JP4348456B2

JP4348456B2 - Variant polynucleotides and nucleic acid molecules that can be used for genetic diagnosis of susceptibility to glucocorticoid preparations

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Publication number: JP4348456B2
Application number: JP2003072338A
Authority: JP
Inventors: 田純一澤; 澤正吾小; 藤嘉朗齋; 川京子前; 藤博久斎; 島敏治中
Original assignee: National Institute of Health Sciences; National Institute of Biomedical Innovation NIBIO
Current assignee: National Institute of Health Sciences; National Institute of Biomedical Innovation NIBIO
Priority date: 2003-03-17
Filing date: 2003-03-17
Publication date: 2009-10-21
Anticipated expiration: 2023-03-17
Also published as: JP2004275101A

Description

【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、グルココルチコイド製剤への感受性の遺伝子診断に用いることができる変異型ポリヌクレオチドおよび核酸分子に関する。
【０００２】
背景技術
グルココルチコイド受容体（ＧＲ）は、グルココルチコイドにより活性化される転写因子であり、様々な遺伝子の発現を調節する。ヒトＧＲα（ｈＧＲα）は、エクソン９αを含む計９個のエクソンによりコードされる（Encio I.J. and Detera-Wadleigh S.D., J. Biol. Chem. 266, 7182-7188, 1991）。ＧＲβは、エクソン９αに代えてエクソン９βを有する選択的スプライシング型であり、グルココルチコイド耐性のヒト多発性骨髄腫細胞において同定されており、機能を持たないｈＧＲαである（Moalli P.A. et al., Cancer Res. 53, 3877-3879, 1993）。７７７個のアミノ酸を有するｈＧＲαは、ＤＮＡ結合ドメイン（第４２１〜４８６番アミノ酸）、リガンド結合ドメイン（第５２８〜７２０番アミノ酸）、ホモ二量体化ドメイン（第４５６〜７７７番アミノ酸）、Ｈｓｐ９０結合ドメイン（第５６８〜６５３番アミノ酸）、核内移行ドメイン（第４７９〜５０６番アミノ酸および第５２６〜７７７番アミノ酸）、トランス活性化ドメイン（第７７〜２６２番アミノ酸、第４０４〜４９１番アミノ酸および第５２６〜５５６番アミノ酸）等の多くの機能性ドメインを有する（Savory J.G., Mol. Cell. Biol. 19, 1025-1037, 1999; Vottero A. and Chrousos G.P., Trends Endocrinol. Metab. 10, 333-338, 1999）。サイトゾル中では、ＧＲは熱ショックタンパク質その他のタンパク質に会合しており（Pratt W.B. and Toft D.O., Endocr. Rev. 18, 306-360, 1997）、グルココルチコイドの結合によりＧＲの核内移行が起きる（Webster J.C. and Cidlowski J.A., Trends Endocrinol. Metab. 10, 396-402, 1999）。
【０００３】
グルココルチコイド療法は、多くの炎症性疾患およびいくつかのタイプの癌において有効である。しかし、少数の患者は臨床的有効量のグルココルチコイドに対して応答せず、この状態はグルココルチコイド耐性と呼ばれる（Loke T.K. et al., Curr. Allergy Asthma Rep. 2, 144-150, 2002）。ＧＲ遺伝子におけるいくつかの家族性変異は、コルチコステロイド耐性または造血系腫瘍と関連することが示されているが、これらの変異は比較的頻度が小さく、耐性の一般的な原因とは考えられていない（DeRijk R.H. et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 81, 103-122, 2002）。
【０００４】
近年、ＧＲ遺伝子における複数の一塩基多型（ＳＮＰ）が同定されており、そのうちのいくつかは比較的頻度が高い。例えば、Ｃｙｓ６４３Ａｒｇ置換またはＣ末端部の遺伝子配列へのアデニンの挿入により、グルココルチコイド受容体の機能が消失することが報告されている（非特許文献１：Nagano M. et al., Cancer Lett. 181, 109-114, 2002）。また、Ｉｌｅ５５９Ａｓｎ、Ｉｌｅ７４７ＭｅｔおよびＡｒｇ４７７Ｈｉｓのアミノ酸置換を起こすそれぞれの一塩基多型により、グルココルチコイド受容体の機能が低下し、または消失することが報告されている（非特許文献２：Kino T. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86, 5600-5608, 2002；非特許文献３：Vottero A. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 87, 2658-2667, 2002；非特許文献４：Ruiz M. et al., Clin. Endocrinol. 55, 363-371, 2001）。さらに、ＢｃｌＩ制限断片長多型は、ステロイド剤への感受性に関連することが報告されている（非特許文献５：Panarelli M. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 83, 1846-1852, 1998）。
【０００５】
【非特許文献１】
Nagano M. et al., Cancer Lett. 181, 109-114, 2002
【非特許文献２】
Kino T. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86, 5600-5608, 2002
【非特許文献３】
Vottero A. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 87, 2658-2667, 2002
【非特許文献４】
Ruiz M. et al., Clin. Endocrinol. 55, 363-371, 2001
【非特許文献５】
Panarelli M. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 83, 1846-1852, 1998
【０００６】
【発明の概要】
本発明者らは、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）遺伝子において、ＧＲタンパク質の第６５１番目のセリン残基をコードするコドンがフェニルアラニン残基をコードするコドンとなり、ＧＲの機能が低減する遺伝子変異を見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００７】
上記の変異を有するヒトにおいては、ＧＲタンパク質の発現量が減少し、その機能である転写活性化能も同様に低下するため、ＧＲに作用するグルココルチコイド製剤の効果が発揮されにくい。
【０００８】
従って、本発明は、グルココルチコイド製剤への感受性の遺伝子診断に用いることができる変異型ポリヌクレオチドおよび変異型タンパク質ならびに核酸分子の提供を目的とする。
【０００９】
そして、本発明による変異型ポリヌクレオチドは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質において、第６５１番目のセリン残基のフェニルアラニン残基への変異を有してなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００１０】
さらに、本発明による変異型タンパク質は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質において、第６５１番目のセリン残基のフェニルアラニン残基への変異を有してなるタンパク質である。
【００１１】
さらに、本発明による核酸分子は、グルココルチコイド受容体遺伝子における、グルココルチコイド受容体タンパク質の第６５１番目のセリン残基をコードするコドンがフェニルアラニン残基をコードするコドンとなる変異を検出しうる核酸分子であって、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子である。
【００１２】
【発明の具体的説明】
本発明により検出されるグルココルチコイド受容体（ＧＲ）遺伝子中の変異は、ＧＲタンパク質の第６５１番目のセリン残基をコードするコドンがフェニルアラニン残基をコードするコドンとなるもの（本発明において「Ｓ６５１Ｆ変異」という）である。このような変異としては、例えば、翻訳開始コドンから数えて第１９５２番目（配列番号１中の第１９５２番目）のシトシン（Ｃ）残基のチミン（Ｔ）残基への変異（本発明において「１９５２Ｃ＞Ｔ」という）が挙げられる。Ｓ６５１Ｆ変異により、ＧＲタンパク質の発現量が減少し、その機能である転写活性化能も同様に低下するため、ＧＲに作用するグルココルチコイド製剤の効果が発揮されにくい。従って、Ｓ６５１Ｆ変異を検出することにより、グルココルチコイド製剤への感受性の判定が可能となる。特に、このような製剤の投与前に、ＧＲ遺伝子上のＳ６５１Ｆ変異を検出することにより、該製剤が奏効しにくいヒトを見出すことが可能となる。
【００１３】
本発明において、「グルココルチコイド製剤」とは、グルココルチコイドを有効成分として含む医薬組成物を意味する。グルココルチコイド製剤は、炎症抑制、白血病細胞死等の薬理作用を有し、抗炎症剤や抗ガン剤として用いられる。該製剤の作用機序は、まず、細胞質にあるＧＲに結合し、次いで、グルココルチコイド製剤が結合したＧＲが遺伝子の上流領域または他の転写因子タンパク質に結合するというものである。これにより、遺伝子群の転写活性化または転写の抑制が起こり、薬理作用がもたらされる。
【００１４】
本発明において、「グルココルチコイド製剤に対して耐性である」とは、被検者においてグルココルチコイド製剤の薬理効果が見られない、もしくは抑制された状態をいう。本発明において「抑制」とは、完全な抑制に限定されず、対照（例えば、健常人）と比較して抑制されていれば、上記「抑制」の意味に解される。例えば、ある被検者についてグルココルチコイド製剤に対して耐性であると判定された場合には、該被検者へのグルココルチコイド製剤の投与による治療効果は見られない、もしくは低いものと予想することができる。本発明によって得られた被検者についてのグルココルチコイド製剤の有効性に関する情報によって、該被検者に対する治療方針等を適宜決定することが可能である。
【００１５】
変異型ポリヌクレオチドおよび変異型タンパク質
Ｓ６５１Ｆ変異を検出するためには、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質において、第６５１番目のセリン残基のフェニルアラニン残基への変異を有してなるタンパク質、ならびにこれをコードするポリヌクレオチドを標的とすることができる。すなわち、このような変異型タンパク質または変異型ポリヌクレオチドの存在を確認することにより、Ｓ６５１Ｆ変異を検出することができる。
【００１６】
Ｓ６５１Ｆ変異を検出する際には、ゲノム中の上記変異型ポリヌクレオチドを標的とすることができる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、検出の標的となる変異型ポリヌクレオチドは、ヒトＧＲ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第６５１番目のセリン残基をコードするコドンのフェニルアラニン残基をコードするコドンへの変異を有してなるポリヌクレオチドとされる。ヒトＧＲ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質を発現しうる限り、特に限定されないが、好ましくは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列中のチミン（Ｔ）残基がウラシル（Ｕ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるｍＲＮＡを生体内において生産しうるヌクレオチド配列とされ、例えば、ＮＣＢＩデータベースに登録番号ＡＣ００４７８２として登録されているゲノム配列中のＧＲ遺伝子配列が挙げられる。ＧＲ遺伝子の両末端部位は当業者にとって明らかであるが、好ましくはＧＲ遺伝子の全エクソンを含むものとする。
【００１７】
また、Ｓ６５１Ｆ変異を検出する際に、ゲノムにおける上記変異型ポリヌクレオチドの転写産物であるｍＲＮＡに対して生成させたｃＤＮＡを標的とすることもできる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、検出の標的となる変異型ポリヌクレオチドは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において、第１９５２番目のシトシン（Ｃ）残基がチミン（Ｔ）残基に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００１８】
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても、相補鎖がハイブリダイズした二本鎖であってもよい。
【００１９】
本発明による変異型タンパク質および変異型ポリヌクレオチドは、既述の通り、Ｓ６５１Ｆ変異を検出する際の標的として有用であるが、さらには、該変異を有するグルココルチコイド受容体を活性化する化合物をスクリーニングするためにも有用である。
【００２０】
核酸分子およびこれを用いた薬物感受性予知／検出方法
本発明による核酸分子は、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異を検出しうるものであり、該核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる。
【００２１】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子が通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。また、あるヌクレオチド分子にハイブリダイズする核酸分子は、特異的なハイブリダイズが可能であれば、そのヌクレオチド分子に対して完全に相補的である必要はないが、好ましくは、そのヌクレオチド分子に相補的なヌクレオチド分子の全部または一部の配列を含んでなるものとする。
【００２２】
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はＤＮＡである。
【００２３】
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、検出の標的をゲノムとする場合には、本発明による核酸分子は、エクソンにハイブリダイズする部分だけでなく、イントロンにハイブリダイズする部分をも含むことができ、あるいは、これらのどちらか一方のみにより構成されていてもよい。
【００２４】
本発明による核酸分子は、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異の検出において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、配列番号２中の第６５１番目のセリン残基に対応する部分を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。該核酸プローブは、市販のオリゴヌクレオチド合成機等を用いて合成オリゴヌクレオチドとして作製してもよいし、あるいは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製してもよい。
【００２５】
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１５ヌクレオチド以上とすることが好ましく、また、１００ヌクレオチド以下、より好ましくは５０ヌクレオチド以下とすることが好ましい。
【００２６】
さらに、本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、該核酸分子を適宜標識することが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を^３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして^３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）が挙げられる。
【００２７】
また、本発明による核酸分子は、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異の検出において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、配列番号２中の第６５１番目のセリン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【００２８】
本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１５〜１００ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは１７〜３０ヌクレオチドとする。
【００２９】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子の鎖長は、１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、さらに好ましくは１８〜５０ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する本発明による核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料から上記Ｓ６５１Ｆ変異を検出する上で好ましいものである。
【００３０】
