JP4542636B2

JP4542636B2 - トランスジェニック動物

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Publication number: JP4542636B2
Application number: JP32334098A
Authority: JP
Inventors: 一烏山; 博通米川; 長治多屋; 邦枝松岡
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 1997-11-14
Filing date: 1998-11-13
Publication date: 2010-09-15
Anticipated expiration: 2018-11-13
Also published as: JPH11220975A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗アレルギー薬の探索または評価のためのアレルギー動物モデルとして有用なトランスジェニック動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アトピー等のアレルギー反応は、アレルゲンに特異的に結合したイムノグロブリンＥ（以下「ＩｇＥ」という）が、マスト細胞上のＩｇＥレセプターを架橋することによって開始される。そして、マスト細胞からヒスタミン等メディエーターの放出が起こり、アレルギー反応を呈するようになる。今日、アレルギーの治療は主として抗ヒスタミン剤や抗炎症ステロイド剤等によるものであるが、それら以外の作用点を有する、より特異的な治療方法の開発は、適切な実験動物がないことにより妨げられている。
【０００３】
従来、実験動物にアレルギー反応を誘発させるためには、予め抗原乃至アレルゲンを繰り返し免疫することにより動物を感作しておいてから当該抗原乃至アレルゲンを投与する必要があった。この場合、同時に多数の動物を感作するのは多大な労力を要するばかりでなく、個々の動物間に反応性のばらつきが生じることがあり、実験の再現性の上で問題となることがあった。
【０００４】
また近年、ＮＣ／Ｎｇａマウスがアトピー性皮膚炎のモデル動物として注目されているが、このマウスに起こる皮膚炎は自然発症型であり、ある特定のアレルゲンに曝露したときに初めて発症するような誘発型のものではない。また、該マウスで皮膚炎を起こすアレルゲンも特定されていない。
【０００５】
ところで、特定のアレルゲンに特異的なＩｇＥを常時産生させるような遺伝子操作を動物に施すことにより、該アレルゲンの単回投与でアレルギー反応を誘発するようなモデル動物を作製することが可能と考えられる。これまでにＩｇＥのトランスジェニックマウスについては一例の報告がある（Adamczewski et al. (1991) Eur. J. Immunol. 21, 617-626）ものの、該マウスに導入されたのはＩｇＥの重鎖をコードする遺伝子のみであり、軽鎖をコードする遺伝子は導入されていなかったため、該マウスは高ＩｇＥ血症を呈するのみで、抗原特異的なＩｇＥは産生しなかった。したがってこのマウスは、単回のアレルゲン投与によってアレルギー反応を誘発するようなモデル動物とはなっていない。
【０００６】
また、国際特許公開ＷＯ９５／１５３７６号公報には、ヒト化されたＩｇＥレセプターα鎖をコードする遺伝子を導入したトランスジェニックマウスが開示されているが、このマウスのマスト細胞にアレルギー反応を起こさせてアレルギーモデル動物として利用するには、ヒト抗体もしくはヒト化抗体を投与する必要がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、抗アレルギー薬の探索または評価のためのモデル動物として有用な、新規トランスジェニック動物およびその使用方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記のような問題点を克服し、ＩｇＥの重鎖定常領域をコードするＤＮＡから予め膜結合部位をコードする部分を除去したＤＮＡを使用して、特定の抗原に対するＩｇＥを常時発現するような遺伝子操作を動物に施すことにより、事前の抗原感作を行なうことなしに、該特定の抗原の単回投与によりアレルギー反応を呈することを特徴とする、新規トランスジェニック動物の作出に成功し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）下記の構成要素ａ）およびｂ）を含むイムノグロブリン（以下「Ｉｇ」という）構造を有する分子を常時発現することができるようにそのゲノムが改変されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物：
ａ）Ｉｇ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む少なくとも一つの抗原特異的認識部位（ただし、該認識部位は、予め選択された抗原に対して特異性を有する）；
ｂ）該動物のマスト細胞上に発現しているイムノグロブリンＥ（以下「ＩｇＥ」という）レセプターへの結合を可能ならしめる重鎖定常領域、
（２）重鎖定常領域がＩｇＥ重鎖定常領域、その一部およびその同効物から選択されることを特徴とする、（１）記載のトランスジェニック動物、
（３）重鎖定常領域がＩｇＥ重鎖定常領域であることを特徴とする、（１）記載のトランスジェニック動物、
（４）Ｉｇ構造を有する分子がＩｇＥであることを特徴とする、（１）記載のトランスジェニック動物、
（５）Ｉｇ構造を有する分子が一つのＩｇ軽鎖および一つのＩｇ重鎖からなることを特徴とする、（１）記載のトランスジェニック動物、
（６）重鎖定常領域が、天然に存在するＩｇＥ重鎖定常領域由来であることを特徴とする、（１）記載のトランスジェニック動物、
（７）事前の抗原感作なしに、特異的抗原に対するアレルギー反応を呈することを特徴とする、（１）乃至（６）のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物、
（８）導入された外来遺伝子の産物であるＩｇ構造を有する分子の血中濃度が、少なくとも８μｇ／ｍｌであることを特徴とする、（１）乃至（７）のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物、
（９）導入された外来遺伝子の産物であるＩｇ構造を有する分子の血中濃度が、事前に抗原感作された同種の非トランスジェニック動物における特異的ＩｇＥの血中濃度と少なくとも同等またはそれ以上であることを特徴とする、（１）乃至（７）のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物、
（１０）予め選択される抗原が、Ｉｇ構造を有する分子と複合体を形成し、マスト細胞上のＩｇＥレセプターを介してヒトのアレルギー症状を擬制したアレルギー反応を起こし得るものであることを特徴とする、（１）乃至（９）のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物、
（１１）ヒトのアレルギー症状が花粉症であることを特徴とする、（１０）記載のトランスジェニック動物、
（１２）齧歯類であることを特徴とする、（１）乃至（１１）のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物、
（１３）マウスであることを特徴とする、（１）乃至（１１）のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物、
（１４）ゲノムの改変にゲノミックＤＮＡが使用されていることを特徴とする、（１）乃至（１３）のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物、
（１５）ゲノミックＤＮＡが、有効なプロモーターおよびエンハンサー領域を含むことを特徴とする、（１４）記載のトランスジェニック動物、
（１６）Ｉｇ構造を有する分子の重鎖および軽鎖可変領域が単一のＩｇアイソタイプ由来であることを特徴とする、（１）記載のトランスジェニック動物、
（１７）ゲノムの改変が、同種動物由来のＤＮＡによるものであることを特徴とする、（１）記載のトランスジェニック動物、
（１８）Ｉｇ構造を有する分子の重鎖定常領域がヒトマスト細胞上のＩｇＥレセプターと結合可能なものから選択されており、かつマスト細胞上に発現するＩｇＥレセプターが、抗原と複合体を形成したヒトＩｇＥと結合できるようにヒト化されていることを特徴とする、（１）記載のトランスジェニック動物、
（１９）Ｉｇ構造を有する分子の重鎖定常領域が分泌型ＩｇＥ分子由来であることを特徴とする、（１）記載のトランスジェニック動物、
（２０）Ｉｇ構造を有する分子をコードする遺伝子のホモ接合体であることを特徴とする、（１）記載のトランスジェニック動物、
（２１）予め選択される抗原が、花粉由来アレルゲン、真菌由来アレルゲン、ダニ由来アレルゲン、ハウスダスト、動物（皮屑、糞、体毛）由来のアレルゲン、昆虫由来アレルゲン、食品（卵、牛乳、肉、魚介類、豆類、穀類、果物・野菜）アレルゲン、寄生虫由来アレルゲン、薬品アレルゲン、化学物質アレルゲンおよび一つもしくは二つ以上のトリニトロフェニル基を有する物質からなる群より選択されることを特徴とする、（１）乃至（２０）のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物、
（２２）予め選択される抗原が、一つもしくは二つ以上のトリニトロフェニル基を有する物質であることを特徴とする、（１）乃至（２０）のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物、
（２３）Ｉｇ構造を有する分子の重鎖定常領域が分泌型ＩｇＥ由来であって、かつ配列表の配列番号２のアミノ酸番号１２０から５４２に示されるアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする、（１）記載のトランスジェニック動物、
（２４）Ｉｇ構造を有する分子の重鎖定常領域をコードする遺伝子が、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４１５から１６８３に示されるヌクレオチド配列を実質的に含むＤＮＡであることを特徴とする、（２３）記載のトランスジェニック動物、
（２５）Ｉｇ構造を有する分子の軽鎖が、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号３９７から７１４に示されるヌクレオチド配列を実質的に含むＤＮＡにコードされる分泌型イムノグロブリンＥの軽鎖定常領域を有するものであることを特徴とする、（１）記載のトランスジェニック動物、
（２６）Ｉｇ構造を有する分子の重鎖が、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から５４２に示されるアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする、（１）記載のトランスジェニック動物、
（２７）Ｉｇ構造を有する分子の軽鎖が、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から２１９に示されるアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする、（１）記載のトランスジェニック動物、
（２８）Ｉｇ構造を有する分子の重鎖が配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から５４２に示されるアミノ酸配列からなり、同軽鎖が配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から２１９に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、（１）記載のトランスジェニック動物、
（２９）Ｉｇ構造を有する分子の重鎖をコードする遺伝子が、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号５８から４１２に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡであることを特徴とする、（２６）記載のトランスジェニック動物、
（３０）Ｉｇ構造を有する分子の軽鎖をコードする遺伝子が、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号５８から３９４に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡであることを特徴とする、（２７）記載のトランスジェニック動物、
