JP4283318B2 - 抗アレルギー薬の評価方法 - Google Patents
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Description
アトピー等のアレルギー反応は、アレルゲンに特異的に結合したイムノグロブリンE(以下「IgE」という)が、マスト細胞上のIgEレセプターを架橋することによって開始される。そして、マスト細胞からヒスタミン等メディエーターの放出が起こり、アレルギー反応を呈するようになる。今日、アレルギーの治療は主として抗ヒスタミン剤や抗炎症ステロイド剤等によるものであるが、それら以外の作用点を有する、より特異的な治療方法の開発は、適切な実験動物がないことにより妨げられている。
(1) 下記の構成要素a)およびb)を含むイムノグロブリン(以下「Ig」という)構造を有する分子を常時発現することができるようにそのゲノムが改変されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物:
a)Ig重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む少なくとも一つの抗原特異的認識部位(ただし、該認識部位は、予め選択された抗原に対して特異性を有する);
b)該動物のマスト細胞上に発現しているイムノグロブリンE(以下「IgE」という)レセプターへの結合を可能ならしめる重鎖定常領域、
(2) 重鎖定常領域がIgE重鎖定常領域、その一部およびその同効物から選択されることを特徴とする、(1)記載のトランスジェニック動物、
(3) 重鎖定常領域がIgE重鎖定常領域であることを特徴とする、(1)記載のトランスジェニック動物、
(4) Ig構造を有する分子がIgEであることを特徴とする、(1)記載のトランスジェニック動物、
(5) Ig構造を有する分子が一つのIg軽鎖および一つのIg重鎖からなることを特徴とする、(1)記載のトランスジェニック動物、
(6) 重鎖定常領域が、天然に存在するIgE重鎖定常領域由来であることを特徴とする、(1)記載のトランスジェニック動物、
(7) 事前の抗原感作なしに、特異的抗原に対するアレルギー反応を呈することを特徴とする、(1)乃至(6)のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物、
(8) 導入された外来遺伝子の産物であるIg構造を有する分子の血中濃度が、少なくとも8μg/mlであることを特徴とする、(1)乃至(7)のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物、
(9) 導入された外来遺伝子の産物であるIg構造を有する分子の血中濃度が、事前に抗原感作された同種の非トランスジェニック動物における特異的IgEの血中濃度と少なくとも同等またはそれ以上であることを特徴とする、(1)乃至(7)のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物、
(10) 予め選択される抗原が、Ig構造を有する分子と複合体を形成し、マスト細胞上のIgEレセプターを介してヒトのアレルギー症状を擬制したアレルギー反応を起こし得るものであることを特徴とする、(1)乃至(9)のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物、
(11) ヒトのアレルギー症状が花粉症であることを特徴とする、(10)記載のトランスジェニック動物、
(12) 齧歯類であることを特徴とする、(1)乃至(11)のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物、
(13) マウスであることを特徴とする、(1)乃至(11)のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物、
(14) ゲノムの改変にゲノミックDNAが使用されていることを特徴とする、(1)乃至(13)のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物、
(15) ゲノミックDNAが、有効なプロモーターおよびエンハンサー領域を含むことを特徴とする、(14)記載のトランスジェニック動物、
(16) Ig構造を有する分子の重鎖および軽鎖可変領域が単一のIgアイソタイプ由来であることを特徴とする、(1)記載のトランスジェニック動物、
(17) ゲノムの改変が、同種動物由来のDNAによるものであることを特徴とする、(1)記載のトランスジェニック動物、
(18) Ig構造を有する分子の重鎖定常領域がヒトマスト細胞上のIgEレセプターと結合可能なものから選択されており、かつマスト細胞上に発現するIgEレセプターが、抗原と複合体を形成したヒトIgEと結合できるようにヒト化されていることを特徴とする、(1)記載のトランスジェニック動物、
(19) Ig構造を有する分子の重鎖定常領域が分泌型IgE分子由来であることを特徴とする、(1)記載のトランスジェニック動物、
(20) Ig構造を有する分子をコードする遺伝子のホモ接合体であることを特徴とする、(1)記載のトランスジェニック動物、
