JP4563659B2

JP4563659B2 - Antioxidant composition, composition for preventing skin aging, anti-inflammatory composition, and composition for improving lipid metabolism

Info

Publication number: JP4563659B2
Application number: JP2003180609A
Authority: JP
Inventors: 泰永山口; 了士高柿; 敏光神原
Original assignee: Maruzen Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Maruzen Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2003-06-25
Filing date: 2003-06-25
Publication date: 2010-10-13
Anticipated expiration: 2023-06-25
Also published as: JP2005015364A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、安全性の高い植物抽出物を有効成分として含有する抗酸化組成物、皮膚老化防止用組成物、抗炎症組成物及び脂質代謝改善用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ノブドウは別名蛇葡萄とも呼ばれる学名Ampelopsis brevipedunculata Trautv.のぶどう科植物であって、北海道から沖縄、中国、朝鮮半島の山野に自生する落葉つる植物である。
中国ではノブドウの葉部及び蔓部が利尿、胃熱嘔吐に効果があるとされ、古くから煎じて飲用されており、大腸菌、ブドウ球菌の抑制作用、止血作用も認められている。
【０００３】
また、ノブドウの果実をアルコールで浸出した浸出液を主成分して成る肝硬変の予防及び治療剤（特許文献１参照）、ノブドウ根のメタノール冷浸エキスを酢酸エチル−水混合溶媒で分配し、酢酸エチル層を濃縮して得られるノブドウ根抽出物よりなる肝疾患治療剤（特許文献２参照）、ノブドウに含まれる没食子酸エステルの有効量を含む線維化抑制剤（特許文献３参照）、ノブドウのエキスを主成分とする免疫調節剤（特許文献４参照）等が知られている。
しかしながら、ノブドウ抽出物の抗酸化作用、皮膚老化防止作用、抗炎症作用及び脂質代謝改善作用については知られていない。
【０００４】
【特許文献１】
特公昭６０−７９７４号公報
【特許文献２】
特開平２−４８５３３号公報
【特許文献３】
特開平５−２７１０６７号公報
【特許文献４】
特開平８−３０５２号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、第一に、安全性の高い天然物の中から、活性酸素消去作用及び／又はラジカル消去作用を有する物質を見出し、それを有効成分とした抗酸化組成物を提供することを目的とする。
【０００６】
また、本発明は、第二に、安全性の高い天然物の中から、活性酸素消去作用、ラジカル消去作用、線維芽細胞増殖作用及びエラスターゼ阻害作用からなる群より選ばれる１種又は２種以上の作用を有する物質を見出し、それを有効成分とした皮膚老化防止用組成物を提供することを目的とする。
【０００７】
さらに、本発明は、第三に、安全性の高い天然物の中から、ヒアルロニダーゼ阻害作用及び／又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害作用を有する物質を見出し、それを有効成分とした抗炎症組成物を提供することを目的とする。
【０００８】
さらに、本発明は、第四に、安全性の高い天然物の中から、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害作用を有する物質を見出し、それを有効成分とした脂質代謝改善用組成物を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明は、ノブドウ抽出物を有効成分として含有する線維芽細胞増殖用組成物を提供する。
【００１１】
本発明の線維芽細胞増殖用組成物において、前記ノブドウ抽出物が、水溶性有機溶媒、含水水溶性有機溶媒又は水を抽出溶媒とした抽出処理により得られたものであることが好ましい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において、「ノブドウ抽出物」には、ノブドウを抽出原料として得られる抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１５】
抽出原料として使用するノブドウの部位は特に限定されるものではないが、例えば、地上部を使用することができ、その中でも特に茎部、蔓部及び葉部の１種又は２種以上を使用することが好ましい。
【００１６】
抽出原料として使用するノブドウは、採取後ただちに乾燥し粉砕したものが適当である。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、ノブドウの極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１７】
抽出処理の際には、抽出溶媒として極性溶媒を使用することが好ましい。ノブドウに含まれる抗酸化作用、皮膚老化防止作用、抗炎症作用又は脂質代謝改善作用を示す成分は、極性溶媒を抽出溶媒とする抽出処理によって容易に抽出することができる。
【００１８】
極性溶媒の具体例としては、水、水溶性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。これら極性溶媒のうち、水溶性有機溶媒又は含水水溶性有機溶媒を使用することが好ましい。
【００１９】
抽出溶媒として使用し得る水には、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、滅菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等が含まれる。
【００２０】
抽出溶媒として使用し得る水溶性有機溶媒としては、低級脂肪族アルコール、アセトン、テトラヒドロフラン等が挙げられ、低級脂肪族アルコールの具体例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等の１価アルコール；１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、イソプロピレングリコール等の多価アルコール等が挙げられる。
抽出溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルセロソルブ等の中間極性溶媒を使用することもできる。
【００２１】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、含水水溶性有機溶媒を使用する場合、一価アルコール、多価アルコール、アセトン、テトラヒドロフラン等の含有量が１０重量％以上であることが好ましい。
【００２２】
抽出処理は、ノブドウに含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定されず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（重量比）の抽出溶媒にノブドウを浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を溶出させた後、ろ過して抽出残渣を除くことにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。精製は、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理、液−液向流分配処理等によって行うことができる。得られた抽出液はそのままでも抗酸化組成物、皮膚老化防止用組成物、抗炎症組成物又は脂質代謝改善用組成物の有効成分として使用することができるが、濃縮液又は乾燥物としたものの方が利用しやすい。
【００２３】
ノブドウ抽出物は、活性酸素消去作用及び／又はラジカル消去作用に基づいて抗酸化作用を発揮することができる。ここで、「活性酸素」には、スーパーオキサイド、過酸化水素、ヒドロキシラジカル、一重項酸素等が含まれる。また、「ラジカル」とは、不対電子を１つまたはそれ以上有する分子または原子を意味し、スーパーオキサイド、ヒドロキシラジカル、ＤＰＰＨ等が含まれる。
【００２４】
ノブドウ抽出物は、抗酸化作用を発揮することができるので、抗酸化組成物の有効成分として使用することができる。なお、ノブドウ抽出物は、活性酸素消去作用又はラジカル消去作用を有しているので、活性酸素消去用組成物又はラジカル消去用組成物の有効成分として使用することもできる。
【００２５】
本発明の抗酸化組成物は、体内における活性酸素濃度の上昇（例えば、体内における活性酸素過剰産生による活性酸素濃度の上昇、老人等におけるスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）作用低下による活性酸素濃度の上昇）に起因する疾患、例えば、関節リウマチ、心筋梗塞、糖尿病、腎炎、肩こり、冷え性等を効果的に予防及び／又は改善することができる。また、本発明の抗酸化組成物は、薬剤、飲食品、化粧料等に配合される油脂類等、活性酸素の働きにより酸化又は劣化する成分の変質を効果的に防止することができる。
【００２６】
皮膚は紫外線等の環境因子の影響を直接受けるため活性酸素が発生しやすい器官であるから、何らかの理由により生体の抗酸化作用が十分に働かないと活性酸素濃度が上昇し、それに起因してメラニンの異常産生、シワ、たるみ、肌荒れ等の皮膚老化現象が生じる。また、加齢により皮膚の細胞増殖能が鈍化すると細胞の更新が行われにくくなるとともに、細胞により生産されるコラーゲン等の細胞間成分の供給も不十分となり、それに起因してシワ、たるみ、くすみ等の皮膚老化現象が生じる。さらに、皮膚の弾性に関与するエラスチンが加水分解酵素であるエラスターゼにより分解されると、皮膚の弾力が減少し、シワ、たるみ等の皮膚老化現象が生じる。したがって、ノブドウ抽出物は、活性酸素消去作用、ラジカル消去作用、線維芽細胞増殖作用及びエラスターゼ阻害作用からなる群より選ばれる１種又は２種以上の作用に基づいて皮膚老化防止作用を発揮することができる。
【００２７】
ノブドウ抽出物は、皮膚老化防止作用を発揮することができるので、皮膚老化防止用組成物の有効成分として使用することができる。なお、ノブドウ抽出物は、線維芽細胞増殖作用又はエラスターゼ阻害作用を有しているので、線維芽細胞増殖用組成物又はエラスターゼ阻害用組成物の有効成分として利用することもできる。
本発明の皮膚老化防止用組成物は、皮膚の弾力低下、シワ、たるみ、肌荒れ等の皮膚老化現象を効果的に予防及び／又は改善することができる。
【００２８】
ヒアルロニダーゼは生体内の様々な組織に通常不活性な状態で存在するが活性化すると毛細血管の透過性を亢進すること、種々の炎症においてヒアルロニダーゼ活性が上昇すること、ヒアルロニダーゼを用いて実験的に急性炎症モデルを作製できること等の事実により、ヒアルロニダーゼが炎症反応に関与することが確認されており、ヒアルロニダーゼは起炎酵素とも呼ばれている。また、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼによりサイクリックＡＭＰが分解され、サイクリックＡＭＰ濃度が低下すると血小板凝集が生じ、血小板凝集はアラキドン酸カスケードのホスホリパーゼＡ２の活性化を招き、それにより放出されたロイコトリエンＢ４やプロスタグランジンＥ２等が炎症反応を引き起こす。したがって、ノブドウ抽出物は、ヒアルロニダーゼ阻害作用及び／又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害作用に基づいて抗炎症作用を発揮することができる。
【００２９】
ノブドウ抽出物は、抗炎症作用を発揮することができるので、抗炎症組成物の有効成分として使用することができる。なお、ノブドウ抽出物は、ヒアルロニダーゼ阻害作用又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害作用を有しているので、ヒアルロニダーゼ阻害用組成物又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害用組成物の有効成分として利用することもできる。
本発明の抗炎症組成物は、炎症性の疾患、例えば、接触性皮膚炎（かぶれ）、乾癬、尋常性天疱瘡等を効果的に予防及び／又は改善することができる。
【００３０】
脂質の代謝促進に関与しているサイクリックＡＭＰが、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼによって分解されると、脂質の代謝が抑制され、体脂肪の過剰蓄積等が生じる。したがって、ノブドウ抽出物は、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害作用に基づいて脂質代謝改善作用を発揮することができる。
すなわち、ノブドウ抽出物は、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性を阻害し、細胞内サイクリックＡＭＰ濃度を上昇させ、脂質の代謝を活発化させることにより、脂質代謝改善作用を発揮することができる。
ノブドウ抽出物は、脂質代謝改善作用を発揮することができるので、脂質代謝改善用組成物の有効成分として使用することができる。
本発明の脂質代謝改善用組成物は、脂質代謝を改善することにより肥満を予防及び／又は改善することができる。
【００３１】
本発明の各組成物において、「有効成分」とは、抗酸化作用、皮膚老化防止作用、抗炎症作用又は脂質代謝改善作用を有する成分を意味し、ノブドウ抽出物が本発明の各組成物の主成分である必要はなく、また、本発明の各組成物にはノブドウ抽出物以外に抗酸化作用、皮膚老化防止作用、抗炎症作用又は脂質代謝改善作用を有する成分が含まれていてもよい。
【００３２】
本発明の各組成物の形態は、目的とする作用効果が発揮され得る限り特に限定されるものではなく、その具体例としては、薬剤組成物、飲食品組成物、飼料組成物、化粧料組成物等が挙げられる。本発明の各組成物におけるノブドウ抽出物以外の成分は、組成物の形態に応じて適宜選択することができる。
【００３３】
薬剤組成物としては、例えば、内用又は外用の医薬品又は医薬部外品（すなわち内用剤又は外用剤）、飲食品や化粧料等に添加される添加剤等が挙げられる。
薬剤組成物は、例えば、ノブドウ抽出物に薬学的に許容され得る賦形剤その他任意の助剤（例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等）を配合することにより製造することができる。薬剤組成物の剤形としては、例えば、粉剤、顆粒剤、錠剤、液剤、噴霧剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。薬剤組成物の投与経路は、剤形等に基づいて適宜選択することができ、投与量及び投与回数は、目的とする作用効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等に応じて適宜調節することができる。
【００３４】
飲食品組成物及び飼料組成物は、ノブドウ抽出物に、例えば、デキストリン、デンプン等の糖類；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等を配合することにより製造することができる。
【００３５】
飲食品組成物は、ノブドウ抽出物をその活性を妨げないような任意の飲食品に配合することにより製造することもできる。ノブドウ抽出物を配合し得る飲食品は特に限定されないが、その具体例としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物、パン等が挙げられる。本発明の飲食品組成物は、飲料、錠剤、ハードカプセル、ソフトカプセル、顆粒等の形態に加工すると簡便に飲食することができる。ノブドウ抽出物は、脂質を含有しない飲食品に配合してもよいが、脂質を含有する飲食品に配合することが好ましい。こうして製造された飲食品組成物は、抗肥満用飲食品としてばかりでなく、美肌、痩身等の美容を目的とした飲食品、すなわち美容用飲食品としても使用することができる。
【００３６】
飼料組成物は、ノブドウ抽出物をその活性を妨げないような任意の飼料に配合することにより製造することもできる。ノブドウ抽出物を配合し得る飼料は特に限定されないが、その具体例としては、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
【００３７】
化粧料組成物は、ノブドウ抽出物に、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素消去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料等を配合することにより製造することができる。
また、化粧料組成物は、ノブドウ抽出物をその活性を妨げないような任意の化粧料に配合することにより製造することもできる。ノブドウ抽出物を配合し得る化粧料は特に限定されないが、その具体例としては、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、入浴剤、リップクリーム、口紅等の皮膚化粧料が挙げられる。
【００３８】
本発明の各組成物におけるノブドウ抽出物の配合量は、組成物の形態や抽出物の活性等に応じて適宜調整することができる。例えば、薬剤組成物に標準的なノブドウ抽出物を配合する場合、好適な配合率は、１〜１００重量％であり、特に好ましい配合率は１０〜５０重量％であり、飲食品組成物又は飼料組成物に標準的なノブドウ抽出物を配合する場合、好適な配合率は、０．０１〜５０重量％であり、特に好ましい配合率は０．１〜１０重量％であり、化粧料組成物に標準的なノブドウ抽出物を配合する場合、好適な配合率は、０．００１〜１重量％であり、特に好ましい配合率は０．０１〜０．１重量％であり、
【００３９】
【実施例】
以下、製造例、試験例及び配合例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。
〔製造例１〕
ノブドウの葉部及び蔓部の乾燥粉砕物１００ｇを１Ｌの３０％エタノール、５０％エタノール、８０％エタノールに浸漬し、２時間還流下に加熱した。その後、濾過して残渣を再び１Ｌのエタノールで同様に処理した。上記２回の処理により得られた抽出液を合わせて減圧下に濃縮し、それぞれ１４ｇ、９．９ｇ、７．８ｇの含水エタノール抽出エキスを得た。
【００４０】
〔製造例２〕
ノブドウの葉部及び蔓部の乾燥粉砕物１００ｇを１Ｌの熱水で２時間抽出処理した。その後、濾過して残渣を再び１Ｌの熱水で同様に処理した。上記２回の処理により得られた抽出液を合わせて減圧下に濃縮し、１０ｇの熱水抽出エキスを得た。
【００４１】
〔試験例１〕スーパーオキサイド消去作用試験
製造例１及び２で得られたエキスについてスーパーオキサイド消去作用を調べた。試験方法（ＮＢＴ法）は次の通りである。
１．試薬
（１）０．０５ＭＮａ_２ＣＯ_３緩衝液（ｐＨ１０.２）
（２）３ｍＭキサンチン溶液：キサンチン４５．６４ｍｇを上記（１）の緩衝液に溶解して１００ｍＬとした。
（３）３ｍＭＥＤＴＡ溶液：ＥＤＴＡ・２Ｎａ１１１．７ｍｇを蒸留水に溶解して１００ｍＬとした。
（４）ＢＳＡ溶液：ウシ血清アルブミン（Sigma）１５ｍｇを蒸留水に溶解して１００ｍＬとした。
（５）０．７５ｍＭＮＢＴ溶液：ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）６１．３２ｍｇを蒸留水に溶解して１００ｍＬとした。
（６）キサンチンオキシダーゼ溶液：キサンチンオキシダーゼを蒸留水で希釈した。濃度は下記「２．操作」の空試験における吸光度が０．２０〜０．２３の範囲に入るようにした。
（７）６ｍＭＣｕＣｌ_２溶液：ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ１０２．２９ｍｇを蒸留水に溶解して１００ｍＬとした。
【００４２】
２．操作
試験管にＮａ₂ＣＯ_３緩衝液２．４ｍＬをとり、これにキサンチン溶液、ＥＤＴＡ溶液、ＢＳＡ溶液、ＮＢＴ溶液、各０．１ｍＬを加えた。試料溶液（８０％エタノール溶液）０．１ｍＬを加え、２５℃で１０分間放置後、キサンチンオキシダーゼ溶液０．１ｍＬを加え、手早く攪拌し、２５℃でインキュベートした。２０分後にＣｕＣｌ_２溶液０．１ｍＬを加えて反応を停止させ、５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。別に、試料溶液の代わりに蒸留水を用いて空試験を行った。ＩＣ_５０（スーパーオキサイド５０％消去濃度）（μｇ／ｍＬ）を表１に示す。
【００４３】
【表１】

