JP4512367B2 - 血液成分の分離方法及び装置 - Google Patents

Description

本出願は、２００１年１２月５日出願の米国仮出願番号６０／３３８，９３８に対して優先権を主張するものであり、その全体を矛盾しない範囲で参照によって本明細書に組み込む。

本発明は、粒子を分離するシステム及び方法に関する。本発明は、白血球を望ましいサブセットに分離し、かつこのような白血球から赤血球を除去すること（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ）に関して特に利点を有する。

本出願は、２０００年４月１８日付けで交付された米国特許第６，０５１，１４６号に関する。この米国特許の開示全体を矛盾しない範囲で参照によって本明細書に組み込む。

全血は液体成分と粒子成分からなる。時には、これらの粒子成分を「成形要素」と呼ぶ。血液の液体部分は血漿から構成され、粒子成分は、主として赤色血液細胞（赤血球）（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、及び血小板（栓球）を含む。これらの成分は同じような密度を有するが、それらの平均密度の関係は、密度の高い順から、赤血球、白血球、血小板、及び血漿となる。さらに、粒子成分は、粒径に関して粒径の大きい順に、白血球、赤血球、及び血小板となる。これらの粒子成分の沈降速度は、それらの粒径と密度に関連する。

医学分野では、しばしば血液又は血液成分を分離することが望ましい。現在のほとんどの分離装置は、輸血又は自己輸血の用途で血液成分を分離及び／又は濾過するために密度及び粒径の差、又は表面の化学的特徴に依拠する。典型的には、血液成分は、遠心器を使用して他の血液成分から分離又は採収される。遠心器は、遠心力を利用して、血液容器を回転させて容器内部の成分を分離する。使用に際して、容器が非常に速い速度で回転している間に血液が容器に入り、遠心力で血液成分を層別化し、個々の成分を別々に取り出すことができる。遠心分離技法は幾つかの成分を相互から分離するのに有効なものもあるが、多くの遠心分離法は、高純度の最終産物を生産することができない。

分離手法の１つのタイプでは、白血球を白血球搬出法（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）によって回収する。このような回収は、上で説明したように遠心器を使用するのが典型である。次いで、得られる採収白血球は、所望に応じて、回収が望ましい細胞のサブセットにさらに分離される。このような回収が望ましい細胞のサブセットは、単球、リンパ球、及び樹状細胞を含み得るが、他の細胞の回収が望ましい場合もあることを理解されたい。しかし、白血球搬出法によって回収された産物は、様々な細胞分離及び／又は細胞選択技法、並びに治療用途に選択された細胞の爾後の培養を阻害する恐れがある、血小板及び赤血球が混入する場合が多い。

白血球は、アフェレーシス以外の他の知られた方法によっても回収可能であり、この場合も回収が望ましい細胞のサブセットにさらに分離される。

白血球を他の粒子から分離又は分別して選択サブセットにするための幾つかの方法が提案されてきた。このような方法の１つは、遠心水簸法（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）である。水簸法の１つの一般的な形態では、回転する遠心器中に位置する漏斗形状のチャンバ中に細胞分量（セルバッチ）を導入する。次いで、この細胞分量を収容するチャンバ中に液体の水簸緩衝剤を流入させる。このチャンバを通過する液体緩衝剤の溶液の流量を増加させると（通常は段階的な方式で）、この液体が、より粒径が小さく沈降速度の遅い細胞をチャンバ内部の水簸境界に向かって押し流し、他方で、より大きく沈降速度の速い細胞は、遠心力と沈降（引きずり）力が平衡しているチャンバ領域に移動する。

したがって、遠心水簸によって異なる沈降速度を有する粒子が分離される。ストークスの法則は、次のように球体粒子の沈降速度（ＳＶ）を説明する。

式中、ｒは粒子の半径であり、
ρ_ｐは粒子の密度であり、
ρ_ｍは液体媒体の密度であり、
ηは媒体の粘度であり、さらに、
ｇは重力加速度又は遠心加速度である。
ストークスの方程式では、粒子の半径が２乗に累乗されるが、粒子の密度は累乗されないので、その密度ではなく、細胞の粒径がその沈降速度に大きく影響する。このように、粒子が同じような密度を有する場合、遠心水簸時には大きい方の粒子がチャンバ内に残り、他方で小さい方が放出される理由が説明される。

遠心水簸法を利用して白血球を他の細胞から精製し、選択されたサブセットに分離することに関する１つの問題は、出発白血球産物中に過剰な赤血球が存在すると、赤血球は球形ではなく、そのために生じる細胞間相互作用の結果として理想的な細胞分離が起こらない恐れがある。

白血球を他の粒子から分別して選択サブセットにする別の方法は、米国特許第５，６７４，１７３号に開示された流動床技法の利用であるが、この特許の開示を矛盾しない範囲で参照によってその全体を本明細書に組み込む。ここでも、過剰な赤血球が存在すると理想的な細胞分離が起こらない恐れがある。

この問題に対処するために、過去には様々な分離媒体を使用して密度勾配遠心法によって白血球産物を赤血球から分離するか又は赤血球を除去してきた。密度勾配遠心法では、試料を媒体支持体の表面上に層状に重ねて遠心器にかける。遠心力の下で、試料中の粒子が、それらの密度に従って媒体によって別々の領域中に沈降する。

密度勾配遠心法では、応用例に的確に応じて多くの異なる種類の媒体（すなわち、スクロース、塩化セシウム、フィコール、ハイパック、ペルコール）を使用する。これらは市販されているが、ほとんどは米国食品医薬品局によって認可されておらず、幾つかのヒトの細胞集団には有害の恐れがある。最も広く使用されている媒体は、おそらくフィコール／ハイパック、フィコール溶液、及びジアトリゾア酸ナトリウムであろう。それは顆粒球と赤血球の大部分を減らすように調合され、他方で単核細胞（リンパ球に加えて単球）の精製分別が確保される。赤血球を減少させるためにフィコール／ハイパックを使用する欠点は、望ましい細胞の５０±１５％の損失を含むこと、及び現在は密閉系で使用されないことである。