(21) 予め選択される抗原が、花粉由来アレルゲン、真菌由来アレルゲン、ダニ由来アレルゲン、ハウスダスト、動物(皮屑、糞、体毛)由来のアレルゲン、昆虫由来アレルゲン、食品(卵、牛乳、肉、魚介類、豆類、穀類、果物・野菜)アレルゲン、寄生虫由来アレルゲン、薬品アレルゲン、化学物質アレルゲンおよび一つもしくは二つ以上のトリニトロフェニル基を有する物質からなる群より選択されることを特徴とする、(1)乃至(20)のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物、
(22) 予め選択される抗原が、一つもしくは二つ以上のトリニトロフェニル基を有する物質であることを特徴とする、(1)乃至(20)のいずれか一つに記載のトランスジェニック動物、
(23) Ig構造を有する分子の重鎖定常領域が分泌型IgE由来であって、かつ配列表の配列番号2のアミノ酸番号120から542に示されるアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする、(1)記載のトランスジェニック動物、
(24) Ig構造を有する分子の重鎖定常領域をコードする遺伝子が、配列表の配列番号1のヌクレオチド番号415から1683に示されるヌクレオチド配列を実質的に含むDNAであることを特徴とする、(23)記載のトランスジェニック動物、
(25) Ig構造を有する分子の軽鎖が、配列表の配列番号3のヌクレオチド番号397から714に示されるヌクレオチド配列を実質的に含むDNAにコードされる分泌型イムノグロブリンEの軽鎖定常領域を有するものであることを特徴とする、(1)記載のトランスジェニック動物、
(26) Ig構造を有する分子の重鎖が、配列表の配列番号2のアミノ酸番号1から542に示されるアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする、(1)記載のトランスジェニック動物、
(27) Ig構造を有する分子の軽鎖が、配列表の配列番号4のアミノ酸番号1から219に示されるアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする、(1)記載のトランスジェニック動物、
(28) Ig構造を有する分子の重鎖が配列表の配列番号2のアミノ酸番号1から542に示されるアミノ酸配列からなり、同軽鎖が配列表の配列番号4のアミノ酸番号1から219に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、(1)記載のトランスジェニック動物、
(29) Ig構造を有する分子の重鎖をコードする遺伝子が、配列表の配列番号1のヌクレオチド番号58から412に示されるヌクレオチド配列を含むDNAであることを特徴とする、(26)記載のトランスジェニック動物、
(30) Ig構造を有する分子の軽鎖をコードする遺伝子が、配列表の配列番号3のヌクレオチド番号58から394に示されるヌクレオチド配列を含むDNAであることを特徴とする、(27)記載のトランスジェニック動物、
(31) Ig構造を有する分子の重鎖をコードする遺伝子が、配列表の配列番号1のヌクレオチド番号58から412に示されるヌクレオチド配列を含むDNAであり、かつ同軽鎖をコードする遺伝子が、配列表の配列番号3のヌクレオチド番号58から394に示されるヌクレオチド配列を含むDNAであることを特徴とする、(28)記載のトランスジェニック動物、
(32) 下記の構成要素a)およびb)を含むIg構造を有する分子を常時発現することができるようにそのゲノムが改変されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物:
a)Ig重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む少なくとも一つの抗原特異的認識部位(ただし、該認識部位は、予め選択された抗原に対して特異性を有する);
b)該動物のマスト細胞上に発現しているIgEレセプターへの結合を可能ならしめる重鎖定常領域:
を得る方法であって、まず動物受精卵に、
i)定常領域が分泌型IgE由来であって、可変領域が特定の抗原に特異的な結合活性を有するIgE由来であることを特徴とするIg重鎖をコードする遺伝子、および
ii)可変領域が前記重鎖可変領域を有するIg由来であることを特徴とするIg軽鎖をコードする遺伝子を導入し、次いで、
iii)該受精卵を偽妊娠処置を施した同種の雌動物卵管に移植し、
iv)該動物胎内で発生させる,
ことを特徴とする方法、
(33) (32)記載の方法によって得られるトランスジェニック動物、
(34) 下記の構成要素a)およびb)を含むIg構造を有する分子を常時発現することができるようにそのゲノムが改変されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物:
a)Ig重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む少なくとも一つの抗原特異的認識部位(ただし、該認識部位は、予め選択された抗原に対して特異性を有する);