【００４４】
表１に示した結果から、ノブドウの含水エタノール抽出エキス、熱水抽出エキスがともにスーパーオキサイド消去作用を有していることが判明した。
【００４５】
〔試験例２〕一重項酸素消去作用試験
製造例１及び２で得られたエキスについて一重項酸素消去作用を調べた。試験法（赤血球溶血法）は次の通りである。
透明ガラス瓶（１０ｍＬ容）中で２％赤血球懸濁液５ｍＬ、試料を所定濃度で含むｐＨ７．４の等張リン酸緩衝液５ｍＬ、及び光増感剤（１０ｍＭヘマトポルフイリン−２０ｍＭ水酸化ナトリウム溶液）０．０１ｍＬを混合した。得られた溶液をメリーゴーランド上、７．５Ｗハロゲンランプで３５分間均一に照射して一重項酸素（^１Ｏ₂）を発生させ、赤血球の溶血を生じさせた。この反応溶液１ｍＬを採取し、等張リン酸緩衝液２ｍＬを加えて混合後、４℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。次いで、上清を採取し、波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。別に、赤血球を一部溶血させた上記反応溶液１ｍＬをとり、これに蒸留水２ｍＬを加えて完全に溶血させたものをコントロールとし、同様に吸光度測定を行った。測定された吸光度より次式により一重項酸素消去率を求めた。
【００４６】
一重項酸素消去率（％）＝（１−Ｂ／Ａ）×１００
なお、式中、「Ａ」はコントロールの吸光度、「Ｂ」は反応溶液上清の吸光度である。
試料濃度を段階的に減少させて上記消去率の測定を行い、一重項酸素消去率が５０％になる試料濃度（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。ＩＣ_５０（一重項酸素５０％消去濃度）（μｇ／ｍＬ）を表２に示す。
【００４７】
【表２】

【００４８】
表２に示した結果から、ノブドウの含水エタノール抽出エキス、熱水抽出エキスがともに一重項酸素消去作用を有していることが判明した。
【００４９】
〔試験例３〕ラジカル消去作用試験
製造例１及び２で得られたエキスについてラジカル消去作用を調べた。試験法（ＤＰＰＨ法）は次の通りである。
１．５×１０^４ＭＤＰＰＨメタノール溶液３ｍＬに試料溶液３ｍＬを加え、直ちに容器を密栓して振り混ぜ、３０分間静置した。その後、５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。対照試験として、試料溶液の代わりにその溶媒を用いて同様に操作し、５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。また空試験として、メタノール試料溶液３ｍＬを加えた後、直ちに５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。
測定された各吸光度により、次式によりラジカル消去率を算出した。
【００５０】
ラジカル消去率（％）＝〔１−（Ｂ−Ｃ）／Ａ〕×１００
なお、式中、「Ａ」は対照試験の吸光度、「Ｂ」は試料溶液を添加した場合の吸光度、「Ｃ」は空試験の吸光度を表す。
試料溶液の試料濃度を段階的に変更して上記消去率の測定を行い、ＤＰＰＨラジカル消去率が５０％になる試料溶液の濃度を内挿法により求めた。ＩＣ_５０（ラジカル５０％消去濃度）（μｇ／ｍＬ）を表３に示す。
【００５１】
【表３】

【００５２】
表３に示した結果から、ノブドウの含水エタノール抽出エキス、熱水抽出エキスがともにラジカル消去作用を有していることが判明した。
【００５３】
〔試験例４〕エラスターゼ阻害作用試験
製造例１で得られたエキスについてエラスターゼ阻害作用を調べた。試験方法は次の通りである。
９６穴マイクロプレートを用意し、１穴に対して試料溶液（溶媒：ＤＭＳＯ＋水）５０μＬ、基質溶液(2mM N-methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide)２５μＬ及びエラスターゼ溶液（ヒト好中球由来エラスターゼ；6μg/mL）を添加した。２５℃で３０分間反応させた後、反応液を採取して４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。上記と同様の酵素反応と吸光度測定を、試料溶液の代わりに試料溶液と等量の溶媒のみを添加して行った。さらにそれぞれの場合について、エラスターゼ溶液を添加せずに同じ操作と測定を行った。測定結果より、下記の式によりエラスターゼ阻害率を算出した。
【００５４】
エラスターゼ阻害率（％）＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００
なお、式中、「Ａ」は酵素添加・試料溶液添加時の吸光度、「Ｂ」は酵素無添加・試料溶液添加時の吸光度、「Ｃ」は酵素添加・試料溶液無添加時の吸光度、「Ｄ」は酵素無添加・試料溶液無添加時の吸光度を表す。
試料濃度を段階的に減少させて上記阻害率の測定を行い、阻害率が５０％になる試料濃度ＩＣ_５０（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。ＩＣ_５０（エラスターゼ５０％阻害濃度）（μｇ／ｍＬ）を表４に示す。
【００５５】
【表４】

