID NO: 18)
2C9Ex7R2: 5'-ATCTGGAGAACACACACTGC-3 '(SEQ ID NO: 19)
(7) Primer pair for amplifying exon 8
2C9Ex8F1: 5'-GTTGCATCCAAGTATCCAAG-3 '(SEQ ID NO: 20)
2C9Ex8R1: 5'-CCAACCTATATTTCAGCTTTCTC-3 '(SEQ ID NO: 21)
(8) Primer pair for amplifying exon 9
2C9Ex9F1: 5'-CTCATCCATCCATTCATTCATG-3 '(SEQ ID NO: 22)
2C9Ex9R1: 5'-CTCTAACACTCACCCAAAATAGC-3 (SEQ ID NO: 23)
上記のプライマーペア（各０．２μＭ）、Ex-Taq（0.625 units; Takara Shuzo, Kyoto, Japan）、およびＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の当該エクソンを含む上述の増幅産物（得られた反応液６μｌ）を用いて、各エクソンを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。この際の反応液の全量は５０μＬとした。また、ＰＣＲの条件は、９４℃で５分間処理した後、「９４℃で３０秒間、５５℃で１分間および７２℃で２分間」を３０サイクルとし、その後、７２℃で７分間処理した。その後、得られた各反応液の５μＬに、PCR Product Pre-Sequencing Kit（USB Co.,Cleveland, OH, USA）に含まれるExonuclease I（０．２μＬ）、Shrimp alkaline phosphatase（０．２μＬ）、および精製水（１．６μＬ）を添加し、これを３７℃で１５分間および８０℃で１５分間処理し、その後４℃に冷却した。 Using the above-mentioned amplification product (extracted reaction solution 6 μl) containing the above-mentioned primer pair (each 0.2 μM), Ex-Taq (0.625 units; Takara Shuzo, Kyoto, Japan), and the exon of the CYP2C9 gene, A DNA fragment containing each exon was amplified by PCR. The total amount of the reaction solution at this time was 50 μL. The PCR was performed at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 30 cycles of “94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 2 minutes”, and then treated at 72 ° C. for 7 minutes. Thereafter, 5 μL of each of the obtained reaction solutions was added to Exonuclease I (0.2 μL), Shrimp alkaline phosphatase (0.2 μL) contained in the PCR Product Pre-Sequencing Kit (USB Co., Cleveland, OH, USA), and Purified water (1.6 μL) was added and this was treated at 37 ° C. for 15 minutes and 80 ° C. for 15 minutes, then cooled to 4 ° C.
次に、ヒトＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のゲノム配列（ＮＣＢＩアクセス番号：ＮＴ＿０３００５９．１２）に基づき、各エクソンについてのシークエンス用のプライマーを、以下のとおり設計した。 Next, based on the genomic sequence of the human CYP2C9 gene (NCBI access number: NT — 030059.12.), Sequencing primers for each exon were designed as follows.
シークエンス用プライマーセット：
（１）エクソン１を配列決定するためのプライマーペア
2C9Ex1F1：5'-GGAATGTACAGAGTGGACAATG-3'（配列番号２４）
2C9Ex1R2：5'-GACCCAAATCTTTCTCTACT-3'（配列番号２５）
（２）エクソン２を配列決定するためのプライマーペア
2C9Ex2-3F2：5'-TCTTGAACTCCTGACCTTGT-3'（配列番号２６）
2C9Ex2R1：5'-GGAGCTCTGTAAGTCTCTGT-3'（配列番号２７）
（３）エクソン３を配列決定するためのプライマーペア
2C9Ex3F1：5'-AGGAGTTTTCTGGAAGAGG-3'（配列番号２８）
2C9Ex3R3s：5'-GGAAAAACACTGCTCTTTAACTC-3'（配列番号２９）
（353-362番目のアデニン塩基の欠失を確認するために使用）
（４）エクソン４を配列決定するためのプライマーペア
2C9Ex4F2：5'-CCTTTCCATCTCAGTGCCTT-3'（配列番号３０）
2C9Ex4R1：5'-GCCGTCTTTCCCAGATATTC-3'（配列番号３１）
（５）エクソン５を配列決定するためのプライマーペア
2C9Ex5F1：5'-CTGGTTAGAATTGATCCTCTG-3'（配列番号１４）
2C9Ex5R1：5'-GGTAGTTTATATTTCTGTGGGCTC-3'（配列番号１５）
（６）エクソン６を配列決定するためのプライマーペア
2C9Ex6F1：5'-GCATGGAATAAGGGAGTAGG-3'（配列番号３２）
2C9Ex6R1：5'-ACTACAGATGGGATTTGGC-3'（配列番号１７）
（７）エクソン７を配列決定するためのプライマーペア
2C9Ex7F2s：5'-CCATGCCCCTTTGTTATTTG-3'（配列番号３３）
2C9Ex7R1：5'-AACACACACTGCCAGACACTAG-3'（配列番号３４）
（８）エクソン８を配列決定するためのプライマーペア
2C9Ex8F1：5'-GTTGCATCCAAGTATCCAAG-3'（配列番号２０）
2C9Ex8R1：5'-CCAACCTATATTTCAGCTTTCTC-3'（配列番号２１）
（９）エクソン９を配列決定するためのプライマーペア（１）
2C9Ex9F1：5'-CTCATCCATCCATTCATTCATG-3'（配列番号２２）
2C9Ex9R1：5'-CTCTAACACTCACCCAAAATAGC-3（配列番号２３）