b)該動物のマスト細胞上に発現しているIgEレセプターへの結合を可能ならしめる重鎖定常領域:
を得る方法であって、該Ig重鎖をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニック動物と、該Ig軽鎖をコードする遺伝子が導入された同一種由来のトランスジェニック動物とを交配し、次いで前記両方の遺伝子を保持する動物を得ることを特徴とする方法、
(35) (34)記載の方法によって得られるトランスジェニック動物、
(36) 下記の構成要素a)およびb)を含むIg構造を有する分子を常時発現することができるようにそのゲノムが改変されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物:
a)Ig重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む少なくとも一つの抗原特異的認識部位(ただし、該認識部位は、予め選択された抗原に対して特異性を有する);
b)該動物のマスト細胞上に発現しているIgEレセプターへの結合を可能ならしめる重鎖定常領域:
を得る方法であって、該Igのいずれか一方の鎖をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニック動物から、該Igの両方の鎖をコードする遺伝子を保持する動物を得ることを特徴とする方法、
(37) (36)記載の方法によって得られるトランスジェニック動物、
(38) 動物に抗原を曝露することによって生じるアレルギー症状に対する、物質の抗アレルギー活性を評価する方法であって、まず該抗原に特異的なIg構造を有する分子を定常的に発現する(1)記載の動物を得、次いで該抗原を該動物に抗アレルギー薬の評価が可能な方法および条件下で投与することを含むことを特徴とする方法、
(39) 事前の抗原感作なしに、予め選択された抗原の単回投与によりアレルギー反応を呈することを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物、
(40) 予め選択された抗原に対して特異的なIgEを構成的に発現するようにゲノムが改変されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物、
(41) 予め選択された抗原に対して特異的な結合能を有する抗体型分子を構成的に発現するようにゲノムが改変されているトランスジェニック非ヒト動物であって、該抗体型分子が該動物のマスト細胞上のIgEレセプターに結合可能な重鎖定常領域を有することを特徴とする動物、
に関する。
a)Ig重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む少なくとも一つの特異的抗原認識部位(ただし、該認識部位は、予め選択された抗原に対して特異性を有する);
b)該動物のマスト細胞上に発現しているIgEレセプターへの結合を可能ならしめる重鎖定常領域。
1) 重鎖の定常領域部分は分泌型IgE分子由来のものである(ここで、「分泌型IgE」とは、細胞膜結合部位を有さず、細胞外に分泌されるIgE分子をいう)。なお軽鎖定常領域は重鎖定常領域と同種の動物由来であることが好ましいが、それに限定されない;
2) 重鎖、軽鎖の可変領域部分は同一のIg分子由来のものである(定常領域と同一のIgE由来でもよい);および
3) 重鎖定常領域部分が遺伝子導入される動物体内で産生されるIgEレセプターと結合可能である;
を全て満たしていることが好ましい。
花粉由来アレルゲン(スギなどの樹木、カモガヤ等のイネ科植物、ブタクサ等の雑草などに由来するもの。例えば、スギ花粉アレルゲンCry j 1(J. Allergy Clin. Immunol. 71, 77-86 (1983))、同Cry j 2(FEBS Letters, 239, 329-332 (1988))、ブタクサアレルゲン(Amb a I.1、Amb a I.2、Amb a I.3、Amb a I.4、Amb a II等));
真菌由来アレルゲン(アスペルギルス属、カンジダ属、アルテルナリア属等);
ダニ由来アレルゲン(ヤケヒョウヒダニ、コナヒョウヒダニ等由来のアレルゲン。例えばDer p I、Der p II、Der p III、Der p VII、Der f I、Der f II、Der f III、Der f VII等);
ハウスダスト;
動物の皮屑、糞、体毛由来のアレルゲン(例えばネコアレルゲンFel d I);
昆虫由来のアレルゲン(ガ、チョウの鱗毛、鱗粉、ユスリカ等またはスズメバチ等の毒);
食品に含まれるアレルゲン(卵、牛乳、肉、魚介類、豆類、穀類、果物・野菜等);
寄生虫由来のアレルゲン(カイチュウ、アニサキス等);
薬品(ペニシリン、インシュリン等);
化学物質(イソシアネート、エチレンオキサイド、無水フタル酸、ラテックス等);
2,4,6−トリニトロフェノール等、トリニトロフェニル(以下「TNP」という)基を有する物質
等を挙げることができる。このうち最も好適なものは、一つもしくは二つ以上のTNP基を有する物質である(なお、これらのアレルゲンの多くは例えばフナコシ(株)を通じて購入することができる)。
