JP4493009B2 - 脳内高分子のサンプリング方法 - Google Patents
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Description
本発明は、脳内高分子をサンプリングできる方法に関する。
ラットやマウスなどの研究用動物の脳内のペプチドやタンパク質などの高分子は、神経科学研究や癌研究など、医学、生理学の分野において重要な意味をもっている。しかしながら、これらの脳内高分子類は生体中に極微量に存在し、脳内の多種多様な共存物質から選択的にサンプリングすることは、容易ではない。
そこで、ラットやマウスなどの研究用動物の脳内高分子をサンプリングする方法として、1970年代に開発されたプッシュ−プル法がある。
このプッシュ−プル法は、目的物質を回収するために、脳内に微小の管を挿入し、この微小な管にチューブをジョイントさせリンゲル液等をシリンジポンプで１分間に約10 μlの速さで脳内に送液(プッシュ)し、別のポンプで目的物質を含むリンゲル溶液等を回収(プル)する方法である。しかしながら、プッシュ−プル法はリンゲル溶液等を送液することで脳へのダメージが大きく、また、目的物質以外の物質も回収され、とても非選択的な方法である。(非特許文献１を参照されたい。)
現在は、1980年代中旬に開発されたマイクロダイアリシス(微小透析)法が現在の主流である。特に脳内のin vivoモニタリング解析の手法には、Ungerstedtらにより開発されたマイクロダイアリシス法が主流になっている。このマイクロダイアリシス法(図１を参照されたい)は、ラットやマウスなどの研究動物の脳内の目的部位に長さ0.5〜4 mm、直径0.1〜0.3 mmの微小な透析膜付きプローブ(透析プローブ)を埋め込み、ラットが無麻酔および無拘束の状態で、挿入した透析プローブにマイクロシリンジポンプを用いてリンゲル溶液等を0.5〜2 μl/分で送液し、脳内の目的物質を約30分間ごとに回収する。(非特許文献２および３を参照されたい。)
しかし、プッシュ−プル法及びマイクロダイアリシス(微小透析)法は、どちらの方法も目的物質に対して非選択的であり、特にマイクロダイアリシス法は高分子に対して非常に回収率は低い等の問題がある。
G. Bartholini, H. Stadler, M. G. Ciria, K. G. Lloyd, The use of the push-pull cannula to estimate the dynamics of acetylcholine and catecholamines within various brain areas. Neuropharmacology, 15, 515-519, 1976. J. Kehr, T. Yoshitake, F. H. Wang, D. Wynick, K. Holmberg, U. Lendahl, T. Bartfai, M. Yamaguchi, T. Hokfelt, S.O.Ogren, Microdialysis in freely moving mice: determination of acetylcholine, serotoninan noradrenaline release in galanin transgenic mice. Journal of Neuroscience Methods, 109, 71-80, 2001. U. Ungerstedt, Measurement of neurotransmitter release by intracranial dialysis. Methods Neuroscience, 6, 81-105, 1984.
G. Bartholini, H. Stadler, M. G. Ciria, K. G. Lloyd, The use of the push-pull cannula to estimate the dynamics of acetylcholine and catecholamines within various brain areas. Neuropharmacology, 15, 515-519, 1976. J. Kehr, T. Yoshitake, F. H. Wang, D. Wynick, K. Holmberg, U. Lendahl, T. Bartfai, M. Yamaguchi, T. Hokfelt, S.O.Ogren, Microdialysis in freely moving mice: determination of acetylcholine, serotoninan noradrenaline release in galanin transgenic mice. Journal of Neuroscience Methods, 109, 71-80, 2001. U. Ungerstedt, Measurement of neurotransmitter release by intracranial dialysis. Methods Neuroscience, 6, 81-105, 1984.