【００５６】
表４に示した結果から、ノブドウの含水エタノール抽出エキスがエラスターゼ阻害作用を有していることが判明した。
【００５７】
〔試験例５〕線維芽細胞増殖作用試験
製造例１で得られたエキスについてNB1RBG細胞増殖作用を調べた。試験方法はＭＴＴ法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ, ９３，１５７，１９８６）に準拠して行った。
２５ｃｍ^２の培養フラスコに入れた１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ含有培地（α−ＭＥＭ培地：ＧＩＢＣＯＢＬＲ社製品，ｐＨ７．２）にヒト正常新生児皮膚繊維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）１×１０^６個を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２−９５％ａｉｒの下で４日間培養した。次いでトリプシン処理し、遠心分離して細胞を集めた。沈殿として得られた細胞を５ｖ／ｖ％ＦＢＳ含有培地（α−ＭＥＭ培地：ＧＩＢＣＯＢＬＲ社製品，ｐＨ７．２）に懸濁し、９６穴プレートの１穴につき７×１０^３個／１００μＬずつ分注した。２４時間培養後、試料を溶解した５ｖ／ｖ％ＦＢＳ含有培地を１穴につき１００μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ_２−９５％ａｉｒの下で３日間培養した。培養後、培地を１穴につき１００μＬずつ除去し、ＭＴＴ試薬（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙ１−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ, ５ｍｇ／ｍＬＰＢＳ(−)溶液）２０μＬを添加し、４．５時間インキュベーションした（増殖した細胞中のミトコンドリア由来の活性酸素がＭＴＴ試薬と反応し、黄色であった試薬の色が５７０ｎｍに吸収のピークを有する青黄色に変わる）。その後、各穴に１０重量％ドデシル硫酸ナトリウム−０．０２ｍｏｌ／Ｌ硫酸溶液を１００μＬずつ分注し、１８時間インキュベーションした。インキュベーション終了後、マイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。別に、試料の有無、細胞の有無を変えて、同様の操作を行い吸光度の測定を行った。また、各吸光度測定値は、同時に測定した６５０ｎｍの吸光度を差し引いて、増殖した細胞による濁度の影響を補正した。補正後の各吸光度より次式により細胞増殖促進率を求めた。
【００５８】
細胞増殖促進率（％）＝{（Ａ−Ｃ）−（Ｂ−Ｄ）}／（Ｂ−Ｄ）×１００
なお、式中、「Ａ」は試料添加時の吸光度、「Ｂ」は試料無添加時の吸光度、「Ｃ」は試料添加・細胞無添加時の吸光度、「Ｄ」は試料無添加・細胞無添加時の吸光度を表す。
試料濃度を段階的に減少させて上記消去率の測定を行い、線維芽細胞増殖率が５０％になる試料濃度（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表５に示す。
【００５９】
【表５】

【００６０】
表５に示した結果から、ノブドウの含水エタノール抽出エキスが線維芽細胞増殖作用を有していることが判明した。
【００６１】
〔試験例６〕ヒアルロニダーゼ阻害作用試験
製造例１で得られたエキスについてヒアルロニダーゼ阻害作用を調べた。試験方法は次の通りである。
ヒアルロニダーゼ溶液（４００ユニット／ｍＬ，ｐＨ３．５酢酸緩衝液）０．１ｍＬと試料溶液０．２ｍＬとを混合し、３７℃で２０分間インキュベートした後、活性化剤溶液（２．５ｍＭ−ＣａＣｌ_２）０．２ｍＬを加え、３７℃で２０分間インキュベートして酵素を活性化した。ヒアルロン酸カリウム緩衝液０．５ｍＬを加え、３７℃で４０分間インキュベートした後、０．４Ｎ水酸化ナトリウム０．２ｍＬを加えると共に氷冷して反応を停止させた。次いで０．８Ｍホウ酸溶液（ｐＨ９．１）０．２ｍＬを加え、沸騰浴中で３分間加熱後、直ちに２０分間氷冷した。Ｐ−ＤＡＢＡ試薬（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド１０ｇを１０Ｎ塩酸１２．５ｍＬと酢酸８７．５ｍＬの混合液に溶解し、酢酸で１０倍に希釈したもの）６．０ｍＬを加えて３７℃で２０分間インキュベートしたことにより、上記酵素反応で遊離したＮ−アセチルグルコサミンを発色させ、波長５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。同様の操作と吸光度測定を、酵素を添加せずに行った。さらに試料溶液を添加せずに蒸留水を添加した場合についても同様の測定を行い、次式によりヒアルロニダーゼ阻害率を求めた。
【００６２】
ヒアルロニダーゼ阻害率（％）＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００
なお、式中、「Ａ」は酵素添加・試料溶液添加時の吸光度、「Ｂ」は酵素無添加・試料溶液添加時の吸光度、「Ｃ」は酵素添加・試料溶液無添加時の吸光度、「Ｄ」は酵素無添加・試料溶液無添加時の吸光度を表す。
試料濃度を段階的に減少させて上記阻害率の測定を行い、阻害率が５０％になる試料濃度ＩＣ_５０（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表６に示す。
【００６３】
【表６】

【００６４】
表６に示した結果から、ノブドウの含水エタノール抽出エキスがヒアルロニダーゼ阻害作用を有していることが判明した。
【００６５】
〔試験例７〕サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害作用試験
製造例１で得られたエキスについてサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害作用を調べた。試験方法は次の通りである。
１．５ｍＭ塩化マグネシウムを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．２ｍＬにウシ胎児血清アルブミン溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ）０．１ｍＬ及びサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）０．１ｍＬを加え、さらに試料をそれぞれ含有する試料溶液０．０５ｍＬを加え、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、サイクリックＡＭＰ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）０．０５ｍＬを加え、３７℃で６０分間反応させた。反応後、沸騰水上で３分間煮沸して反応を停止させ、４℃で遠心分離し、上清中の反応基質（サイクリックＡＭＰ）を高速液体クロマトグラフィーにより定量した。
【００６６】
試料溶液を加えずに同様の酵素反応と反応基質の定量を行い、試料無添加時の反応基質量に対する試料添加時の反応基質の比率により、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害率（％）を求めた。
試料溶液の試料濃度を段階的に変化させてサイクリックAMPホスホジエステラーゼ阻害率（％）を測定し、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性を５０％阻害する試料濃度ＩＣ_５０（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。結果を表７に示す。
【００６７】
【表７】

