JP4555681B2 - 抗オーロラ−aモノクローナル抗体、該抗体を得る方法、並びに癌の診断および処置のための該抗体の使用 - Google Patents
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Description
上記ヒトまたはマウスのオーロラ−Aタンパク質を含有するメンブレン上に固定することができる、
免疫沈降により上記ヒトおよびマウスのオーロラ−Aタンパク質の検出、適切な場合には精製を可能にする、
上記オーロラ−Aタンパク質が分泌される生物組織の染色を可能にする、および
上記ヒトおよびマウスのオーロラ−Aタンパク質の酵素活性を阻害しない、
を有する抗オーロラ−Aモノクローナル抗体であって、
該モノクローナル抗体が、以下の工程:
−ゲノム中にオーロラ−AをコードするヒトcDNAが挿入された細菌発現ベクターにより形質転換されたE.coli細菌により産生された組み換えオーロラ−Aタンパク質キナーゼを15日間にわたってマウスに5回注射し、上記マウスを犠牲死させ、これらのマウスの脾臓細胞と培養物中で不死化されたハムスター細胞とを融合させてハイブリドーマを得る工程、
−前の工程中で上記マウスの免疫感作に用いられた上記組み換えタンパク質を免疫沈降することができる抗体を産生する上記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第1のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養ヒトHeLa細胞の抽出物由来の内因性(endogenous)オーロラ−Aタンパク質を免疫沈降することができる抗体を産生する、前の工程で回収された上記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第2のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養ヒト細胞の中心体および紡錘体極を間接免疫蛍光法で認識することができる抗体を産生する、前の工程で回収された上記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第3のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養マウス細胞の抽出物由来のマウスの内因性オーロラ−Aタンパク質を免疫沈降することができる抗体を産生する、前の工程で回収された上記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第4のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養マウス細胞の中心体および紡錘体極を間接免疫蛍光法で認識することができる抗体を産生する、前の工程で回収した上記ハイブリドーマをスクリーニングする工程、
−前のスクリーニング工程後に陽性のハイブリドーマをクローニングすることにより回収および精製し、先に定義した特性をすべて有するモノクローナル抗体を産生する工程、
により得られるモノクローナル抗体に関する。
個体から採取した生物学的試料の存在下に先に定義したモノクローナル抗体、より具体的には先に言及した35C1抗体を置く工程(該抗体は適切な場合には固体支持体上に固定される)、
前の工程中にモノクローナル抗体と生物試料中に存在し得る上記オーロラ−Aタンパク質との間で形成された複合体中の上記オーロラ−Aタンパク質に結合した上記モノクローナル抗体または上記モノクローナル抗体に結合した上記オーロラ−Aタンパク質のいずれかを認識する有標の試薬、特に有標の抗体を用いて、上記生物学的試料中に存在し得る前記オーロラ−Aタンパク質を検出し、適切な場合には定量化する工程(これは必要な場合には上記固体支持体を適当にリンスした後に行う)、
を含むことを特徴とする方法である。
先に定義した抗オーロラ−Aモノクローナル抗体、より具体的には先に言及した35C1抗体、
適切な場合には、PCNAタンパク質のマーカー、特に抗PCNA抗体などの細胞増殖マーカー、
を含むことを特徴とする先に定義した診断方法を行うためのキットである。
−種々の癌(乳癌、結腸癌など)に由来する系などの細胞を、試験された阻害剤により処置する工程、
−上記定義のモノクローナル抗体、より具体的には先に言及した35C1抗体を用いてオーロラ−Aタンパク質キナーゼを免疫沈降し、具体的には以下のパラグラフ3.g)に従った方法によりキナーゼ活性を測定する工程、
を含むことを特徴とするオーロラ−Aキナーゼの阻害剤をスクリーニングする方法である。
−ゲノム中にオーロラ−AをコードするヒトcDNAが挿入された細菌発現ベクターにより形質転換されたE.coli細菌により産生された組み換えオーロラ−Aタンパク質キナーゼを15日間にわたってマウスに5回注射し、上記マウスを犠牲死させ、これらのマウスの脾臓細胞と培養において不死化されたハムスター細胞とを融合させてハイブリドーマを得る工程、