適正な条件下では、赤血球が相互に付着して赤血球の連銭を形成する傾向があることが知られている。連銭の形成と大きさ、したがって赤血球の沈降速度は、細胞縣濁液のヘマトクリット値、剪断にさらされること、タンパク質濃度、及び沈降剤の存在によって影響を受ける。

本発明は、このような背景に対処するために考案されたものである。

本発明の１つの態様は、分離チャンバ中の白血球を分離又は分別するものであり、このチャンバは、赤血球をいずれも容易に除去して爾後の分離又は分別を容易にする。

本発明の別の態様は、赤血球の沈降速度を早めかつ赤血球が白血球から分離しやすくするために、赤血球の連銭形成を助長することである。

本発明は、関連技術の１つ又は複数の限界を実質的に取り除く方法及びシステムに関する。これら及び他の利点を実現するために、本明細書に実施しかつ広範に説明する本発明の目的に従って、本発明は、沈降によって赤血球から白血球を分離する方法を含む。本方法では、流体チャンバを回転軸回りに回転させ、白血球及び赤血球ばかりでなく、他の細胞をいずれも含有する第１液体血液産物を流体チャンバの入口に流入させる。本方法はさらに、流体チャンバ中の赤血球を沈降させ、次いでチャンバの入口を介して赤血球を抜き出し又は除去するものである。本方法は、白血球を選択されたサブセットに分別することをさらに含む。

別の態様では、本発明は、少なくとも白血球、赤血球、及びおそらくは血小板を含む出発血液産物を用意し、この出発血液産物を分離チャンバに充填し、赤血球の連銭形成を助長するために希釈又は沈降剤を追加し、粒子を沈降させ、かつ沈降した赤血球を分離チャンバから抜き出すことによって、赤血球を白血球から除去する方法を含む。

別の態様では、本発明は、粒子集団の１つの沈降速度を増大させ、かつ増大した又はより速い沈降速度を有する粒子を除去することによって、第１粒子を第２粒子から分離する方法に関する。上に説明した方法を実施するためのシステムを含む装置も企図されている。

本発明の追加的な態様は、概ね円錐形の流体チャンバを形成する平滑な表面壁を有する遠心分離器と他の粒子濃縮器のための使い捨て品に関する。

本発明は、白血球を望ましい選択されたサブセットに分離することに関し、このような白血球は白血球搬出法によって回収されるが、本発明の技法は、他のより知られた回収方法を使用することによって、また限定するものではないが骨髄及び臍帯血を含む、末梢血以外の供給源から回収された白血球にも応用可能であることを理解されたい。望ましい除去法を用いて白血球を赤血球から分離可能であり、爾後に白血球を白血球サブセットに分離する場合もあるが、分離しない場合もあることをさらに理解されたい。説明した除去処理は、他の種類の細胞及び他の種類の粒子を分離することにも応用可能なことをさらに理解されたい。したがって、以上の概略的な説明及び以下の詳細な説明は例示であり、特許請求の範囲で請求されている本発明をさらに説明しようとするものである。

添付の図面は、本発明をさらに理解するために含まれ、本明細書に組み込まれかつその一部を構成する。これらの図面は、本発明の１つの実施形態を例示し、かつ説明と併せて本発明の原理を説明する役割を果たすものである。

ここで本発明の実施形態を詳細に参照するが、その例を添付の図面に示す。可能な限り、図面及び説明では同じ参照符号を使用して同じ又は同様の部分を指す。

本発明の実施形態は、コロラド州のＧａｍｂｒｏ ＢＣＴ，Ｉｎｃ．社によって製造されたＣＯＢＥ（登録商標）ＳＰＥＣＴＲＡ（商標）血液成分遠心器を含むことが好ましい。このＣＯＢＥ（登録商標）ＳＰＥＣＴＲＡ（商標）遠心器は、Ｉｔｏへの米国特許第４，４２５，１１２号に開示された１オメガ／２オメガ無封止管連結を組み込むが、この特許の開示全体を参照によって本明細書に組み込む。本発明の実施形態をＣＯＢＥ（登録商標）ＳＰＥＣＴＲＡ（商標）遠心器と組み合わせて説明するが、例示目的のためのみにそれを参照するものであり、いかなる意味においても本発明を限定しようとするものではない。

当業者には明白なように、本発明は、血液をその成分に分離するために一般に使用される様々な遠心器で用いることができる。特に、本発明は、遠心装置が１オメガ／２オメガ角速度の無封止管連結を使用するかどうかに拘わらず任意の遠心装置で用いることができる。

本発明の教示は、粒子及び血球ばかりでなく、他の細胞を分離するために使用可能であることも明白である。粒子及び細胞について説明するが、両者は、本発明の趣旨から逸脱することなく相互に置換え可能に使用されることを理解された。

本明細書に実施しかつ図１に示すように、本発明は、遠心器ロータ１２で使用するための粒子分離用の使い捨てシステム１０を含む。好ましくは、図２に示すように、腕１４を介して遠心器ロータ１２をモータ（図示せず）に結合し、遠心器ロータ１２がその回転軸Ａ−Ａ回りに回転するようにする。

図２に示すように、保持器１６がロータ１２の頂面上に備わる。この保持器１６は、赤血球以外の成分用の出口２０（以後、流体チャンバ１８の出口と呼ぶ）が、流体チャンバ１８の入口２２よりも回転軸Ａ−Ａに近接して位置決めされるように、ロータ１２上で流体チャンバ１８を釈放可能に保持する。保持器１６は、流体チャンバ１８の長手軸がロータの回転軸Ａ−Ａを横切る平面内にあるように流体チャンバ１８をロータ１２上で配向することが好ましい。さらに、保持器１６は、赤血球以外の成分用の流体チャンバ出口２０が回転軸Ａ−Ａに向くように流体チャンバ１８をロータ１２上に保持するように配置されていることが好ましい。保持器１６は、流体チャンバ１８をロータ１２の頂面上に保持するが、ロータ１２の頂面下などの別の箇所に流体チャンバ１８をロータ１２に固定することもできる。図示の保持器以外に他によく知られた固着装置又は他の方法によって、流体チャンバ１８を固定できることも理解されたい。