【００６８】
表７に示した結果から、ノブドウの含水エタノール抽出エキスがサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害作用を有していることが判明した。
【００６９】
〔配合例１〕
下記の原料を均一に混合し、常法により顆粒状にした後、打錠し、錠剤状健康食品を製造した。
ノブドウ地上部５０％エタノール抽出物７５重量部
ウコン抽出物５０重量部
甘草抽出物５重量部
酵母エキス(アミノ酸、ビタミン含有) ２５重量部
粉糖１２３重量部
結晶セルロース１０重量部
ショ糖脂肪酸エステル１２重量部
【００７０】
〔配合例２〕
下記の原料を混合し、常法による打ち抜き法でソフトカプセル状の健康食品を製造した。
ノブドウ地上部水抽出物５０重量部
ビタミンＥ２５重量部
シリマリン６０重量部
牡蠣肉エキス２５重量部
植物油１１３重量部
グリセリン脂肪酸エステル１２重量部
ミツロウ１５重量部
【００７１】
〔配合例３〕
下記の原料を均一に混合し、常法により顆粒状にし、顆粒状健康食品を製造した。
ノブドウ地上部エタノール抽出物３０重量部
ギムネマエキス粉末２５重量部
大豆ペプチド６５重量部
マルチトール１６０重量部
結晶セルロース２０重量部
【００７２】
【発明の効果】
本発明により、安全性の高いノブドウ抽出物を有効成分として含有する抗酸化組成物、皮膚老化防止用組成物、抗炎症組成物及び脂質代謝改善用組成物が提供される。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an antioxidant composition, a composition for preventing skin aging, an anti-inflammatory composition, and a composition for improving lipid metabolism, which contain a highly safe plant extract as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
Grapevine is a grapevine plant with the scientific name Ampelopsis brevipedunculata Trautv. Also known as gabion, it is a deciduous vine plant that grows naturally in Hokkaido, Okinawa, China, and the Korean Peninsula.
In China, the leaves and vines of grapevine are said to be effective for diuresis and gastric fever, and have been decocted for a long time.
[0003]
In addition, a preventive and therapeutic agent for cirrhosis consisting mainly of a leachate obtained by leaching no grapefruit with alcohol (see Patent Document 1), a methanol cold soaked extract of no grape root with an ethyl acetate-water mixed solvent, and ethyl acetate A therapeutic agent for liver disease comprising a vine grape root extract obtained by concentrating a layer (see Patent Document 2), a fibrosis inhibitor (see Patent Document 3) containing an effective amount of a gallic acid ester contained in vine grape, and an extract of vine grape There are known immunomodulators (see Patent Document 4) and the like mainly composed of.
However, the antioxidant effect, anti-skin aging effect, anti-inflammatory effect and lipid metabolism improving effect of no grape extract are not known.
[0004]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Publication No. 60-7974
[Patent Document 2]
Japanese Patent Laid-Open No. 2-48533
[Patent Document 3]
Japanese Patent Laid-Open No. 5-271667
[Patent Document 4]
JP-A-8-3052
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
It is an object of the present invention to firstly find a substance having an active oxygen scavenging action and / or a radical scavenging action among highly safe natural products, and to provide an antioxidant composition containing the substance as an active ingredient. And
[0006]
In addition, the present invention is, secondly, one or more selected from the group consisting of active oxygen scavenging action, radical scavenging action, fibroblast proliferation action and elastase inhibitory action among highly safe natural products. An object of the present invention is to provide a composition for preventing skin aging, which has a substance having the above-mentioned action and uses it as an active ingredient.
[0007]
Furthermore, the present invention thirdly provides a substance having a hyaluronidase inhibitory action and / or a cyclic AMP phosphodiesterase inhibitory action among highly safe natural products, and provides an anti-inflammatory composition comprising the substance as an active ingredient. The purpose is to do.
[0008]
A fourth object of the present invention is to find a substance having a cyclic AMP phosphodiesterase inhibitory action from highly safe natural products, and to provide a composition for improving lipid metabolism using the substance as an active ingredient. And
[0009]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present invention provides a composition for proliferating fibroblasts, which contains a grape extract as an active ingredient.
[0011]
In the composition for proliferating fibroblasts of the present invention, it is preferable that the grape extract is obtained by an extraction treatment using a water-soluble organic solvent, a water-containing water-soluble organic solvent, or water as an extraction solvent.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present invention, the “no grape extract” refers to an extract obtained using no grape as an extraction raw material, a diluted or concentrated solution of the extract, a dried product obtained by drying the extract, or a crudely purified product thereof. Alternatively, any purified product is included.
[0015]
The part of wild grape used as the extraction raw material is not particularly limited. For example, the above-ground part can be used, and among them, one or more of stem part, vine part and leaf part are used. It is preferable.
[0016]
The grapes used as the raw material for extraction are suitably dried and pulverized immediately after collection. Drying may be performed in the sun or using a commonly used dryer. Moreover, after performing pre-processing, such as degreasing, with nonpolar solvents, such as hexane and benzene, you may use as an extraction raw material. By performing a pretreatment such as degreasing, the extraction process with the polar solvent of No grape can be efficiently performed.
[0017]
In the extraction process, it is preferable to use a polar solvent as the extraction solvent. Ingredients showing antioxidative action, skin aging preventive action, anti-inflammatory action or lipid metabolism improving action contained in grapevine can be easily extracted by extraction treatment using a polar solvent as an extraction solvent.
[0018]
Specific examples of the polar solvent include water and water-soluble organic solvents, and these can be used alone or in combination of two or more. Of these polar solvents, it is preferable to use a water-soluble organic solvent or a water-containing water-soluble organic solvent.
[0019]
Water that can be used as the extraction solvent includes pure water, tap water, well water, mineral spring water, mineral water, hot spring water, spring water, fresh water, and the like, as well as those subjected to various treatments. Examples of the treatment applied to water include purification, heating, sterilization, sterilization, filtration, ion exchange, adjustment of osmotic pressure, buffering, and the like. Therefore, the water that can be used as the extraction solvent in the present invention includes purified water, hot water, ion-exchanged water, physiological saline, phosphate buffer, phosphate buffered saline, and the like.
[0020]
Examples of water-soluble organic solvents that can be used as the extraction solvent include lower aliphatic alcohols, acetone, tetrahydrofuran, and the like. Specific examples of lower aliphatic alcohols include monohydric alcohols such as methanol, ethanol, propanol, and butanol; 1 , 3-butylene glycol, glycerin, propylene glycol, isopropylene glycol, and other polyhydric alcohols.
As the extraction solvent, an intermediate polar solvent such as ethyl acetate, butyl acetate or methyl cellosolve can be used.
[0021]
When using the liquid mixture of 2 or more types of polar solvents as an extraction solvent, the mixing ratio can be adjusted suitably. For example, when a water-containing water-soluble organic solvent is used, the content of monohydric alcohol, polyhydric alcohol, acetone, tetrahydrofuran or the like is preferably 10% by weight or more.
[0022]
The extraction treatment is not particularly limited as long as the soluble component contained in wild grape can be eluted in the extraction solvent, and can be performed according to a conventional method. For example, vine grapes are immersed in an extraction solvent 5 to 15 times the weight of the extraction raw material (weight ratio), and soluble components are eluted at room temperature or under reflux heating, followed by filtration to remove the extraction residue to obtain an extract. be able to. The obtained extract is diluted, concentrated, dried, purified, etc. according to a conventional method in order to obtain a diluted or concentrated solution of the extract, a dried product of the extract, or a crude purified product or a purified product thereof. Processing may be performed. Purification can be performed by, for example, activated carbon treatment, adsorption resin treatment, ion exchange resin treatment, liquid-liquid countercurrent distribution treatment, or the like. The obtained extract can be used as an active ingredient of an antioxidant composition, a composition for preventing skin aging, an anti-inflammatory composition, or a composition for improving lipid metabolism as it is, but it can be used as a concentrated solution or a dried product. It is easier to use.
[0023]
The grapevine extract can exert an antioxidant action based on the active oxygen scavenging action and / or the radical scavenging action. Here, “active oxygen” includes superoxide, hydrogen peroxide, hydroxy radical, singlet oxygen and the like. “Radical” means a molecule or atom having one or more unpaired electrons, and includes superoxide, hydroxy radical, DPPH and the like.
[0024]
Since the grape extract can exert an antioxidant action, it can be used as an active ingredient of an antioxidant composition. The grapevine extract has an active oxygen scavenging action or a radical scavenging action, and can therefore be used as an active ingredient of the active oxygen scavenging composition or radical scavenging composition.
[0025]
The antioxidant composition of the present invention has increased active oxygen concentration in the body (for example, increased active oxygen concentration due to excessive production of active oxygen in the body, increased active oxygen concentration due to decreased superoxide dismutase (SOD) action in the elderly). It is possible to effectively prevent and / or ameliorate diseases caused by the disease, such as rheumatoid arthritis, myocardial infarction, diabetes, nephritis, stiff shoulders, coldness and the like. Moreover, the antioxidant composition of the present invention can effectively prevent alteration of components that are oxidized or deteriorated by the action of active oxygen, such as oils and fats blended in drugs, foods and drinks, cosmetics and the like.
[0026]
Since the skin is directly affected by environmental factors such as ultraviolet rays, it is an organ that is prone to generate active oxygen. Therefore, for some reason, the active oxygen concentration rises if the body's antioxidant action does not work sufficiently, resulting in melanin. Skin aging phenomena such as abnormal production, wrinkles, sagging, and rough skin occur. In addition, when the cell growth ability of the skin slows down due to aging, renewal of cells becomes difficult, and supply of intercellular components such as collagen produced by cells becomes insufficient, resulting in wrinkles, sagging, dullness. Skin aging phenomenon occurs. Furthermore, when elastin involved in skin elasticity is decomposed by elastase, which is a hydrolase, the elasticity of the skin decreases, and skin aging phenomena such as wrinkles and sagging occur. Therefore, the grapevine extract exhibits a skin aging preventing action based on one or more actions selected from the group consisting of an active oxygen scavenging action, a radical scavenging action, a fibroblast proliferation action and an elastase inhibitory action. Can do.
[0027]