目的タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部が解明されている場合、該アミノ酸配列の一部に対応するセンスストランドとアンチセンスストランドのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、これらを組合せてポリメラーゼ連鎖反応[Saiki, R. K., et al. (1988) Science 239, 487-49 参照]を行ない、目的の抗原特異的Ig重鎖あるいは軽鎖サブユニットをコードするDNA断片を増幅する。ここで用いる鋳型DNAとしては、例えばTNP抗原特異的モノクローナルIgEを産生するハイブリドーマのmRNAより逆転写酵素反応にて合成したcDNAを用いることができる。
目的タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部が解明されている場合(該配列は、複数個連続した特異的配列であれば、目的タンパク質のどの領域のものでもよい)、該アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し(この場合、コドン使用頻度を参考に推測されるヌクレオチド配列、または考えられるヌクレオチド配列を組み合わせた複数個のヌクレオチド配列のいずれも採用でき、また後者の場合イノシンを含ませてその種類を減らすこともできる)、これをプローブ(32P、35Sあるいはビオチン等で標識する)として、形質転換株のDNAを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を選別する。
(1)RNAの調製
抗TNPIgE産生ハイブリドーマ IGEL−b4(ATCC TIB 141、Rudolph, A. K. et al. (1981) Eur. J. Immunol. 11, 527-529、Kofler, H. et al. (1992) Mol. Immunol. 29, 161-166およびNaito, K. et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25, 1631-1637参照)を、5%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地中で、37℃で5×107細胞になるまで培養した後、遠心分離(12000rpm、5分間)により沈澱した細胞を回収した。この細胞に全RNA抽出用溶媒(ISOGEN(登録商標):ニッポンジーン(株)社製)1mlを加え懸濁し、細胞を溶解させた。この溶解液にクロロホルム 0.4mlを加えて懸濁した後、15000rpm、4℃で15分間遠心分離してから水層(上層)を回収した。このものに等量の2−プロパノールを加えてから−80℃で1時間冷却した後、15000rpm、4℃で20分間遠心分離して上清を除去した。沈澱を1mlの75% エタノールで洗浄し、再び15000rpm、4℃で5分間遠心分離して上清を除去した。この沈澱を風乾してから、200μlの水に溶解したものを全RNA試料とした。
上記(1)で調製した全RNAを鋳型として、市販のRT−PCR用キット(ギブコ・ビーアールエル社製)、マウス免疫グロブリン可変領域特異的プライマー(重鎖用プライマー1および同2、または軽鎖用プライマー混合液:ファルマシア社製)およびTaqポリメラーゼ(Ex Taq(登録商標)、宝酒造(株)社製)を用いてRT−PCRを実施した。
全RNA 10乃至15μg
オリゴdT(10μM、キットに付属) 1μl
5× 第一鎖合成用緩衝液(キットに付属) 4μl
25mM 塩化マグネシウム(キットに付属) 2μl
0.1M ジチオスレイトール(キットに付属) 2μl
上記試料および試薬を混合し、全量が19μlとなるように水を加え、逆転写酵素(キットに付属)を1μl加えてから42℃で50分保温した。
逆転写反応液 2μl
10× PCR用緩衝液(キットに付属) 5μl
10mM dNTP1μl
プライマー
重鎖用プライマー1および同2 各0.5μl
軽鎖用プライマー混合液 0.5μl
上記試料および試薬を混合し、全量が49.5μlとなるように水を加え、Taqポリメラーゼを0.5μl加えてから、96℃で2分加温した後、96℃で30秒、55℃で1分、72℃で1分の温度サイクルを40サイクル実施し、さらに72℃で7分保温してから、25℃で10分保温した。