−前の工程中で上記マウスの免疫感作に用いられた上記組み換えタンパク質を免疫沈降することができる抗体を産生する上記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第1のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養ヒトHeLa細胞の抽出物由来の内因性オーロラ−Aタンパク質を免疫沈降することができる抗体を産生する、前の工程で回収された上記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第2のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養ヒト細胞の中心体および紡錘体極を間接免疫蛍光法で認識することができる抗体を産生する、前の工程で回収された上記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第3のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養マウス細胞の抽出物由来のマウスの内因性オーロラ−Aタンパク質を免疫沈降することができる抗体を産生する、前の工程で回収された上記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第4のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養マウス細胞の中心体および紡錘体極を間接免疫蛍光法で認識することができる抗体を産生する、前の工程で回収した上記ハイブリドーマをスクリーニングする工程、
−前のスクリーニング工程後に陽性のハイブリドーマをクローニングすることにより回収および精製し、上記定義の特性をすべて有するモノクローナル抗体を産生する工程、
を含むことを特徴とする、上記定義のモノクローナル抗体、より具体的には先に言及した35C1抗体の調製方法に関する。
該抗体は、ウエスタンブロット(ニトロセルロースまたはナイロンメンブレン上でのタンパク質の間接免疫検出)に用いることができる、
該抗体は、培養細胞中のタンパク質を間接免疫検出により位置を特定することを可能にする、
該抗体は、インビトロでのキナーゼの酵素活性を阻害しない、
該抗体は、無細胞抽出物由来のオーロラ−Aキナーゼを免疫沈降により精製することを可能にする、
該抗体は、オーロラ−Aのキナーゼ活性を阻害しないので、病理を示す組織から調製されるタンパク質抽出物でのキナーゼ活性をアッセイするのに用いることができる。
ヒトオーロラ−AキナーゼをコードするcDNAを、6個の追加のヒスチジン残基を含有する組み換えタンパク質の産生を可能とする細菌発現ベクターpET29(供給者Novagen)中にクローニングした。タンパク質分解酵素が欠失し、かつ、凍結融解後にリゾチームの産生によって自己溶解する(これらの特性はすべてタンパク質の精製を容易にする)E.coli細菌(供給者Promega)のBL21(DE3)pLysS株を用いた。増殖期(OD600=0.6)における細菌中のオーロラ−A−(His)6−タンパク質の過剰発現は、1mMのIPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトシド)を添加することにより22℃で4時間にわたって誘導する。次いで、自己溶解特性に加えてリゾチームおよび超音波を用い、4℃で細菌を溶解した。次いで、オーロラ−A−(His)6−タンパク質をニッケルカラムNi−NTA−アガロース(供給者Qiagen)でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。Qiagenの指示書に従って、250mMのイミダゾールでタンパク質を溶出した。次いで、精製タンパク質をcentricon YM-10(供給者Millipore)に通過させ、PBS溶液(NaCl 136mM、KCl 26mM、Na2HPO4 2mM、KH2PO4 2mM、pH7.2)中に置いた。タンパク質画分15μgを調製し、凍結乾燥し、4℃で保存した。
50%フロイント完全アジュバント(供給者Sigma)に希釈した組み換えオーロラ−Aタンパク質15μgで、腹腔内経路により、BALB/cマウスを免疫感作した。次いで、3週間の間隔をおいて、50%フロイント完全アジュバントに希釈したオーロラ−Aタンパク質15μgでマウスに2度注射した。抗オーロラ−A抗体がマウスの血液中に検出されたとき、該マウスを犠牲死させ、脾臓を取り除いた。ダウンス型のホモジェナイザーにより、懸濁している細胞をこの脾臓から得た。
a)ELISA