本発明は、上記問題を解決し、脳内高分子を特異的に効率よくサンプリングできる方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、ナノ磁性微粒子が良く拡散し、抗体付きナノ磁性微粒子と脳内高分子が選択的に反応し、磁気ニードルと組み合わせることにより、上記課題を解決することができることを見出した。
本発明の方法は、ラットやマウスなどの研究用動物の脳内高分子(ペプチドやタンパク質など)に対して、ナノ磁性微粒子に抗体をリンクさせた「抗体付きナノ磁性微粒子」(図３Ｂ)の抗体と脳内高分子を選択的に反応させ、磁気ニードルを研究用動物の脳内に挿入し、脳内高分子と選択的に反応した抗体付きナノ磁性微粒子のナノ磁性微粒子を磁気ニードルに選択的に反応させ、磁気ニードルを脳内から取り出す事により脳内高分子をサンプリングできる方法である。
回収されたナノ磁性微粒子の測定法に関しては、ナノ磁性微粒子と反応した磁気ニードルを脳内から取り出し、測定に適する溶液を入れたバイアル中に浸す。次いで、ニードルから永久磁石を取り外すことにより、ナノ磁性微粒子を溶液中に遊離させ、次いで化学的に測定する。
回収されたナノ磁性微粒子の測定法に関しては、ナノ磁性微粒子と反応した磁気ニードルを脳内から取り出し、測定に適する溶液を入れたバイアル中に浸す。次いで、ニードルから永久磁石を取り外すことにより、ナノ磁性微粒子を溶液中に遊離させ、次いで化学的に測定する。
本明細書中、ナノ磁性微粒子は、酸化鉄をデキストランや金などでコーティングして成るものである。該粒子は、直径約5〜200 nmの範囲であるが、できるだけ小さい範囲(5〜20 nm)が望ましい。
本明細書中、抗体とは、目的物質、特に脳内高分子と特異的に反応する物質を意味し、β-アミロイド蛋白(Aβ1-40、Aβ1-42)、IgG、IgE、ガラニン、ノシセプチン、カルシトニン、インターロイキン、TNF、テストステロンなどのタンパク質、ペプチド、サイトカイン及びホルモンなどが含まれるが、これらには制限されない。
本明細書中、抗体とは、目的物質、特に脳内高分子と特異的に反応する物質を意味し、β-アミロイド蛋白(Aβ1-40、Aβ1-42)、IgG、IgE、ガラニン、ノシセプチン、カルシトニン、インターロイキン、TNF、テストステロンなどのタンパク質、ペプチド、サイトカイン及びホルモンなどが含まれるが、これらには制限されない。
本明細書中、リンクとは、ナノ磁性微粒子(ナノ粒子酸化鉄)と抗体の間の結合を意味するが、ナノ磁性微粒子に3-スルフヒドリルプロピルトリメトキシシラン(sulfhydrylpropyltrimethoxy silane) または3-アミノプロピルトリメトキシシラン(aminopropyltrimethoxy silane)等を加え、熱を加え反応させた後、メトキシポリエチレングリコール(methoxy polyethylene glycol)または4-[4-N-マレイミドフェニル]酪酸ヒドラジド塩酸塩(4-[4-N-maleimidophenyl]butyric hydrazide . HCl)等を加え、反応後、さらにカルボニル基付き抗体を加えることにより形成されるもの(図２を参照されたい)や、EDC: 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロライドなど、アミノ基やカルボニル基などを利用し反応させることにより形成されるものが含まれるが、これらには制限されない。
本明細書中、研究動物には、ラットやマウス以外にモルモット、ウサギ及びイヌ等の研究動物が挙げられるが、これらには制限されない。
本明細書中、研究動物には、ラットやマウス以外にモルモット、ウサギ及びイヌ等の研究動物が挙げられるが、これらには制限されない。
本発明の抗体付きナノ磁性微粒子は、一般的には、微細なインジェクションカニューレを用いて研究動物の脳室内に投与または測定部位に直接投与するが、静脈内、皮下投与等も可能である。
磁気ニードルを脳内から取り出す時間は、基本的に抗体と目的物質が反応するのに最低必要な時間としての30分以上であるが、目的物質により変化してよい。一般に、反応時間が長いほど、抗体と目的物質との反応性は上がる。
回収されたナノ磁性微粒子の測定における、磁気ニードルを入れるバイアル中の測定に適する溶液は、水、メタノール、およびアセトニトリル等の水系有機溶媒である。
磁気ニードルを脳内から取り出す時間は、基本的に抗体と目的物質が反応するのに最低必要な時間としての30分以上であるが、目的物質により変化してよい。一般に、反応時間が長いほど、抗体と目的物質との反応性は上がる。
回収されたナノ磁性微粒子の測定における、磁気ニードルを入れるバイアル中の測定に適する溶液は、水、メタノール、およびアセトニトリル等の水系有機溶媒である。