上記(2)で得られた重鎖用および軽鎖用RT−PCR反応液についてそれぞれ0.8% アガロースゲル電気泳動を実施した。泳動終了後、ゲルを常法に従って臭化エチジウムで染色してからUVトランスイルミネーター上でDNAバンドを可視化し、それぞれの試料について300乃至350bpに相当するバンド部分のゲルを切り出して透析チューブ(シームレス、セルロース製)中に入れた。この透析チューブを電気泳動槽中に入れて電気泳動(100V、1時間)を行なうことにより、DNAをゲルから溶出させた後、透析チューブ内液を回収してフェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出およびクロロホルム抽出を行った後、エタノール沈澱操作を行ってDNAを精製し、10乃至20μlのTE緩衝液(10mM トリス−塩酸(pH8.0)、1mM エチレンジアミン四酢酸(以下「EDTA」という))に溶解した。このようにして得られたRT−PCR産物を、プラスミドベクター pCRII(インビトロジェン社製)に、ライゲーションキット(宝酒造(株)社製)を用いて組み込んだ後、コンピテント大腸菌株(JM109)を常法に従って形質転換してアンピシリン耐性クローンを選択した。これらのクローンを少量培養してプラスミドDNAを調製した後、ジデオキシ法に従ってヌクレオチド配列を解析した。その結果、得られたクローンは重鎖用、軽鎖用とも、IGEL−b4が産生する抗TNPIgEの重鎖または軽鎖可変領域の一部をコードするDNA(配列表の配列番号1のヌクレオチド番号58から412および配列番号3のヌクレオチド番号58から393)を有することが確認された。
上記(3)で得られた、重鎖または軽鎖の可変領域の一部をコードするDNAを含むプラスミドをそれぞれ制限酵素EcoRIで消化した後、電気泳動を行ってから(3)記載と同様の方法でそれぞれの挿入DNA断片を単離した。これらの断片をそれぞれランダムプライマー法用DNA標識キット(バージョン2、宝酒造(株)社製)および[α−32P]dCTP(ニューイングランドニュークリア(NEN)社製)を用いて標識し、ゲノミックDNAスクリーニング用のプローブとした。
(1)ゲノミックDNAの抽出
抗TNPIgE産生ハイブリドーマ IGEL−b4 を1×107細胞になるまで培養し、1200rpmで5分間遠心分離して上清を除去した。沈澱した細胞を氷冷したダルベッコPBS(−)(phosphate buffered saline:以下単に「PBS」という)で2回洗浄した後、100mM 塩化ナトリウム、25mM EDTA、0.5% ラウリル硫酸ナトリウム(以下「SDS」という)および0.1mg/ml プロテイナーゼKを含む10mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)に懸濁し、50℃で保温しながら一晩振盪した。次いでこのものについてフェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出およびクロロホルム抽出を行った後、エタノール沈澱操作を行ってDNAを精製し、水に溶解したものをゲノミックDNA試料とした。
上記(1)で調製したゲノミックDNAを、制限酵素EcoRI、BamHI、PstI、BglII、XbaI、HindIIIまたはSacIでそれぞれ消化した。各消化物をアガロースゲル電気泳動し、ナイロン膜(ハイボンド−N+:アマシャム社製)にブロッティングした後、上記1.の(4)で調製した重鎖および軽鎖に対応するプローブ、マウスIgM重鎖をコードするDNAを保持するプラスミドpVH167μ[Kim, S. et al., (1981) Cell 27, 573-581、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 7400-7404参照]に由来するHindIII−XbaI断片を標識したプローブ、および同軽鎖をコードするDNAを保持するプラスミドpV167Cκ[Selsing, E. and Storb, U., (1981) Cell 25, 47-58参照]のSacI−SacII断片を標識したプローブを用いてそれぞれハイブリダイゼーションを行った。なお、pVH167μのHindIII−XbaI断片およびpV167CκのSacI−SacII断片は、それぞれIgM重鎖および軽鎖をコードするゲノミックDNAの可変領域の一部をコードする部分とエンハンサー上流の領域を含む断片である。重鎖、軽鎖それぞれについて、上記1.の(4)で調製した重鎖用プローブとpVH167μのHindIII−XbaI断片のプローブ、または上記1.の(4)で調製した軽鎖用プローブとpV167CκのSacI−SacII断片のプローブとで共通に検出されるバンドをクローニングするため、該バンド付近のゲノミックDNA断片のDNAライブラリーを以下に記載する方法に従って構築した。
上記(2)で得られた重鎖用および軽鎖用DNAライブラリーから、上記1.の(4)で調製したプローブにハイブリダイズするクローンを以下に記載の方法(プラークハイブリダイゼーション法)に従ってスクリーニングした。
1)重鎖
上記(3)で重鎖用ライブラリーから単離された陽性クローンからファージDNAを精製[前出Maniatis et al.参照]し、EcoRI消化した後、アガロースゲル電気泳動を実施して、目的のDNAを含むEcoRI−EcoRI断片(約4kbp)を分離・精製した。この断片を予めEcoRI消化したpBluescript SK(+)ベクターに組み込んだものを作製した。
軽鎖用ライブラリーから単離された陽性クローンに保持される目的のDNA(HindIII−HindIII断片、約2.5kbp)は、ZAP エクスプレス ベクターに組み込まれているため、該ベクターの使用方法に従ってヘルパーファージを用いることにより、プラスミドpBK−CMVに組み込まれた形で回収された。