（３１）Ｉｇ構造を有する分子の重鎖をコードする遺伝子が、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号５８から４１２に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡであり、かつ同軽鎖をコードする遺伝子が、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号５８から３９４に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡであることを特徴とする、（２８）記載のトランスジェニック動物、
（３２）下記の構成要素ａ）およびｂ）を含むＩｇ構造を有する分子を常時発現することができるようにそのゲノムが改変されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物：
ａ）Ｉｇ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む少なくとも一つの抗原特異的認識部位（ただし、該認識部位は、予め選択された抗原に対して特異性を有する）；
ｂ）該動物のマスト細胞上に発現しているＩｇＥレセプターへの結合を可能ならしめる重鎖定常領域：
を得る方法であって、まず動物受精卵に、
ｉ）定常領域が分泌型ＩｇＥ由来であって、可変領域が特定の抗原に特異的な結合活性を有するＩｇＥ由来であることを特徴とするＩｇ重鎖をコードする遺伝子、および
ｉｉ）可変領域が前記重鎖可変領域を有するＩｇ由来であることを特徴とするＩｇ軽鎖をコードする遺伝子を導入し、次いで、
ｉｉｉ）該受精卵を偽妊娠処置を施した同種の雌動物卵管に移植し、
ｉｖ）該動物胎内で発生させる，
ことを特徴とする方法、
（３３）（３２）記載の方法によって得られるトランスジェニック動物、
（３４）下記の構成要素ａ）およびｂ）を含むＩｇ構造を有する分子を常時発現することができるようにそのゲノムが改変されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物：
ａ）Ｉｇ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む少なくとも一つの抗原特異的認識部位（ただし、該認識部位は、予め選択された抗原に対して特異性を有する）；
ｂ）該動物のマスト細胞上に発現しているＩｇＥレセプターへの結合を可能ならしめる重鎖定常領域：
を得る方法であって、該Ｉｇ重鎖をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニック動物と、該Ｉｇ軽鎖をコードする遺伝子が導入された同一種由来のトランスジェニック動物とを交配し、次いで前記両方の遺伝子を保持する動物を得ることを特徴とする方法、
（３５）（３４）記載の方法によって得られるトランスジェニック動物、
（３６）下記の構成要素ａ）およびｂ）を含むＩｇ構造を有する分子を常時発現することができるようにそのゲノムが改変されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物：
ａ）Ｉｇ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む少なくとも一つの抗原特異的認識部位（ただし、該認識部位は、予め選択された抗原に対して特異性を有する）；
ｂ）該動物のマスト細胞上に発現しているＩｇＥレセプターへの結合を可能ならしめる重鎖定常領域：
を得る方法であって、該Ｉｇのいずれか一方の鎖をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニック動物から、該Ｉｇの両方の鎖をコードする遺伝子を保持する動物を得ることを特徴とする方法、
（３７）（３６）記載の方法によって得られるトランスジェニック動物、
（３８）動物に抗原を曝露することによって生じるアレルギー症状に対する、物質の抗アレルギー活性を評価する方法であって、まず該抗原に特異的なＩｇ構造を有する分子を定常的に発現する（１）記載の動物を得、次いで該抗原を該動物に抗アレルギー薬の評価が可能な方法および条件下で投与することを含むことを特徴とする方法、
（３９）事前の抗原感作なしに、予め選択された抗原の単回投与によりアレルギー反応を呈することを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物、
（４０）予め選択された抗原に対して特異的なＩｇＥを構成的に発現するようにゲノムが改変されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物、
（４１）予め選択された抗原に対して特異的な結合能を有する抗体型分子を構成的に発現するようにゲノムが改変されているトランスジェニック非ヒト動物であって、該抗体型分子が該動物のマスト細胞上のＩｇＥレセプターに結合可能な重鎖定常領域を有することを特徴とする動物、
に関する。
【００１０】
本発明は、下記の構成要素ａ）およびｂ）を含むＩｇ構造を有する分子を常時発現できるようにそのゲノムが改変されていることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物を提供する：
ａ）Ｉｇ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む少なくとも一つの特異的抗原認識部位（ただし、該認識部位は、予め選択された抗原に対して特異性を有する）；
ｂ）該動物のマスト細胞上に発現しているＩｇＥレセプターへの結合を可能ならしめる重鎖定常領域。
【００１１】
また、本発明は、マスト細胞上に発現しているＩｇＥレセプターへの結合が可能な定常領域（好ましくはＩｇＥ重鎖定常領域、その一部またはその同効物）を有し、特定の抗原に特異的に結合する抗体型分子を常時発現するように、そのゲノムが改変されていることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００１２】
さらに本発明は、特定の抗原に特異的に結合するＩｇＥを常時発現するようにそのゲノムが改変されていることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００１３】
さらにまた、本発明は、事前の感作を必要とせず、特定の抗原の単回投与によりアレルギー反応を呈することを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物を提供するものである。
【００１４】
本発明において、「抗体型分子」とは、少なくとも一つずつ（好ましくは一つずつ）の軽鎖および重鎖を含む特徴的なＩｇ構造を有し、特定の抗原に特異的に結合する分子をいう。このうち、少なくとも一つの重鎖定常領域はマスト細胞上のＩｇＥレセプターに結合可能でなければならない。この重鎖定常領域は天然に存在するものである必要はなく、例えば、あるＩｇＥの定常領域をそのまま用いても、または少なくともＩｇＥレセプターに対する結合能が維持されるようにその定常領域のアミノ酸配列が改変された同効物であってもよい。
【００１５】
ここに「同効物」とは、導入される遺伝子がコードする分子内に、天然に存在するあるＩｇＥの定常領域と同じ態様でマスト細胞上のＩｇＥレセプターに結合できるような定常領域として組み込まれ得る全ての配列をいう。すなわち、該分子とその特異的抗原とが形成する複合体により架橋されたＩｇＥレセプターがアレルギー反応を起こすことができれば、いかなる配列であってもよい。
【００１６】
「重鎖可変領域」および「軽鎖可変領域」という用語は、Ｉｇ分子中で抗原に対する結合能を担う領域を示す。本発明においては、それら可変領域は天然に存在するものから選択するのが便利であるが、必要な抗原結合能を有するように人工的に設計されたものも用いられ得る。
【００１７】
本発明によれば、複数種類の異なるＩｇＥ分子が常時発現されるようにすることにより、それぞれの外来ＩｇＥに対応した抗原に対して反応する、安定した動物モデルが提供される。このことにより、実験の長期化や結果のばらつきの原因となっていた、従来の抗原感作の操作が不要となる。
【００１８】
本発明の動物は、実質的に安定した量の外来ＩｇＥ（典型的な例では約８μｇ／ｍｌまたはそれ以上）を発現する。この外来ＩｇＥ発現量は、いかなる動物種であっても、当該技術分野における周知の方法（例えば、後述するような方法）により確認することができる。
【００１９】
本発明の、特定のＩｇＥを発現する動物は、通常、例えばＩｇＥレセプターが欠損していたりしない限り、事前に抗原感作した普通の動物よりも高値のＩｇＥを産生し、しかも予め選択された抗原の最初の曝露によりアレルギー反応を呈する。これにより、抗アレルギー剤の探索が容易となる。
【００２０】
本発明の動物には特定の抗原に対してアレルギーを起こせるが、その症状としては例えば花粉症やアトピー性皮膚炎等のヒトのアレルギー症状を動物で擬制したものが選択され得る。したがって、抗アレルギー療法の研究においては、特定の症状に対する治療法を調べたり、容易に測定できるマーカーを利用して同定されるアレルギー反応を起こすようにすることができる。
【００２１】
本発明に使用するための動物（ヒトを除く）は、ＩｇＥを介してアレルギー反応を起こすものであればいかなる動物でもよい。小動物の多くは好適に使用できるが、他の制約がない場合は、繁殖が早く維持が容易なものが特に好ましい。その中でも、ウサギ、ラットまたはマウスがより好適であり、マウスが最も好適である。
【００２２】
本発明の動物は予め決まった特異性を有するＩｇＥを発現するが、そのＩｇＥをコードする導入遺伝子は所望の抗原に特異的に結合するように改変されていてもよい。そのような改変は、例えば、まず所望の抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを取得し、次いで当該技術分野における周知の方法でその抗体をコードするＤＮＡをクローニングすることにより可能である。そのようなＤＮＡを使用する利点は、その可変領域の再構成が既に完了していることにある。このＤＮＡが適切なプロモーターおよびエンハンサー領域とともにゲノムに組み込まれると、結果として予め選択された抗原に特異性を有するＩｇＥのサブユニット（重鎖または軽鎖）が発現される。導入されるＩｇをコードする遺伝子はｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡのいずれでもよいが、プロモーターおよびエンハンサー領域を伴ったゲノミックＤＮＡがより好適である。
【００２３】
重鎖および軽鎖の可変領域としては、抗原認識を最適にするため、互いに補い合って同一の抗原を認識するようなものであればよい。また両可変領域は、ＩｇＥ由来のものに特に限定はされないが、同じ型の抗体分子由来であることが好ましい。さらに、両可変領域は同一の動物種由来（例えば、マウス重鎖とマウス軽鎖）であることが好ましいが、それに限定されない。
【００２４】
本発明において、導入されるＩｇＥに必須な要件は、抗原と結合して複合体を形成したら、その動物体内のマスト細胞上のＩｇＥレセプターに結合できることである。例えば、動物がマウスの場合、マウスＩｇＥ重鎖由来の定常領域か、少なくともそのＩｇＥレセプターに結合可能な部分またはその同効物が、導入される分子の一部を構成していないと、抗原と複合体を形成できてもＩｇＥレセプターと結合できないことになる。ただし、外来ＩｇＥレセプター遺伝子が導入された動物を用いるような場合はこの限りではなく、例えば国際特許出願ＷＯ９５／１５３７６号公報に開示されているような、ヒト化されたＩｇＥレセプターのトランスジェニックマウスを利用して本発明のトランスジェニック動物を作出しようとする場合は、ヒトＩｇＥ重鎖由来の定常領域が使用される（なお、ヒトＩｇＥ重鎖定常領域をコードする遺伝子の配列は公知（Flanagan and Rabbitts (1982) EMBO J. 1, 655-660他）である）。
【００２５】
したがって、トランスジェニック動物体内で、予め選択された抗原と結合することができ、その結合が起こった際にマスト細胞上のＩｇＥレセプターを架橋してアレルギー反応を起こすことさえできれば、本発明において導入されるＩｇＥは、その動物体内で天然に産生されるＩｇＥと関連したものでなくてもよい。
【００２６】
より具体的には、本発明のトランスジェニック動物に導入される抗原特異的Ｉｇ重鎖または軽鎖をコードする遺伝子は、いかなる動物由来のものでもよいが、以下に記載する条件：
１）重鎖の定常領域部分は分泌型ＩｇＥ分子由来のものである（ここで、「分泌型ＩｇＥ」とは、細胞膜結合部位を有さず、細胞外に分泌されるＩｇＥ分子をいう）。なお軽鎖定常領域は重鎖定常領域と同種の動物由来であることが好ましいが、それに限定されない；
２）重鎖、軽鎖の可変領域部分は同一のＩｇ分子由来のものである（定常領域と同一のＩｇＥ由来でもよい）；および
３）重鎖定常領域部分が遺伝子導入される動物体内で産生されるＩｇＥレセプターと結合可能である；
を全て満たしていることが好ましい。
【００２７】