（１０）エクソン９を配列決定するためのプライマーペア（２）
2C9Ex9F2s：5'-CTGCAGCTCTCTTTCCTC-3'（配列番号３５）
2C9Ex9R2s：5'-CGAATGTTCACTAGATCTTCAG-3'（配列番号３６）
Sequence primer set:
(1) Primer pair for sequencing exon 1
2C9Ex1F1: 5′-GGAATGTACAGAGTGGACAATG-3 ′ (SEQ ID NO: 24)
2C9Ex1R2: 5'-GACCCAAATCTTTCTCTACT-3 '(SEQ ID NO: 25)
(2) Primer pair for sequencing exon 2
2C9Ex2-3F2: 5'-TCTTGAACTCCTGACCTTGT-3 '(SEQ ID NO: 26)
2C9Ex2R1: 5'-GGAGCTCTGTAAGTCTCTGT-3 '(SEQ ID NO: 27)
(3) Primer pair for sequencing exon 3
2C9Ex3F1: 5'-AGGAGTTTTCTGGAAGAGG-3 '(SEQ ID NO: 28)
2C9Ex3R3s: 5'-GGAAAAACACTGCTCTTTAACTC-3 '(SEQ ID NO: 29)
(Used to confirm deletion of the 353-362th adenine base)
(4) Primer pair for sequencing exon 4
2C9Ex4F2: 5'-CCTTTCCATCTCAGTGCCTT-3 '(SEQ ID NO: 30)
2C9Ex4R1: 5'-GCCGTCTTTCCCAGATATTC-3 '(SEQ ID NO: 31)
(5) Primer pair for sequencing exon 5
2C9Ex5F1: 5'-CTGGTTAGAATTGATCCTCTG-3 '(SEQ ID NO: 14)
2C9Ex5R1: 5'-GGTAGTTTATATTTCTGTGGGCTC-3 '(SEQ ID NO: 15)
(6) Primer pair for sequencing exon 6
2C9Ex6F1: 5'-GCATGGAATAAGGGAGTAGG-3 '(SEQ ID NO: 32)
2C9Ex6R1: 5'-ACTACAGATGGGATTTGGC-3 '(SEQ ID NO: 17)
(7) Primer pair for sequencing exon 7
2C9Ex7F2s: 5'-CCATGCCCCTTTGTTATTTG-3 '(SEQ ID NO: 33)
2C9Ex7R1: 5'-AACACACACTGCCAGACACTAG-3 '(SEQ ID NO: 34)
(8) Primer pair for sequencing exon 8
2C9Ex8F1: 5'-GTTGCATCCAAGTATCCAAG-3 '(SEQ ID NO: 20)
2C9Ex8R1: 5'-CCAACCTATATTTCAGCTTTCTC-3 '(SEQ ID NO: 21)
(9) Primer pair for sequencing exon 9 (1)
2C9Ex9F1: 5'-CTCATCCATCCATTCATTCATG-3 '(SEQ ID NO: 22)
2C9Ex9R1: 5'-CTCTAACACTCACCCAAAATAGC-3 (SEQ ID NO: 23)
(10) Primer pair for sequencing exon 9 (2)
2C9Ex9F2s: 5'-CTGCAGCTCTCTTTCCTC-3 '(SEQ ID NO: 35)
2C9Ex9R2s: 5'-CGAATGTTCACTAGATCTTCAG-3 '(SEQ ID NO: 36)
上述のＰＣＲにより得られた増幅産物の両鎖につき、上記の各プライマーを用いて、ABI BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（Version 3.1, Applied Biosystems, Foster City, CA）により直接塩基配列決定を行なった。すなわち、計７μＬのＰＣＲ増幅産物に、１μＭのプライマー（１．６μＬ）、BigDye（Ver.3.1）（２μＬ）、５×Sequencing buffer（３μＬ）、および精製水（６．４μＬ）を添加して合計２０μＬとし、「９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で４分間」を２５サイクル行い、その後、４℃に冷却した。過剰な色素をDyeEx96 plate（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて反応産物から除去し、全量２０μＬの溶出液を、ABI Prism 3730 DNA Analyzer（Applied Biosystems）を用いて分析した。その際、溶出液について、９４℃で２分間のヒートショックを行った。 For both strands of the amplification product obtained by the above-mentioned PCR, the base sequence was directly determined by the ABI BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Version 3.1, Applied Biosystems, Foster City, Calif.) Using the above-mentioned primers. That is, 1 μM primer (1.6 μL), BigDye (Ver.3.1) (2 μL), 5 × Sequencing buffer (3 μL), and purified water (6.4 μL) were added to a total of 7 μL of the PCR amplification product. The amount was 20 μL, and 25 cycles of “96 ° C. for 10 seconds, 50 ° C. for 5 seconds, 60 ° C. for 4 minutes” were performed, and then cooled to 4 ° C. Excess dye was removed from the reaction product using DyeEx96 plate (Qiagen, Hilden, Germany) and a total volume of 20 μL of eluate was analyzed using ABI Prism 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems). At that time, the eluate was subjected to heat shock at 94 ° C. for 2 minutes.