核酸増幅法は、通常、プライマーのペアを用いて実施される。従って、本発明によれば、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異を検出するためのプライマーペアであって、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、配列番号２中の第６５１番目のセリン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅しうるプライマーペアが提供される。このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【００３１】
本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることにより、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異の有無を検出することができ、これにより、グルココルチコイド製剤への感受性を判定することができる。
【００３２】
具体的には、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアは、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異を検出するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができ、より具体的には、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、配列番号２中の第６５１番目のセリン残基に対応する部分を含む領域を増幅するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて、被検者由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中においてＳ６５１Ｆ変異を検出する工程を含んでなる、グルココルチコイド製剤への感受性判定方法が提供される。
【００３３】
この方法による薬物感受性判定に当たっては、例えば、被験者から末梢血白血球、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞、涙、唾液、尿、糞便または毛髪などの試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異を検出することができる。核酸増幅法およびこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としては、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とする場合には通常のＰＣＲ法等を用いることができ、ｍＲＮＡを鋳型とする場合には、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法等を用いることができる。
【００３４】
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。
【００３５】
上記の核酸増幅法とダイレクトシークエンス法とによりＳ６５１Ｆ変異を検出する場合には、例えば、以下の配列を有するプライマー：
フォワード：5'-TTTTTGGGGGGAAGTAGCAG-3'（配列番号１９）；
リバース：5'-AACAGAGATCCCTATGCAGC-3'（配列番号２０）、
を用いて核酸増幅法を行ない、これらのプライマーをシークエンスプライマーとしてダイレクトシークエンス法を行なうことができる。
【００３６】
また、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異において、この変異により特定の制限酵素による認識配列が失われるかまたは生成する場合には、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用する方法、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いて上記の変異を検出することができる。このような方法は、例えば、上述の核酸増幅法において前記制限酵素認識配列を包含する領域を増幅するようなプライマーペアを用い、得られた増幅断片をこの制限酵素で消化した後、得られる断片の数およびそれらの鎖長を調べることにより実施することができる。このような方法は当技術分野において周知であり、当業者であれば、適切な制限酵素、プライマー、増幅反応条件、制限酵素反応条件等を適宜設定することができる。
【００３７】
さらに、上述のような核酸増幅法によって得られた増幅断片につき、その増幅断片中に何らかの変異が存在するか否かを簡便な方法により調べ、変異を有すると判断されたサンプルについてのみ、Ｓ６５１Ｆ変異の検出を行なうこともできる。
【００３８】
上記の簡便法としては、例えば、一本鎖高次構造多型（single-strand conformation polymorphism）を利用した方法（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法：Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313-1318.、Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling.、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275-282）が挙げられる。この方法では、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させ、次いで、この一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、そのゲル上での移動度を、変異を有しない対照サンプルの移動度と比較する。この方法において増幅するＤＮＡ断片の鎖長は２００〜４００ｂｐとすることが好ましい。
【００３９】
上記の簡便法としては、また、変性剤濃度勾配ゲル法（denaturant gradient gel electrophoresis：ＤＧＧＥ法）を用いることもできる。この方法では、増幅したＤＮＡをＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離し、そのゲル上での移動度を、変異を有しない対照サンプルの移動度と比較する。このような方法は当技術分野において公知であり、当業者であれば適切に実施することができる。
【００４０】
本発明による薬物感受性判定法においては、アレル特異的ＰＣＲ法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、プライマーの一方を変異部位に対合できるように設計し、他方を変異部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に変異が存在する場合には増幅産物が得られ、変異が存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより変異の有無を判定することができる。
【００４１】
本発明による核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等による変異の検出にプローブとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子と被検者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、グルココルチコイド製剤への感受性判定方法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異の存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。
【００４２】
この方法による薬物感受性判定に当たっては、例えば、被検者から末梢血白血球、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞、涙、唾液、尿、糞便または毛髪などの試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異を検出することができる。核酸試料は必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)を参照することができる。
【００４３】
本発明による核酸分子をハイブリダイゼーション法による変異の検出においてプローブとして用いる場合、本発明による核酸分子を基板上に固定したＤＮＡチップを作製し、このＤＮＡチップと被験者由来の核酸試料とをハイブリダイゼーション条件下で接触させ、ハイブリダイゼーションの有無を検出してもよい。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子を基板上に固定してなる、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異を検出しうるＤＮＡチップ、さらには、このＤＮＡチップを用いてＳ６５１Ｆ変異を検出する工程を含んでなる、グルココルチコイド製剤への感受性を判定する方法が提供される。本発明において基板に結合させるプローブの鎖長は特に制限されないが、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは１５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１７〜２５ヌクレオチドとする。このようなＤＮＡチップを用いて変異を検出する技術は当技術分野において周知であり（ポストシークエンスのゲノム科学、第１巻「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１２８−１３５、２０００年）、当業者であれば、本発明による核酸分子を用いて適切なＤＮＡチップを作製し、このＤＮＡチップを用いてＳ６５１Ｆ変異を検出することができる。
【００４４】
ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異を検出する場合には、また、本発明による核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。この方法は、Ｓ６５１Ｆ変異が一塩基多型である場合において特に好ましい。このような一塩基多型としては、例えば、１９５２Ｃ＞Ｔが挙げられる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、ＳＮａＰｓｈｏｔ^ＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法として知られる方法が用いられる。
【００４５】
ＳＮａＰｓｈｏｔ^ＴＭ法においては、一塩基多型の部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその３’末端に付加するヌクレオチドが前記一塩基多型の部位に相補的なものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被検者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴＰ）を用いることにより、伸長反応は、上記の多型部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、多型部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４６】
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（Ahmadian A et al., Anal. Biochem. vol. 280, pp103-110, (2000)）においては、被検者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、４種のｄＮＴＰを１種ずつ反応させる。ｄＮＴＰのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）が遊離し、遊離したＰＰｉはスルフリラーゼと反応してＡＴＰを生成させ、このＡＴＰによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のｄＮＴＰを加えたときに発光が起こった場合には、そのｄＮＴＰに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、ｄＮＴＰが用いられるため、ＳＮａＰｓｈｏｔ^ＴＭ法で用いられるような多型部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４７】
ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異が上述のような一塩基多型である場合には、さらに、本発明による核酸分子をプローブおよび／またはプライマーとして使用する遺伝子型決定法（タイピング法）を用いてその変異を検出することもできる。遺伝子型決定法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプローブおよび／またはプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記の遺伝子型決定法としては、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法として知られる方法が用いられる。
【００４８】
ＴａｑＭａｎＰＣＲ法（Livak KJ. Genet. Anal. vol.14, pp143-149, (1999)）において、例えば、１９５２Ｃ＞Ｔ変異を検出する場合には、多型部位のヌクレオチドを含む領域に対して、ＣアレルおよびＴアレルのそれぞれに特異的にハイブリダイズする２種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付され、さらに３’末端がリン酸化されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、被検者由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲ用プライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができる。また、２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれのクエンチャーとともに当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはＦＡＭとＶＩＣの組合せを用いる。このＰＣＲ反応においては、まず、各アレルにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。従って、この方法によれば、各アレルの存在量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、被検者の遺伝子型（Ｃ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、またはＴ／Ｔ）が容易に決定される。
【００４９】
ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異の検出に用いることのできる他の方法としては、質量分析法による方法（Griffin TJ and Smith LM, Trends Biotechnol. vol. 18, pp77-84, (2000)）、Ｉｎｖａｄｅｒ法（Lyamichev V et al., Nat. B iotechnol. vol. 17, pp292-296, (1999)；「遺伝子医学」vol.4, No.1, メディカルドゥ社発行、pp44-51およびpp68-72 (2000)）が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、遺伝子の変異を検出しうる方法であれば、いかなる方法を用いることもできる。
【００５０】
本発明による薬物感受性判定法において、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異が存在すると評価されたサンプルは、グルココルチコイド製剤に対して耐性であると、すなわち、該製剤が奏効しにくいものと判断することができる。また、本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。
【００５１】
以上のような薬物への感受性の判定のために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる。本発明によるキットはさらに、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異を検出するための具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【００５２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【００５３】
例１：グルココルチコイド受容体（ＧＲ）の機能に対するＧＲ遺伝子中の変異の影響
（１）材料および方法
（i）ＧＲ遺伝子のＤＮＡ供給源および配列決定
本研究において採用する８８名の被検者は、ステロイド薬の投与を受けた日本人のアレルギー患者とした。これらの被検者から採取した末梢血リンパ球を、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスを用いて不朽化した。不朽化されたリンパ球から、ゲノムＤＮＡを抽出した。なお、この研究は、国立成育医療センター（日本国）および国立医薬品食品衛生研究所（日本国）の倫理審査委員会による承認を得て行なった。また、上記の全被検者からインフォームドコンセントを書面で得た。
【００５４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびコード領域の配列決定のためのプライマーは、ＮＣＢＩデータベースから得たヌクレオチド配列（Ｍ７８５０６、Ｍ７８５０７、Ｕ７８５０８、ＡＣ００４７８２）に基づいて設計した。本研究に使用した全てのプライマー（配列番号３〜２６）を、下記の表１に示す。表１に記載されたプライマーの名称において、「ＧＲＥＸ」に続く数字は増幅の対象とするエクソンの番号を示し、この数字に続く「Ｆ」および「Ｒ」はそれぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーを意味する。
【００５５】
【表１】