Since the grape extract can exert an anti-skin aging effect, it can be used as an active ingredient in a composition for preventing skin aging. In addition, since a grapevine extract has a fibroblast proliferation action or an elastase inhibitory action, it can also be utilized as an active ingredient of the composition for fibroblast proliferation or the composition for elastase inhibition.
The composition for preventing skin aging according to the present invention can effectively prevent and / or improve skin aging phenomena such as reduced skin elasticity, wrinkles, sagging and rough skin.
[0028]
Hyaluronidase is normally inactive in various tissues in the body, but when activated, it increases the permeability of capillaries, increases hyaluronidase activity in various inflammations, and is experimentally acute with hyaluronidase. It has been confirmed that hyaluronidase is involved in the inflammatory reaction due to the fact that an inflammation model can be prepared, and hyaluronidase is also called a pro-inflammatory enzyme. In addition, cyclic AMP is degraded by cyclic AMP phosphodiesterase, and when the cyclic AMP concentration is lowered, platelet aggregation occurs, and the platelet aggregation leads to activation of phospholipase A2 of the arachidonic acid cascade, and thus released leukotriene B4 and prostas. Grungein E2 etc. cause an inflammatory reaction. Therefore, the grapevine extract can exert an anti-inflammatory action based on a hyaluronidase inhibitory action and / or a cyclic AMP phosphodiesterase inhibitory action.
[0029]
Since grapevine extract can exert an anti-inflammatory action, it can be used as an active ingredient of an anti-inflammatory composition. In addition, since the grapevine extract has a hyaluronidase inhibitory action or a cyclic AMP phosphodiesterase inhibitory action, it can also be used as an active ingredient of a hyaluronidase inhibitory composition or a cyclic AMP phosphodiesterase inhibitory composition.
The anti-inflammatory composition of the present invention can effectively prevent and / or improve inflammatory diseases such as contact dermatitis (rash), psoriasis, pemphigus vulgaris and the like.
[0030]
When cyclic AMP involved in the promotion of lipid metabolism is degraded by cyclic AMP phosphodiesterase, lipid metabolism is suppressed, resulting in excessive accumulation of body fat. Therefore, the grape extract can exert a lipid metabolism improving action based on the cyclic AMP phosphodiesterase inhibitory action.
That is, the grapevine extract can exert a lipid metabolism improving action by inhibiting cyclic AMP phosphodiesterase activity, increasing intracellular cyclic AMP concentration, and activating lipid metabolism.
Since the grape extract can exert an action of improving lipid metabolism, it can be used as an active ingredient of a composition for improving lipid metabolism.
The composition for improving lipid metabolism of the present invention can prevent and / or improve obesity by improving lipid metabolism.
[0031]
In each composition of the present invention, the “active ingredient” means a component having an antioxidant action, an anti-skin aging action, an anti-inflammatory action or a lipid metabolism improving action, and the grape extract is used in each composition of the present invention. It is not necessary to be a main component, and each composition of the present invention may contain an ingredient having an antioxidative action, an anti-skin aging action, an anti-inflammatory action or a lipid metabolism improving action in addition to the grape extract. .
[0032]
The form of each composition of the present invention is not particularly limited as long as the intended effect can be exhibited. Specific examples thereof include a pharmaceutical composition, a food and drink composition, a feed composition, and a cosmetic composition. Thing etc. are mentioned. Components other than the grape extract in each composition of the present invention can be appropriately selected according to the form of the composition.
[0033]
Examples of the pharmaceutical composition include an internal or external pharmaceutical product or quasi-drug (ie, internal preparation or external preparation), an additive added to a food or drink, a cosmetic, and the like.
In the pharmaceutical composition, for example, vinegar extract is mixed with a pharmaceutically acceptable excipient or any other auxiliary agent (for example, binder, disintegrant, lubricant, stabilizer, flavoring / flavoring agent, etc.). Can be manufactured. Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition include powders, granules, tablets, solutions, sprays, capsules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like. The route of administration of the pharmaceutical composition can be appropriately selected based on the dosage form, etc., and the dosage and the number of administrations are appropriately adjusted according to the intended effect, administration method, treatment period, age, weight, etc. be able to.
[0034]
Food / beverage composition and feed composition can be obtained from, for example, sugar, such as dextrin and starch; proteins such as gelatin, soybean protein, and corn protein; amino acids such as alanine, glutamine, and isoleucine; cellulose, gum arabic, etc. It can be produced by blending oils and fats such as soybean oil and medium chain fatty acid triglycerides.
[0035]
The food / beverage product composition can also be produced by blending the grape extract in any food / beverage product that does not interfere with its activity. The food and drink that can be mixed with the grape extract is not particularly limited, but specific examples thereof include beverages such as soft drinks, carbonated drinks, nutritional drinks, fruit drinks, lactic acid drinks (concentrated concentrates and adjustment powders of these drinks). Ice cream, ice sherbet, shaved ice and other frozen desserts; buckwheat noodles, udon, harusame, gyoza skin, cucumber skin, Chinese noodles, instant noodles and other noodles; Sweets such as snacks, biscuits, jelly, jam, cream, baked goods; processed fishery and livestock products such as kamaboko, ham, sausage; dairy products such as processed milk and fermented milk; salad oil, tempura oil, margarine, mayonnaise, shortening , Whipped cream, fat and other processed foods such as dressings; seasonings such as sauces and sauces; soup, Chu, salad, prepared foods, pickles, bread and the like. The food / beverage composition of the present invention can be easily eaten or consumed when processed into a form such as a beverage, a tablet, a hard capsule, a soft capsule, or a granule. The grape extract may be blended in foods and drinks that do not contain lipids, but is preferably blended in foods and drinks that contain lipids. The food / beverage product composition produced in this way can be used not only as a food / beverage product for anti-obesity but also as a food / beverage product for beauty such as beautiful skin and slimming, that is, a food / beverage product for beauty.
[0036]
A feed composition can also be manufactured by mix | blending a grape extract with arbitrary feed which does not prevent the activity. The feed to which the grape extract can be blended is not particularly limited, and specific examples thereof include pet food, livestock feed, fish feed and the like.
[0037]
Cosmetic compositions can be obtained from grape extract, such as astringents, bactericides / antibacterial agents, whitening agents, UV absorbers, moisturizers, cell activators, anti-inflammatory / anti-allergic agents, antioxidant / active oxygen scavengers, oils and fats. , Waxes, hydrocarbons, fatty acids, alcohols, esters, surfactants, fragrances, and the like.
The cosmetic composition can also be produced by blending the grape extract with any cosmetic that does not interfere with its activity. Cosmetics to which the grape extract can be blended are not particularly limited, and specific examples thereof include skin cosmetics such as ointments, creams, emulsions, lotions, packs, bathing agents, lip balms, and lipsticks.
[0038]
The compounding amount of the grape extract in each composition of the present invention can be appropriately adjusted according to the form of the composition, the activity of the extract and the like. For example, when a standard grape extract is blended with the pharmaceutical composition, the preferred blending rate is 1 to 100% by weight, and the particularly preferred blending rate is 10 to 50% by weight. When a standard grape extract is blended in the composition, the preferred blending ratio is 0.01 to 50% by weight, and the particularly preferred blending ratio is 0.1 to 10% by weight. When blending a standard grape extract, a suitable blending ratio is 0.001 to 1% by weight, a particularly preferable blending ratio is 0.01 to 0.1% by weight,
[0039]
【Example】
Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail based on a manufacture example, a test example, and a compounding example, this invention is not limited to these content.
[Production Example 1]
100 g of dried pulverized leaves and vines were immersed in 1 L of 30% ethanol, 50% ethanol, and 80% ethanol and heated under reflux for 2 hours. Thereafter, the residue was filtered and the residue was again treated with 1 L of ethanol in the same manner. The extracts obtained by the above two treatments were combined and concentrated under reduced pressure to obtain 14 g, 9.9 g, and 7.8 g of a water-containing ethanol extract.
[0040]
[Production Example 2]
100 g of dried pulverized product of leaves and vines were extracted with 1 L of hot water for 2 hours. Then, it filtered and the residue was similarly processed with 1 L hot water again. The extracts obtained by the above two treatments were combined and concentrated under reduced pressure to obtain 10 g of hot water extract.
[0041]
[Test Example 1] Superoxide scavenging action test
The extracts obtained in Production Examples 1 and 2 were examined for superoxide scavenging action. The test method (NBT method) is as follows.
1. reagent
(1) 0.05M Na ₂ CO ₃ Buffer solution (pH 10.2)
(2) 3 mM xanthine solution: 45.64 mg of xanthine was dissolved in the buffer solution of the above (1) to make 100 mL.
(3) 3 mM EDTA solution: EDTA · 2Na 111.7 mg was dissolved in distilled water to make 100 mL.
(4) BSA solution: Bovine serum albumin (Sigma) 15 mg was dissolved in distilled water to make 100 mL.
(5) 0.75 mM NBT solution: 61.32 mg of NBT (nitroblue tetrazolium) was dissolved in distilled water to make 100 mL.
(6) Xanthine oxidase solution: Xanthine oxidase was diluted with distilled water. The concentration was such that the absorbance in the blank test of “2. Operation” below was in the range of 0.20 to 0.23.
(7) 6 mM CuCl ₂ Solution: CuCl ₂ ・ 2H ₂ 102.29 mg of O was dissolved in distilled water to make 100 mL.
[0042]
2. operation
Na in the test tube ₂ CO ₃ 2.4 mL of buffer solution was taken, and 0.1 mL each of xanthine solution, EDTA solution, BSA solution, and NBT solution were added thereto. 0.1 mL of the sample solution (80% ethanol solution) was added and allowed to stand at 25 ° C. for 10 minutes, and then 0.1 mL of the xanthine oxidase solution was added, stirred rapidly, and incubated at 25 ° C. CuCl after 20 minutes ₂ The reaction was stopped by adding 0.1 mL of the solution, and the absorbance at 560 nm was measured. Separately, a blank test was performed using distilled water instead of the sample solution. IC ₅₀ Table 1 shows (superoxide 50% erase concentration) (μg / mL).
[0043]
[Table 1]