1)重鎖
上記(4)で得られたEcoRI−EcoRI断片(4kbp)をさらにXbaIで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離後回収したEcoRI−XbaI断片、XbaI−XbaI断片、XbaI−EcoRI断片をそれぞれ別個にpBluescript SK(+)ベクターにサブクローニングし、ヌクレオチド配列の解析を行った結果、重鎖用RT−PCR産物と同一のヌクレオチド配列(配列表の配列番号1のヌクレオチド番号58から412)を含むことを確認した。
上記(4)で得られた軽鎖クローンをHindIIIで消化し、得られたHindIII−HindIII断片(2.5kbp)をさらにHaeIIIで消化してから、アガロースゲル電気泳動によって分離後回収した断片をpBluescript SK(+)ベクターにサブクローニングし、ヌクレオチド配列の解析を行った結果、該軽鎖クローンが軽鎖用RT−PCR産物と同一のヌクレオチド配列(配列表の配列番号3のヌクレオチド番号58から394)を含むことを確認した。
各導入遺伝子の構築の概略を図1および図2に示した。
上記2.の(4)で得られた、重鎖クローン中のEcoRI−EcoRI断片(約4kbp)は、プロモーターおよび再構成された可変領域(VDJ)を含んでいたので、そのまま以後の操作を行なった。
1)BALB/cマウスゲノミックDNAライブラリーの調製
マウスIgEの重鎖定常領域をコードするDNAをクローニングため、以下に記載する方法に従ってゲノムライブラリーを調製した。
まず、以下に記載するヌクレオチド配列:
5'- ctcaacatca ctgagcagca atgg -3'
(センスプライマー:配列表の配列番号9);
5'- gcgttattgt ggtgcttagt gtacc -3'
(アンチセンスプライマー:配列表の配列番号10)
を有するオリゴヌクレオチドプライマーをホスホアミダイト法で合成した。次いで、上記1)で調製したBALB/cマウスゲノミックDNAのXbaI−XbaI消化断片混合物(2.5乃至4.5kbp)を鋳型として、以下に記載する条件でPCRを実施した。
鋳型DNA 5μg
センスプライマー(1μM) 5μl
アンチセンスプライマー(1μM) 5μl
10× Ex Taqバッファー 10μl
10mM dNTP 10μl
全量が99μlとなるように水を加え、さらにEx Taqポリメラーゼを1μl添加した。
上記2)で調製されたプローブで、上記1)で調製されたゲノムライブラリーをプラークハイブリダイゼーション法(上記2.の(3)参照)でスクリーニングを行ない、得られたクローン(プラスミドpBK−CMVに組み込まれた形で回収される)をXbaI消化してからアガロースゲル電気泳動を行って約4kbpのXbaI−XbaI断片を回収した。
まず、既知のマウス免疫グロブリン重鎖エンハンサーのヌクレオチド配列を参考にして、以下に記載するヌクレオチド配列:
5'- tagaattcat tttcaaaatt agg -3'
(センスプライマー:配列表の配列番号11);
5'- agtctagata attgcattca tttaa -3'
(アンチセンスプライマー:配列表の配列番号12)
を有するオリゴヌクレオチドプライマーをホスホアミダイト法で合成した。次いで、上記1)で調製したBALB/cマウスゲノミックDNAを鋳型として、以下に記載する条件でPCRを実施した。
鋳型DNA 5μg
センスプライマー(1μM) 1μl
アンチセンスプライマー(1μM) 1μl
10× Ex Taqバッファー 5μl
10mM dNTP 5μl
全量が99μlとなるように水を加え、さらにEx Taqポリメラーゼを1μl添加した。
一方、マウスIgEの軽鎖定常領域をコードするゲノミックDNAとして、IgK軽鎖をコードするDNAクローン pMM222[Hiramatsu, R. et al., (1995) Cell 83, 1113-1123参照]を制限酵素PstIおよびNotIで消化してからアガロースゲル電気泳動し、イントロンエンハンサー、定常領域をコードする部分(Cκ)および3’末端側エンハンサーを含むPstI−NotI断片(約12kbp)を分離・回収した。また、pMM222を制限酵素SalIおよびPvuIIで消化してからアガロースゲル電気泳動し、プロモーターを含むSalI−PvuII断片(約5kbp)を分離・回収した。
1)重鎖