【００５６】
ＰＣＲおよび配列決定は次のようにして行なった。まず、ＧＲ遺伝子を３分割して増幅するためのプライマーセットとZ-Taq（TaKaRa社、京都、日本）を用いて、ゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）からＧＲ遺伝子を増幅した。ここで、プライマーセットとしては以下のものを用いた。また、このＰＣＲの条件は、９８℃で５秒間、５５℃で５秒間および７２℃で１９０秒間の反応を３０サイクルとした。
【００５７】
（ａ）エクソン２〜３増幅用プライマー：
フォワード：ATTGGGAACTCTGTGAAATCATAA（配列番号２７）、
リバース：AATCTCTGTACCTTGTCATTGTTA（配列番号２８）；
（ｂ）エクソン３〜７増幅用プライマー：
フォワード：GAGAACTGTATTTTGATATTCCTT（配列番号２９）、
リバース：AGAATCACACAGTATGTAGCCC（配列番号３０）；
（ｃ）エクソン７〜９β増幅用プライマー：
フォワード：GACTTCAGAATCATAAGCAAGA（配列番号３１）、
リバース：CTTGTGGAAAAAAAGGTACTCA（配列番号３２）。
【００５８】
次に、各エクソンをそれぞれ表１に記載のプライマーセットを用いて増幅した。ＤＮＡポリメラーゼとしてはEx-Taqポリメラーゼ（TaKaRa社、京都、日本）を使用した。まず、９５℃で５分の熱変性を行ない、その後、９５℃で３０秒、５５℃で１分および７２℃で２分の反応を３０サイクル行ない、さらに７２℃で７分の最終反応を１回行なった。その後、ＰＣＲ産物を、ABI Prism 3700 DNA分析装置(Applied Biosystems社、CA、米国)を使用するABI BigDye Terminater Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems社、CA、米国)を用いて直接配列決定した。
【００５９】
（ii）プラスミド
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC、VA、米国)から入手したpRShGRαは、ヒトＧＲαの完全長コード領域および構成的に活性のあるラウス肉腫ウイルスプロモーターを含んでいる（V. Giguere, S. M. Hollenberg, M. G. Rosenfeld, R. M. Evans, Functional domains of the human glucocorticoid receptor. Cell 46 (1986) 645-652）。Ｔ５０４Ｓ変異型ＧＲおよびＳ６５１Ｆ変異型ＧＲのそれぞれをコードする発現プラスミドは、野生型pRShGRαプラスミドを鋳型とし、QuickChange位置指定突然変異導入キット（Stratagene社、CA、米国）を用いて構築した。対照として用いるエンプティーベクタープラスミドは、pRShGRαプラスミドからhGRαのｃＤＮＡを除去することにより構築した。Renilla（ウミシイタケ）ルシフェラーゼをコードするphRL-TK（Promega社、WI、米国）を、同時トランスフェクションによるトランスフェクション効率の標準化に用いた。phRL-TKを用いることにより得られるトランスフェクション効率は一貫していた（エンプティーベクターの９２〜１０３％）。
【００６０】
（iii）細胞培養
ＧＲ発現プラスミドをトランスフェクトする細胞としては、内因性ＧＲレベルが非常に低いという理由で、アフリカミドリザルの腎細胞株であるＣＯＳ−７細胞を用いた。ＣＯＳ−７細胞は、厚生労働省研究資源バンク（ＪＣＲＢ）(東京、日本)から入手した。この細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、５％ＣＯ_２大気下、３７℃で増殖させた。デキサメタゾン処理用には、この細胞を、チャコールデキストラン処理済のＦＢＳ（１０％）を補充したＤＭＥＭ中で培養した。
【００６１】
（iv）ノーザンブロット分析
ＣＯＳ−７細胞（1.6×10⁶細胞）を、PolyFect Transfection試薬（Qiagen）を用いて、野生型ＧＲまたは変異型ＧＲの発現プラスミド３．５μｇとphRL-TKプラスミド０．５μｇとで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収し、RNeasyキット（Qiagen）を用いて全ＲＮＡを抽出した。５μｇの各全ＲＮＡサンプルを電気泳動し、ナイロン膜（GeneScreen Plus, NEN Life Science Products Inc., MA、米国）に転写し、文献（Brown T. and Mackey K., Analysis of RNA by Northern and slot blot hybridization. In Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Wiley and Sons Inc., supple. 37, unit 4.9, 1997）の記載に従って、^３２Ｐ標識したｈＧＲαまたはサル由来グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ｈＧＲαのｃＤＮＡは、pRShGRαプラスミドをＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化することにより作製した。サルＧＡＰＤＨのｃＤＮＡは、サルＧＡＰＤＨ特異的プライマーペアと鋳型としてのＣＯＳ−７細胞からの全ＲＮＡを用いる逆転写ＰＣＲにより作製した。ハイブリダイゼーションシグナルは、Bioimage Analyzer BAS-1500（富士写真フイルム、東京、日本）を用いて分析した。
【００６２】
（v）ウェスタンブロット分析
同時トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞（1.6×10⁶細胞）を上述のように作製し、その細胞ペレットをタンパク質サンプル緩衝液中で煮沸した。全細胞タンパク質を、６％ＳＤＳ−ポロアクリルアミドゲル(Tefuco社、東京、日本)上で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜(Bio-Rad社、CA、米国)上に転写した。この膜を、５％脱脂乳でブロッキングし、一次抗体としてポリクローナルウサギ抗ヒトＧＲ抗体（Santa Cruz Biotechnology社、CA、米国）とともにインキュベートし、次いで、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗ウサギIgG抗体（Amersham Pharmacia Biotech、英国）とともにインキュベートした。ＧＲタンパク質を、WestFemto最大感度基質（Pierce Biotechnology社、IL、米国）を用いて、その説明書に従って可視化した。これらのシグナルは、密度分析により評価した。
【００６３】
（vi）ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＣＯＳ−７細胞（1.4×10⁵細胞）を、野生型ＧＲ発現プラスミドpRShGRαまたは変異型ＧＲ発現プラスミド０．３μｇと、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター−ルシフェラーゼレポーター構築物（pHH-Luc）（ATCC、VA、米国、その配列はＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＦ０９３６８６に登録されている）０．６μｇおよび内部対照としてのphRL-TKプラスミド０．６μｇとで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、これらの細胞をビークル（メタノール）または様々な濃度のデキサメタゾンで処理し、さらに２４時間培養した。これらの細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、PicaGene Dual SeaPansy Luminescence Kit（Nippongene社、東京、日本）を用いて細胞溶解物を調製した。その後、ルシフェラーゼ活性を、VICTOR² Multilabel Counter（Wallac社、Turku、フィンランド）を用いて測定した。全てのトランスフェクション効率は、Renillaルシフェラーゼ活性に従って標準化した。
【００６４】
（vii）免疫細胞学的分析
ＣＯＳ−７細胞（1.6×10⁶細胞）を、野生型ＧＲまたは変異型ＧＲの発現プラスミド４μｇでトランスフェクトし、４８時間培養した。これらの細胞を、ビークルまたは１００ｎＭデキサメタゾンで９０分間処理した。トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで、室温下にて１５分間固定化し、０．５％トリトンＸ−１００で１５分間透過化処理した。固定化された細胞を、１０％ヤギ血清を含有するＰＢＳとのインキュベーションによりブロッキングし、同時に、１００ｎｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Santa Cruz Biotechnology社）で、室温下にて３０分間処理し、次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄した。これらの細胞を、１０％ヤギ血清を含有するＰＢＳで希釈したウサギポリクローナル抗ＧＲ抗体（Santa Cruz Biotechnology社）とともに、４℃で一晩インキュベートした。これらの細胞を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで５回洗浄し、１０％ヤギ血清を含有するＰＢＳで希釈した、Ａｌｅｘ５９４に結合させた抗ウサギIgG抗体（FUNAKOSHI社、東京、日本）とともに、室温下にて１時間インキュベートした。免疫反応したＧＲおよびＤＡＰＩで染色した核を、蛍光顕微鏡下で可視化した。
【００６５】
（viii）統計学的解析
ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析およびレポーターアッセイの結果を、StatViewソフトウエア（SAS Institute社、NC、米国）を用いるＯｎｅ−ｗａｙＡＮＯＶＡ、さらにはフィッシャーのＰＬＳＤ法により、統計学的有意差について評価した。
【００６６】
（２）結果
（i）ＧＲ遺伝子中に見出された２種の遺伝子変異
８８人の日本人被検者についてＧＲ遺伝子のコード領域を配列決定した結果、アミノ酸置換を伴う２つのヘテロ接合性一塩基変異が見出された。一つは第１５１０ヌクレオチドにおけるアデニン（Ａ）からチミン（Ｔ）への置換であり、これは第５０４アミノ酸におけるトレオニン（Ｔｈｒ）からセリン（Ｓｅｒ）へのアミノ酸置換を伴う（１５１０Ａ＞Ｔ；Ｔ５０４Ｓ）。もう一つは第１９５２ヌクレオチドにおけるシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換であり、これは第６５１アミノ酸におけるセリン（Ｓｅｒ）からフェニルアラニン（Ｐｈｅ）へのアミノ酸置換を伴う（１９５２Ｃ＞Ｔ；Ｓ６５１Ｆ）。なお、ヌクレオチドおよびアミノ酸の位置を示す上記の数字は、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＣ００４７８２に登録されている配列に従うものである。
【００６７】
（ii）トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞における変異型ＧＲｍＲＮＡの発現
変異型ＧＲｍＲＮＡの発現レベルを調べるために行なったノーザンブロット分析の結果を図１に示す。図１において、上方のパネルは、ｈＧＲαｃＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションシグナルを示し、下方のパネルは、ＲＮＡの定量の際の補正に用いるための、内因性ＧＡＰＤＨとＧＡＰＤＨｃＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションシグナルを示す。この分析から、野生型ＧＲのｍＲＮＡ発現レベルを１００とした場合のＴ５０４Ｓ変異体およびＳ６５１Ｆ変異体のｍＲＮＡ発現レベルは、それぞれ１１３．７±１２．２および８５．９±５．５と推定され、これらの２種の変異体の間に有意差は認められなかった。
【００６８】
（iii）全細胞溶解物における変異型ＧＲタンパク質の発現レベル
変異型ＧＲタンパク質の発現レベルを定量するために行なったウェスタンブロット分析の結果を図２に示す。この分析から、野生型ＧＲのタンパク質発現レベルを１００とした場合のＴ５０４Ｓ変異体およびＳ６５１Ｆ変異体のタンパク質発現レベルは、それぞれ９０．２±１５．１および６５．６±４．３と推定された。野生型ＧＲとＴ５０４Ｓ変異型ＧＲとの間では、タンパク質発現レベルにおける有意差は認められなかった。他方で、Ｓ６５１Ｆ変異型ＧＲのタンパク質発現レベルは、野生型ＧＲと比較して有意に減少していた（Ｐ＜０．０５）。上述のノーザンブロット分析において有意差が見られなかったことを考慮すると、Ｓ６５１Ｆ変異型ＧＲのタンパク質発現レベルの減少は、タンパク質の不安定性またはＣＯＳ−７細胞における不十分な翻訳に起因するものと考えられる。
【００６９】
（iv）変異型ＧＲの細胞内局在
変異型ＧＲの細胞内局在を調べるために行なった免疫細胞学的分析から、次のようなことが明らかとなった。まず、野生型ＧＲでトランスフェクトした細胞をビークルで処理した場合には、発現したＧＲタンパク質は細胞質中に存在していた。他方で、同細胞を１００ｎＭデキサメタゾンで処理した場合には、ほとんどのＧＲタンパク質は核の中に存在していた。Ｔ５０４Ｓ変異体およびＳ６５１Ｆ変異体のタンパク質の局在パターンは、野生型のものとほとんど同様であった。
【００７０】
（v）変異型ＧＲの転写活性
変異型ＧＲの転写活性を調べるために行なったレポーターアッセイの結果を図３に示す。図３において、ルシフェラーゼ活性は、１００ｎＭデキサメタゾンで処理した野生型ＧＲの測定値に対する百分率（％）として示す。各プロットにおける棒は標準偏差（ｎ＝３）を表し、「＊＊」はフィッシャーのＰＬＳＤ法においてＰ＜０．００１であることを表す。エンプティーベクタープラスミドのみでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞では、デキサメタゾン処理の有無にかかわらず、ルシフェラーゼ活性は見られなかった。野生型ＧＲでトランスフェクトした細胞では、デキサメタゾンの用量に比例してルシフェラーゼ活性が増加した。Ｔ５０４Ｓ変異体でトランスフェクトした細胞では、野生型と同様のルシフェラーゼ活性が見られた。これに対し、Ｓ６５１Ｆ変異体でトランスフェクトした細胞では、野生型と比較してルシフェラーゼ活性が有意に低く、１００ｎＭデキサメタゾンで処理した場合には、野生型の６５％のルシフェラーゼ活性となった。変異型ＧＲの転写活性は、それらのタンパク質発現レベル（図２）と良好な相関を示した。
【００７１】
（３）考察
上述の実験結果によれば、ＧＲ遺伝子におけるＳ６５１Ｆ変異により、ｍＲＮＡの発現レベルは変化しないにもかかわらず、タンパク質発現レベルおよび転写活性はともに野生型の６５％にまで減少することがわかる（図１〜３）。これにより、タンパク質発現レベルの減少はタンパク質の不安定性または不十分な翻訳に起因することが示される。また、転写活性とタンパク質発現レベルとの良好な相関から、転写活性の減少はタンパク質発現レベルの低下に起因するものと考えられる。このことは、Ｓ６５１Ｆ変異型ＧＲがデキサメタゾンに応答して核内に移行することを示す免疫細胞学的データにより支持される。第６５１アミノ酸残基はＨｓｐ９０結合ドメイン中に位置する。Ｈｓｐ９０はＧＲタンパク質を安定化させるため、この位置におけるセリンのフェニルアラニンへの置換がその変異型ＧＲに対するＨｓｐ９０の結合特性に影響を与え、この変異型ＧＲタンパク質の安定性を害している可能性がある。
【００７２】
一方で、Ｔ５０４Ｓ変異体は、野生型と同様のｍＲＮＡレベル、タンパク質レベルおよび転写活性を示す。
【００７３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】野生型、Ｔ５０４Ｓ変異型およびＳ６５１Ｆ変異型それぞれのＧＲ転写産物のノーザンブロット分析の結果を示す電気泳動写真である。
【図２】野生型、Ｔ５０４Ｓ変異型およびＳ６５１Ｆ変異型それぞれのＧＲタンパク質のウェスタンブロット分析の結果を示す電気泳動写真である。
【図３】野生型、Ｔ５０４Ｓ変異型およびＳ６５１Ｆ変異型それぞれのＧＲの転写活性を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
Field of Invention
The present invention relates to mutant polynucleotides and nucleic acid molecules that can be used for genetic diagnosis of sensitivity to glucocorticoid preparations.
[0002]
Background art
Glucocorticoid receptor (GR) is a transcription factor activated by glucocorticoid and regulates the expression of various genes. Human GRα (hGRα) is encoded by a total of 9 exons including exon 9α (Encio I.J. and Detera-Wadleigh S.D., J. Biol. Chem. 266, 7182-7188, 1991). GRβ is a alternatively spliced form with exon 9β instead of exon 9α, has been identified in glucocorticoid-resistant human multiple myeloma cells and is a nonfunctional hGRα (Moalli PA et al., Cancer Res. 53, 3877-3879, 1993). HGRα having 777 amino acids has a DNA binding domain (amino acids 421 to 486), a ligand binding domain (amino acids 528 to 720), a homodimerization domain (amino acids 456 to 777), and an Hsp90 binding Domain (amino acids 568-653), nuclear translocation domain (amino acids 479-506 and 526-777), transactivation domain (amino acids 77-262, 404-491) and amino acids (Savory JG, Mol. Cell. Biol. 19, 1025-1037, 1999; Vottero A. and Chrousos GP, Trends Endocrinol. Metab. 10, 333-338) 1999). In the cytosol, GR is associated with heat shock proteins and other proteins (Pratt WB and Toft DO, Endocr. Rev. 18, 306-360, 1997), and GR translocation into the nucleus occurs due to the binding of glucocorticoids. (Webster JC and Cidlowski JA, Trends Endocrinol. Metab. 10, 396-402, 1999).
[0003]
Glucocorticoid therapy is effective in many inflammatory diseases and some types of cancer. However, a small number of patients do not respond to clinically effective amounts of glucocorticoids, a condition called glucocorticoid resistance (Loke T.K. et al., Curr. Allergy Asthma Rep. 2, 144-150, 2002). Several familial mutations in the GR gene have been shown to be associated with corticosteroid resistance or hematopoietic tumors, but these mutations are relatively infrequent and may be a common cause of resistance (DeRijk RH et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 81, 103-122, 2002).
[0004]
In recent years, multiple single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the GR gene have been identified, some of which are relatively frequent. For example, it has been reported that the function of the glucocorticoid receptor is lost by Cys643Arg substitution or insertion of adenine into the C-terminal gene sequence (Non-patent Document 1: Nagano M. et al., Cancer Lett. 181). , 109-114, 2002). In addition, it has been reported that the function of the glucocorticoid receptor is reduced or lost by each single nucleotide polymorphism causing amino acid substitution of Ile559Asn, Ile747Met and Arg477His (Non-Patent Document 2: Kino T. et al). , J. Clin. Endocrinol. Metab. 86, 5600-5608, 2002; Non-patent document 3: Vottero A. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 87, 2658-2667, 2002; : Ruiz M. et al., Clin. Endocrinol. 55, 363-371, 2001). Furthermore, Bcl I restriction fragment length polymorphism has been reported to be associated with susceptibility to steroids (Non-Patent Document 5: Panarelli M. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 83, 1846- 1852, 1998).