流体チャンバ１８は、好ましい実施形態では、図３及び４に示しかつ下に説明するように平滑な側面を有するが、上で参照した米国特許第５，６７４，１７３号で開示された流体チャンバの１つと同様に又は全く同じに作製可能である。図１及び２に示すように、流体チャンバ１８の入口２２及び出口２０は、流体チャンバ１８の長手軸に沿って配置されている。流体チャンバ１８の壁２１は、入口２２と出口２０の間に延在し、それによって流体チャンバ１８の入口２２、出口２０、側面、及び内部を画定する。

流体チャンバ１８は、この流体チャンバ１８の最大断面積２３で相互に接合された２つの円錐台形部分２５、２７を含む。流体チャンバ１８の内部は、最大断面積２３から入口２２と出口２０に向かって対向方向に先細りする（断面が減少する）。流体チャンバ１８は円錐台の内部形状を有する２つの部分（２５、２７）を備えるように図示してあるが、それぞれの部分の内部は、放物面であっても又は入口もしくは出口面積よりも大きな主要断面積を有する任意の他の形状でもよい。

流体チャンバ１８は、プラスチック製の一体部品又は知られた固着もしくは封止方法を用いて相互に接合された別体の部品から作製され、流体チャンバ１８の別個の部分を形成することができる。流体チャンバ１８は、ＰＥＴＧなどの透明又は半透明のコポリエステルプラスチックから作製可能であり、分離又は除去過程時に随意選択のストロボ（図示せず）を利用してチャンバ内部の内容物を見ることができる。

図１に示すように、流体チャンバ１８内表面上の最大断面積２３の位置に溝２４を随意選択で形成することもできる。この溝２４は、流体チャンバ１８の長手軸に実質的に垂直に配向された上壁面及び下壁面、並びに長手軸を向く流体チャンバ１８内表面によって画定される。しかし、好ましくは、溝２４は環状であり、溝２４は流体チャンバ１８の長手軸の一部を取り囲むことができる。

この随意選択の溝２４は、流体チャンバ１８内部の液体に関するコリオリ噴流（Ｃｏｒｉｏｌｉｓ ｊｅｔｔｉｎｇ）を消散する上で助けになり得ると考えられる。流体チャンバ１８中に流入する液体はコリオリの噴流効果を受け得る。このような噴流の流れが、液体及び粒子を流体チャンバ１８の内壁に沿って通過させる恐れがあり、さらには、下に説明する赤血球などのより速く沈降する粒子が、より沈降の遅い粒子と混合することになってチャンバから除去される恐れがある。溝２４を備える流体チャンバ１８は、この流体チャンバ１８の軸回りに部分的に円周方向にコリオリ噴流を導くことによって、これらの効果を相殺することができる。したがって、溝２４は、特に液体の流量が増大するとき、最大沈降するように粒子の分布を改善することができる。

複数の段２６が、流体チャンバ１８内表面上の、チャンバ１８の最大断面積２３と入口２２の間に随意選択で形成されている。それぞれの段２６は、流体チャンバ１８の長手軸に実質的に垂直に配向された基底面と、この基底面に直交して位置する側面とを有する。図１は、側面と基底面が交差するかどを示すが、凹面の溝がこのかどと置き換わってもよい。１つの実施形態では、それぞれの段２６が、環状であり、チャンバ１８の軸を完全に取り囲んで円筒形領域を画する。別法として、段２６がチャンバ１８の軸の一部を取り囲んでもよい。

流体チャンバ１８中に段２６を含むことによって、より沈降の速い粒子の流れを流路から減少させ、したがって沈降のためにチャンバ内の粒子分布を改善することもできる。段２６は、流体チャンバ１８内のコリオリ噴流を抑制するための勢い反らし面及び再誘導面（ｍｏｍｅｎｔｕｍ ｄｅｆｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ ｓｕｒｆａｃｅｓ）となることによってこのように改善する。コリオリ噴流が発生すると、噴流の液体と粒子は、遠心器の回転方向を向く流体チャンバ１８内表面に沿って移動する。したがって、噴流によって、流体チャンバ内表面に沿って粒子が運ばれ、下に説明する希釈液又は沈降液と一緒に分離チャンバから除去される恐れがある。段２６は、液体及び粒子のコリオリ噴流の流れの勢いをチャンバ１８の軸回りの概ね円周方向に誘導又は変更可能であり、したがって希釈、水簸、又は沈降液との望ましい混交が改善し、かつ必要な粒子は、それらが沈降するまでチャンバ１８内に確実に残留する。

上に説明した溝２４と段２６を含むことは随意選択である。チャンバ１８の内面は、図３及び４の好ましい実施形態で模式的に示すように平滑でもよい。下でさらに説明するように、この好ましい実施形態は、このような段及び溝が存在しないと細胞の捕捉及び付着を防止する上で助けとなり得るので、随意選択の段及び溝を備えていない。

図１に示すように、使い捨て品として図示するシステム１０は、第１導管又は管路２８と、第２又は除去用の導管もしくは管路３０と、流体チャンバ１８の入口２２に流体連通する入口導管もしくは管路３２と、第１導管２８、第２又は除去用の導管３０、及び入口管路３２を流通又は流体連結するための３本足を有する３方向又はＹ字コネクタ３４とをさらに含む。第１導管２８は、この第１導管２８を導管又は管路２７に流体連結するための継ぎ手３６と、継ぎ手３９と、相互に分離するべき粒子を保有する液体、すなわち、白血球を含むソース血液産物を含む第１供給源３８とを含む。同様に、第１導管２８は、継ぎ手３６によって、低密度の希釈、沈降、又は水簸液を含む第２供給源４２に第１導管２８を流通連結するための継ぎ手４０を備える導管又は管路３７に連結されている。継ぎ手３９及び４０は、スパイク（ｓｐｉｋｅｓ）又は無菌管コネクタなどの、任意の種類の一般的な医療用継ぎ手装置であることが好ましい。

図１に示すように、第１導管２８は、第１管ループ４４を含む。使用時には、第１管ループ４４は、分離するべき液体と、希釈、沈降、又は水簸液とをそれぞれ第１供給源３８及び第２供給源４２からそれぞれに汲み上げるための蠕動ポンプ（図示せず）中に取り付けられる。