本発明のサンプリング方法により、効率的に、即ち目的物質に対して選択的かつ高い回収率で、研究動物の脳内高分子をサンプリングすることが可能となる。
１. 抗体付きナノ磁性微粒子の作製
1)塩化第二鉄六水化物及び塩化第一鉄四水化物を塩酸で溶解し、水酸化ナトリウムを加え共沈させ、遠心分離後、デキストランや金などを含む界面活性剤を加えコーティングさせることにより、酸化鉄をデキストランや金などでコーティングして成る、磁気を帯びたナノ磁性微粒子(図３Ａ)を合成する。
1)塩化第二鉄六水化物及び塩化第一鉄四水化物を塩酸で溶解し、水酸化ナトリウムを加え共沈させ、遠心分離後、デキストランや金などを含む界面活性剤を加えコーティングさせることにより、酸化鉄をデキストランや金などでコーティングして成る、磁気を帯びたナノ磁性微粒子(図３Ａ)を合成する。
2) ナノ磁性微粒子に3-スルフヒドリルプロピルトリメトキシシラン(sulfhydrylpropyltrimethoxy silane) または3-アミノプロピルトリメトキシシラン(aminopropyltrimethoxy silane)等を加え、熱を加え反応させた後、メトキシポリエチレングリコール(methoxy polyethylene glycol)または4-[4-N-マレイミドフェニル]酪酸ヒドラジド塩酸塩(4-[4-N-maleimidophenyl]butyric hydrazide . HCl)等を加える。反応後、さらにカルボニル基付き抗体を加える。こうして、リンクを介してナノ磁性微粒子と目的物質である高分子(ペプチドやタンパク質など)に特有の抗体を結合させ、抗体付きナノ磁性微粒子(図３Ｂ)を作製する。
2. ナノ磁性微粒子の特性
以下の実施例に従い、本発明のナノ磁性微粒子の特性を評価する。
以下の実施例に従い、本発明のナノ磁性微粒子の特性を評価する。
[実施例１]
1) ナノ磁性微粒子のサイズの違いによる脳内への拡散
直径20及び150 nmのナノ磁性微粒子(図３Ａ)それぞれ1及び5 μgをラット脳の線条体へ投与したときの脳内への拡散をfMRIを用いて確認した。投与容量は0.5 μlとし、投与の流速は0.5 μl/分とした。
脳のfMRIを図４に示す。
1) ナノ磁性微粒子のサイズの違いによる脳内への拡散
直径20及び150 nmのナノ磁性微粒子(図３Ａ)それぞれ1及び5 μgをラット脳の線条体へ投与したときの脳内への拡散をfMRIを用いて確認した。投与容量は0.5 μlとし、投与の流速は0.5 μl/分とした。
脳のfMRIを図４に示す。
投与量5 μgでは直径20 nmのナノ磁性微粒子が、直径150 nmのナノ磁性微粒子を投与したときと比較して、明らかに広範囲に拡散する結果が得られた。
投与量1 μgでは、直径20 nmのナノ磁性微粒子の投与中心部が直径150 nmのナノ磁性微粒子投与時よりも画像が薄くなっていることがはっきりと確認できる。これは、5 μg投与のときと同じく、20 nmの方がよく拡散していることを示している。
以上の結果から、20 nmの方がより拡散していることがわかった。
投与量1 μgでは、直径20 nmのナノ磁性微粒子の投与中心部が直径150 nmのナノ磁性微粒子投与時よりも画像が薄くなっていることがはっきりと確認できる。これは、5 μg投与のときと同じく、20 nmの方がよく拡散していることを示している。
以上の結果から、20 nmの方がより拡散していることがわかった。
[実施例２]
2) 脳内からのナノ磁性微粒子の回収
本実施例により、脳内からのナノ磁性微粒子が磁気ニードルを用いることにより回収されるかを調べた。
回収率を調べるためにナノ磁性微粒子(直径9 nm)とルテニウム(化学分析をするために用いた)の合成物質[Ru(bpy)3 +2] (図５)を研究用動物の脳(前頭葉)内及び脳内緩衝液中に0.5 μl、重量にして5 μgにて注入した。
永久磁石により磁気を帯びた磁気ニードルを動物の脳内又は脳内緩衝液中に挿入し、[Ru(bpy)3 +2]中のナノ磁性微粒子を選択的に磁気ニードルに反応させた(図６Ａ)。
2) 脳内からのナノ磁性微粒子の回収
本実施例により、脳内からのナノ磁性微粒子が磁気ニードルを用いることにより回収されるかを調べた。
回収率を調べるためにナノ磁性微粒子(直径9 nm)とルテニウム(化学分析をするために用いた)の合成物質[Ru(bpy)3 +2] (図５)を研究用動物の脳(前頭葉)内及び脳内緩衝液中に0.5 μl、重量にして5 μgにて注入した。
永久磁石により磁気を帯びた磁気ニードルを動物の脳内又は脳内緩衝液中に挿入し、[Ru(bpy)3 +2]中のナノ磁性微粒子を選択的に磁気ニードルに反応させた(図６Ａ)。