[0005]
[Non-Patent Document 1]
Nagano M. et al., Cancer Lett. 181, 109-114, 2002
[Non-Patent Document 2]
Kino T. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86, 5600-5608, 2002
[Non-Patent Document 3]
Vottero A. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 87, 2658-2667, 2002
[Non-Patent Document 4]
Ruiz M. et al., Clin. Endocrinol. 55, 363-371, 2001
[Non-Patent Document 5]
Panarelli M. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 83, 1846-1852, 1998
[0006]
SUMMARY OF THE INVENTION
The present inventors have found a gene mutation in the glucocorticoid receptor (GR) gene in which the codon encoding the 651st serine residue of the GR protein becomes a codon encoding a phenylalanine residue, and the function of GR is reduced. It was. The present invention is based on this finding.
[0007]
In humans having the above mutations, the expression level of the GR protein is reduced, and the transcriptional activation ability, which is a function thereof, is similarly reduced. Therefore, the effect of the glucocorticoid preparation acting on GR is hardly exhibited.
[0008]
Therefore, an object of the present invention is to provide a mutant polynucleotide, a mutant protein, and a nucleic acid molecule that can be used for genetic diagnosis of sensitivity to a glucocorticoid preparation.
[0009]
The mutant polynucleotide according to the present invention is a polynucleotide encoding a protein having a mutation of the 651st serine residue to a phenylalanine residue in the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. It is a nucleotide.
[0010]
Furthermore, the mutant protein according to the present invention is a protein having a mutation of the 651st serine residue to a phenylalanine residue in the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
[0011]
Furthermore, the nucleic acid molecule according to the present invention is a nucleic acid molecule capable of detecting a mutation in the glucocorticoid receptor gene in which the codon encoding the 651st serine residue of the glucocorticoid receptor protein is a codon encoding a phenylalanine residue. A nucleic acid molecule comprising a nucleotide fragment that hybridizes to a mutated polynucleotide according to the present invention or a polynucleotide complementary thereto.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The mutation in the glucocorticoid receptor (GR) gene detected by the present invention is such that the codon encoding the 651st serine residue of the GR protein becomes a codon encoding a phenylalanine residue (in the present invention, “S651F Called "mutation"). Examples of such a mutation include a mutation of the 1952st (1952 in SEQ ID NO: 1) cytosine (C) residue to a thymine (T) residue counted from the translation initiation codon (in the present invention, “ 1952C> T ”). The S651F mutation reduces the expression level of the GR protein and similarly reduces the transcriptional activation ability, which is a function thereof, so that the effect of the glucocorticoid preparation acting on GR is difficult to be exhibited. Therefore, by detecting the S651F mutation, it is possible to determine the sensitivity to the glucocorticoid preparation. In particular, by detecting the S651F mutation on the GR gene before administration of such a preparation, it becomes possible to find a human who is difficult to respond to the preparation.
[0013]
In the present invention, the “glucocorticoid preparation” means a pharmaceutical composition containing glucocorticoid as an active ingredient. Glucocorticoid preparations have pharmacological actions such as inflammation suppression and leukemia cell death, and are used as anti-inflammatory agents and anti-cancer agents. The mechanism of action of the preparation is that it first binds to GR in the cytoplasm, and then the GR bound to the glucocorticoid preparation binds to the upstream region of the gene or other transcription factor protein. As a result, transcriptional activation or transcriptional repression of the gene group occurs, resulting in a pharmacological action.
[0014]
In the present invention, “resistant to a glucocorticoid preparation” means a state in which the pharmacological effect of the glucocorticoid preparation is not observed or suppressed in a subject. In the present invention, “suppression” is not limited to complete suppression, and is understood to mean “suppression” as long as it is suppressed as compared with a control (for example, a healthy person). For example, if it is determined that a subject is resistant to a glucocorticoid formulation, the therapeutic effect of administration of the glucocorticoid formulation to the subject is not expected or expected to be low Can do. Based on the information regarding the effectiveness of the glucocorticoid preparation for the subject obtained by the present invention, it is possible to appropriately determine the treatment policy for the subject.
[0015]
Mutant polynucleotide and mutant protein
In order to detect the S651F mutation, in the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a protein having a mutation of the 651st serine residue to a phenylalanine residue, and the same are encoded. Polynucleotides can be targeted. That is, the S651F mutation can be detected by confirming the presence of such a mutant protein or mutant polynucleotide.
[0016]
When detecting the S651F mutation, the mutant polynucleotide in the genome can be targeted. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the mutant polynucleotide to be detected is a 651st serine residue in SEQ ID NO: 2 in a polynucleotide comprising the genomic DNA sequence of the human GR gene. Is a polynucleotide having a mutation to a codon encoding a phenylalanine residue. The genomic DNA sequence of the human GR gene is not particularly limited as long as it can express the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, but preferably thymine (T) in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 A nucleotide sequence capable of producing in vivo an mRNA comprising a nucleotide sequence in which a residue is substituted with a uracil (U) residue, such as GR in a genomic sequence registered under the accession number AC004782 in the NCBI database. Examples include gene sequences. The both terminal sites of the GR gene will be apparent to those skilled in the art, but preferably include all exons of the GR gene.
[0017]
In addition, when detecting the S651F mutation, it is also possible to target cDNA generated with respect to mRNA that is a transcription product of the mutant polynucleotide in the genome. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the mutant polynucleotide to be detected is a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein the 1952st cytosine (C) residue is a thymine (T) residue. It comprises a nucleotide sequence substituted with
[0018]
The mutant polynucleotide according to the present invention may be single-stranded or double-stranded with hybridized complementary strands.
[0019]
As described above, the mutant protein and the mutant polynucleotide according to the present invention are useful as a target for detecting the S651F mutation, and further, a compound that activates the glucocorticoid receptor having the mutation is screened. It is also useful for
[0020]
Nucleic acid molecule and drug sensitivity prediction / detection method using the same
The nucleic acid molecule according to the present invention is capable of detecting the S651F mutation in the GR gene, and the nucleic acid molecule comprises a nucleotide fragment that hybridizes to the mutant polynucleotide according to the present invention or a polynucleotide complementary thereto. .
[0021]
In the present invention, “hybridize” means that the nucleic acid molecule according to the present invention hybridizes to a target nucleotide molecule under normal hybridization conditions, preferably under stringent hybridization conditions, to a nucleotide molecule other than the target nucleotide molecule. Means not hybridized. Stringent conditions can be determined depending on the melting temperature Tm (° C.) of the duplex between the nucleic acid molecule of the present invention and its complementary strand, the salt concentration of the hybridization solution, etc., for example, J. Sambrook , EF Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), and the like. For example, when hybridization is performed at a temperature slightly lower than the melting temperature of the nucleic acid molecule to be used, the nucleic acid molecule can be specifically hybridized to the target nucleotide molecule. In addition, a nucleic acid molecule that hybridizes to a nucleotide molecule need not be completely complementary to the nucleotide molecule as long as specific hybridization is possible, but is preferably complementary to the nucleotide molecule. A complete or partial sequence of such a nucleotide molecule.
[0022]
In the present invention, “nucleic acid molecule” is used to mean DNA, RNA, and PNA (peptide nucleic acid). According to a preferred embodiment of the invention, the nucleic acid molecule is DNA.
[0023]
The nucleotide sequence of the nucleic acid molecule according to the present invention can be appropriately designed by those skilled in the art. For example, when the detection target is a genome, the nucleic acid molecule according to the present invention can include not only a portion that hybridizes to an exon, but also a portion that hybridizes to an intron, or one of these. You may be comprised only by.
[0024]
The nucleic acid molecule according to the present invention can be used as a nucleic acid probe in the detection of the S651F mutation in the GR gene. For this purpose, the nucleic acid molecule according to the present invention comprises a region comprising a portion corresponding to the 651st serine residue in SEQ ID NO: 2 of the mutant polynucleotide according to the present invention or a complementary polynucleotide thereto. It preferably comprises a nucleotide fragment that hybridizes to. The nucleic acid probe may be prepared as a synthetic oligonucleotide using a commercially available oligonucleotide synthesizer or the like, or may be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like.