[0044]
From the results shown in Table 1, it was found that both water-containing ethanol extract of grapevine and hot water extract have superoxide scavenging action.
[0045]
[Test Example 2] Singlet oxygen scavenging action test
The extracts obtained in Production Examples 1 and 2 were examined for singlet oxygen scavenging action. The test method (erythrocyte hemolysis method) is as follows.
5 mL of 2% red blood cell suspension in a clear glass bottle (10 mL volume), 5 mL of isotonic phosphate buffer pH 7.4 containing a sample at a predetermined concentration, and a photosensitizer (10 mM hematoporphyrin-20 mM sodium hydroxide solution) ) 0.01 mL was mixed. The resulting solution was uniformly irradiated on a merry-go-round with a 7.5 W halogen lamp for 35 minutes to produce singlet oxygen ( ¹ O ₂ ) To cause hemolysis of red blood cells. 1 mL of the reaction solution was collected, 2 mL of isotonic phosphate buffer was added and mixed, and then centrifuged at 4 ° C. and 3000 rpm for 5 minutes. Next, the supernatant was collected and the absorbance at a wavelength of 540 nm was measured. Separately, 1 mL of the reaction solution in which red blood cells were partially hemolyzed was taken, and 2 mL of distilled water was added thereto to completely hemolyze it, and the absorbance was measured in the same manner. The singlet oxygen scavenging rate was determined from the measured absorbance by the following formula.
[0046]
Singlet oxygen elimination rate (%) = (1−B / A) × 100
In the formula, “A” is the absorbance of the control, and “B” is the absorbance of the reaction solution supernatant.
The above-mentioned erasure rate was measured by decreasing the sample concentration stepwise, and the sample concentration (μg / mL) at which the singlet oxygen erasure rate was 50% was determined by interpolation. IC ₅₀ (Singlet oxygen 50% elimination concentration) (μg / mL) is shown in Table 2.
[0047]
[Table 2]