そのようなＩｇをコードする遺伝子は、好適にはマウス、ラット等の齧歯類動物由来のＩｇをコードする遺伝子またはサル、ヒト等霊長類動物由来のＩｇをコードする遺伝子であり、より好適にはマウスまたはヒト由来のＩｇをコードする遺伝子である。さらに、重鎖をコードする遺伝子として好適なものとして、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１２０から５４２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域および任意の抗体の重鎖可変領域を含むポリペプチドをコードするＤＮＡを挙げることができる。また、軽鎖をコードする遺伝子として好適なものとして、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１１４から２１９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域および前記重鎖可変領域を有する抗体の軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードするＤＮＡを挙げることができる。より好適には配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から５４２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡおよび／または配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から２１９に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【００２８】
上記において可変領域部分を提供するＩｇは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等いかなるＩｇでもよく、また分泌型であるか膜結合型であるかを問わない。
すなわち、本発明のトランスジェニック動物に導入される遺伝子にコードされるＩｇは天然型に限定されず、例えば可変領域がＩｇＧ由来で重鎖定常領域がＩｇＥ由来であるようなものでもよく、さらにいわゆるキメラ抗体やヒト化抗体等の人工改変抗体でもよい。遺伝子導入する動物とは異種の動物由来のＩｇや人工改変抗体をコードする遺伝子を導入する場合は、導入された遺伝子の発現産物であるＩｇまたは該人工改変抗体が該動物体内で自己または外来の（トランスジェニック技術により導入された）ＩｇＥレセプターに結合可能であればよい。なお、本発明のトランスジェニック動物に導入された遺伝子産物のＩｇは、通常新生仔の時期から産生されるので、非自己と認識されずに免疫寛容が成立すると考えられ、特異的抗原のない環境下であれば発生や生育に及ぼす影響は少ない。
【００２９】
導入する遺伝子を取得するための遺伝子源としては、導入によって発現させようとする抗原特異的Ｉｇを十分量産生する細胞、特にモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを用いることが好ましい。ただし、分泌型ＩｇＥ定常領域をコードするゲノミックＤＮＡのみを別個に取得する場合は、抗体産生細胞以外の細胞も好適に使用可能である。分泌型ＩｇＥ産生細胞としては、免疫グロブリンとして所望の抗原特異的ＩｇＥを専ら産生するハイブリドーマが好ましく用いられる。そのようなＩｇＥ産生ハイブリドーマとしては、ＴＮＰ基を有する物質に特異的に結合するＩｇＥ（以下「抗ＴＮＰＩｇＥ」という）産生細胞であるＩＧＥＬ−ｂ４（ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）ＴＩＢ１４１、Eur. J. Immunol. (1981) 11, 527-529およびMol. Immunol. (1992) 29, 161-166参照）を例示することができる。
【００３０】
本発明の動物に導入されたＩｇ遺伝子は、少なくともアレルギー反応の試験が行われる時期までに構成的に発現していればよい。ただし、抗体の産生を誘導するために人為的操作を要するような場合は、試験に余分な操作が加わることになり、事前の感作を必要とする従来法と比較して利点が少ない。よって、導入されたＩｇ遺伝子は、アレルギー反応を即座に起こせる程度に連続的に十分量発現されることが重要である。
【００３１】
本発明において「特定の抗原」とは、イムノグロブリン（以下「Ｉｇ」という）が特異的に結合し得る物質であって、本発明で使用される動物自らは通常産生しない物質であればいかなるものでもよく、天然物由来であるか人工的な物質であるかを問わない。好適な抗原として、以下に挙げるようなアレルゲンが例示できる：
花粉由来アレルゲン（スギなどの樹木、カモガヤ等のイネ科植物、ブタクサ等の雑草などに由来するもの。例えば、スギ花粉アレルゲンCry j 1（J. Allergy Clin. Immunol. 71, 77-86 (1983)）、同Cry j 2（FEBS Letters, 239, 329-332 (1988)）、ブタクサアレルゲン（Amb a I.1、Amb a I.2、Amb a I.3、Amb a I.4、Amb a II等））；
真菌由来アレルゲン（アスペルギルス属、カンジダ属、アルテルナリア属等）；
ダニ由来アレルゲン（ヤケヒョウヒダニ、コナヒョウヒダニ等由来のアレルゲン。例えばDer p I、Der p II、Der p III、Der p VII、Der f I、Der f II、Der f III、Der f VII等）；
ハウスダスト；
動物の皮屑、糞、体毛由来のアレルゲン（例えばネコアレルゲンFel d I）；
昆虫由来のアレルゲン（ガ、チョウの鱗毛、鱗粉、ユスリカ等またはスズメバチ等の毒）；
食品に含まれるアレルゲン（卵、牛乳、肉、魚介類、豆類、穀類、果物・野菜等）；
寄生虫由来のアレルゲン（カイチュウ、アニサキス等）；
薬品（ペニシリン、インシュリン等）；
化学物質（イソシアネート、エチレンオキサイド、無水フタル酸、ラテックス等）；
２，４，６−トリニトロフェノール等、トリニトロフェニル（以下「ＴＮＰ」という）基を有する物質
等を挙げることができる。このうち最も好適なものは、一つもしくは二つ以上のＴＮＰ基を有する物質である（なお、これらのアレルゲンの多くは例えばフナコシ（株）を通じて購入することができる）。
【００３２】
本発明のトランスジェニック動物は、導入された外来のＩｇ重鎖をコードする遺伝子または同軽鎖をコードする遺伝子のヘテロ接合体、およびホモ接合体を包含するものである。いずれの場合も、導入された遺伝子は発現するので、アレルギー動物モデルとして利用可能である。なお、本発明のトランスジェニック動物もしくは本発明のトランスジェニック動物と他のトランスジェニック動物等の系統との雑種を繁殖によって得ようとする場合には、本発明のトランスジェニック動物のホモ接合体を少なくとも一方の親として使用する方が、より確実に目的の動物を生産できる。
【００３３】
また例えば、本発明のトランスジェニック動物を作出するために、特定の抗原に特異的な結合活性を有するＩｇ重鎖をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニック動物と、同軽鎖をコードする遺伝子が導入された同一種由来のトランスジェニック動物とを交配する方法や、まず重鎖をコードする遺伝子を導入したトランスジェニック動物を作出し、次にそのトランスジェニック動物またはその子孫を材料として軽鎖をコードする遺伝子を導入する方法等を採用することが可能である。従って、特定の抗原に特異的な結合活性を有するＩｇ重鎖または軽鎖のいずれか一方をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニック動物は、それ自体本発明の効果を奏するものではないが、本発明のトランスジェニック動物を作出するための中間体として有用である。
【００３４】
【発明の実施の形態】
本発明のトランスジェニック動物は、動物受精卵に特定の抗原に特異的な結合活性を有するＩｇ重鎖をコードする遺伝子および／または同軽鎖をコードする遺伝子を導入し、次いで該受精卵を偽妊娠処置を施した同種の雌動物卵管に移植し、該動物胎内で発生させることにより作出することができる。また、特定の抗原に特異的な結合活性を有するＩｇ重鎖をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニック動物と、同軽鎖をコードする遺伝子が導入された同一種由来のトランスジェニック動物とを交配する方法や、まず重鎖をコードする遺伝子を導入したトランスジェニック動物を作出し、次にそのトランスジェニック動物またはその子孫を材料として軽鎖をコードする遺伝子を導入する方法等を採用することもできる。
【００３５】
前記した遺伝子源から所望の遺伝子クローンを単離する方法としては、通常の遺伝子クローニングで汎用されるものをいずれも採用しうる。以下に本発明における好適なクローニング方法を概説するが、本発明のトランスジェニック動物に導入する遺伝子のクローニング方法はこれらに限定されない。
【００３６】
まず、細胞からのｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ）の調製は、まず全ＲＮＡを調製し、該全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）セルロースやオリゴ（ｄＴ）ラテックスビーズ等のポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ精製用担体を用いて精製する方法、または細胞ライセートから該担体を用いて直接精製する方法により実施できる。全ＲＮＡの調製方法としては、アルカリショ糖密度勾配遠心分離法［Dougherty, W. G. and Hiebert, E. (1980) Viology 101, 466-474参照］、グアニジンチオシアネート・フェノール法、グアニジンチオシアネート・トリフルオロセシウム法、フェノール・ＳＤＳ法、グアニジンチオシアネートおよび塩化セシウムを用いる方法［Chirgwin, J. M., et al. (1979) Biochemistry 18, 5294- 5299参照］等も採用し得るが、全ＲＮＡ抽出用溶媒（ＩＳＯＧＥＮ（登録商標）：ニッポンジーン（株）社製）を用いる方法が好適である。
【００３７】
上記のごとくして得られたポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素反応により一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成することができる。この方法としてはＳ１ヌクレアーゼ法［Efstratiadis, A., et al. (1976) Cel1 7, 279-288 参照］、グブラー−ホフマン法［Gubler, U. and Hoffman, B. J. (1983) Gene 25, 263-269 参照］、オカヤマ−バーグ法［Okayama, H. and Berg, P. (1982) Mol. Cell. Biol. 2, 161-170 参照］等を採用し得るが、本発明においては、逆転写酵素反応後直ちに、該反応生成物である一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）［Saiki, R. K., et al. (1988) Science 239, 487-49 参照］を行なう、いわゆるＲＴ−ＰＣＲ法が好適である。特にＩｇの場合、マウス等のｍＲＮＡからＰＣＲを利用してクローニングを行なうためのプライマーが重鎖用、軽鎖用ともに市販されているので、それら既製のプライマーとハイブリドーマから抽出されたＲＮＡを使用してＲＴ−ＰＣＲを実施することにより、所望のＩｇ重鎖または軽鎖をコードするｃＤＮＡ断片を容易に取得することができる。
【００３８】
このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡをクローニングベクターに組み込み、得られた組換えベクターを大腸菌等の微生物に導入して形質転換させ、テトラサイクリン耐性あるいはアンピシリン耐性等を指標として形質転換体を選択することができる。大腸菌の形質転換は、ハナハン法［Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol. 166, 557-580 参照］、すなわち塩化カルシウムや塩化マグネシウムまたは塩化ルビジウムを共存させて調製したコンピテント細胞に、該組換えＤＮＡベクターを加える方法により実施することができる。なお、ベクターとしてブラスミドを用いる場合は、上記の薬剤耐性遺伝子を有することが必要である。また、プラスミド以外のクローニングベクター、例えばラムダ系のファージ等を用いることも可能である。
【００３９】
上記により得られた形質転換株から、目的の抗原特異的Ｉｇの各サブユニットをコードするｃＤＮＡを有する株を選択する方法としては、例えば以下に示す各種方法を採用できる。なお、上記ＲＴ−ＰＣＲ法により目的のｃＤＮＡを特異的に増幅した場合は、これらの操作を省略することが可能である。
【００４０】
（１）ポリメラーゼ連鎖反応を用いる方法