第１供給源３８からの流体及び粒子と、第２供給源４２からの希釈、沈降、又は水簸液とは、第１導管２８を介して３方向コネクタ３４までそれぞれに流れる。次いで、これらの物質は、入口管路３２を介して流体チャンバ１８の入口２２に流入する。流体チャンバ１８では、遠心領域内の粒子が、ロータ１２と一緒に回転すると、沈降速度の差に従って分離し、より速く沈降する粒子は流体チャンバ１８に残り、下で説明するように、一部のより沈降が遅い粒子は流体チャンバ１８から流出することができる。

下で十二分に説明するように、流体チャンバ１８に粒子が充填されるとき、相対的に遅い沈降速度を有する流体と粒子は、それらには一般に血漿、血小板、及びおそらくは一部の白血球が含まれるが、流体チャンバ出口２０を介して導管又は管路４８中に流入する。図１及び２に示すように、管４８は、遠心器ロータ１２に取り付けた分離容器５２又は粒子濃縮器の入口５０に連結されている。白血球をサブセットに分離するいずれの水簸過程時でも、下で十二分に説明するように、このような分離されたサブセットが流体チャンバ１８から分離容器５２又は濃縮器に流れることになる。

遠心器ロータ１２の外方部分に近接して、分離容器５２又は濃縮器は、この分離容器５２又は濃縮器中に流入する粒子を回収するための回収ウェル５４を有する。遠心器ロータ１２が回転すると、粒子は回収ウェル５４中に沈降し、他方では、より遅く沈降する流体とおそらくは一部のより沈降が遅い粒子とが回収ウェル５４の上部境界の上方に残留する。回収ウェル５４中に回収された粒子には、流体チャンバ１８から流出した細胞もしくは粒子、又は上で留意したように白血球の分離サブセットが含まれ得る。

回収ウェル５４は、粒子濃縮管路又は導管５８に連結する粒子濃縮出口５６を有する。粒子濃縮管路５８は、下で十二分に説明するように、流体の少量部分と一緒に回収ウェル５４中に保持された粒子を除去する。分離容器５２は、流体出口管路又は導管６２に連結する流体出口６０も含む。この流体出口管路６２は、回収ウェル５４の上部境界の上方を流れる流体を除去する。さらに、流体出口管路６２は、回収ウェル５４を通過して上部境界の上方を流れる一部の沈降のより遅い粒子を除去することもできる。

流体出口６０は分離容器５２又は濃縮器の一端に又はそれに隣接して位置し、入口５０は分離容器５２又は濃縮器の対向端に又はそれに隣接して位置することが好ましい。このように間隔を空けると、粒子が流体から分離するのに十分な時間が確保され、確実に回収ウェル５４中に実質的な数の粒子が回収され、さらに粒子濃縮管路５８を介して、白血球の分離サブセットをいずれも含む実質的な数の粒子が対応して確実に除去される。

図２に示す実施形態では、分離容器５２又は濃縮器がロータ１２中に形成した溝６４中に配置されている。分離容器５２又は濃縮器中で遠心力を受ける流体又は粒子に応答して分離器５２又は濃縮器が拡張するとき、溝６４の外壁中の谷６６が回収ウェル５４を形成するように、分離容器５２又は濃縮器は半剛性材料から作製された流路であることが好ましい。図２に示すように、ロータ１２の頂面は、第１及び第２導管２８及び３０、３方向コネクタ３４、入口管路３２、管４８、粒子濃縮管路５８、並びに流体出口管路６２を含むことが好ましい。

図１に示すように、流体出口管路６２は、分離容器５２又は濃縮器から除去された流体を回収するための流体回収容器６６に流体結合し、粒子濃縮管路５８は、分離容器５２又は濃縮器から除去された粒子を回収するための１つ又は複数の粒子回収容器７０に流体結合する。粒子濃縮管路５８は、この粒子濃縮管路５８を介して粒子を汲み上げるための蠕動ポンプ中に取付け可能である管ループ７２を含むことが好ましい。管ループ７２用のポンプは、粒子濃縮管路５８中の粒子の流量と濃度を調節する。目的とする白血球は、バッグ７０の１つの中に回収されることになる。白血球の望ましいサブセットを回収するために任意の数の容器７０が使用可能であることを理解されたい。図３は、下で十二分に説明するように、目的とする血球用の３つの回収バッグを例示する。所望であれば、血小板を別体のバッグ中に回収することもできる。

下で十二分に説明するように、チャンバ１８中で沈降させた後で、入口２２を介して赤血球を入口導管３２に除去する。次いで除去された赤血球はＹ字コネクタ３４を通過して除去導管３０に達する。図１で示したように、導管３０は、除去過程時に回収された赤血球を回収するための赤血球回収容器又は除去細胞回収容器３１に流体結合している。赤血球回収又は除去管路もしくは導管３０は、導管３０を介して赤血球を汲み上げるための蠕動ポンプ中に取付け可能である管ループ４６を含むことが好ましい。

システム１０の動作時に物質の流量とロータ１２の回転速度を制御するために、制御装置（図示せず）が、管ループ４４、４６、及び７２を介して物質を汲み上げるためのポンプ（図示せず）を制御し、かつ遠心器ロータ１２を回転させるためのモータ（図示せず）を制御する。

図３は、使い捨て分離システム１１０中に流体チャンバ１１８を有する、本発明の１代替実施形態を示す。図１及び３の実施形態に共通の要素は同じ参照符号を有し、このような要素の説明は図１に関して見出すことができる。図３はまた、目的とする白血球用の随意選択的な第３回収バッグ７０を例示する。図１を参照して上に説明したように、任意の数の回収バッグが使用可能である。

図３の流体チャンバ１１８は、平滑な内面を備える壁１２１を有する。流体チャンバ１１８の壁１２１は、概ね円錐形を形成し、かつ図１の流体チャンバ１８の段２６又は溝２４が備わっていない。壁１２１に段及び溝が存在しないと、多少のコリオリ噴流を許す恐れがある。しかし、溝を使用すると、細胞又は粒子がその中に捕捉されるきらいがある点で不利になり得る。同様に、細胞又は粒子が段に付着するきらいがある。したがって、細胞又は粒子を最大限に回収するためには、段又は溝を割愛する方がより利点があると考えられる。

