JP4487036B2 - 新規ベクター及びその利用 - Google Patents
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Description
1.GST−T vectorの作製を上述の「SmaI/Taq」を用いた方法を用いて試作した。一応それらしきものの完成をみるが、再現性がなく、またPCR産物のサブクローニングの効率も悪いため実用性がなかった。
2.SmaI/Taqで行った場合の効率を改善するための改良法をWWW上の文書から取得したのでそれを試したが、改善は見られなかった。
3.SmaIにより切断された平滑末端の塩基配列が低い効率の原因ではないかと考え、BamHI切断による突出末端をKlenow fragmentで平滑化したのち、TaqでdTを付加するという独自の改良法も試みたが改善しなかった。
4.上述の「制限酵素カセットを用いる方法」に戦略変更し、制限酵素としてAhdIを用いることにした。
5.pGEX−2T/pGEX−4T3(GST融合ベクター)に限らず、抗生物質耐性を持っているplasmidにAhdIを作用させると、そのampicilin耐性遺伝子が切断されることが判明した。そこでサイレントな部位特異的変異を導入してAmp耐性遺伝子に含まれるAhdI切断部位を変異させたpGEX−4T3を作製した。(部位特異的変異の導入に使用したprimer=Anti AhdIの配列を配列表の配列番号21に示した)。
6.AhdI−linkerを作製した。すなわち、配列番号22及び23の配列のPCR primerを利用して、鋳型としてpET32a(Novagene社製)の誘導体pET32aPACAPを用いてPCRを行い、約500bpの断片を得て、これを既存のTA−vector(今回はPromega製品pGEM−T)に定法により組み込み、配列を確認したのちクローンを増幅して、精製したplasmidを得、このplasmidにBamHIを作用させるとAhd−I linker(約500bp)ができた。
7.GST−T vector(GST−T vector:GST融合のTA−vectorの意)の母体となるvectorを作製した。すなわち、5によって得たpGEX−4T3の変異体を増幅し、BamHIで切断し、そのBamHIサイトに6で得たAhdI linkerを挿入し、ligationにより閉環させた。正しく作製されたクローンを単離し、増幅した。なおこの段階のAhdI linkerには原理上、方向性は存在しない(どちら向きで入っていてもかまわない)
8.GST−T vectorを作製した。すなわち、7をAhdIで切断して、開環状plasmidをagarose gelで分離精製した。このベクターは、3’にdT突出末端を有するため、TA−cloningに利用できる。
9.NcoIを作用させた時に、逆方向に外来遺伝子が挿入されたベクター(例えば、プラスミド)が切断され、該ベクターが導入された宿主は生育できず、その結果、順方向で外来遺伝子が挿入されたベクターが導入された宿主のみの選択をすること(NcoI ORF選択法)に利用可能なAhdI linkerを作製した。作製法は6と同じであるが、primerに配列番号22及び24の配列の組を用いた。作製されたNcoI ORF選択法適用可能なAhdI linkerの配列を配列番号26及び27に示す。配列番号26の配列を有するDNA鎖と配列番号27の配列を有するDNA鎖とが会合して形成する2本鎖DNAがAhdI linkerである。
10.NcoI ORF選択法が可能なdGST−T vector(directional GST−T vector:ORFの方向選択が可能なGST−T vectorの意)を作製した。作製法は上記7・8と同じである。ただし7に対応するときの配列確認時に、GSTとの融合部分でprimerの配列番号22に相当する配列が5’側(GST側)に来ているものを選択して、NcoI ORF選択法の可能なベクターの母体となる閉環状ベクターを得た。また、このベクターは、挿入される外来遺伝子を増幅するPCR primerの設計を変更すれば、NcoIの代わりにNdeIを作用させて、逆方向に外来遺伝子が挿入されたベクター(例えば、プラスミド)が切断され、該ベクターが導入された宿主は生育できず、その結果、順方向で外来遺伝子が挿入されたベクターが導入された宿主のみの選択(NdeI ORF選択法)も可能であった。
本願の第1発明は、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる2つの切断認識配列を持ち、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まないことを特徴とするベクターを提供する。
第一の制限酵素は、切断したDNAに3’突出末端を生成する制限酵素であるとよく、3’突出末端の塩基としてはチミンを例示することができる。
第一の制限酵素はAhdIまたはそのイソスキゾマー、XcmIまたはそのイソスキゾマー、およびその組み合わせからなる群より選択されるとよい。
第一の制限酵素がAhdIまたはそのイソスキゾマーである場合、AhdIによって認識される塩基配列の異なる2つの切断認識配列の一方が下記の配列(I)及び(II)で表され、他方が下記の配列(III)及び(IV)で表されることが好ましい。
5’−GACX1aX2aTX3aX4aGTC−3’(I)
3’−CTGX1bX2bAX3bX4bCAG−5’(II)
5’−GACX5aX6aAX7aX8aGTC−3’(III)
3’−CTGX5bX6bTX7bX8bCAG−5’(IV)
(配列(I)〜(IV)中、Gはグアニン、Aはアデニン、Cはシトシン、Tはチミンであり、
X1a〜X8a及びX1b〜X8bはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、X1aとX1bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X2aとX2bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X3aとX3bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X4aとX4bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X5aとX5bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X6aとX6bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X7aとX7bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X8aとX8bは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列CX1aX2aTは第二の制限酵素の切断認識配列の5’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列CX8bX7bTは配列CX1aX2aTに含まれるところの第二の制限酵素の切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
5’−及び3’−は2本鎖DNAのそれぞれの末端を示す。)
第一の制限酵素がXcmIまたはそのイソスキゾマーである場合、XcmIによって認識される塩基配列の異なる2つの切断認識配列の一方が下記の配列(V)及び(VI)で表され、他方が下記の配列(VII)及び(VIII)で表されることが好ましい。
5’−CCAY1aY2aY3aY4aTY5aY6aY7aY8aTGG−3’(V)
3’−GGTY1bY2bY3bY4bAY5bY6bY7bY8bACC−5’(VI)
5’−CCAY9aY10aY11aY12aAY13aY14aY15aY16aTGG−3’(VII)
3’−GGTY9bY10bY11bY12bTY13bY14bY15bY16bACC−5’(VIII)
(配列(V)〜(VIII)中、Gはグアニン、Aはアデニン、Cはシトシン、Tはチミンであり、