目的タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部が解明されている場合、該アミノ酸配列の一部に対応するセンスストランドとアンチセンスストランドのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、これらを組合せてポリメラーゼ連鎖反応［Saiki, R. K., et al. (1988) Science 239, 487-49 参照］を行ない、目的の抗原特異的Ｉｇ重鎖あるいは軽鎖サブユニットをコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、例えばＴＮＰ抗原特異的モノクローナルＩｇＥを産生するハイブリドーマのｍＲＮＡより逆転写酵素反応にて合成したｃＤＮＡを用いることができる。
【００４１】
このようにして調製したＤＮＡ断片は、市販のキット等を利用して直接プラスミドベクターに組み込むこともできるし、該断片を³²Ｐ、³⁵Ｓあるいはビオチン等で標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより目的のクローンを選択することもできる。
【００４２】
例えば、本発明のトランスジェニック動物に導入される抗原特異的Ｉｇの各サブユニットの部分アミノ酸配列を調べる方法としては、電気泳動やカラムクロマトグラフィーなどの周知の方法を用いて各サブユニットを単離してから、自動プロテインシークエンサー（例えば、島津製作所（株）製ＰＰＳＱ−１０）等を利用してそれぞれのサブユニットのＮ末端アミノ酸配列を解析する方法が好適である。
【００４３】
上記のごとくして得られた目的の形質転換株より、抗原特異的Ｉｇの各サブユニットをコードするｃＤＮＡを採取する方法は、公知の方法［Maniatis, T., et al. (1982) in "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY. 参照］に従い実施できる。例えば細胞よりベクターＤＮＡに相当する画分を分離し、該プラスミドＤＮＡより目的とするサブユニットをコードするＤＮＡ領域を切り出すことにより行うことが可能である。
【００４４】
（２）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法
目的タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部が解明されている場合（該配列は、複数個連続した特異的配列であれば、目的タンパク質のどの領域のものでもよい）、該アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し（この場合、コドン使用頻度を参考に推測されるヌクレオチド配列、または考えられるヌクレオチド配列を組み合わせた複数個のヌクレオチド配列のいずれも採用でき、また後者の場合イノシンを含ませてその種類を減らすこともできる）、これをプローブ（³²Ｐ、³⁵Ｓあるいはビオチン等で標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を選別する。
【００４５】
このようにして得られるＤＮＡの配列の決定は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法［Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1980) in "Methods in Enzymology" 65, 499-576参照］やジデオキシヌクレオチド鎖終結法［Messing, J. and Vieira, J. (1982) Gene 19, 269-276参照］等により実施することができる。
【００４６】
また近年、蛍光色素を用いた自動塩基配列決定システムが普及している（例えばパーキンエルマージャパン社製シークエンスロボット"CATALYST 800"およびモデル３７３ＡＤＮＡシークエンサ一等）。
【００４７】
こうしたシステムを利用することで、ＤＮＡヌクレオチド配列決定操作を能率よく、かつ安全に行うことも可能である。このようにして決定された本発明のＤＮＡの各ヌクレオチド配列、および重鎖および軽鎖の各Ｎ末端アミノ酸配列データから、本発明のトランスジェニック動物に導入する抗原特異的Ｉｇの重鎖および軽鎖の全アミノ酸配列を決定することができる。
【００４８】
また、導入遺伝子をゲノミックＤＮＡの形でクローニングする場合は、遺伝子源となる細胞から定法に従ってＤＮＡを抽出し、ゲノムライブラリーを作製した後、上記のｃＤＮＡクローニングの場合と同様の方法により所望のクローンを単離することができる。
【００４９】
全アミノ酸配列または部分アミノ酸配列が既知であるようなＩｇＥの定常領域については、それらの知見に基づいてまず定常領域をコードする遺伝子を別途クローニングすることができるので、本発明においては、そのようにしてクローニングされたＩｇＥ定常領域をコードする遺伝子を、抗原特異的Ｉｇの可変領域をコードする遺伝子と連結することにより、導入する遺伝子を調製することができる。なおこの場合、連結する遺伝子が両者ともイントロンを含むゲノミックＤＮＡであれば、両者の間にエンハンサー配列を挿入することができ、また翻訳される際のリーディングフレームを合わせる必要もない。さらに、可変領域をコードする遺伝子を他の抗原特異的Ｉｇのものと置換することにより、所望の抗原に対するアレルギーモデル動物を作製するための導入遺伝子を作製することができる。
【００５０】
導入する遺伝子を動物細胞内で発現させるための、プロモーターやエンハンサー等の調節遺伝子としては、導入された動物の細胞内で機能するものであればいずれも使用することができるが、特にイムノグロブリン遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーが最も好適である。該プロモーターまたはエンハンサーは、公知のもの［例えば、Hiramatsu, R. et al., (1995) Cell 83, 1113-1123参照］を別途クローニングしておいて導入遺伝子に連結するか、もしくは導入遺伝子としてクローニングしたゲノミックＤＮＡ中に含まれているものをそのまま利用することにより使用可能である。
【００５１】
導入遺伝子は、動物受精卵に導入する際には、ＩｇをコードするＤＮＡおよびその発現を制御するプロモーターやエンハンサーを含む断片の形態であればよく、それ以外の部分は除去して使用することができる。したがって、導入遺伝子を増幅するためのベクターとしては、公知のクローニング用ベクターをいずれも使用することができるが、導入に必要な断片を切り取るために適当な制限酵素切断部位を有するものが好ましい。また、適当な制限酵素部位がないベクターを使用した場合も、導入に必要な部分の両端に対応するセンスおよびアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲを実施することによって、該必要部分のみの増幅が可能である。
【００５２】
そのような、導入遺伝子を増幅するための宿主−ベクター系としては、通常の遺伝子クローニングで汎用されているものを好適に利用することができる。原核細胞の宿主としては、例えば大腸菌（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis）等が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で増幅させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコン、すなわち複製起点を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換すればよい。またべクターは、形質転換した細胞での表現形質による選択性を付与することができる配列を有するものが望ましい。例えば大腸菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２株由来のＪＭ１０９株等がよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドがよく用いられるが、これらに限定されず、公知の各種の菌株およびベクターをいずれも使用できる。
【００５３】
上記のごとくして得られた導入遺伝子をプロモーター下流に連結し、さらに必要に応じてエンハンサーやポリＡ付加シグナル配列等を連結したものを上記増幅用ベクターに組込んで組換えベクターを構築し、該組換えベクターで形質転換された宿主を培養することにより、該組換えベクターを増幅して、必要量の導入遺伝子を得ることができる。導入効率を上げるため、導入遺伝子は、ベクター部分を制限酵素消化等により除去した後、塩化セシウム密度勾配遠心分離等の操作により精製されることが好ましい。
【００５４】
遺伝子を導入する動物は、ヒト以外の哺乳動物であればよいが、特にマウス、ラット等の齧歯類が好適であり、マウスが最も好適である。
【００５５】
動物から受精卵を取得し、遺伝子導入の後、偽妊娠動物に移植し発生させる手順については、既に確立されている方法に従うことができる［発生工学実験マニュアル（野村達次監修、勝木元也編、1987年刊）、マウス胚の操作マニュアル（"Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual" B. Hogan, F. Costantini and E. Lacy著、山内一也、豊田裕、森庸厚、岩倉洋一郎訳、1989年刊）、特公平５−４８０９３号公報等参照］。具体的には、例えばマウスの場合、まず雌マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６等）に排卵誘起剤を投与後、同系統の雄と交配し、翌日雌マウスの卵管より前核受精卵を採取する。次いで、導入するＤＮＡ断片溶液を微小ガラス管を用いて受精卵の前核に注入する。このとき、重鎖をコードする遺伝子と軽鎖をコードする遺伝子とを混合したものを注入することが好ましいが、本発明はこの方法に限定されない。遺伝子をＤＮＡを注入した受精卵は、偽妊娠仮親雌マウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ等）の卵管に移植し、約２０日後に自然分娩又は帝王切開により出生させる。
【００５６】
このようにして得られた動物が導入した遺伝子を保持していることを確認する方法としては、該動物の尾等からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを鋳型として導入遺伝子に特異的なセンスおよびアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲを行う方法、該ＤＮＡを数種の制限酵素で消化後ゲル電気泳動し、ゲル中のＤＮＡをニトロセルロース膜やナイロン膜等にブロッティングしたものについて導入遺伝子の全部または一部を標識したものをプローブとしたサザンブロット解析を行なう方法等を挙げることができる。
【００５７】
また、導入された遺伝子が実際に動物体内で発現しているか否かを確認する方法としては、末梢血中のＩｇ濃度をエンザイム・イムノアッセイ法（以下「ＥＬＩＳＡ法」という）により測定して正常動物よりも血中Ｉｇ濃度が高いことを確認するか、または導入した遺伝子にコードされるＩｇが特異的に結合する抗原を固相化して、該固相化抗原に対する血中Ｉｇの結合活性をＥＬＩＳＡ法により調べる方法等を挙げることができる。
【００５８】
本発明のトランスジェニック動物が、導入した遺伝子にコードされるＩｇが特異的に結合する抗原の単回投与によりアレルギー反応を起こすことを確認する方法としては、例えば該抗原を動物皮膚に塗布し、塗布部位の皮膚の発赤や肥厚を観察する方法、該抗原を静脈注射することにより全身性のアナフィラキシー症状（呼吸困難、体温低下、運動停止、血管透過性の上昇等）を起こすか否かを確認する方法等を挙げることができる。また、上記のような実験系において、抗アレルギー薬の候補物質を抗原投与の前後に投与するか、または抗原との同時投与や連続投与を行なってアレルギー反応が軽減されるか否かを調べることにより、該候補物質の薬効評価を行なうことができる。なお、本発明のトランスジェニック動物が抗原投与により起こすアレルギー反応の多くは、上記のようないわゆるＩ型アレルギー反応に分類されるものであるので、上記以外の他のＩ型アレルギー反応を起こさせる実験系で候補物質の薬効評価を行なうことも可能である。
【００５９】