[0025]
When the nucleic acid molecule according to the present invention is used as a nucleic acid probe, the chain length of the nucleic acid molecule is preferably 15 nucleotides or more, and preferably 100 nucleotides or less, more preferably 50 nucleotides or less.
[0026]
Furthermore, when the nucleic acid molecule according to the present invention is used as a nucleic acid probe, it is preferable to appropriately label the nucleic acid molecule. As a labeling method, T4 polynucleotide kinase is used to remove the 5 'end of the oligonucleotide.³²A method of labeling by phosphorylation with P, and a DNA polymerase such as Klenow enzyme, and using random hexamer oligonucleotides as primers³²Examples thereof include a method of incorporating a substrate base labeled with an isotope such as P, a fluorescent dye, biotin or the like (random prime method or the like).
[0027]
Further, the nucleic acid molecule according to the present invention can be used as a primer for nucleic acid amplification in the detection of S651F mutation in the GR gene. For this purpose, the nucleic acid molecule according to the present invention is obtained by amplifying a region containing a portion corresponding to the 651st serine residue in SEQ ID NO: 2 of the mutant polynucleotide according to the present invention in a nucleic acid amplification method. It is preferable that
[0028]
When the nucleic acid molecule according to the present invention is used as a primer for nucleic acid amplification, the chain length of the nucleic acid molecule is preferably 15 to 100 nucleotides, more preferably 17 to 30 nucleotides.
[0029]
According to another preferred embodiment of the present invention, the length of the nucleic acid molecule according to the present invention is 15-100 nucleotides, more preferably at least 17 nucleotides, even more preferably at least 18 nucleotides, even more preferably 18-50 nucleotides. . The nucleic acid molecule according to the present invention having such a chain length is particularly preferable for detecting the S651F mutation from a nucleic acid sample containing impurities.
[0030]
The nucleic acid amplification method is usually performed using a pair of primers. Therefore, according to the present invention, a primer pair for detecting the S651F mutation in the GR gene, the portion of the mutant polynucleotide according to the present invention corresponding to the 651st serine residue in SEQ ID NO: 2 Primer pairs that can amplify the region to be included in the nucleic acid amplification method are provided. As the two primers constituting such a primer pair, the nucleic acid molecule according to the present invention can be used. Such a primer can be appropriately designed by those skilled in the art based on the nucleotide sequence of the region to be amplified. For example, one primer of the primer pair has a 5 ′ terminal sequence in the nucleotide sequence of the amplification target region, and the other primer has a 5 ′ terminal sequence in the nucleotide sequence of the complementary strand of the amplification target region. It can have an array.
[0031]
By using the nucleic acid molecule according to the present invention or the primer pair according to the present invention, it is possible to detect the presence or absence of the S651F mutation in the GR gene, whereby the sensitivity to the glucocorticoid preparation can be determined.
[0032]
Specifically, the nucleic acid molecule according to the present invention or the primer pair according to the present invention can be used as a primer in a nucleic acid amplification method for detecting the S651F mutation in the GR gene, more specifically, the mutant type according to the present invention. The polynucleotide can be used as a primer in a nucleic acid amplification method for amplifying a region containing a portion corresponding to the 651st serine residue in SEQ ID NO: 2. Therefore, according to the present invention, using the nucleic acid molecule or primer pair according to the present invention, a nucleic acid amplification method using a nucleic acid sample derived from a subject as a template, and detecting the S651F mutation in the obtained amplification product A method for determining sensitivity to a glucocorticoid formulation, comprising:
[0033]
In determining drug sensitivity by this method, for example, samples of tissues or cells such as peripheral blood leukocytes, skin, oral mucosa, tears, saliva, urine, feces or hair are collected from a subject, and genomic DNA is obtained from the obtained samples. Extract nucleic acid sample such as RNA or mRNA, if necessary, create cDNA from mRNA using reverse transcriptase, and perform nucleic acid amplification method using the obtained nucleic acid sample as a template and nucleic acid molecule or primer pair according to the present invention Then, by analyzing the nucleotide sequence of the obtained amplification product, the S651F mutation in the GR gene can be detected. Any method known in the art may be used as the nucleic acid amplification method and the mutation detection method using the nucleic acid amplification method. For example, as a nucleic acid amplification method, a normal PCR method or the like can be used when genomic DNA or cDNA is used as a template, and an RT-PCR method or NASBA method or the like can be used when mRNA is used as a template. Can do.
[0034]
Analysis of the nucleotide sequence of the amplification product obtained by the nucleic acid amplification method can be easily performed by, for example, a direct sequencing method using a sequencing primer. Such methods are well known in the art and can be performed, for example, using commercially available kits.
[0035]
When detecting the S651F mutation by the nucleic acid amplification method and the direct sequencing method, for example, a primer having the following sequence:
Forward: 5'-TTTTTGGGGGGAAGTAGCAG-3 '(SEQ ID NO: 19);
Reverse: 5′-AACAGAGATCCCTATGCAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 20),
A nucleic acid amplification method can be performed using a direct sequencing method using these primers as sequence primers.
[0036]
In addition, in the S651F mutation in the GR gene, when a recognition sequence by a specific restriction enzyme is lost or generated due to this mutation, a method using a restriction fragment length polymorphism (RFLP), for example, PCR-RFLP method is used. Can be used to detect the mutations described above. Such a method is obtained by, for example, using a primer pair that amplifies a region including the restriction enzyme recognition sequence in the nucleic acid amplification method described above, digesting the obtained amplified fragment with this restriction enzyme, and then obtaining the fragment. Can be carried out by examining the number of and their chain lengths. Such methods are well known in the art, and those skilled in the art can appropriately set appropriate restriction enzymes, primers, amplification reaction conditions, restriction enzyme reaction conditions, and the like.
[0037]
Further, for the amplified fragment obtained by the nucleic acid amplification method as described above, whether or not any mutation exists in the amplified fragment is examined by a simple method, and only the S651F mutation is determined for a sample determined to have the mutation. Can also be detected.
[0038]
As the above simple method, for example, a method using a single-strand conformation polymorphism (PCR-SSCP method: Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats) on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12 (1): 139-146., Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products.Oncogene. 1991 Aug 1; 6 ( 8): 1313-1318., Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling., PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4 (5): 275-282). In this method, the amplified DNA is dissociated into single-stranded DNA, and then this single-stranded DNA is separated on a non-denaturing gel, and the mobility on the gel is compared to the mobility of a control sample without mutation. Compare with The chain length of the DNA fragment amplified in this method is preferably 200 to 400 bp.
[0039]
As the above simple method, a denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE method) can also be used. In this method, the amplified DNA is separated on a gel with an increasing concentration of DNA denaturant, and the mobility on the gel is compared to that of a control sample without mutation. Such methods are known in the art and can be appropriately performed by those skilled in the art.
[0040]
In the drug sensitivity determination method according to the present invention, primers can be designed so that an allele-specific PCR method can be performed. Specifically, one of the primers can be designed to be paired with a mutation site, and the other can be designed to be paired with a region not including the mutation site. When the nucleic acid amplification method is performed using the primer pair designed in this way, an amplification product is obtained when a mutation is present in the nucleic acid sample, and an amplification product is not obtained when there is no mutation. Therefore, in this case, the presence or absence of the mutation can be determined by detecting the presence or absence of the amplification product.
[0041]
The nucleic acid molecule according to the present invention can be used as a probe for detection of mutation by a hybridization method or the like. Thus, according to the present invention, the sensitivity to a glucocorticoid formulation comprising the steps of hybridizing a nucleic acid molecule according to the present invention with a nucleic acid sample from a subject and then detecting the presence of a hybridization complex. A determination method is provided. The presence of the hybridization complex indicates the presence of the S651F mutation in the GR gene. The method using this hybridization method can also be applied to the amplification product obtained by the method using the nucleic acid amplification method described above.