[0048]
From the results shown in Table 2, it was found that both the water-containing ethanol extract and the hot water extract of wild grapes have a singlet oxygen scavenging action.
[0049]
[Test Example 3] Radical scavenging action test
The radical scavenging action of the extracts obtained in Production Examples 1 and 2 was examined. The test method (DPPH method) is as follows.
1.5 × 10 ⁴ 3 mL of sample solution was added to 3 mL of MDPPH methanol solution, and the container was immediately sealed and shaken and allowed to stand for 30 minutes. Thereafter, the absorbance at 520 nm was measured. As a control test, the same operation was performed using the solvent instead of the sample solution, and the absorbance at 520 nm was measured. As a blank test, the absorbance at 520 nm was immediately measured after adding 3 mL of the methanol sample solution.
Based on each measured absorbance, the radical scavenging rate was calculated by the following formula.
[0050]
Radical scavenging rate (%) = [1- (BC) / A] × 100
In the formula, “A” represents the absorbance in the control test, “B” represents the absorbance when the sample solution was added, and “C” represents the absorbance in the blank test.
The above-mentioned erasure rate was measured while changing the sample concentration of the sample solution stepwise, and the concentration of the sample solution at which the DPPH radical erasure rate was 50% was determined by interpolation. IC ₅₀ (Radical 50% elimination concentration) (μg / mL) is shown in Table 3.
[0051]
[Table 3]

[0052]
From the results shown in Table 3, it was found that both the water-containing ethanol extract of grapevine and the hot water extract have a radical scavenging action.
[0053]
[Test Example 4] Elastase inhibitory action test
The extract obtained in Production Example 1 was examined for elastase inhibitory action. The test method is as follows.
Prepare a 96-well microplate. 50 μL of sample solution (solvent: DMSO + water), 25 μL of substrate solution (2 mM N-methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide) and elastase solution (human preferred) Neutrophil-derived elastase; 6 μg / mL) was added. After reacting at 25 ° C. for 30 minutes, the reaction solution was collected and the absorbance at 415 nm was measured. Enzymatic reaction and absorbance measurement similar to the above were performed by adding only the solvent equivalent to the sample solution instead of the sample solution. Further, in each case, the same operation and measurement were performed without adding the elastase solution. From the measurement results, the elastase inhibition rate was calculated by the following formula.
[0054]
Elastase inhibition rate (%) = {1− (A−B) / (C−D)} × 100
In the formula, “A” is the absorbance when the enzyme is added and the sample solution is added, “B” is the absorbance when the enzyme is not added and the sample solution is added, “C” is the absorbance when the enzyme is added and the sample solution is not added, “ “D” represents the absorbance when no enzyme was added and no sample solution was added.
Measure the above inhibition rate by decreasing the sample concentration step by step, and the sample concentration IC at which the inhibition rate becomes 50% ₅₀ (Μg / mL) was determined by interpolation. IC ₅₀ (Elastase 50% inhibitory concentration) (μg / mL) is shown in Table 4.
[0055]
[Table 4]