さらに、本発明のトランスジェニック動物と、同種の他のトランスジェニック動物等の系統との交配により、両系統の遺伝的特徴を有する動物を得ることができる。例えば、本発明の方法に従って、導入遺伝子にコードされるＩｇの重鎖定常領域がヒトＩｇＥ由来であるようなトランスジェニックマウスを作出し［ヒトＩｇＥ定常領域をコードする遺伝子については、Seno, M. et al. (1983) Nuc. Acids Res. 11, 719-726、Ueda, S. et al. (1982) EMBO J. 1, 1539-1544等参照］、該トランスジェニックマウスと、ヒトＩｇＥレセプターをコードする遺伝子が導入されたトランスジェニックマウス［Fung-Leung, W-P. et al. (1996) J. Ex. Med. 183, 49-56およびDombrowicz, D. et al. (1996) J. Immunol. 157, 1645-1651参照］とを交配させることにより、ＩｇＥ−ＩｇＥレセプター系がヒト型であるトランスジェニックマウスを得ることができ、該マウスはヒトのアレルギーを想定したモデル動物として有用である。
【００６０】
【実施例】
以下に実施例および試験例をあげ、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、遺伝子操作実験における基本操作については文献［Maniatis, T., et al. (1982) in "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY. 参照］の記載に従った。
【００６１】
１．抗ＴＮＰＩｇＥの重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ断片の単離
（１）ＲＮＡの調製
抗ＴＮＰＩｇＥ産生ハイブリドーマＩＧＥＬ−ｂ４（ＡＴＣＣＴＩＢ１４１、Rudolph, A. K. et al. (1981) Eur. J. Immunol. 11, 527-529、Kofler, H. et al. (1992) Mol. Immunol. 29, 161-166およびNaito, K. et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25, 1631-1637参照）を、５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃で５×１０⁷細胞になるまで培養した後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分間）により沈澱した細胞を回収した。この細胞に全ＲＮＡ抽出用溶媒（ＩＳＯＧＥＮ（登録商標）：ニッポンジーン（株）社製）１ｍｌを加え懸濁し、細胞を溶解させた。この溶解液にクロロホルム０．４ｍｌを加えて懸濁した後、１５０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離してから水層（上層）を回収した。このものに等量の２−プロパノールを加えてから−８０℃で１時間冷却した後、１５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離して上清を除去した。沈澱を１ｍｌの７５％エタノールで洗浄し、再び１５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上清を除去した。この沈澱を風乾してから、２００μｌの水に溶解したものを全ＲＮＡ試料とした。
【００６２】
（２）ＲＴ−ＰＣＲ
上記（１）で調製した全ＲＮＡを鋳型として、市販のＲＴ−ＰＣＲ用キット（ギブコ・ビーアールエル社製）、マウス免疫グロブリン可変領域特異的プライマー（重鎖用プライマー１および同２、または軽鎖用プライマー混合液：ファルマシア社製）およびＴａｑポリメラーゼ（ＥｘＴａｑ（登録商標）、宝酒造（株）社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【００６３】
逆転写反応：
全ＲＮＡ１０乃至１５μｇ
オリゴｄＴ（１０μＭ、キットに付属）１μｌ
５× 第一鎖合成用緩衝液（キットに付属）４μｌ
２５ｍＭ塩化マグネシウム（キットに付属）２μｌ
０．１Ｍジチオスレイトール（キットに付属）２μｌ
上記試料および試薬を混合し、全量が１９μｌとなるように水を加え、逆転写酵素（キットに付属）を１μｌ加えてから４２℃で５０分保温した。
【００６４】
ＰＣＲ（重鎖用反応と軽鎖用反応を別個に実施した）：
逆転写反応液２μｌ
１０× ＰＣＲ用緩衝液（キットに付属）５μｌ
１０ｍＭｄＮＴＰ１μｌ
プライマー
重鎖用プライマー１および同２各０．５μｌ
軽鎖用プライマー混合液０．５μｌ
上記試料および試薬を混合し、全量が４９．５μｌとなるように水を加え、Ｔａｑポリメラーゼを０．５μｌ加えてから、９６℃で２分加温した後、９６℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１分の温度サイクルを４０サイクル実施し、さらに７２℃で７分保温してから、２５℃で１０分保温した。
【００６５】
（３）ＰＣＲ産物の分離
上記（２）で得られた重鎖用および軽鎖用ＲＴ−ＰＣＲ反応液についてそれぞれ０．８％アガロースゲル電気泳動を実施した。泳動終了後、ゲルを常法に従って臭化エチジウムで染色してからＵＶトランスイルミネーター上でＤＮＡバンドを可視化し、それぞれの試料について３００乃至３５０ｂｐに相当するバンド部分のゲルを切り出して透析チューブ（シームレス、セルロース製）中に入れた。この透析チューブを電気泳動槽中に入れて電気泳動（１００Ｖ、１時間）を行なうことにより、ＤＮＡをゲルから溶出させた後、透析チューブ内液を回収してフェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出およびクロロホルム抽出を行った後、エタノール沈澱操作を行ってＤＮＡを精製し、１０乃至２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（以下「ＥＤＴＡ」という））に溶解した。このようにして得られたＲＴ−ＰＣＲ産物を、プラスミドベクターｐＣＲＩＩ（インビトロジェン社製）に、ライゲーションキット（宝酒造(株)社製）を用いて組み込んだ後、コンピテント大腸菌株（ＪＭ１０９）を常法に従って形質転換してアンピシリン耐性クローンを選択した。これらのクローンを少量培養してプラスミドＤＮＡを調製した後、ジデオキシ法に従ってヌクレオチド配列を解析した。その結果、得られたクローンは重鎖用、軽鎖用とも、ＩＧＥＬ−ｂ４が産生する抗ＴＮＰＩｇＥの重鎖または軽鎖可変領域の一部をコードするＤＮＡ（配列表の配列番号１のヌクレオチド番号５８から４１２および配列番号３のヌクレオチド番号５８から３９３）を有することが確認された。
【００６６】
（４）プローブの標識
上記（３）で得られた、重鎖または軽鎖の可変領域の一部をコードするＤＮＡを含むプラスミドをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、電気泳動を行ってから（３）記載と同様の方法でそれぞれの挿入ＤＮＡ断片を単離した。これらの断片をそれぞれランダムプライマー法用ＤＮＡ標識キット（バージョン２、宝酒造（株）社製）および［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ（ニューイングランドニュークリア（ＮＥＮ）社製）を用いて標識し、ゲノミックＤＮＡスクリーニング用のプローブとした。
【００６７】
２．抗ＴＮＰＩｇＥの重鎖および軽鎖をコードするゲノミックＤＮＡのクローニング
（１）ゲノミックＤＮＡの抽出
抗ＴＮＰＩｇＥ産生ハイブリドーマＩＧＥＬ−ｂ４を１×１０⁷細胞になるまで培養し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去した。沈澱した細胞を氷冷したダルベッコＰＢＳ（−）（phosphate buffered saline：以下単に「ＰＢＳ」という）で２回洗浄した後、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ラウリル硫酸ナトリウム（以下「ＳＤＳ」という）および０．１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、５０℃で保温しながら一晩振盪した。次いでこのものについてフェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出およびクロロホルム抽出を行った後、エタノール沈澱操作を行ってＤＮＡを精製し、水に溶解したものをゲノミックＤＮＡ試料とした。
【００６８】
（２）ゲノムライブラリーの調製
上記（１）で調製したゲノミックＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩまたはＳａｃＩでそれぞれ消化した。各消化物をアガロースゲル電気泳動し、ナイロン膜（ハイボンド−Ｎ＋：アマシャム社製）にブロッティングした後、上記１．の（４）で調製した重鎖および軽鎖に対応するプローブ、マウスＩｇＭ重鎖をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＶＨ１６７μ［Kim, S. et al., (1981) Cell 27, 573-581、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 7400-7404参照］に由来するＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片を標識したプローブ、および同軽鎖をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＶ１６７Ｃκ［Selsing, E. and Storb, U., (1981) Cell 25, 47-58参照］のＳａｃＩ−ＳａｃＩＩ断片を標識したプローブを用いてそれぞれハイブリダイゼーションを行った。なお、ｐＶＨ１６７μのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片およびｐＶ１６７ＣκのＳａｃＩ−ＳａｃＩＩ断片は、それぞれＩｇＭ重鎖および軽鎖をコードするゲノミックＤＮＡの可変領域の一部をコードする部分とエンハンサー上流の領域を含む断片である。重鎖、軽鎖それぞれについて、上記１．の（４）で調製した重鎖用プローブとｐＶＨ１６７μのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片のプローブ、または上記１．の（４）で調製した軽鎖用プローブとｐＶ１６７ＣκのＳａｃＩ−ＳａｃＩＩ断片のプローブとで共通に検出されるバンドをクローニングするため、該バンド付近のゲノミックＤＮＡ断片のＤＮＡライブラリーを以下に記載する方法に従って構築した。
【００６９】
まず、上記（１）で調製したゲノミックＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩ（重鎖用）またはＨｉｎｄＩＩＩ（軽鎖用）で消化した。それぞれの消化物を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、泳動後のゲルを臭化エチジウムで染色した後、ＵＶトランスイルミネーター上で目的のバンドに相当する部分のゲルを切り出し、上記１．の（３）に記載した方法でゲル中のＤＮＡを抽出・精製した。
【００７０】
このようにして得られたＥｃｏＲＩ消化断片（重鎖用）をλｇｔ１０（ストラタジーン社製）に、またＨｉｎｄＩＩＩ消化断片（軽鎖用）をＺＡＰエクスプレスベクター（ストラタジーン社製）に、それぞれＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブ社製）を用いて連結した。これらのものを、パッケージングキット（GIGAPACK II Gold、ストラタジーン社製）を用いてファージにパッケージングした。その結果、それぞれ９×１０⁵プラーク形成単位（ｐｆｕ）（重鎖用ライブラリー）、４×１０⁶ｐｆｕ（軽鎖用ライブラリー）の力価を有するＤＮＡライブラリーが得られた。
【００７１】
（３）スクリーニング
上記（２）で得られた重鎖用および軽鎖用ＤＮＡライブラリーから、上記１．の（４）で調製したプローブにハイブリダイズするクローンを以下に記載の方法（プラークハイブリダイゼーション法）に従ってスクリーニングした。
【００７２】
まず、宿主大腸菌（重鎖用：ＮＭ５１４株、軽鎖用：ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ'株（以上ストラタジーン社製））に重鎖用または軽鎖用ライブラリーを感染させ、それらをφ１５ｃｍプラスチックシャーレ中に作製した寒天培地プレート上に１×１０⁵プラークが出現するように培養した。このプレート上にナイロン膜（ハイボンドＮ＋：アマシャム社製）をのせ、はがした後風乾した。次に、この膜を１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に５分間浸して膜上のＤＮＡをアルカリ変性させた後、１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に５分間浸して中和した。
さらにこの膜を２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）に５分間浸してから、風乾した後、ＵＶクロスリンカー（ストラタジーン社製）を用いてＤＮＡを膜上に固定した。