Y1a〜Y16a及びY1b〜Y16bはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Y1aとY1bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y2aとY2bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y3aとY3bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y4aとY4bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y5aとY5bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y6aとY6bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y7aとY7bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y8aとY8bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y9aとY9bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y10aとY10bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y11aとY11bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y12aとY12bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y13aとY13bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y14aとY14bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y15aとY15bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y16aとY16bは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列Y1aY2aY3aY4aTは第二の制限酵素の切断認識配列の5’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列Y16bY15bY14bY13bTは配列Y1aY2aY3aY4aTに含まれるところの第二の制限酵素の切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
5’−及び3’−は2本鎖DNAのそれぞれの末端を示す。)
第一の制限酵素がAhdIまたはそのイソスキゾマーとXcmIまたはそのイソスキゾマーとの組み合わせである場合、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる2つの切断認識配列のうちの一方がAhdIまたはそのイソスキゾマーによって認識される切断認識配列であり、かつAhdIまたはそのイソスキゾマーとは異なる第二の制限酵素によって認識される切断配列の一部を含むものとし、他方の切断認識配列がXcmIまたはそのイソスキゾマーによって認識される切断認識配列であり、かつ前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まないものとしてもよい。AhdIまたはそのイソスキゾマーによって認識される切断認識配列であり、かつAhdIまたはそのイソスキゾマーとは異なる第二の制限酵素によって認識される切断配列の一部を含む切断認識配列は、下記の配列(I)及び(II)で表されることが好ましい。XcmIまたはそのイソスキゾマーによって認識される切断認識配列であり、かつ第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まない切断認識配列は、下記の配列(VII)及び(VIII)で表されることが好ましい。
5’−GACX1aX2aTX3aX4aGTC−3’(I)
3’−CTGX1bX2bAX3bX4bCAG−5’(II)
(配列(I)及び(II)中、Gはグアニン、Aはアデニン、Cはシトシン、Tはチミンであり、
X1a〜X4a及びX1b〜X4bはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、X1aとX1bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X2aとX2bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X3aとX3bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X4aとX4bは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列CX1aX2aTは第二の制限酵素の切断認識配列の5’側の部分配列を含む塩基配列であり、
5’−及び3’−は2本鎖DNAのそれぞれの末端を示す。)
5’−CCAY9aY10aY11aY12aAY13aY14aY15aY16aTGG−3’(VII)
3’−GGTY9bY10bY11bY12bTY13bY14bY15bY16bACC−5’(VIII)
(配列(VII)及び(VIII)中、Gはグアニン、Aはアデニン、Cはシトシン、Tはチミンであり、
Y9a〜Y16a及びY9b〜Y16bはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Y9aとY9bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y10aとY10bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y11aとY11bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y12aとY12bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y13aとY13bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y14aとY14bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y15aとY15bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y16aとY16bは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列Y16bY15bY14bY13bTは配列CX1aX2aTに含まれるところの第二の制限酵素の切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
5’−及び3’−は2本鎖DNAのそれぞれの末端を示す。)
第一の制限酵素がAhdIまたはそのイソスキゾマー、XcmIまたはそのイソスキゾマー、およびその組み合わせからなる群より選択される場合、第二の制限酵素は、NcoI,DsaI,EcoT14I,NdeI,SfeI,AvaI,SmlI,XhoI,PstI,EcoT22I,PshBI,AccI,ApaLI,PsiI,ScaI,SplI,Bsp1107I,Bsp1286I,BspT107I,Bsp1407I,TatI,HgiCI,KpnI,SpeI,BlnI,NheI,XbaI,SspI,EcoRVおよびそれらのイソスキゾマーからなる群より選択されることが好ましい。
第一の制限酵素がXcmIまたはそのイソスキゾマーである場合、第二の制限酵素が、AflIII,BspLU11I,NspI,SphI,BspHI,BsaAI,PmaCI,SnaBI,NspBII、PvuII,BanII,HgiAI,SacIおよびそれらのイソスキゾマーからなる群より選択されることが好ましい。
第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる2つの切断認識配列はマルチクローニングサイトに挿入されているとよい。
第一の制限酵素がAhdIまたはそのイソスキゾマーである場合、下記の配列(IX)及び(X)で表される二本鎖DNAがマルチクローニングサイトに挿入されていることが好ましい。
5’−GACX1aX2aTX3aX4aGTC−N1−GACX5aX6aAX7aX8aGTC−3’(IX)
3’−CTGX1bX2bAX3bX4bCAG−N2−CTGX5bX6bTX7bX8bCAG−5’(X)
(配列(IX)及び(X)中、Gはグアニン、Aはアデニン、Cはシトシン、Tはチミンであり、