その結果、配列決定した６０例のゲノムＤＮＡのうちの１例から、配列番号１中の第３５３１〜３５４０残基（配列番号２中の第３５３〜３６２残基）の欠失が見出された。この１０ヌクレオチドの欠失によりフレームシフトが生じ、その結果、ＣＹＰ２Ｃ９タンパク質のアミノ酸配列中、第１１８残基からのアミノ酸が置換され、さらに第１２６番目のコドンが終止コドンとなるため、それ以降のアミノ酸残基が欠失する。ＣＹＰ２Ｃ９タンパク質は４９０個のアミノ酸からなるため、この１０ヌクレオチド欠失により、ＣＹＰ２Ｃ９タンパク質の約７４％のアミノ酸残基が欠失することとなる。特に、欠失するＣＹＰ２Ｃ９タンパク質の第１２６〜４９０アミノ酸残基には、酵素活性に必須の基質認識部位およびヘム結合部位が存在するため、上記の１０ヌクレオチド欠失によりＣＹＰ２Ｃ９タンパク質の機能は消失する。従って、上記１０ヌクレオチド欠失は、ＣＹＰ２Ｃ９酵素の基質となる薬物の濃度上昇を招くことから、該薬物による副作用を増強するものと考えられる。 As a result, a deletion of residues 3531 to 3540 in SEQ ID NO: 1 (residues 353 to 362 in SEQ ID NO: 2) was found in one of the 60 genomic DNAs that were sequenced. . This 10 nucleotide deletion causes a frame shift, and as a result, in the amino acid sequence of CYP2C9 protein, the amino acid from residue 118 is replaced, and the 126th codon is a stop codon. A residue is deleted. Since the CYP2C9 protein consists of 490 amino acids, this 10 nucleotide deletion results in the deletion of about 74% of the amino acid residues of the CYP2C9 protein. In particular, since the substrate recognition site and the heme binding site essential for enzyme activity are present at the 126th to 490th amino acid residues of the CYP2C9 protein to be deleted, the function of the CYP2C9 protein is lost by the 10 nucleotide deletion described above. Therefore, the 10 nucleotide deletion causes an increase in the concentration of the drug serving as a substrate for the CYP2C9 enzyme, and thus is considered to enhance the side effect of the drug.
Claims (11)
請求項２または３に記載のポリヌクレオチド、またはこれに相補的なポリヌクレオチドの、前記変異において変更される配列を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。 A nucleic acid molecule capable of detecting a mutation in the CYP2C9 gene wherein the 126th codon is a stop codon,
A nucleic acid molecule comprising a nucleotide fragment that hybridizes to a region comprising a sequence that is altered in the mutation of the polynucleotide of claim 2 or 3, or a polynucleotide complementary thereto .
請求項２または３に記載のポリヌクレオチドの、前記変異において変更される配列を含む領域を核酸増幅法において増幅しうる、プライマーペア。 A primer pair for detecting a mutation in the CYP2C9 gene in which the 126th codon is a stop codon,
The primer pair which can amplify the area | region containing the arrangement | sequence changed in the said mutation of the polynucleotide of Claim 2 or 3 in a nucleic acid amplification method.
請求項４または５に記載の核酸分子、および／または請求項７または８に記載のプライマーペアを用いて、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子における、第１２６番目のコドンが終止コドンとなる変異の有無を検出する工程を含んでなる、方法。 A method for predicting or detecting an abnormality in detoxification metabolism by a CYP2C9 enzyme by detecting a mutation in the CYP2C9 gene,
Using the nucleic acid molecule according to claim 4 and / or the primer pair according to claim 7 or 8 to detect the presence or absence of a mutation in which the 126th codon is a stop codon in the CYP2C9 gene. Comprising a method.
（ａ）請求項２または３に記載のポリヌクレオチドを発現する細胞を用意する工程、
（ｂ）該細胞に被験化合物を接触させる工程、
（ｃ）被験化合物を接触させた細胞におけるＣＹＰ２Ｃ９酵素活性を検出する工程、および
（ｄ）被験化合物を接触させない細胞におけるＣＹＰ２Ｃ９酵素活性と比較して、工程（ｃ）で検出された活性を増加させる化合物を選択する工程
を含んでなる、方法。 A method for screening a compound that enhances the detoxifying metabolic activity of a CYP2C9 enzyme, comprising:
(A) preparing a cell expressing the polynucleotide according to claim 2 or 3 ,
(B) contacting the cell with a test compound;
(C) detecting CYP2C9 enzyme activity in cells contacted with the test compound, and (d) increasing the activity detected in step (c) compared to CYP2C9 enzyme activity in cells not contacted with the test compound A method comprising selecting a compound.
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