[0042]
In determining drug sensitivity by this method, for example, samples of tissues or cells such as peripheral blood leukocytes, skin, oral mucosa, tears, saliva, urine, feces or hair are collected from the subject, and the obtained samples are used. By extracting a nucleic acid sample such as genomic DNA or mRNA, if necessary, preparing cDNA from the mRNA by reverse transcriptase, and detecting the presence or absence of hybridization with the nucleic acid molecule according to the present invention under stringent conditions, The S651F mutation in the GR gene can be detected. If necessary, the nucleic acid sample can be subjected to a restriction enzyme treatment or the like to have a length suitable for hybridization. Any method known in the art may be used as a hybridization method and a mutation detection method using the hybridization method. For example, techniques such as Southern hybridization, colony hybridization and the like can be used. You can refer to it.
[0043]
When the nucleic acid molecule according to the present invention is used as a probe in the detection of a mutation by a hybridization method, a DNA chip is prepared by immobilizing the nucleic acid molecule according to the present invention on a substrate, and the DNA chip and a nucleic acid sample derived from a subject are subjected to hybridization conditions. The presence or absence of hybridization may be detected by contacting under. Therefore, according to the present invention, a DNA chip capable of detecting the S651F mutation in the GR gene, wherein the nucleic acid molecule according to the present invention is immobilized on a substrate, and a step of detecting the S651F mutation using this DNA chip are further provided. A method of determining susceptibility to a glucocorticoid formulation is provided. In the present invention, the chain length of the probe to be bound to the substrate is not particularly limited, but is preferably 15 to 100 nucleotides, more preferably 15 to 50 nucleotides, and still more preferably 17 to 25 nucleotides. Techniques for detecting mutations using such DNA chips are well known in the art (Post-Sequence Genome Science, Volume 1, “Strategy for SNP Gene Polymorphism”, Kenichi Matsubara, Yoshiyuki Tsuji, Nakayama Shoten, p128 -135, 2000), a person skilled in the art can make a suitable DNA chip using the nucleic acid molecules according to the invention and detect the S651F mutation using this DNA chip.
[0044]
When detecting the S651F mutation in the GR gene, the primer extension method using the nucleic acid molecule according to the present invention as a primer can also be used. This method is particularly preferred when the S651F mutation is a single nucleotide polymorphism. Examples of such a single nucleotide polymorphism include 1952C> T. The primer extension method is known to those skilled in the art, and the procedure for the procedure and the specific nucleotide sequence of the primer to be used can be easily determined by those skilled in the art. According to a preferred embodiment of the present invention, the above-described primer extension method includes SNaPshot.^TMThe method known as the method or Pyrosequencing method is used.
[0045]
SNaPshot^TMIn the method, a primer adjacent to the site of the single nucleotide polymorphism, in which the nucleotide added to the 3 'end by the extension reaction is complementary to the site of the single nucleotide polymorphism is used. Using such a primer, a primer extension reaction is carried out using a nucleic acid sample from a subject as a template. By using ddNTP (dideoxyNTP) at that time, the extension reaction is carried out at the above polymorphic site. Terminate when the corresponding single nucleotide has been incorporated. The incorporated nucleotide is easily identified by pre-labeling with a fluorescent label or the like, and thus the nucleotide at the polymorphic site is identified. Such methods are known to those skilled in the art, and the procedures for the operation and the specific nucleotide sequences of the primers used can be easily determined by those skilled in the art.
[0046]
In the Pyrosequencing method (Ahmadian A et al., Anal. Biochem. Vol. 280, pp103-110, (2000)), during the extension reaction of primers using a nucleic acid sample from a subject as a template, One dNTP is reacted at a time. When any of dNTPs is incorporated, an equal amount of pyrophosphate (PPi) is liberated, and the liberated PPi reacts with sulfurylase to produce ATP, which causes luciferase reaction and luminescence. Therefore, when light emission occurs when a specific dNTP is added, it becomes clear that the nucleotide corresponding to the dNTP has been incorporated, and thereby the nucleotide of the target site in the nucleic acid sample is identified. In this method, since dNTP is used, SNaPshot^TMIt is not necessary to use a primer adjacent to the polymorphic site as used in the method, and a primer separated by several bases may be used. Such methods are known to those skilled in the art, and the procedures for the operation and the specific nucleotide sequences of the primers used can be easily determined by those skilled in the art.
[0047]
When the S651F mutation in the GR gene is a single nucleotide polymorphism as described above, the mutation is further determined using a genotyping method (typing method) using the nucleic acid molecule according to the present invention as a probe and / or primer. It can also be detected. Genotyping methods are known to those skilled in the art, and the procedures for the procedures and the specific nucleotide sequences of the probes and / or primers used can be easily determined by those skilled in the art. According to a preferred embodiment of the present invention, a method known as TaqMan PCR method is used as the genotyping method.
[0048]
TaqMan PCR method (Livak KJ.Genet. Anal. vol.14, pp143-149, (1999)), for example, when a 1952C> T mutation is detected, the C allele and the T allele are specifically compared to the region containing the nucleotide of the polymorphic site. Two types of probes that hybridize, each with a different fluorescent labeling substance attached to the 5 ′ end, a quencher (quenching substance) for the fluorescent label attached to the 3 ′ end, and further phosphorylated at the 3 ′ end These probes (TaqMan probes) are used, and these are added to a PCR reaction solution to perform a PCR reaction using a nucleic acid sample derived from the subject as a template. As the TaqMan probe and the PCR primer, the nucleic acid molecule according to the present invention can be used, and the specific nucleotide sequence thereof can be appropriately determined by those skilled in the art. The two kinds of fluorescent labeling substances may be any combination that can be distinguished from each other, and such a combination of fluorescent labeling substances can be used together with each quencher, and those known to those skilled in the art can be used. And a combination of VICs. In this PCR reaction, a TaqMan probe is first hybridized to each allele, and when an extension reaction from a primer reaches its hybridization region, a fluorescent labeling substance is released by the action of Taq DNA polymerase. Since the released fluorescent labeling substance is not affected by the quencher, it emits fluorescence. Therefore, according to this method, each fluorescence having an intensity corresponding to the abundance of each allele can be observed, whereby the genotype of the subject (C / C, C / T, or T / T) Is easily determined.
[0049]
Other methods that can be used to detect the S651F mutation in the GR gene include mass spectrometry (Griffin TJ and Smith LM,Trends Biotechnol. vol. 18, pp77-84, (2000)), Invader method (Lyamichev V et al.,Nat. B iotechnol. vol. 17, pp292-296, (1999); “Gene Medicine” vol.4, No.1, published by Medical Do, pp44-51 and pp68-72 (2000)). Any method can be used as long as it can detect gene mutations.
[0050]
In the drug sensitivity determination method according to the present invention, it can be determined that a sample evaluated as having the S651F mutation in the GR gene is resistant to the glucocorticoid preparation, that is, the preparation is hardly effective. Further, according to the present invention, it is possible to diagnose before birth and immediately after birth.
[0051]
In order to determine the sensitivity to the drug as described above, necessary reagents can be collected into a kit. Thus, a kit according to the invention comprises a nucleic acid molecule according to the invention and / or a primer pair according to the invention. The kit according to the present invention may further contain reagents, reaction containers, instructions, etc., depending on the specific method for detecting the S651F mutation in the GR gene.
[0052]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0053]
Example 1: Effect of mutations in the GR gene on the function of the glucocorticoid receptor (GR)
(1) Materials and methods
(I) DNA source and sequencing of the GR gene
The 88 subjects employed in this study were Japanese allergic patients who received steroid drugs. Peripheral blood lymphocytes collected from these subjects were immortalized using Epstein-Barr virus. Genomic DNA was extracted from immortalized lymphocytes. This research was conducted with the approval of the Ethical Review Boards of the National Center for Child Health and Development (Japan) and the National Institute of Pharmaceutical Health (Japan). Informed consent was obtained in writing from all the subjects described above.
[0054]
Primers for polymerase chain reaction (PCR) and coding region sequencing were designed based on nucleotide sequences obtained from the NCBI database (M78506, M78507, U78508, AC004782). All primers (SEQ ID NOs: 3 to 26) used in this study are shown in Table 1 below. In the primer names shown in Table 1, the number following “GREX” indicates the number of the exon to be amplified, and “F” and “R” following this number mean the forward primer and the reverse primer, respectively. .
[0055]
[Table 1]