【００７３】
この膜を、プレハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、１×デンハート液、２５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）に浸し、４２℃で１時間保温した後、上記１．の（４）で調製した重鎖用または軽鎖用プローブを含むハイブリダイゼーション溶液（プレハイブリダイゼーション溶液：５０％硫酸デキストラン＝４：１（ｖ／ｖ））に浸し、４２℃で一晩保温した。膜を取り出し、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄した（室温で５分間、５０℃で３０分間）後、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄した（５０℃で３０分間を２回）。
洗浄後の膜を風乾し、Ｘ線フィルム（Ｘ−ＯＭＡＴＡＲ、コダック社製）を用いてオートラジオグラフィーを行なった。その結果ゲル上で同定された陽性プラークに相当する培地のゲルを切り出し、ファージをゲルから回収した後、低いプラーク密度で再度プラークハイブリダイゼーションを実施することにより、単一クローンを獲得した。
【００７４】
（４）クローニング
１）重鎖
上記（３）で重鎖用ライブラリーから単離された陽性クローンからファージＤＮＡを精製［前出Maniatis et al.参照］し、ＥｃｏＲＩ消化した後、アガロースゲル電気泳動を実施して、目的のＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約４ｋｂｐ）を分離・精製した。この断片を予めＥｃｏＲＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ベクターに組み込んだものを作製した。
【００７５】
２）軽鎖
軽鎖用ライブラリーから単離された陽性クローンに保持される目的のＤＮＡ（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、約２．５ｋｂｐ）は、ＺＡＰエクスプレスベクターに組み込まれているため、該ベクターの使用方法に従ってヘルパーファージを用いることにより、プラスミドｐＢＫ−ＣＭＶに組み込まれた形で回収された。
【００７６】
（５）ヌクレオチド配列の確認
１）重鎖
上記（４）で得られたＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（４ｋｂｐ）をさらにＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離後回収したＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片、ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片、ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片をそれぞれ別個にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ベクターにサブクローニングし、ヌクレオチド配列の解析を行った結果、重鎖用ＲＴ−ＰＣＲ産物と同一のヌクレオチド配列（配列表の配列番号１のヌクレオチド番号５８から４１２）を含むことを確認した。
【００７７】
２）軽鎖
上記（４）で得られた軽鎖クローンをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（２．５ｋｂｐ）をさらにＨａｅＩＩＩで消化してから、アガロースゲル電気泳動によって分離後回収した断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ベクターにサブクローニングし、ヌクレオチド配列の解析を行った結果、該軽鎖クローンが軽鎖用ＲＴ−ＰＣＲ産物と同一のヌクレオチド配列（配列表の配列番号３のヌクレオチド番号５８から３９４）を含むことを確認した。
【００７８】
３．導入遺伝子の調製
各導入遺伝子の構築の概略を図１および図２に示した。
【００７９】
（１）重鎖／軽鎖ゲノミックＤＮＡの処置
上記２．の（４）で得られた、重鎖クローン中のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約４ｋｂｐ）は、プロモーターおよび再構成された可変領域（ＶＤＪ）を含んでいたので、そのまま以後の操作を行なった。
【００８０】
一方、上記２．の（４）で得られた、軽鎖クローン中のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約２．５ｋｂｐ）は、制限酵素ＰｖｕＩＩおよびＰｓｔＩで消化し、再構成された可変領域（ＶＪ）を含むＰｖｕＩＩ−ＰｓｔＩ断片（１．５ｋｂｐ）を回収して以後の操作を行なった。
【００８１】
（２）重鎖／軽鎖定常領域ゲノミックＤＮＡおよびプロモーター・エンハンサーのクローニング
１）ＢＡＬＢ／ｃマウスゲノミックＤＮＡライブラリーの調製
マウスＩｇＥの重鎖定常領域をコードするＤＮＡをクローニングため、以下に記載する方法に従ってゲノムライブラリーを調製した。
【００８２】
まず、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本エスエルシー社より購入）を安楽死させた後、肝臓を摘出して液体窒素中で凍結させた。この肝臓をハンマーで破砕した後、上記２．の（１）記載と同様の方法に従ってゲノミックＤＮＡを抽出精製した。
マウス分泌型ＩｇＥ定常領域をコードするＤＮＡはゲノム中のＸｂａＩ−ＸｂａＩ消化断片の一つ（約４ｋｂｐ）に含まれることが知られている［Ishida, N. et al. (1982) EMBO J. 1, 1117-1123参照］ので、このゲノミックＤＮＡをＸｂａＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行って、２．５乃至４．５ｋｂｐに相当する部分のゲルを切り出し、ＤＮＡを抽出した。以下、上記２．の（２）記載と同様の方法に従って、ＺＡＰエクスプレスベクターをベクターとするゲノムライブラリーを調製した。
【００８３】
２）スクリーニング用プローブの調製
まず、以下に記載するヌクレオチド配列：
5'- ctcaacatca ctgagcagca atgg -3'
（センスプライマー：配列表の配列番号９）；
5'- gcgttattgt ggtgcttagt gtacc -3'
（アンチセンスプライマー：配列表の配列番号１０）
を有するオリゴヌクレオチドプライマーをホスホアミダイト法で合成した。次いで、上記１）で調製したＢＡＬＢ／ｃマウスゲノミックＤＮＡのＸｂａＩ−ＸｂａＩ消化断片混合物（２．５乃至４．５ｋｂｐ）を鋳型として、以下に記載する条件でＰＣＲを実施した。
【００８４】
反応液組成：
鋳型ＤＮＡ５μｇ
センスプライマー（１μＭ）５μｌ
アンチセンスプライマー（１μＭ）５μｌ
１０× ＥｘＴａｑバッファー１０μｌ
１０ｍＭｄＮＴＰ１０μｌ
全量が９９μｌとなるように水を加え、さらにＥｘＴａｑポリメラーゼを１μｌ添加した。
【００８５】
温度条件：９６℃で２分間加熱した後、９６℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分間の温度サイクルを３０サイクル繰り返し、さらに７２℃で７分間、次いで２５℃で１０分間保温した。
【００８６】
ＰＣＲ後の反応液から、上記１．の（３）記載の方法に従って増幅されたＤＮＡ断片（３７５ｂｐ）をｐＣＲＩＩベクターにクローニングし、上記１．の（４）記載の方法に従って³²Ｐで標識した。
【００８７】
３）スクリーニング
上記２）で調製されたプローブで、上記１）で調製されたゲノムライブラリーをプラークハイブリダイゼーション法（上記２．の（３）参照）でスクリーニングを行ない、得られたクローン（プラスミドｐＢＫ−ＣＭＶに組み込まれた形で回収される）をＸｂａＩ消化してからアガロースゲル電気泳動を行って約４ｋｂｐのＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片を回収した。
【００８８】
４）重鎖エンハンサーの一部のクローニング
まず、既知のマウス免疫グロブリン重鎖エンハンサーのヌクレオチド配列を参考にして、以下に記載するヌクレオチド配列：
5'- tagaattcat tttcaaaatt agg -3'
（センスプライマー：配列表の配列番号１１）；
5'- agtctagata attgcattca tttaa -3'
（アンチセンスプライマー：配列表の配列番号１２）
を有するオリゴヌクレオチドプライマーをホスホアミダイト法で合成した。次いで、上記１）で調製したＢＡＬＢ／ｃマウスゲノミックＤＮＡを鋳型として、以下に記載する条件でＰＣＲを実施した。
【００８９】
反応液組成：
鋳型ＤＮＡ５μｇ
センスプライマー（１μＭ）１μｌ
アンチセンスプライマー（１μＭ）１μｌ
１０× ＥｘＴａｑバッファー５μｌ
１０ｍＭｄＮＴＰ５μｌ
全量が９９μｌとなるように水を加え、さらにＥｘＴａｑポリメラーゼを１μｌ添加した。
【００９０】
温度条件：９６℃で２分間加熱した後、９６℃で３０秒、４５℃で１分間、７２℃で１分間の温度サイクルを３０サイクル繰り返し、さらに７２℃で７分間保温した。
【００９１】
ＰＣＲ終了後の反応液をアガロースゲル電気泳動し、増幅されたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、再度アガロースゲル電気泳動を行って約３００ｂｐの断片を回収した。
【００９２】
５）軽鎖
一方、マウスＩｇＥの軽鎖定常領域をコードするゲノミックＤＮＡとして、ＩｇＫ軽鎖をコードするＤＮＡクローンｐＭＭ２２２［Hiramatsu, R. et al., (1995) Cell 83, 1113-1123参照］を制限酵素ＰｓｔＩおよびＮｏｔＩで消化してからアガロースゲル電気泳動し、イントロンエンハンサー、定常領域をコードする部分（Ｃκ）および３'末端側エンハンサーを含むＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ断片（約１２ｋｂｐ）を分離・回収した。また、ｐＭＭ２２２を制限酵素ＳａｌＩおよびＰｖｕＩＩで消化してからアガロースゲル電気泳動し、プロモーターを含むＳａｌＩ−ＰｖｕＩＩ断片（約５ｋｂｐ）を分離・回収した。
【００９３】
（３）可変領域と定常領域、プロモーター・エンハンサーの連結
１）重鎖
上記（２）の４）で調製した、エンハンサーの一部を含むＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片（約３００ｂｐ）を、予めＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ベクターにサブクローニングした。このプラスミドをＸｂａＩで消化して開環してから、上記（２）の３）で調製したマウスＩｇＥ重鎖定常領域をコードする遺伝子を含むＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片（約４ｋｂｐ）をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により連結しサブクローニングした。得られたクローンのヌクレオチド配列解析を行って、該ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片が正方向に連結された（定常領域をコードするＤＮＡのセンス鎖の５'末端側がエンハンサーの３'末端側に連結された）クローンを選択した。次に、このクローンをＥｃｏＲＩ消化により開環してから、上記２．の（４）で得られた重鎖クローン中のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約４ｋｂｐ、プロモーター・可変領域を含む）をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により連結しサブクローニングした。得られたクローンのヌクレオチド配列解析を行って、該ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片が正方向に連結された（可変領域をコードするＤＮＡのセンス鎖の３'末端側がエンハンサーの５'末端側に連結された）クローンを選択し、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列（リーダー配列を含む）をコードする遺伝子、該遺伝子発現用プロモーターおよびエンハンサー配列が連結されたＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＳＫ−ＴＮＰ−ＩｇＥ−Ｈを得た。
【００９４】
２）軽鎖
ＳａｌＩとＰｓｔＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ベクターに、上記（２）で調製したプロモーターを含むＳａｌＩ−ＰｖｕＩＩ断片（約５ｋｂｐ）および上記（１）で調製した可変領域を含むＰｖｕＩＩ−ＰｓｔＩ断片（約１．５ｋｂｐ）をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により同時に連結しサブクローニングした。次に、得られたプラスミドをＰｓｔＩおよびＮｏｔＩで消化した後、上記（２）で調製したイントロンエンハンサー、定常領域をコードする部分（Ｃκ）および３'末端側エンハンサーを含むＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ断片（１２ｋｂｐ）をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により同時に連結して、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列（リーダー配列を含む）をコードする遺伝子、該遺伝子発現用プロモーターおよびエンハンサー配列が連結されたＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＳＫ−ＴＮＰ−ＩｇＥ−Ｌを得た。
【００９５】
（４）導入遺伝子の調製
上記（３）で構築したｐＳＫ−ＴＮＰ−ＩｇＥ−ＨおよびｐＳＫ−ＴＮＰ−ＩｇＥ−Ｌは、いずれもＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化して直鎖化し、アガロースゲル電気泳動を行って、導入に必要なＤＮＡ断片（重鎖：約８．５ｋｂｐ、軽鎖：約１９ｋｂｐ）を分離・精製した。さらにこれらのＤＮＡ断片を、塩化セシウム密度勾配超遠心法により精製してからＴＥに溶解し、重鎖用断片と軽鎖用断片を等量混合したものを導入用ＤＮＡ試料とした。
【００９６】
４．遺伝子導入
雌マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、４週齢、日本エスエルシー（株）より購入）に排卵誘起剤を投与後、同系統の雄と交配し、翌日雌マウスの卵管より前核受精卵を採取した。上記４．で調製した導入用ＤＮＡ溶液（１乃至５μｇ／ｍｌ）を、微小ガラス管を用いて受精卵の前核に約２ｐｌ注入した。この操作は、文献［「受精卵へのＤＮＡの注入」発生工学実験マニュアル 41-76頁（野村達次監修、勝木元也編、講談社、1987年）および「前核へのＤＮＡのマイクロインジェクション」マウス胚の操作マニュアル 155-173頁、（"Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual" B. Hogan, F. Costantini and E. Lacy著、山内一也、豊田裕、森庸厚、岩倉洋一郎訳、近代出版、1989年］の記載に従って実施した。ＤＮＡを注入した受精卵は、偽妊娠仮親雌マウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ、日本エスエルシー株式会社製）の卵管に移植し、約２０日後に自然分娩または帝王切開により出生させた。
【００９７】
５．導入の確認
（１）導入遺伝子の検出
１）プライマーの合成
上記４．で導入した遺伝子が、出生したマウスに保持されているか否かをＰＣＲによって調べるため、以下に記載するヌクレオチド配列からなる４種のオリゴヌクレオチドプライマー：
5'- gcaagatggg gcttaatctt tgctatgg -3'
（重鎖用センスプライマー：配列表の配列番号５）；
5'- ccaccttgat gctctagata attgc -3'
（重鎖用アンチセンスプライマー：配列表の配列番号６）；
5'- gatgttttga tgacccaaac tccac -3'
（軽鎖用センスプライマー：配列表の配列番号７）；
5'- cttggtccca gcaccgaacg tgagc -3'
（軽鎖用アンチセンスプライマー：配列表の配列番号８）；
を、ホスホアミダイト法により合成した。
【００９８】
２）ＰＣＲ
上記４．で得られたマウス（生後３週齢）の尾（約１ｃｍ長）から、上記２．の（１）に記載した方法に従ってゲノミックＤＮＡを抽出し、１００μｌの水に溶解した。このＤＮＡを鋳型として、重鎖、軽鎖それぞれについて以下に記載する条件でＰＣＲを実施した。
【００９９】
反応液組成：
鋳型ＤＮＡ２μｌ
センスプライマー（１μＭ）０．５μｌ
アンチセンスプライマー（１μＭ）０．５μｌ
１０× Ｅｘバッファー２μｌ
水１４．５μｌ
ＥｘＴａｑポリメラーゼ０．５μｌ
温度条件：９６℃で２分間加熱した後、９６℃で３０秒、５０℃で１分間、７２℃で１分間の温度サイクルを３０サイクル繰り返してから、２５℃で７分間保温した。
【０１００】
ＰＣＲ終了後、反応液の一部を採取して１．２％アガロースゲル電気泳動を実施し、特異的に増幅されるバンドの有無を確認した（重鎖：約１．５ｋｂｐ、軽鎖：約３００ｂｐ）。その結果、上記４．で作出したマウス７１匹のうち、３匹のマウスから、上記４．で導入した重鎖および軽鎖のそれぞれをコードする遺伝子が検出された。
【０１０１】
また、これらの導入した重鎖および軽鎖のそれぞれをコードする遺伝子が検出されたマウスをＢＡＬＢ／ｃ正常マウスと交配させ、生まれた子のＤＮＡを上記の方法で解析した結果、５０％の子が導入遺伝子を重鎖、軽鎖ともに保持していた。
【０１０２】
（２）マウスの血中ＩｇＥ濃度測定方法および結果
マウスの血中ＩｇＥ濃度の測定は、マウスＩｇＥ分子上の異なるエピトープを認識する２種の抗マウスＩｇＥ抗体を用いて、サンドイッチ−ＥＬＩＳＡ法で行った［Hirano, T. et al., (1988) Int. Archs. Allergy Appl. Immun. 85, 47-54参照］。試料として生後４週以上経過したマウスから採取した血清を使用した。また標準曲線作成用の試料としてマウスＩｇＥ（ファーミンジェン社製）を使用した。
【０１０３】
まず、ＰＢＳで希釈した抗マウスＩｇＥ抗体６ＨＤ５（５μｇ／ｍｌ、ヤマサ醤油（株）社製）をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Nunc-Immuno Plate, PolySorp Surface：ヌンク社製）に５０μｌ／ウエル添加し、４℃で一晩静置して抗体をウエル底面に吸着させた。抗体溶液を除去後、ブロッキング溶液（４％ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という。シグマ社製）および０．２％ツイーン２０を含むＰＢＳ）を７０μｌ／ウエル加え、室温で１時間静置した（ブロッキング）。ウエル内のブロッキング溶液を除去後、各ウエルを洗浄溶液（０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ）２００μｌ／ウエルで３回洗浄してから、ブロッキング溶液で希釈した試料（マウス血清または段階希釈した濃度既知のマウスＩｇＥ）を５０μｌ／ウエル加え、３７℃で１時間保温した。
【０１０４】
ウエル内の試料を除去し、洗浄溶液２００μｌ／ウエルで３回洗浄した後、ブロッキング溶液で希釈したビオチン標識抗マウスＩｇＥＨＭＫ１２（５μｇ／ｍｌ、ヤマサ醤油（株）社製）を５０μｌ／ウエル加え、３７℃で１時間保温した。
【０１０５】
ウエル内の抗体溶液を除去し、洗浄溶液２００μｌ／ウエルで３回洗浄した後、ブロッキング溶液で２５０倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（アマシャム社製）を５０μｌ／ウエル加え、室温で１時間静置した。
【０１０６】
ウエル内のストレプトアビジン溶液を除去し、洗浄溶液２００μｌ／ウエルで３回洗浄した後、基質溶液（４０ｍｇ／ｍｌｏ−フェニレンジアミン、０．００００１％過酸化水素、４０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、５０ｍＭクエン酸）を５０μｌ／ウエル加え、室温で２０分間静置した。次いで、６Ｎ硫酸を５０μｌ／ウエル加えてペルオキシダーゼ反応を停止させ、各ウエルの４９０ｎｍの吸光度を測定し、その測定値をマウスＩｇＥの標準曲線に参照して、試料中のＩｇＥ濃度を決定した。
【０１０７】
その結果、導入遺伝子の存在が確認された全てのマウスは、８μｇ／ｍｌ以上の高い血中ＩｇＥ濃度を示した。
【０１０８】
（３）抗ＴＮＰＩｇＥの検出方法および結果
上記４．で作出したマウスの血中ＩｇＥの抗原特異性をＥＬＩＳＡ法により評価した。まず、ＴＮＰで標識したニワトリ由来オブアルブミン（以下「ＯＶＡ」という）または未標識ＯＶＡ溶液（５μｇ／ｍｌ）をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Nunc-Immuno Plate, PolySorp Surface、ヌンク社製）に５０μｌ／ウエル添加し、４℃で一晩静置してＯＶＡをウエル底面に吸着させた。以下、このＯＶＡ固相化プレートを使用し、上記（２）と同様の操作を行ってＴＮＰ特異的ＩｇＥ濃度を測定した。ただし、標準曲線作成用のＩｇＥとしてハイブリドーマＩＧＥＬ−ｂ４が産生する抗ＴＮＰＩｇＥを使用した。その結果、導入遺伝子の存在が確認された全てのマウスの血中ＩｇＥは、ＴＮＰ標識ＯＶＡには結合するが、未標識ＯＶＡには結合しなかったので、該マウスで発現した遺伝子産物はＴＮＰに対する特異性を保持していることが明らかとなった。また、血中の抗ＴＮＰＩｇＥ濃度と上記（２）で測定されたＩｇＥ濃度との比較から、導入遺伝子の存在が確認されたマウスの血中ＩｇＥのほとんどが、導入遺伝子の産物であることが判明した。
【０１０９】
試験例
（１）ハプテンとしてＴＮＰを有する塩化ピクリル（picryl chloride）を未感作の正常マウスおよび実施例で作製されたトランスジェニックマウスの耳介に塗布したところ、正常マウスでは著変は認められなかったが、トランスジェニックマウスにおいては塗布後１時間をピークとする著明な皮膚の一過性の肥厚が認められた。これに対し、異なるハプテン抗原オキザゾロン（oxazolone)を塗布した場合には、いずれのマウスにおいても耳介皮膚の肥厚は観察されなかった。
すなわち、実施例で作製されたトランスジェニックマウスでは事前の感作を何ら必要とせず、１回の抗原投与のみで抗原特異的な典型的Ｉ型アレルギー反応を誘発できることが確かめられた。
【０１１０】
（２）ＴＮＰを結合させたアルブミンを青色素エバンスブルーとともに正常マウスおよび実施例で作製されたトランスジェニックマウスの尾静脈から注射した結果、トランスジェニックマウスでは呼吸困難、体温の低下、運動停止、青色素の血管外滲出など典型的な全身性アナフィラキシーの病態を呈した。一方、ＴＮＰを結合させていないアルブミンを注射した場合にはこのようなアナフィラキシー症状は認められなかった。また、正常マウスではいずれの場合もアナフィラキシー症状は呈さなかった。
【０１１１】
（３）抗アレルギー剤の探索または効果確認のための試験方法
以下に挙げる各実験系において、被検物質の前投与、同時投与、後投与または連続投与による効果を調べる。
【０１１２】
（ａ）上記（１）の方法で本発明のトランスジェニック動物に誘発した皮膚アレルギー反応（皮膚の肥厚）に対する、被検物質投与による抑制効果を、皮膚厚を測定することにより判定する。
【０１１３】
（ｂ）上記（２）の方法で本発明のトランスジェニック動物に誘発した全身性アナフィラキシーショックに対する、被検物質投与による抑制効果を、体温、気道抵抗、青色素の血管外滲出などを指標にして判定する。
【０１１４】
（ｃ）アレルゲンをネブライザーなどを用いて本発明のトランスジェニック動物に鼻から吸入させることにより、呼吸器系におけるアレルギー反応を誘発することが可能である。このような呼吸器系におけるアレルギー反応に対する、被検物質投与による抑制効果を、気道抵抗、肺のコンプライアンスなどを測定することにより判定する。
【０１１５】
（ｄ）アレルゲンを本発明のトランスジェニック動物に経口的に投与することによって、消化器系におけるアレルギー反応を誘発することが可能である。このような消化器系におけるアレルギー反応に対する被検物質投与による抑制効果を、下痢、嘔吐などの症状の軽減を指標にして判定する。
【０１１６】
【発明の効果】
上記のごとく、本発明により抗アレルギー薬の探索のためのアレルギー動物モデルとして有用な、新規トランスジェニック動物およびその使用方法が提供された。本発明のトランスジェニック動物を用いることにより、アレルギー性疾患の治療薬の探索や効果の確認を効率良く行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】マウス抗ＴＮＰＩｇＥ重鎖をマウスで発現させるための導入遺伝子の構築図。
【図２】マウス抗ＴＮＰＩｇＥ軽鎖をマウスで発現させるための導入遺伝子の構築図。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：設計されたマウスＩｇＥ重鎖をコードするＤＮＡ。
配列番号２：設計されたマウスＩｇＥ重鎖。
配列番号３：設計されたマウスＩｇＥ軽鎖をコードするＤＮＡ。