4μg/mlの組み換えオーロラ−Aタンパクを含有するPBS100μlをElisaプレート(96ウェルプレート)の各ウェル中に投入し、4℃で36時間インキュベートした。PBSで2回洗浄した後、ウェルを3%BSA(ウシ血清アルブミン、供給者Sigma)を含有するPBSで満たし、該プレートを4℃で一晩インキュベートした。次の日、各々の融合上清100μlを、組み換えオーロラ−Aを含有するこれらの96ウェルプレートに移した。これらのプレートを周囲温度で2時間インキュベートした。PBS/BSAで2回洗浄した後、ホスファターゼ結合抗マウス抗体(Sigma Biochemical)とともにインキュベートした。次いで、ウェルをPBSで2回、AP溶液(100mM Tris pH9.5、100mM NaClおよび5mM MgCl2)で1回洗浄した。合成ホスファターゼ基質(4−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物塩)(供給者Merck)を5mg/ml含有するAP溶液50μlでウェルを満たした後、ウェル中に黄色の染色が現れることにより、モノクローナル抗体の存在を検出した。
96ウェルプレート(8×12)10枚をELISA試験により分析したが、あまり再現性ある結果が出なかった。次いで、以下の方式により、これらのプレートをウエスタンブロットにより試験した。従来に記載された技術(Roghiら、1998)に従い、組み換えオーロラ−Aタンパク質をポリアクリルアミド−SDSゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロースメンブレン上に移した。メンブレンを切り取りオーロラ−Aタンパク質が移動した位置に対応する領域を単離した。5%ミルクを含有するTBST溶液(20mM Tris−HCl pH7.5、150mM NaCl、0.05% Tween 20)中で4℃で2時間インキュベーションすることにより、メンブレン側をブロッキングした。次いで、2.5%ミルクを含有するTBST溶液で1:100に希釈された細胞上清とともに4℃で1時間、各メンブレン端をインキュベーションした。製造者が薦める希釈でペルオキシダーゼまたはホスファターゼ(供給者Sigma Chemicals)のいずれかと結合させた第2の抗マウス抗体を用いて、免疫複合体を同定した。反応物の現像を、ペルオキシダーゼ(供給者Amersham Pharmacia Biotech)の場合には、供給者の指示書に従って化学発光技術により実施し、ホスファターゼの場合には製造者の指示書に従って2つの基質NBT/BCIP(供給者Sigma Chemicals)を用いて比色法により実施した。
今回は同じウエスタンブロット技術を用いて、培養ヒト細胞から調製された全無細胞抽出物のすべてのタンパク質からオーロラ−Aタンパク質を認識することができる上清を特定した。
培養ヒト細胞の中心体を装飾することができる抗体を選択するために、追加の工程をスクリーニングに取り入れた。細胞の選択は乳癌に由来する細胞系MCF7に対するものとしたが、その理由はこれらの細胞中でオーロラ−Aタンパク質が過剰発現することが報告されていたからである。
スクリーニングの選択性を増大させる目的で、マウスのオーロラ−Aのオーソロガスなタンパク質に対して4つの上清を試験した。培養マウス細胞であるm−ICc12細胞の無細胞抽出物に対するウエスタンブロットにより第1のスクリーニングを行った。ヒト細胞について無細胞抽出物を調製し、上述と同じ方法でウエスタンブロットを行った。上清のうち2つは、46kD(マウスオーロラ−Aキナーゼに対しても予想されるサイズ)のタンパク質を認識することができた。
ウエスタンブロットを用いて先に特定した2つの上清が培養マウス細胞の中心体を装飾することができるかどうかを検証した。LLC1細胞を選択したが、その理由は該LLC1細胞が非常に高い分裂指数を示すためである。2つの抗体のうち1つだけが中心体および紡錘体極におけるタンパク質の位置特定を可能とし、この位置特定はマウスのオーロラ−Aタンパク質キナーゼについて予想されたものであった。
オーロラ−Aキナーゼ活性の測定を、図5ではミエリン塩基性タンパク質(MBP)4μg(供給者Sigma Chemicals)をまたは図6ではGST−H3タンパク質を産生する細菌の抽出物10μlを含有する、1μCiの[γ−32P]ATP3000Ci/mmoleを含むTris−HCl 50mM pH7.5、NaCl 50mM、DDT 1mM、MgCl2 10mM、およびATP 10μM(供給者Amersham Pharmacia Chemicals)20μl中で行った。反応物を37℃で10分間インキュベーションした。反応物10μlを計数中(図5)、またはポリアクリルアミド−SDSゲル上での移動、乾燥、オートラジオグラフィーによる検査の後(図6)に解析した。
選択した上清は、融合後に得られた細胞の不均一混合物(heterogeneous mixture)を含有していた。限界希釈を行ってこれらの細胞を継代培養し、20のクローンを得た。組み換えオーロラ−Aタンパク質に対するウエスタンブロットを用いてこれらの20のクローンの上清を試験すると、8つが陽性反応を生じた。これらの8つの上清をヒトHeLa細胞の抽出物、マウスm−ICc12細胞の抽出物に対して試験した。2つの上清だけを保持した。
該抗体は、ウエスタンブロットを用いて全無細胞抽出物中でヒトおよびマウスのオーロラ−Aタンパク質キナーゼを特異的に認識する(図1)。
Claims (9)
- ヒトおよびマウスのオーロラ−Aキナーゼを特異的に認識し、以下の特性:
前記ヒトまたはマウスのオーロラ−Aタンパク質を含有するメンブレン上に固定することができる、
免疫沈降により前記ヒトおよびマウスのオーロラ−Aタンパク質の検出、適切な場合には精製を可能にする、
前記オーロラ−Aタンパク質が分泌される生物組織の染色を可能にする、および
前記ヒトおよびマウスのオーロラ−Aタンパク質の酵素活性を阻害しない、
を有する抗オーロラ−Aモノクローナル抗体であって、
該モノクローナル抗体が、以下の工程:
−ゲノム中にオーロラ−AをコードするヒトcDNAが挿入された細菌発現ベクターにより形質転換されたE.coli細菌により産生された組み換えオーロラ−Aタンパク質キナーゼを15日間にわたってマウスに5回注射し、前記マウスを犠牲死させ、これらのマウスの脾臓細胞と培養において不死化されたハムスター細胞とを融合させてハイブリドーマを得る工程、
−前の工程中で前記マウスの免疫感作に用いられた前記組み換えタンパク質を免疫沈降することができる抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、この第1のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養ヒトHeLa細胞の抽出物由来の内因性オーロラ−Aタンパク質を免疫沈降することができる抗体を産生する、前の工程で回収された前記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第2のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養ヒト細胞の中心体および紡錘体極を間接免疫蛍光法で認識することができる抗体を産生する、前の工程で回収された前記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第3のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養マウス細胞の抽出物由来のマウスの内因性オーロラ−Aタンパク質を免疫沈降することができる抗体を産生する、前の工程で回収された前記ハイブリドーマをスクリーニングし、この第4のスクリーニング後に陽性のハイブリドーマを回収する工程、
−培養マウス細胞の中心体および紡錘体極を間接免疫蛍光法で認識することができる抗体を産生する、前の工程で回収した前記ハイブリドーマをスクリーニングする工程、
−前のスクリーニング工程後に陽性のハイブリドーマをクローニングすることにより回収および精製し、先に定義した特性をすべて有するモノクローナル抗体を産生する工程、
により得られる、
パスツール研究所のCollection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)に番号I−3050で寄託されているハイブリドーマにより分泌され、35CI抗体とも呼ばれる、前記抗オーロラ−Aモノクローナル抗体。 - ヒトまたは動物での癌のインビトロ診断法を行うための、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 乳癌、胃癌、および結腸直腸癌を含む充実性腫瘍のインビトロ診断法を行うための、請求項2項に記載のモノクローナル抗体。
- PCNAタンパク質のマーカーを含む細胞増殖マーカーを併用する、請求項2または3に記載の抗体。
- ヒトまたは動物での、請求項3に記載の癌のインビトロ検出法であって、以下の工程:
−個体から採取した生物試料の存在下に請求項1に記載のモノクローナル抗体を置く工程(該抗体は、適切な場合には固体支持体上に固定される)、
−前の工程中に前記モノクローナル抗体と前記生物試料中に存在し得る前記オーロラ−Aタンパク質とで形成された複合体中の前記オーロラ−Aタンパク質に結合した前記モノクローナル抗体または前記モノクローナル抗体に結合した前記オーロラ−Aタンパク質のいずれかを認識する、標識化された試薬を用いて、前記生物試料中に存在し得る前記オーロラ−Aタンパク質を検出し、適切な場合には定量化する工程(これは必要な場合には前記固体支持体を適当にリンスした後に行う)、
を含むことを特徴とする、前記方法。 - 前記標識化された試薬が、標識化された抗体である、請求項5に記載の癌のインビトロ検出方法。
- 前記生物試料中の、正常な生理学的値より低いまたは高いオーロラ−Aタンパク質の量の決定が、診断される癌に対してそれぞれ良好なまたは劣悪な予後を示すことを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- 以下:
請求項1に記載の抗オーロラ−Aモノクローナル抗体、
適切な場合には、PCNAタンパク質のマーカーを含む細胞増殖マーカー、
を含むことを特徴とする、請求項5または6に記載のインビトロ検出方法を行うためのキット。 - 前記マーカーが、抗PCNA抗体である、請求項8に記載のインビトロ検出方法を行うためのキット。
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