図３の流体チャンバ１１８の入口１２２と出口１２０は、流体チャンバ１１８の長手軸に沿って配置されている。流体チャンバ１１８の壁１２１は、入口１２２と出口１２０の間に延在して流体チャンバの内部を画定する。

図１の流体チャンバに関する場合と同様に、流体チャンバ１１８は、この流体チャンバ１１８の最大断面積１２３で互いに接合された２つの円錐台形部分１２５、１２７から作製可能である。流体チャンバ１１８の内部も、最大断面積１２３から入口１２２と出口１２０に向かって対向方向に先細りする。

図１の流体チャンバ１８と同様に、流体チャンバ１１８は、プラスチック製の一体部品又は互いに接合された別体部品から随意選択的に作製され、流体チャンバ１１８の分離部分を形成することができる。別体の部品は、任意の知られた固着材料又は当業で知られた方法によって互いに接合可能である。流体チャンバは、上で流体チャンバ１８に関して説明したものと同様の材料から作製可能である。

図３では、第１供給源３８からの流体と粒子は、導管１２７と蠕動ポンプに関連する管ループ１４３とによって空気チャンバ１４７に連結可能である。供給源４２からの希釈、沈降、又は水簸液も、導管１３７と蠕動ポンプに関連する管ループ１４４によって空気チャンバ１４７に連結可能である。空気チャンバ１４７は、粒子を分離する前に凝集体を濾過するための入口フィルタとなる。空気チャンバ１４７は、気泡トラップ及び空気検出チャンバとしての役割も果たす。空気チャンバ１４７はさらに脈流抑制器としても機能する。しかし、空気チャンバ１４７の使用は随意選択であり、したがって、それは割愛可能であり、図１の供給源送出構成を使用できることも理解されたい。

血液成分の分離、特に、赤血球から白血球を分離する１つの好ましい方法を図１〜４を参照して論じる。本発明は、血液成分分離過程及び特に白血球分離又は分別過程に関連して説明されているが、本発明は、その広範な意味において、そのように限定するものではないことを理解されたい。本発明を用いて幾つかの異なる種類の粒子を分離することができる。本方法は、図１の流体チャンバ１８又は図３の流体チャンバ１１８を有する使い捨て分離システム１０又は１１０で使用可能であることを理解されたい。下の本方法の説明では、両方を別法として参照する。同様に、図１又は図３の供給源と流体送出構成はどちらも使用可能であることを理解されたい。

最初に、血液を患者から採取し、この血液を遠心分離過程で分離して白血球を含む血液産物として知られるものを分離する。このような最初の遠心分離過程時に、血小板を多く含んだ血漿、並びに赤血球とより高密度の白血球の一部を血液から分離して、白血球産物が得られる。さらに、この得られた血液産物は、一部の血小板と赤血球を含んでいる可能性が最も高い。必ずしもすべての出発血液産物を最初に遠心分離する必要はない。例えば、臍帯から採取した血液は、最初に遠心分離にかけないことが一般的である。次いで、出発血液産物を上で説明した装置の第１供給源３８から供給する。

上に説明した採取血液の最初の分離は、２段階又は単一段階遠心分離など、システム１０とは別体の遠心器（図示せず）で行うことが好ましい。１つの代替実施形態では、遠心器ロータ１２は、上で参照した米国特許第５，６７４，１７３号で開示されたように、遠心器ロータ１２で最初の血液成分分離を行うための構造を含むことができる。分離血液産物は、他の方法によって、回収可能であり、望ましい場合は、最初に分離可能であることも理解されたい。

得られる分離された又は回収された血液産物を図１に示す第１供給源３８に配置し、導管２７、１２７を介して第１供給源３８を第１導管２８に連結する。さらに、導管３７、１３７を介して希釈液、沈降液、及び水簸液を含む第２供給源４２を導管２８に連結する。遠心器ロータ１２は、約２４００ｒｐｍで回転軸Ａ−Ａ回りに回転する。血液産物を低流量で供給源３８から汲み出し、流体チャンバ１８、１１８中に充填する。次いで、供給源３８からの血液産物の流れを弁又は他のよく知られた機構によって停止する。次いで、希釈、沈降、又は水簸液を流して導管２８の洗流し及び／又は充填した血液産物の洗浄を開始する。希釈、沈降、又は水簸液は、導管２８及びＹ字コネクタ３４を通過し、さらに入口導管３２を通過して、チャンバ１８の入口２２又はチャンバ１１８の入口１２２中に流入する。

管ループに関連する入口ポンプ４４又は１４４は、低密度の希釈、沈降、又は水簸液のチャンバ１８、１１８中への流入を止めるために停止される。遠心器が回転を続けると、チャンバ中に充填された粒子成分が、得られる遠心力の下で沈降する。粒子成分の沈降が、流体チャンバ１１８に関して図４に模式的に示してあり、連銭形成によって付着した赤血球を含む赤血球Ｒがチャンバ１８の入口２２に近接する底に沈降するように示されている。白血球Ｗ及び血小板Ｐも模式的に示してある。

血液産物の粒子成分が沈降した後で、管ループ４６に関連するポンプを駆動し、チャンバ１８の入口２２又はチャンバ１１８の入口１２２を介して沈降した赤血球Ｒを低流量で取り出し又は除去し、次いで入口導管３２及び除去導管３０を介して容器３１に送る。

赤血球を取り出した後で、下に説明するように、チャンバ１８又は１１８中に残留する白血球を水簸によって分離可能であり、又は管ループ４４、１４３に関連する入口ポンプを再始動して供給源３８から第２分量の血液産物をチャンバ１８、１１８中に再導入することができる。

白血球を望ましいサブセットに分離する水簸段階は、それぞれの除去過程の後で、又は供給源３８の血液産物が空になった後で実行可能である。唯一の要件は、効果的な分離又は分別を実現するのに十分な数の白血球がチャンバ１８、１１８中に存在することである。したがって、出発血液産物の白血球含有量は、水簸段階の一連の順番を決定する際に考慮されるべきである。

分別もしくは分離された白血球、又は分離された望ましい粒子を回収するために、除去後又は第１供給源３８が空になった後で、操作者は、管ループ４４、１４４に関連する入口ポンプの速度をゆっくり増大させるか、遠心器の速度を低下させるか、又は希釈、沈降、もしくは水簸液の密度もしくは粘度を増大させて、当業でよく知られているように、水簸法によってチャンバ１８中の細胞をサブセットに分離する。このように分離されたサブセットを次ぎに分離容器又は濃縮器５２中で濃縮する。