配列番号４：設計されたマウスＩｇＥ軽鎖。
配列番号５：ＩｇＥ重鎖をコードする導入遺伝子を検出するためのＰＣＲプライマー。
配列番号６：ＩｇＥ重鎖をコードする導入遺伝子を検出するためのＰＣＲプライマー。
配列番号７：ＩｇＥ軽鎖をコードする導入遺伝子を検出するためのＰＣＲプライマー。
配列番号８：ＩｇＥ軽鎖をコードする導入遺伝子を検出するためのＰＣＲプライマー。
配列番号９：マウスＩｇＥ重鎖定常領域をコードするＤＮＡの断片を増幅するためのＰＣＲプライマー。
配列番号１０：マウスＩｇＥ重鎖定常領域をコードするＤＮＡの断片を増幅するためのＰＣＲプライマー。
配列番号１１：マウスＩｇ重鎖遺伝子のエンハンサー領域を増幅するためのＰＣＲプライマー。
配列番号１２：マウスＩｇ重鎖遺伝子のエンハンサー領域を増幅するためのＰＣＲプライマー。
【配列表】

Claims

下記の構成要素ａ）およびｂ）を含むイムノグロブリン（以下「Ｉｇ」という）構造を有する分子を常時発現することができるようにそのゲノムが改変されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物：
ａ）Ｉｇ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む少なくとも一つの抗原特異的認識部位（ただし、該認識部位は、イムノグロブリンが特異的に結合し得る物質であって、該動物自らは通常産生しない物質に対して特異性を有する）；
ｂ）細胞膜結合部位を有さず、且つ、該動物のマスト細胞上に発現しているイムノグロブリンＥ（以下「ＩｇＥ」という）レセプターへの結合を可能ならしめることを特徴とする、ＩｇＥ重鎖定常領域に由来する重鎖定常領域。
重鎖定常領域がＩｇＥ重鎖定常領域であることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック動物。
Ｉｇ構造を有する分子がＩｇＥであることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック動物。
Ｉｇ構造を有する分子が一つのＩｇ軽鎖および一つのＩｇ重鎖からなることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック動物。
重鎖定常領域が、天然に存在するＩｇＥ重鎖定常領域由来であることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック動物。
事前の抗原感作なしに、イムノグロブリンが特異的に結合し得る物質であって、該動物自らは通常産生しない物質に対するアレルギー反応を呈することを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物。
導入された外来遺伝子の産物であるＩｇ構造を有する分子の血中濃度が、少なくとも８μｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物。
導入された外来遺伝子の産物であるＩｇ構造を有する分子の血中濃度が、事前に抗原感作された同種の非トランスジェニック動物における特異的ＩｇＥの血中濃度と少なくとも同等またはそれ以上であることを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物。
イムノグロブリンが特異的に結合し得る物質であって、該動物自らは通常産生しない物質が、Ｉｇ構造を有する分子と複合体を形成し、マスト細胞上のＩｇＥレセプターを介してヒトのアレルギー症状を擬制したアレルギー反応を起こし得るものであることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物。
ヒトのアレルギー症状が花粉症であることを特徴とする、請求項９記載のトランスジェニック動物。
齧歯類であることを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物。
マウスであることを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物。
ゲノムの改変にゲノミックＤＮＡが使用されていることを特徴とする、請求項１乃至１２のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物。
ゲノミックＤＮＡが、有効なプロモーターおよびエンハンサー領域を含むことを特徴とする、請求項１４記載のトランスジェニック動物。
ゲノムの改変が、同種動物由来のＤＮＡによるものであることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック動物。
Ｉｇ構造を有する分子の重鎖定常領域がヒトマスト細胞上のＩｇＥレセプターと結合可能なものから選択されており、かつマスト細胞上に発現するＩｇＥレセプターが、抗原と複合体を形成したヒトＩｇＥと結合できるようにヒト化されていることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック動物。
Ｉｇ構造を有する分子の重鎖定常領域が分泌型ＩｇＥ分子由来であることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック動物。
Ｉｇ構造を有する分子をコードする遺伝子のホモ接合体であることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック動物。
イムノグロブリンが特異的に結合し得る物質であって、該動物自らは通常産生しない物質が、花粉由来アレルゲン、真菌由来アレルゲン、ダニ由来アレルゲン、ハウスダスト、動物（皮屑、糞、体毛）由来のアレルゲン、昆虫由来アレルゲン、食品（卵、牛乳、肉、魚介類、豆類、穀類、果物・野菜）アレルゲン、寄生虫由来アレルゲン、薬品アレルゲン、化学物質アレルゲンおよび一つもしくは二つ以上のトリニトロフェニル基を有する物質からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１乃至１８のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物。
イムノグロブリンが特異的に結合し得る物質であって、該動物自らは通常産生しない物質が、一つもしくは二つ以上のトリニトロフェニル基を有する物質であることを特徴とする、請求項１乃至２０のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物。
Ｉｇ構造を有する分子の重鎖定常領域が分泌型ＩｇＥ由来であって、かつ配列表の配列番号２のアミノ酸番号１２０から５４２に示されるアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック動物。
Ｉｇ構造を有する分子の重鎖定常領域をコードする遺伝子が、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号４１５から１６８３に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡであることを特徴とする、請求項２１記載のトランスジェニック動物。
Ｉｇ構造を有する分子の軽鎖が、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号３９７から７１４に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡにコードされる軽鎖定常領域を有するものであることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック動物。
Ｉｇ構造を有する分子の重鎖が、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から５４２に示されるアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック動物。
Ｉｇ構造を有する分子の軽鎖が、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から２１９に示されるアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック動物。
Ｉｇ構造を有する分子の重鎖が配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から５４２に示されるアミノ酸配列からなり、同軽鎖が配列表の配列番号４のアミノ酸番号１から２１９に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック動物。
Ｉｇ構造を有する分子の重鎖をコードする遺伝子が、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号５８から４１２に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡであることを特徴とする、請求項２４記載のトランスジェニック動物。
Ｉｇ構造を有する分子の軽鎖をコードする遺伝子が、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号５８から３９４に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡであることを特徴とする、請求項２５記載のトランスジェニック動物。
Ｉｇ構造を有する分子の重鎖をコードする遺伝子が、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号５８から４１２に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡであり、かつ同軽鎖をコードする遺伝子が、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号５８から３９４に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡであることを特徴とする、請求項２６記載のトランスジェニック動物。
下記の構成要素ａ）およびｂ）を含むＩｇ構造を有する分子を常時発現することができるようにそのゲノムが改変されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物：
ａ）Ｉｇ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む少なくとも一つの抗原特異的認識部位（ただし、該認識部位は、イムノグロブリンが特異的に結合しうる物質であって、該動物は通常産生しない物質に対して特異性を有する）；
ｂ）細胞膜結合部位を有さず、且つ、該動物のマスト細胞上に発現しているＩｇＥレセプターへの結合を可能ならしめることを特徴とする、ＩｇＥ重鎖定常領域に由来する重鎖定常領域：
を得る方法であって、まず動物受精卵に、
ｉ）定常領域が分泌型ＩｇＥ由来であって、可変領域がイムノグロブリンが特異的に結合し得る物質であって、該動物自らは通常産生しない物質に特異的な結合活性を有するＩｇ由来であることを特徴とするＩｇ重鎖をコードする遺伝子、および
ｉｉ）可変領域が前記重鎖可変領域を有するＩｇ由来であることを特徴とするＩｇ軽鎖をコードする遺伝子を導入し、次いで、
ｉｉｉ）該受精卵を偽妊娠処置を施した同種の雌動物卵管に移植し、
ｉｖ）該動物胎内で発生させる，
ことを特徴とする方法。
請求項３０記載の方法によって得られるトランスジェニック動物。
下記の構成要素ａ）およびｂ）を含むＩｇ構造を有する分子を常時発現することができるようにそのゲノムが改変されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物：
ａ）Ｉｇ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む少なくとも一つの抗原特異的認識部位（ただし、該認識部位は、イムノグロブリンが特異的に結合し得る物質であって、該動物自らは通常産生しない物質に対して特異性を有する）；
ｂ）細胞膜結合部位を有さず、且つ、該動物のマスト細胞上に発現しているＩｇＥレセプターへの結合を可能ならしめることを特徴とする、ＩｇＥ重鎖定常領域に由来する重鎖定常領域：
を得る方法であって、該Ｉｇ重鎖をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニック動物と、該Ｉｇ軽鎖をコードする遺伝子が導入された同一種由来のトランスジェニック動物とを交配し、次いで前記両方の遺伝子を保持する動物を得ることを特徴とする方法。
請求項３２記載の方法によって得られるトランスジェニック動物。
事前の抗原感作なしに、イムノグロブリンが特異的に結合し得る物質であって、該動物自らは通常産生しない物質の単回投与によりアレルギー反応を呈することを特徴とする、請求項１乃至５のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。