上記(2)の4)で調製した、エンハンサーの一部を含むEcoRI−XbaI断片(約300bp)を、予めEcoRIおよびXbaIで消化したpBluescript SK(+)ベクターにサブクローニングした。このプラスミドをXbaIで消化して開環してから、上記(2)の3)で調製したマウスIgE重鎖定常領域をコードする遺伝子を含むXbaI−XbaI断片(約4kbp)をT4 DNAリガーゼ反応により連結しサブクローニングした。得られたクローンのヌクレオチド配列解析を行って、該XbaI−XbaI断片が正方向に連結された(定常領域をコードするDNAのセンス鎖の5’末端側がエンハンサーの3’末端側に連結された)クローンを選択した。次に、このクローンをEcoRI消化により開環してから、上記2.の(4)で得られた重鎖クローン中のEcoRI−EcoRI断片(約4kbp、プロモーター・可変領域を含む)をT4 DNAリガーゼ反応により連結しサブクローニングした。得られたクローンのヌクレオチド配列解析を行って、該EcoRI−EcoRI断片が正方向に連結された(可変領域をコードするDNAのセンス鎖の3’末端側がエンハンサーの5’末端側に連結された)クローンを選択し、配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列(リーダー配列を含む)をコードする遺伝子、該遺伝子発現用プロモーターおよびエンハンサー配列が連結されたDNAを含む組換えプラスミドpSK−TNP−IgE−Hを得た。
SalIとPstIで消化したpBluescript SK(+)ベクターに、上記(2)で調製したプロモーターを含むSalI−PvuII断片(約5kbp)および上記(1)で調製した可変領域を含むPvuII−PstI断片(約1.5kbp)をT4 DNAリガーゼ反応により同時に連結しサブクローニングした。次に、得られたプラスミドをPstIおよびNotIで消化した後、上記(2)で調製したイントロンエンハンサー、定常領域をコードする部分(Cκ)および3’末端側エンハンサーを含むPstI−NotI断片(12kbp)をT4 DNAリガーゼ反応により同時に連結して、配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列(リーダー配列を含む)をコードする遺伝子、該遺伝子発現用プロモーターおよびエンハンサー配列が連結されたDNAを含む組換えプラスミドpSK−TNP−IgE−Lを得た。
上記(3)で構築したpSK−TNP−IgE−HおよびpSK−TNP−IgE−Lは、いずれもSalIおよびNotIで消化して直鎖化し、アガロースゲル電気泳動を行って、導入に必要なDNA断片(重鎖:約8.5kbp、軽鎖:約19kbp)を分離・精製した。さらにこれらのDNA断片を、塩化セシウム密度勾配超遠心法により精製してからTEに溶解し、重鎖用断片と軽鎖用断片を等量混合したものを導入用DNA試料とした。
雌マウス(BALB/c、4週齢、日本エスエルシー(株)より購入)に排卵誘起剤を投与後、同系統の雄と交配し、翌日雌マウスの卵管より前核受精卵を採取した。上記4.で調製した導入用DNA溶液(1乃至5μg/ml)を、微小ガラス管を用いて受精卵の前核に約2pl注入した。この操作は、文献[「受精卵へのDNAの注入」発生工学実験マニュアル 41-76頁(野村達次 監修、勝木元也 編、講談社、1987年)および「前核へのDNAのマイクロインジェクション」マウス胚の操作マニュアル 155-173頁、("Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual" B. Hogan, F. Costantini and E. Lacy著、山内一也、豊田裕、森庸厚、岩倉洋一郎 訳、近代出版、1989年]の記載に従って実施した。DNAを注入した受精卵は、偽妊娠仮親雌マウス(Slc:ICR、日本エスエルシー株式会社製)の卵管に移植し、約20日後に自然分娩または帝王切開により出生させた。
(1)導入遺伝子の検出
1)プライマーの合成
上記4.で導入した遺伝子が、出生したマウスに保持されているか否かをPCRによって調べるため、以下に記載するヌクレオチド配列からなる4種のオリゴヌクレオチドプライマー:
5'- gcaagatggg gcttaatctt tgctatgg -3'
(重鎖用センスプライマー:配列表の配列番号5);
5'- ccaccttgat gctctagata attgc -3'
(重鎖用アンチセンスプライマー:配列表の配列番号6);
5'- gatgttttga tgacccaaac tccac -3'
(軽鎖用センスプライマー:配列表の配列番号7);
5'- cttggtccca gcaccgaacg tgagc -3'
(軽鎖用アンチセンスプライマー:配列表の配列番号8);
を、ホスホアミダイト法により合成した。
上記4.で得られたマウス(生後3週齢)の尾(約1cm長)から、上記2.の(1)に記載した方法に従ってゲノミックDNAを抽出し、100μlの水に溶解した。このDNAを鋳型として、重鎖、軽鎖それぞれについて以下に記載する条件でPCRを実施した。
鋳型DNA 2μl
センスプライマー(1μM) 0.5μl
アンチセンスプライマー(1μM) 0.5μl
10× Exバッファー 2μl
水 14.5μl
Ex Taqポリメラーゼ 0.5μl
温度条件: 96℃で2分間加熱した後、96℃で30秒、50℃で1分間、72℃で1分間の温度サイクルを30サイクル繰り返してから、25℃で7分間保温した。
マウスの血中IgE濃度の測定は、マウスIgE分子上の異なるエピトープを認識する2種の抗マウスIgE抗体を用いて、サンドイッチ−ELISA法で行った[Hirano, T. et al., (1988) Int. Archs. Allergy Appl. Immun. 85, 47-54参照]。試料として生後4週以上経過したマウスから採取した血清を使用した。また標準曲線作成用の試料としてマウスIgE(ファーミンジェン社製)を使用した。