[0056]
PCR and sequencing were performed as follows. First, the GR gene was amplified from genomic DNA (100 ng) using a primer set for amplifying the GR gene in three parts and Z-Taq (TaKaRa, Kyoto, Japan). Here, the following was used as a primer set. The PCR conditions were 30 cycles of 98 ° C. for 5 seconds, 55 ° C. for 5 seconds and 72 ° C. for 190 seconds.
[0057]
(A) Exon 2-3 amplification primer:
Forward: ATTGGGAACTCTGTGAAATCATAA (SEQ ID NO: 27),
Reverse: AATTCTCTGTACCTTGTCATTGTTA (SEQ ID NO: 28);
(B) Exon 3-7 primer for amplification:
Forward: GAGAACTGTATTTTGATATTCCTT (SEQ ID NO: 29),
Reverse: AGAATCACACAGTATGTAGCCC (SEQ ID NO: 30);
(C) Exon 7-9β amplification primer:
Forward: GACTTCAGAATCATAAGCAAGA (SEQ ID NO: 31),
Reverse: CTTGTGGAAAAAAAGGTACTCA (SEQ ID NO: 32).
[0058]
Next, each exon was amplified using the primer set described in Table 1. Ex-Taq polymerase (TaKaRa, Kyoto, Japan) was used as the DNA polymerase. First, heat denaturation is performed at 95 ° C. for 5 minutes, and then 30 cycles of reaction at 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 2 minutes are performed, and a final reaction of 7 minutes at 72 ° C. is performed for 1 cycle. Performed once. PCR products were then directly sequenced using the ABI BigDye Terminater Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) using an ABI Prism 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems, CA, USA).
[0059]
(Ii) Plasmid
PRShGRα obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA) contains the full-length coding region of human GRα and the constitutively active Rous sarcoma virus promoter (V. Giguere, SM Hollenberg, MG Rosenfeld, RM Evans, Functional domains of the human glucocorticoid receptor. Cell 46 (1986) 645-652). Expression plasmids encoding each of the T504S mutant GR and the S651F mutant GR were constructed using the wild-type pRShGRα plasmid as a template and a QuickChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene, CA, USA). The empty vector plasmid used as a control was constructed by removing the hGRα cDNA from the pRShGRα plasmid.RenillaPhRL-TK (Promega, WI, USA) encoding (Renilla) luciferase was used to standardize transfection efficiency by co-transfection. The transfection efficiency obtained by using phRL-TK was consistent (92-103% of the empty vector).
[0060]
(Iii) Cell culture
As cells transfected with the GR expression plasmid, COS-7 cells, an African green monkey kidney cell line, were used because endogenous GR levels were very low. COS-7 cells were obtained from Ministry of Health, Labor and Welfare Research Resource Bank (JCRB) (Tokyo, Japan). The cells were treated with 5% CO 2 in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 10% FBS, 100 U / ml penicillin and streptomycin.₂Grow at 37 ° C. in air. For dexamethasone treatment, the cells were cultured in DMEM supplemented with charcoal dextran-treated FBS (10%).
[0061]
(Iv) Northern blot analysis
COS-7 cells (1.6x10⁶Cells) were co-transfected with 3.5 μg of wild-type or mutant GR expression plasmid and 0.5 μg of phRL-TK plasmid using PolyFect Transfection reagent (Qiagen). Cells were harvested 48 hours after transfection and total RNA was extracted using the RNeasy kit (Qiagen). 5 μg of each total RNA sample was electrophoresed, transferred to a nylon membrane (GeneScreen Plus, NEN Life Science Products Inc., MA, USA), and literature (Brown T. and Mackey K., Analysis of RNA by Northern and slot blot). hybridization. In Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Wiley and Sons Inc., supple. 37, unit 4.9, 1997)³²Hybridization with P-labeled hGRα or monkey-derived glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) cDNA probe. The hGRα cDNA was prepared by digesting the pRShGRα plasmid with Kpn I and Xho I. Monkey GAPDH cDNA was prepared by reverse transcription PCR using monkey GAPDH specific primer pairs and total RNA from COS-7 cells as template. Hybridization signals were analyzed using Bioimage Analyzer BAS-1500 (Fuji Photo Film, Tokyo, Japan).
[0062]
(V) Western blot analysis
Co-transfected COS-7 cells (1.6 × 10 6⁶Cells) were prepared as described above and the cell pellet was boiled in protein sample buffer. Total cellular proteins were electrophoresed on 6% SDS-poloacrylamide gel (Tefuco, Tokyo, Japan) and transferred onto PVDF membrane (Bio-Rad, CA, USA). This membrane was blocked with 5% non-fat milk, incubated with a polyclonal rabbit anti-human GR antibody (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) as the primary antibody, and then goat anti-conjugated with horseradish peroxidase as the secondary antibody. Incubated with rabbit IgG antibody (Amersham Pharmacia Biotech, UK). The GR protein was visualized using WestFemto maximum sensitivity substrate (Pierce Biotechnology, IL, USA) according to the instructions. These signals were evaluated by density analysis.
[0063]
(Vi) Luciferase reporter assay
COS-7 cells (1.4 x 10^FiveCells), wild type GR expression plasmid pRShGRα or mutant GR expression plasmid 0.3 μg and mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter-luciferase reporter construct (pHH-Luc) (ATCC, VA, USA, the sequence is GenBank access) No .: registered in AF093686) and 0.6 μg of phRL-TK plasmid as internal control. Twenty-four hours after transfection, the cells were treated with vehicle (methanol) or various concentrations of dexamethasone and cultured for an additional 24 hours. These cells were washed with PBS, and then cell lysates were prepared using the PicaGene Dual Sea Pansy Luminescence Kit (Nippongene, Tokyo, Japan). Then, luciferase activity² Measurements were made using a Multilabel Counter (Wallac, Turku, Finland). All transfection efficiencies areRenillaNormalized according to luciferase activity.
[0064]
(Vii) Immunocytological analysis
COS-7 cells (1.6x10⁶Cells) were transfected with 4 μg of wild type GR or mutant GR expression plasmid and cultured for 48 hours. These cells were treated with vehicle or 100 nM dexamethasone for 90 minutes. Transfected COS-7 cells were washed twice with PBS, fixed with 3.7% formaldehyde in PBS for 15 minutes at room temperature, and permeabilized with 0.5% Triton X-100 for 15 minutes. . Fixed cells were blocked by incubation with PBS containing 10% goat serum and simultaneously treated with 100 ng / ml DAPI (Santa Cruz Biotechnology) for 30 minutes at room temperature, then 0. Washed with PBS containing 05% Tween-20. These cells were incubated overnight at 4 ° C. with a rabbit polyclonal anti-GR antibody (Santa Cruz Biotechnology) diluted in PBS containing 10% goat serum. These cells were washed 5 times with PBS containing 0.05% Tween-20 and diluted with PBS containing 10% goat serum, anti-rabbit IgG antibody conjugated to Alex594 (FUNAKOSHI, Tokyo, Japan). ) And 1 hour at room temperature. Immunoreacted GR and DAPI stained nuclei were visualized under a fluorescence microscope.
[0065]
(Viii) Statistical analysis
The results of Northern blot analysis, Western blot analysis and reporter assay were evaluated for statistical significance by One-way ANOVA using StatView software (SAS Institute, NC, USA) and Fisher's PLSD method.
[0066]
(2) Results
(I) Two gene mutations found in the GR gene
As a result of sequencing the coding region of the GR gene for 88 Japanese subjects, two heterozygous single nucleotide mutations with amino acid substitutions were found. One is an adenine (A) to thymine (T) substitution at nucleotide 1510, which involves an amino acid substitution from threonine (Thr) to serine (Ser) at amino acid 504 (1510A> T; T504S). . The other is a substitution of cytosine (C) to thymine (T) at nucleotide 1952, which involves an amino acid substitution from serine (Ser) to phenylalanine (Phe) at amino acid 651 (1952C> T; S651F). ). The above numbers indicating the positions of nucleotides and amino acids are in accordance with the sequence registered in GenBank accession number: AC004782.
[0067]
(Ii) Expression of mutant GR mRNA in transfected COS-7 cells
The results of Northern blot analysis performed to examine the expression level of mutant GR mRNA are shown in FIG. In FIG. 1, the upper panel shows the hybridization signal with the hGRα cDNA probe, and the lower panel shows the hybridization signal between the endogenous GAPDH and the GAPDH cDNA probe for use in correction during RNA quantification. From this analysis, the mRNA expression level of the T504S mutant and the S651F mutant when the mRNA expression level of wild-type GR is taken as 100 is estimated to be 113.7 ± 12.2 and 85.9 ± 5.5, respectively. There was no significant difference between these two variants.
[0068]
(Iii) Expression level of mutant GR protein in whole cell lysate
The results of Western blot analysis performed to quantify the expression level of the mutant GR protein are shown in FIG. From this analysis, the protein expression levels of the T504S mutant and the S651F mutant were estimated to be 90.2 ± 15.1 and 65.6 ± 4.3, respectively, when the wild-type GR protein expression level was taken as 100. . There was no significant difference in protein expression level between wild type GR and T504S mutant GR. On the other hand, the protein expression level of S651F mutant GR was significantly decreased compared to wild type GR (P <0.05). In view of the fact that no significant difference was observed in the Northern blot analysis described above, the decrease in the protein expression level of S651F mutant GR is thought to be due to protein instability or insufficient translation in COS-7 cells. It is done.
[0069]
(Iv) Subcellular localization of mutant GR
From the immunocytological analysis conducted to examine the intracellular localization of the mutant GR, the following was revealed. First, when cells transfected with wild-type GR were treated with a vehicle, the expressed GR protein was present in the cytoplasm. On the other hand, when the cells were treated with 100 nM dexamethasone, most GR proteins were present in the nucleus. The protein localization patterns of T504S mutant and S651F mutant were almost the same as those of the wild type.
[0070]
(V) Transcriptional activity of mutant GR
The result of the reporter assay performed to examine the transcriptional activity of the mutant GR is shown in FIG. In FIG. 3, luciferase activity is shown as a percentage (%) relative to the measured value of wild type GR treated with 100 nM dexamethasone. The bar in each plot represents the standard deviation (n = 3), and “**” represents P <0.001 in Fisher's PLSD method. COS-7 cells transfected with the empty vector plasmid alone did not show luciferase activity regardless of dexamethasone treatment. Cells transfected with wild type GR increased luciferase activity in proportion to dexamethasone dose. Cells transfected with the T504S mutant showed luciferase activity similar to the wild type. In contrast, cells transfected with the S651F mutant had significantly lower luciferase activity compared to the wild type, and when treated with 100 nM dexamethasone, the wild type luciferase activity was 65%. The transcriptional activity of mutant GR showed a good correlation with their protein expression level (FIG. 2).
[0071]
(3) Consideration
According to the above experimental results, it can be seen that the S651F mutation in the GR gene reduces both the protein expression level and the transcriptional activity to 65% of the wild type even though the mRNA expression level does not change (FIG. 1). ~ 3). This indicates that the decrease in protein expression level is due to protein instability or poor translation. Further, from the good correlation between the transcription activity and the protein expression level, it is considered that the decrease in the transcription activity is caused by the decrease in the protein expression level. This is supported by immunocytological data showing that S651F mutant GR translocates into the nucleus in response to dexamethasone. The 651th amino acid residue is located in the Hsp90 binding domain. Since Hsp90 stabilizes the GR protein, substitution of serine with phenylalanine at this position may affect the binding properties of Hsp90 to the mutant GR and may impair the stability of the mutant GR protein. .
[0072]
On the other hand, the T504S mutant shows the same mRNA level, protein level and transcriptional activity as the wild type.
[0073]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is an electrophoresis photograph showing the results of Northern blot analysis of GR transcripts of wild type, T504S mutant type and S651F mutant type.
FIG. 2 is an electrophoretogram showing the results of Western blot analysis of each of the wild-type, T504S mutant and S651F mutant GR proteins.
FIG. 3 is a graph showing the transcriptional activity of GR for each of the wild type, T504S mutant type and S651F mutant type.

Claims

A polynucleotide encoding a protein comprising a mutation of the 651st serine residue to a phenylalanine residue in the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

A polynucleotide comprising a genomic DNA sequence of a human glucocorticoid receptor gene, comprising a mutation of a codon encoding the 651st serine residue in SEQ ID NO: 2 to a codon encoding a phenylalanine residue The polynucleotide of claim 1 which is a polynucleotide.

The polynucleotide according to claim 1, comprising a nucleotide sequence in which the 1952st cytosine (C) residue is substituted with a thymine (T) residue in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.

A nucleic acid molecule capable of detecting a mutation in the glucocorticoid receptor gene, wherein the codon encoding the 651st serine residue of the glucocorticoid receptor protein is a codon encoding a phenylalanine residue,
A nucleotide sequence of a region containing a portion corresponding to the 651st serine residue in SEQ ID NO: 2 of the polynucleotide according to any one of claims 1 to 3, or a polynucleotide complementary thereto. A nucleic acid molecule consisting of

The region containing a portion corresponding to the 651st serine residue in SEQ ID NO: 2 of the polynucleotide according to any one of claims 1 to 3, can be amplified by a nucleic acid amplification method. A nucleic acid molecule according to 1.

The nucleic acid molecule according to claim 4 or 5 for use in determination of sensitivity to a glucocorticoid preparation.

In the glucocorticoid receptor gene, a primer pair for detecting a mutation in which the codon encoding the 651st serine residue of the glucocorticoid receptor protein is a codon encoding a phenylalanine residue,
A region comprising a portion corresponding to the 651st serine residue in SEQ ID NO: 2 of the polynucleotide according to any one of claims 1 to 3, which can be amplified by a nucleic acid amplification method, and one primer A primer pair, which is the nucleic acid molecule according to claim 4.

The primer pair according to claim 7 for use in determination of sensitivity to a glucocorticoid preparation.

A method of determining sensitivity to a glucocorticoid preparation by detecting a mutation in a glucocorticoid receptor gene,
Using the nucleic acid molecule according to any one of claims 4 to 6 and / or the primer pair according to claim 7 or 8, the 651st glucocorticoid receptor protein in the glucocorticoid receptor gene. A method comprising detecting the presence or absence of a mutation in which a codon encoding a serine residue is a codon encoding a phenylalanine residue.

A kit for determining sensitivity to a glucocorticoid preparation, comprising the nucleic acid molecule according to any one of claims 4 to 6 and / or the primer pair according to claim 7 or 8.

A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 having a mutation of the 651st serine residue to a phenylalanine residue.