好ましい実施形態は、チャンバ１８及び１１８中で水簸法を用いて白血球をサブセットに分離することを開示するが、チャンバ１８、１１８と分離容器又は濃縮器５２の間に第２分離チャンバ（図示しないが、チャンバ１８、１１８と同様である）を流体連結し、この第２チャンバ中で水簸分離過程を用いて白血球をサブセットに分離できることも理解されたい。水簸分離は、白血球をバッグ７０中に回収後に別個の処理段階として行うことも可能である。さらには、赤血球の除去後に、米国特許第５，６７４，１７３号の流動床技法を用いて白血球をサブセットに分離することもできる。

したがって、上に説明した、充填、低密度流体の追加、沈降、除去、及び水簸段階は、（除去後に行われる場合は、）血液産物全体が望ましい成分又は望ましいサブセットに分離もしくは分別され、かつ赤血球が除去されてしまうまで反復される。

好ましい実施形態では、チャンバ１８、１１８中に充填された細胞が低密度の希釈、沈降、又は水簸液を追加することによって洗浄される。このような低密度液が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などのタンパク質又はヒドロキシエチルデンプン（ＨＡＥＳ）などの流体沈降剤を含むことが望ましい。希釈液は、赤血球の付着を助長して赤血球連銭を形成するように選択されることが好ましい。上で留意したように、これは赤血球の沈降速度の増加させる要因である。このように沈降速度が増加すると、赤血球が最後まで沈降することになり、より完全に流体チャンバ１８、１１８の入口２２、１２２から回収される。これによって赤血球をチャンバ１８、１１８から効果的に除去又は分離することができる。

上に特定したタンパク質及び沈降剤は例示に過ぎず、他によく知られたタンパク質又は沈降剤が希釈、沈降液であり得ること、又はそれによって希釈、沈降液を作製できることを理解されたい。低密度液は、媒体又は血漿であり得ることも理解されたい。

本発明を用いて赤血球を含む粒子を分離するとき、赤血球は連銭を形成するように助長される。タンパク質又は沈降液を含む希釈用の低密度液を使用すると、赤血球の連銭形成の発生が高まる。上述の液体を流体チャンバ１８、１１８中の物質に追加すると、そのような赤血球の付着が助長され、かつ上に説明したように、赤血球の沈降速度も増大する。赤血球の連銭形成が助長されるので、白血球から赤血球が最後まで沈降する。

過程の幾つかの部分でのみ希釈、沈降、又は水簸液を追加するが、他の構成も可能であることを理解されたい。例えば、流体チャンバ１８、１１８が、血液成分と希釈又は沈降液のために別個の入口を備えるように変更可能である。希釈又は沈降液は、一定分量を分離する過程の前又はその開始時に、第１供給源３８中の血液成分に追加可能である。水簸液の選択は、除去後に水簸技法によってサブセットが分離されるかどうかに左右され得ることもさらに理解されたい。

血液産物が分離チャンバ１８、１１８中に充填されるとき、及び水簸段階時に、希釈、沈降、又は水簸液、血漿、及び白血球、並びに流体チャンバ出口２０、１２０から流れる他のいずれの材料も、介在する管４８を通過して分離容器５２又は濃縮器の入口５０へ流れる。分離容器５２又は濃縮器中では、ロータ１２の回転によって発生する遠心力が、粒子を回収ウェル５４中に保持し、他方で希釈液及び血漿は、流体出口６０及び流体出口管路６２を介して容器６６へ流れる。これによって血小板及び他の粒子が、希釈液及び血漿から分離される。

粒子及び液体の一部は、粒子濃縮管路５８を介して１つ又は複数の粒子回収容器７０に流れ、希釈、沈降、又は水簸液及び血漿は、流体回収管路６２を介して流体回収容器６６に流れる。上で説明したように、任意の望ましい数の容器７０を使用して、白血球のいずれの分離サブセットも含めて、細胞の望ましい分離サブセットを回収することができる。

以上の過程は白血球を赤血球から除去することに関して説明されているが、第１粒子を第２粒子から分離するために、又は望ましい粒子の細胞選択を実行するために同様に使用可能である。

本発明の除去過程によってＷＢＣをそれほど失わずにＲＢＣの効果的な除去が実現可能であり、かつこのようなことが密閉系で実現可能である。本発明のシステムの能力は、幾つかのチャンバを並列に又は直列に配置することによって、又は１つの大きなチャンバを使用することによって向上可能である。理想的には、合計チャンバ容積が、１時間で約１５から４５ｍｌまでのＲＢＣの除去能力、及び２時間で約２×１０^１０個のＷＢＣの水簸能力（１又は２サイクルで）を有するべきである。４０ｍｌの産物の収容能力が好ましいが、任意所望の産物量を収容するように流体チャンバ１８及び１１８をサイズ決めできることが想定されている。

別法として、約４０ｍｌの容積を有する１つの（又は複数の）チャンバを使用することもできる。チャンバをロータ１２中の凹部に収めることができれば、本使い捨てシステムは、このような大型のチャンバを収容するように容易に適合可能である。

この使い捨て粒子分離システムは、粒子濃縮管路中などの様々な出力箇所に、回収されている細胞の種類及濃度を監視するためのセンサを最も適切に備えることもできる。任意の知られた種類のセンサを使用することができる。