上記4.で作出したマウスの血中IgEの抗原特異性をELISA法により評価した。まず、TNPで標識したニワトリ由来オブアルブミン(以下「OVA」という)または未標識OVA溶液(5μg/ml)をELISA用96穴プレート(Nunc-Immuno Plate, PolySorp Surface、ヌンク社製)に50μl/ウエル添加し、4℃で一晩静置してOVAをウエル底面に吸着させた。以下、このOVA固相化プレートを使用し、上記(2)と同様の操作を行ってTNP特異的IgE濃度を測定した。ただし、標準曲線作成用のIgEとしてハイブリドーマIGEL−b4が産生する抗TNPIgEを使用した。その結果、導入遺伝子の存在が確認された全てのマウスの血中IgEは、TNP標識OVAには結合するが、未標識OVAには結合しなかったので、該マウスで発現した遺伝子産物はTNPに対する特異性を保持していることが明らかとなった。また、血中の抗TNPIgE濃度と上記(2)で測定されたIgE濃度との比較から、導入遺伝子の存在が確認されたマウスの血中IgEのほとんどが、導入遺伝子の産物であることが判明した。
(1) ハプテンとしてTNPを有する塩化ピクリル(picryl chloride)を未感作の正常マウスおよび実施例で作製されたトランスジェニックマウスの耳介に塗布したところ、正常マウスでは著変は認められなかったが、トランスジェニックマウスにおいては塗布後1時間をピークとする著明な皮膚の一過性の肥厚が認められた。これに対し、異なるハプテン抗原オキザゾロン(oxazolone)を塗布した場合には、いずれのマウスにおいても耳介皮膚の肥厚は観察されなかった。すなわち、実施例で作製されたトランスジェニックマウスでは事前の感作を何ら必要とせず、1回の抗原投与のみで抗原特異的な典型的I型アレルギー反応を誘発できることが確かめられた。
以下に挙げる各実験系において、被検物質の前投与、同時投与、後投与または連続投与による効果を調べる。
Claims (7)
- 下記の工程AおよびBを含むことからなる、抗アレルギー薬の評価方法、
工程A)下記の構成要素a)およびb);
a)Ig重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む少なくとも一つの抗原特異的認識部位(ただし、該認識部位は、イムノグロブリン(以下「Ig」という)が特異的に結合しうる物質であって、該動物は通常産生しない物質(以下、「抗原」という)に対して特異性を有する);
b)細胞膜結合部位を有さず、且つ、該動物のマスト細胞上に発現しているイムノグロブリンE(以下「IgE」という)レセプターへの結合を可能ならしめる重鎖定常領域;
を含むIg構造を有する分子を常時発現することができるようにそのゲノムが改変されていること、及び、事前の感作なしに前記抗原の単回投与によりアレルギー反応を呈することを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物に対して、前記抗原を事前の感作なしに単回投与し、前記抗原の投与の前、後又は同時に抗アレルギー薬の候補物質を投与する工程、
工程B)前記抗原の投与により呈されるアレルギー反応を測定し、該候補物質の投与によりアレルギー反応が軽減されるか否かを判定する工程。 - Igが特異的に結合しうる物質であって、該動物は通常産生しない物質が、花粉由来アレルゲン、真菌由来アレルゲン、ダニ由来アレルゲン、ハウスダスト、動物(皮屑、糞、体毛)由来のアレルゲン、昆虫由来アレルゲン、食品(卵、牛乳、肉、魚介類、豆類、穀類、果物・野菜)アレルゲン、寄生虫由来アレルゲン、薬品アレルゲン、化学物質アレルゲンおよび一つもしくは二つ以上のトリニトロフェニル基を有する物質からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1に記載の抗アレルギー薬の評価方法。
- Igが特異的に結合しうる物質であって、該動物は通常産生しない物質が、一つもしくは二つ以上のトリニトロフェニル基を有する物質であることを特徴とする、請求項2に記載の抗アレルギー薬の評価方法。
- Ig構造を有する分子の重鎖定常領域が分泌型IgE分子由来であることを特徴とする、請求項1乃至3のいずれかに記載の抗アレルギー薬の評価方法。
- Ig構造を有する分子の重鎖定常領域が分泌型IgE由来であって、かつ配列表の配列番号2のアミノ酸番号120から542に示されるアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする、請求項1乃至3のいずれかに記載の抗アレルギー薬の評価方法。
- Ig構造を有する分子の重鎖定常領域をコードする遺伝子が、配列表の配列番号1のヌクレオチド番号415から1683に示されるヌクレオチド配列を実質的に含むDNAであることを特徴とする、請求項1乃至3のいずれかに記載の抗アレルギー薬の評価方法。
- アレルギー反応が、I型アレルギー反応である、請求項1乃至6のいずれかに記載の抗アレルギー薬の評価方法。
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