脳及び脳内緩衝液ともに磁気ニードルの挿入時を0時間(ただし、ナノ磁性微粒子とルテニウムの合成物質はニードル挿入の１時間前に投与した)とし、磁気ニードルの挿入時間は挿入後1、3及び24時間とした。
ナノ磁性微粒子と反応した磁気ニードルを脳内あるいは脳内緩衝液中から取り出し、測定に適する溶液を入れたバイアル中に浸した(図６Ｂ)。
ニードルから永久磁石を取り外すことにより、ナノ磁性微粒子を溶液中に遊離させ、溶液中の[Ru(bpy)3 +2]について、ルテニウムの化学発光強度を測定した(図６Ｃ、図６Ｄ)。
ナノ磁性微粒子と反応した磁気ニードルを脳内あるいは脳内緩衝液中から取り出し、測定に適する溶液を入れたバイアル中に浸した(図６Ｂ)。
ニードルから永久磁石を取り外すことにより、ナノ磁性微粒子を溶液中に遊離させ、溶液中の[Ru(bpy)3 +2]について、ルテニウムの化学発光強度を測定した(図６Ｃ、図６Ｄ)。
脳内の[Ru(bpy)3 +2]も脳内緩衝液中の[Ru(bpy)3 +2]も、ともに、磁気ニードルの挿入時間に依存して回収率が高くなった(図７)。
これより、脳内と脳内緩衝液という、磁気ニードルを挿入した環境の違いに関わらず、磁気ニードルの挿入時間(1、3、および24時間)が長いほど、[Ru(bpy)3 +2]の回収率は高くなることが証明された。
これより、脳内と脳内緩衝液という、磁気ニードルを挿入した環境の違いに関わらず、磁気ニードルの挿入時間(1、3、および24時間)が長いほど、[Ru(bpy)3 +2]の回収率は高くなることが証明された。
[実施例３]
以下に、本発明の実際の適用例を説明する。
脳に図２の抗体付きナノ磁性微粒子を注入し、抗体とペプチド及びタンパク質が反応する(図８Ａ)。
脳内にニードルを挿入し、数時間後、ニードルを脳から取り出す(図８Ｂ)。
化学発光物質や蛍光物質を用いてペプチド及びタンパク質を測定する(図８Ｃ)。
以下に、本発明の実際の適用例を説明する。
脳に図２の抗体付きナノ磁性微粒子を注入し、抗体とペプチド及びタンパク質が反応する(図８Ａ)。
脳内にニードルを挿入し、数時間後、ニードルを脳から取り出す(図８Ｂ)。
化学発光物質や蛍光物質を用いてペプチド及びタンパク質を測定する(図８Ｃ)。
Claims (1)
- 研究用動物の脳内高分子に対して、ナノ磁性微粒子に抗体をリンクさせた抗体付きナノ磁性微粒子の抗体を選択的に反応させ、磁気ニードルを研究用動物の脳内に挿入し、脳内高分子と選択的に反応した抗体付きナノ磁性微粒子のナノ磁性微粒子を磁気ニードルに選択的に反応させ、磁気ニードルを脳内から取り出すことを特徴とする脳内高分子のサンプリング方法。
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|---|---|---|---|
| JP2004135718A JP4493009B2 (ja) | 2004-04-30 | 2004-04-30 | 脳内高分子のサンプリング方法 |
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| JP2004135718A JP4493009B2 (ja) | 2004-04-30 | 2004-04-30 | 脳内高分子のサンプリング方法 |
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| JP2005312757A JP2005312757A (ja) | 2005-11-10 |
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| ATE508679T1 (de) * | 2008-02-26 | 2011-05-15 | Biostems Ltd | Vorrichtung zur mikroinvasiven in-vivo- untersuchung, die einen metallischen leiter umfasst |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1151934A (ja) * | 1997-07-31 | 1999-02-26 | Kagakuhin Kensa Kyokai | 生体成分の分析方法、及び生体成分分析装置 |
| JP2005147686A (ja) * | 2003-11-11 | 2005-06-09 | Nara Institute Of Science & Technology | 脳内物質の回収装置 |
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