精製された又は分別された白血球産物を実現するために、赤血球除去の効果を様々な実験で評価した。報告実験で用いた除去手順は以下の通りである。
１．アフェレーシス処理から残留物を入手し、遠心分離によって白血球（ＷＢＣ）を分離及び回収し、さらにヘマトクリット値を５〜２０％に調整する。
２．この産物の処理前産物試料を入手し、それに「前」と標示を付け、フロリダ州マイアミ市のＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社から入手したＣｏｕｌｔｅｒ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して、この試料を（３重反復試験で）分析する。
３．３．５１ｍＬの分離チャンバ内部で細胞負荷（ｌｏａｄ）を実現するのに必要な産物の容積を計算する。
４．産物の適正容積を１５０ｍＬの移変え容器に移し換える。
５．ヒト血清アルブミン又はヒドロキシエチルデンプンを含有する希釈液を調製し、５０ｍＬを１５０ｍＬの移換え容器に移し換え、残部を第２移換え容器に移し換える。
６．入口ポンプループ、除去ポンプループ（内径０．１１２センチメートル（０．０４４インチ）管を使用）、出口管路、及び分離チャンバからなる管使い捨てセットを準備する。これらの要素は、ポンプループ４４、赤血球ループ４６、入口管路２８、除去された赤血球用の出口管路３０、及び図１のチャンバ１８に対応する。
７．除去ポンプの出口を画分回収器に取り付け、５ｍＬのポリプロピレン試験管中に４００〜５００μＬの画分を回収するように設定する。
８．「出口」と標示された６００ｍＬの移換え容器に分離チャンバ出口からの出口管路を取り付ける。
９．管セットに調製した希釈液を注入する。
１０．４ｍＬ／分の流量及び２４００ｒｐｍの遠心器速度で細胞産物を分離チャンバ中に充填する。
１１．細胞を分離チャンバ中に充填している間に、チャンバ出口を介して流出する液体及び細胞を移換え容器中に回収する。
１２．５０ｍＬの希釈液で管と分離チャンバ内部の細胞とを洗浄する。
１３．入口ポンプを停止し、事前に画定した時間の長さの間、分離チャンバ内部の細胞を沈降させる。
１４．除去ポンプを使用して１ｍＬ／分の流量で細胞を分離チャンバの底から除去し、画分回収器を使用して小量のアリコートの細胞を回収する。
１５．一旦、すべての細胞を分離チャンバから取り除いたら、画分回収を中断する。
１６．「出口」と標示した移換え容器中及び試験管中の液体と細胞の重さを記録する。
１７．ＣＥＬＬ−ＤＹＮ ４０００ Ｓｙｓｔｅｍを使用して「前」及び「出口」試料を分析すると共に、すべての試験管のアリコートも分析する。

下で９つの実験の結果を表１に報告する。

実験では、イリノイ州アボットパーク市のＡｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ社によって製造されたＣＥＬＬ−ＤＹＮ ４０００ Ｓｙｓｔｅｍを使用して画分を分析したが、この装置は流動細胞計測法及び吸収分光測光法を用いて、血球及び血小板を計数し、分粒し、かつ分類するものである。ＣＥＬＬ−ＤＹＮ分析器の選択理由は、それが５つ部分（好中球、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球）に白血球を鑑別する能力を有し、赤血球の沈降と一緒に、白血球サブセットの沈降に関する情報を得ることができるからである。

それぞれの除去実験に続いて、細胞個数及び試料の重さを使用して、分離チャンバから取り除かれた累積容積の関数として様々な細胞の種類の回収率を計算した。

試料中では、分離チャンバの底から最初に取り出された細胞は主として赤血球であった。しかし、約３ｍＬの細胞懸濁液の除去後、画分は赤血球と白血球の混合物を含む。さらに、これらの後の画分中の細胞は、密度の差に従って沈降したことが（好中球、リンパ球、単球、次いで血小板）一部見受けられる。

次いで、累積細胞回収率の結果を使用して、リンパ球又は単球の可測回収率（１％）が存在する時点での赤血球細胞の回収率を計算した。除去された赤血球中でのリンパ球又は単球の１％の回収率は、追加的な処理（水簸など）対象のどちらかの細胞種類の１％の損失に対応する。この１％という値は、恣意的でありかつ著しく低い（他の予備的な処理過程に比べて）ものであるが、それは異なる除去条件下で得られる結果を比較する手段になる。

このような実行可能性研究の一部として評価した幾つかの条件を表１に示した。上に説明した設定及び分析器を使用して実施した報告実験のそれぞれの結果は、先に説明したように、ＲＢＣ除去に関して表示した。

表１に示すように、約１０％のヘマトクリット値を有する出発産物を使用して実験又は試験１から９を実行した。このようなヘマトクリット値の選択は、１回のみのアフェレーシス処理（ＷＢＣの最小水準のみを供給するに過ぎない）からの細胞からなる３．５１ｍＬの細胞容積をチャンバに充填することが望ましいという考えと、確実に連銭形成させる必要性とに基づく。約２％を下回るヘマトクリット値では、「赤血球の沈降速度が白血球の沈降速度に等しい」と考えられ、したがって赤血球の連銭が小さいか、又は形成されないことを示唆する。このような出発ヘマトクリット値は、現実的な精製過程をより適切に模擬するためにも選択されている。

実験１から９でのチャンバ中のＷＢＣ負荷は、３．６×１０^８個から１．５×１０^９個まで変動するが、１０％のヘマトクリット値のために、細胞負荷中のＲＢＣ対ＷＢＣの比率は、常に１０：１よりも十分に大きかった（１５：１から１０２：１の範囲）。赤血球が水簸による細胞分離を阻害するのを防止するためには、比率が１０：１を下回るべきであり、１０：１を下回っていない場合、出発産物は、説明したＲＢＣ除去過程などの処理過程を経るべきであると考える。分離チャンバ中の、ＲＢＣ対ＷＢＣの初期比率及び１％のリンパ球、１％の単球、又は１％の合計ＷＢＣを除去した後の最終比率に関するデータを表１に示す。

出発産物をチャンバ中に充填した後、管とチャンバ内部の細胞とを希釈液で洗浄した。実験又は試験１から７では、この希釈液がＩｓｏｌｙｔｅ Ｓ中の５％のヒト血清アルブミン（又は単に５％のＨＳＡ）からなるものであった。連銭形成は、少なくとも１〜２ｇ％濃度のタンパク質の存在下のみで生じると考えられる。したがって、５％のアルブミンで十分であると考えた。