[0056]
From the results shown in Table 4, it was found that the water-containing ethanol extract of grapevine has an elastase inhibitory action.
[0057]
[Test Example 5] Fibroblast proliferation test
The extract obtained in Production Example 1 was examined for NB1RBG cell proliferation action. The test method was performed according to the MTT method (J. Immunol. Method, 93, 157, 1986).
25cm ² Human normal neonatal skin fibroblasts (NBIRGB) 1 × 10 in 10 v / v% FBS-containing medium (α-MEM medium: GIBCO BLR, product pH 7.2) ⁶ Seeded, 37 ° C, 5% CO ₂ Cultured for 4 days under -95% air. Cells were then collected by trypsinization and centrifugation. Cells obtained as a precipitate were suspended in a medium containing 5 v / v% FBS (α-MEM medium: GIBCO BLR, pH 7.2), and 7 × 10 6 per well of a 96-well plate. ³ Dispense / 100 μL. After culturing for 24 hours, 100 μL per well of 5 v / v% FBS-containing medium in which the sample was dissolved was added, and the mixture was incubated at 37 ° C., 5% CO ₂ -Cultured for 3 days under -95% air. After the culture, the medium was removed by 100 μL per well, and MTT reagent (3- (4,5-dimethyl1-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide, 5 mg / mL PBS (−) solution) 20 μL Was added and incubated for 4.5 hours (reactive oxygen from mitochondria in the grown cells reacted with the MTT reagent, and the color of the reagent that was yellow turns blue-yellow with an absorption peak at 570 nm). Thereafter, 100 μL of 10 wt% sodium dodecyl sulfate-0.02 mol / L sulfuric acid solution was dispensed into each well and incubated for 18 hours. After completion of the incubation, the absorbance at 570 nm was measured using a microplate reader. Separately, the absorbance was measured by changing the presence / absence of the sample and the presence / absence of cells. In addition, each absorbance measurement value was corrected by subtracting the absorbance measured at 650 nm at the same time to correct the influence of turbidity caused by the grown cells. From each corrected absorbance, the cell growth promotion rate was determined by the following formula.
[0058]
Cell growth promotion rate (%) = {(AC)-(BD)} / (BD) × 100
In the formula, “A” is the absorbance when the sample is added, “B” is the absorbance when the sample is not added, “C” is the absorbance when the sample is added and no cell is added, and “D” is the sample added and no cell is added. It represents the absorbance at the time of addition.
The elimination rate was measured by decreasing the sample concentration stepwise, and the sample concentration (μg / mL) at which the fibroblast proliferation rate was 50% was determined by interpolation. The results are shown in Table 5.
[0059]
[Table 5]

[0060]
From the results shown in Table 5, it was found that the water-containing ethanol extract of grapevine has a fibroblast proliferation action.
[0061]
[Test Example 6] Hyaluronidase inhibitory action test
The extract obtained in Production Example 1 was examined for hyaluronidase inhibitory action. The test method is as follows.
After mixing 0.1 mL of a hyaluronidase solution (400 units / mL, pH 3.5 acetate buffer) and 0.2 mL of a sample solution and incubating at 37 ° C. for 20 minutes, an activator solution (2.5 mM-CaCl ₂ ) 0.2 mL was added and incubated at 37 ° C. for 20 minutes to activate the enzyme. After adding 0.5 mL of potassium hyaluronate buffer and incubating at 37 ° C. for 40 minutes, 0.2 mL of 0.4N sodium hydroxide was added and ice-cooled to stop the reaction. Next, 0.2 mL of 0.8 M boric acid solution (pH 9.1) was added, heated in a boiling bath for 3 minutes, and immediately cooled on ice for 20 minutes. Add 6.0 mL of P-DABA reagent (10 g of p-dimethylaminobenzaldehyde dissolved in 12.5 mL of 10N hydrochloric acid and 87.5 mL of acetic acid and dilute 10-fold with acetic acid) and incubate at 37 ° C. for 20 minutes As a result, N-acetylglucosamine released by the enzyme reaction was colored and the absorbance at a wavelength of 585 nm was measured. The same operation and absorbance measurement were performed without adding the enzyme. Furthermore, the same measurement was performed when distilled water was added without adding the sample solution, and the hyaluronidase inhibition rate was determined by the following equation.
[0062]
Hyaluronidase inhibition rate (%) = {1− (A−B) / (C−D)} × 100
In the formula, “A” is the absorbance when the enzyme is added and the sample solution is added, “B” is the absorbance when the enzyme is not added and the sample solution is added, “C” is the absorbance when the enzyme is added and the sample solution is not added, “ “D” represents the absorbance when no enzyme was added and no sample solution was added.
Measure the above inhibition rate by decreasing the sample concentration step by step, and the sample concentration IC at which the inhibition rate becomes 50% ₅₀ (Μg / mL) was determined by interpolation. The results are shown in Table 6.
[0063]
[Table 6]

[0064]
From the results shown in Table 6, it was found that the water-containing ethanol extract of grapevine has a hyaluronidase inhibitory action.
[0065]
[Test Example 7] Cyclic AMP phosphodiesterase inhibitory action test
The extract obtained in Production Example 1 was examined for cyclic AMP phosphodiesterase inhibitory action. The test method is as follows.
0.2 mL of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 1.5 mM magnesium chloride, 0.1 mL of fetal bovine serum albumin solution (2.5 mg / mL) and cyclic AMP phosphodiesterase solution (0.1 mg / mL) 0.1 mL was added, and 0.05 mL of a sample solution containing each sample was further added, and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. Next, 0.05 mL of a cyclic AMP solution (0.5 mg / mL) was added and reacted at 37 ° C. for 60 minutes. After the reaction, the reaction was stopped by boiling for 3 minutes in boiling water, centrifuged at 4 ° C., and the reaction substrate (cyclic AMP) in the supernatant was quantified by high performance liquid chromatography.
[0066]
The same enzyme reaction and reaction substrate were quantified without adding the sample solution, and the cyclic AMP phosphodiesterase inhibition rate (%) was determined from the ratio of the reaction substrate when the sample was added to the reaction group mass when no sample was added.
Sample concentration IC which measures cyclic AMP phosphodiesterase inhibition rate (%) by changing sample concentration of sample solution stepwise and inhibits cyclic AMP phosphodiesterase activity by 50% ₅₀ (Μg / mL) was determined by interpolation. The results are shown in Table 7.
[0067]
[Table 7]

[0068]
From the results shown in Table 7, it was found that the water-containing ethanol extract of grapevine has a cyclic AMP phosphodiesterase inhibitory action.
[0069]
[Formulation Example 1]
The following raw materials were uniformly mixed, granulated by a conventional method, and then tableted to produce a tablet-like health food.
No grape terrestrial 50% ethanol extract 75 parts by weight
Turmeric extract 50 parts by weight
Licorice extract 5 parts by weight
Yeast extract (containing amino acids and vitamins) 25 parts by weight
123 parts by weight of powdered sugar
10 parts by weight of crystalline cellulose
Sucrose fatty acid ester 12 parts by weight
[0070]
[Formulation Example 2]
The following ingredients were mixed and a soft capsule-shaped health food was produced by a conventional punching method.
50 parts by weight
Vitamin E 25 parts by weight
60 parts by weight of silymarin
25 parts by weight of oyster meat extract
113 parts by weight of vegetable oil
Glycerin fatty acid ester 12 parts by weight
15 parts by weight of beeswax
[0071]
[Composition Example 3]
The following raw materials were uniformly mixed and granulated by a conventional method to produce a granular health food.
30 parts by weight
Gymnema extract powder 25 parts by weight
65 parts by weight of soy peptide
160 parts by weight of maltitol
20 parts by weight of crystalline cellulose
[0072]
【The invention's effect】
INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, an antioxidant composition, an anti-skin aging composition, an anti-inflammatory composition, and a composition for improving lipid metabolism, which contain highly safe grapevine extract as an active ingredient, are provided.

Claims

A composition for proliferating fibroblasts, comprising a grape extract as an active ingredient.

The composition for proliferating fibroblasts according to claim 1 , wherein the grape extract is obtained by an extraction treatment using a water-soluble organic solvent, a water-containing water-soluble organic solvent, or water as an extraction solvent.