実験又は試験８及び９では、タンパク質含有希釈液の代わりに沈降剤（ヒドロキシエチルデンプン）を含有する希釈液を使用した。実際には、０．４４％のＨＡＥＳ希釈液は、Ｉｓｏｌｙｔｅ Ｓ中で、ｐＨ６．９３の、０．４４ｇ％のヒドロキシエチルデンプン及び０．２０ｇ％のクエン酸三ナトリウムからなるものであった。このＨＡＥＳの濃度は、Ｓｐｅｃｔｒａ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ用のＳｐｅｃｔｒａ操作者用取扱説明書（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｏｐｅｒａｔｏｒ’ｓ ｍａｎｕａｌ）に記載されている情報に由来するものであり、この説明書では、幾つかのＷＢＣ処理では標準的なＡＣＤ−Ａ液の代わりにヒドロキシエチルデンプンを使用すること、及びこの溶液を約１３：１の「インレット」（Ｉｎｌｅｔ）対ＡＣ（ＡＣ）の比率で処方することが推奨されている。実験９では、用量反応をチェックするためにＨＡＥＳのレベルを倍の０．８８％のＨＡＥＳにした。この０．８８％のＨＡＥＳ希釈液は、１％のリンパ球損失で、実現可能なＲＢＣ除去が２８から５７％に増加し、１％の単球損失で、ＲＢＣ除去が１４から２１％に増加した。赤血球除去では（特に、単球に対する応用例では）、より高水準のＨＡＥＳも使用可能である。別法として、タンパク質とＨＡＥＳ（より低水準の）の組合せを使用することもできる。

これらの実験時に評価した他の条件は、沈降時間であった。図５に例示するように、沈降時間が１から１５分まで増加するとき、赤血球（ＲＢＣ）の除去率が増加した。これらの結果は、赤血球は少なくとも５分間チャンバ中で沈降させることが好ましいことを示唆する。

それぞれの除去実験時に、出発細胞産物（約３．５１ｍＬの合計細胞容積を有する）を４ｍＬ／分の流量及び２４００ｒｐｍの遠心器速度でチャンバ中に充填した。これらの条件によって、チャンバ中の細胞塊が大径に達した。充填過程及び希釈液による細胞塊の洗浄過程時に、流体及び一部の細胞がチャンバ出口から流出した。この産物（「出口」と呼ぶ）を回収し、後に分析してＲＢＣ除去前に実現した血小板除去水準を求めた。血小板除去及びＷＢＣ除去（すなわち、ＷＢＣ損失）の結果を表２に示す。

これらの結果は、かなりの水準の血小板（６０．０±２１．１％）が、４ｍＬ／分に過ぎない入口流量で、約３．５１ｍＬの細胞容積を分離チャンバに充填する間に出発細胞産物から除去されたことを示す。この過程に関連してＷＢＣの損失水準が低かった（０．４±０．６％）ことは、血小板の除去水準をさらに引き上げるために、入口流量をわずかに増大させ得ることを示唆する。

これまでに実施したＲＢＣ除去実験の結果は、本発明を用いると、白血球をそれほど損失せずに細胞産物中の約５５％の赤血球を除去できることを示唆する。これらの結果はまた、本発明のシステムを使用して細胞産物を充填する間、混入する血小板の水準を約６０％削減できることを示す。

本発明の範囲と趣旨から逸脱せずに、様々な変更及び変形が本発明の構成及び方法になされ得ることが当業者には明白であろう。例えば、本発明を用いて腫瘍細胞を赤血球から分離可能であり、第１供給源３８中の細胞懸濁液が、Ｔ細胞及び／又は幹細胞を含むことができよう。以上を考慮して、本発明の変更形態及び変形形態が以下の特許請求の範囲及びそれらの均等物の範囲内にあれば、本発明はそれらを網羅しようとするものである。

本発明の一実施形態に従う粒子分離システムを示すが模式図である。 図１に示した遠心器ロータ上に取り付けた流体チャンバ及び分離容器を示す斜視図である。 図１に示した同じ符号が同じ要素に使用されている１つの別法による粒子分離システムを示す模式図である。 赤血球の除去処理時の、図１の流体チャンバ中に沈降した粒子を示す模式図である。 本発明に従う実施例に関する沈降時間対赤血球除率を示すグラフである。

Claims (9)

1. 少なくとも白血球及び赤血球を含有する血液産物を、入口と出口を有し遠心器ロータに取り付けられた流体チャンバに、流体チャンバの入口を介して充填する段階と、
   赤血球の連銭形成を助長し、かつそれらの沈降速度を増大させるために充填された血液産物にヒドロキシエチル澱粉を含む低密度の流体を追加する段階と、
   遠心力下で赤血球を白血球から沈降させる段階と、
   沈降させた赤血球を白血球から流体チャンバの入口を介して除去する段階と、
   を含む赤血球を白血球から除去する方法。
2. 供給源のすべての流体が空になるまで、充填する段階と、回転する段階と、追加する段階と、沈降させる段階と、除去する段階とを反復する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 少なくとも白血球及び赤血球を含有する血液産物を有する流体供給源を、流体チャンバの入口に第１導管を介して流体連結する段階と、
   流体チャンバから除去された赤血球を収容するため流体チャンバの入口に除去導管を流体連結する段階と、
   除去された赤血球を収容するため除去容器に除去導管を連結する段階と、
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 白血球を分離して、流体チャンバ出口を介して流出する流体から回収するため、流体チャンバの出口に分離容器を流体連結する段階をさらに含む、請求項３に記載の方法。
5. 流体チャンバが、
   入口と出口の間に延在する平滑な内部面を有する壁と、
   壁中の最大面積であって、該壁は最大断面積から入口に向かって、かつ最大断面積から出口に向かって先細りする最大断面積と、
   をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 流体チャンバの入口に粒子を収容するため除去導管を流体連結することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. 流体チャンバの入口に３方向コネクタを連結する段階と、
   ３方向コネクタを介して、流体チャンバの入口に入口導管を連結する段階と、
   ３方向コネクタを介して、流体チャンバの入口に除去導管を流体連結する段階と、
   をさらに含む、請求項６に記載の方法。
8. 除去する段階の後で、水簸によって白血球を白血球サブセットに分離する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
9. 流体チャンバの出口を介して、分離された白血球サブセットを除去する段階と、
   除去された分離した白血球サブセットを粒子濃縮器に供給する段階と、
   粒子濃縮器中で白血球サブセットから流体を分離する段階と、
   望ましい白血球サブセットを回収する段階と、
   をさらに含む、請求項８に記載の方法。

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