X1a〜X8a及びX1b〜X8bはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、X1aとX1bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X2aとX2bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X3aとX3bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X4aとX4bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X5aとX5bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X6aとX6bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X7aとX7bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X8aとX8bは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列CX1aX2aTは第二の制限酵素の切断認識配列の5’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列CX8bX7bTは配列CX1aX2aTに含まれるところの第二の制限酵素の切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
5’−及び3’−は2本鎖DNAのそれぞれの末端を示し、
N1は存在しなくともよいが、存在する場合には、1〜1000塩基の任意のヌクレオチド配列であり、
N2は存在しなくともよいが、存在する場合には、N1のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。)
第一の制限酵素がXcmIまたはそのイソスキゾマーである場合、下記の配列(XI)及び(XII)で表される二本鎖DNAがマルチクローニングサイトに挿入されていることが好ましい。
5’−CCAY1aY2aY3aY4aTY5aY6aY7aY8aTGG−N1−CCAY9aY10aY11aY12aAY13aY14aY15aY16aTGG−3’(XI)
3’−GGTY1bY2bY3bY4bAY5bY6bY7bY8bACC−N2−GGTY9bY10bY11bY12bTY13bY14bY15bY16bACC−5’(XII)
(配列(XI)及び(XII)中、Gはグアニン、Aはアデニン、Cはシトシン、Tはチミンであり、
Y1a〜Y16a及びY1b〜Y16bはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Y1aとY1bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y2aとY2bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y3aとY3bbは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y4aとY4bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y5aとY5bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y6aとY6bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y7aとY7bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y8aとY8bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y9aとY9bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y10aとY10bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y11aとY11bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y12aとY12bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y13aとY13bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y14aとY14bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y15aとY15bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y16aとY16bは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列Y1aY2aY3aY4aTは第二の制限酵素の切断認識配列の5’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列Y16bY15bY14bY13bTは配列Y1aY2aY3aY4aTに含まれるところの第二の制限酵素の切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
5’−及び3’−は2本鎖DNAのそれぞれの末端を示し、
N1は存在しなくともよいが、存在する場合には、1〜1000塩基の任意のヌクレオチド配列であり、
N2は存在しなくともよいが、存在する場合には、N1のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。)
第一の制限酵素がAhdIまたはそのイソスキゾマーとXcmIまたはそのイソスキゾマーの組み合わせである場合、下記の配列(XIII)及び(XIV)で表される二本鎖DNAがマルチクローニングサイトに挿入されていることが好ましい。
5’−GACX1aX2aTX3aX4aGTC−N1−CCAY9aY10aY11aY12aAY13aY14aY15aY16aTGG−3’(XIII)
3’−CTGX1bX2bAX3bX4bCAG−N2−GGTY9bY10bY11bY12bTY13bY14bY15bY16bACC−5’(XIV)
(配列(XIII)及び(XIV)中、Gはグアニン、Aはアデニン、Cはシトシン、Tはチミンであり、
X1a〜X4a及びX1b〜X4bはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、X1aとX1bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X2aとX2bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X3aとX3bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X4aとX4bは互いに対合を形成しうる塩基であり、
Y9a〜Y16a及びY9b〜Y16bはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Y9aとY9bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y10aとY10bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y11aとY11bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y12aとY12bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y13aとY13bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y14aとY14bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y15aとY15bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y16aとY16bは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列CX1aX2aTは第二の制限酵素の切断認識配列の5’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列Y16bY15bY14bY13bTは配列CX1aX2aTに含まれるところの第二の制限酵素の切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
5’−及び3’−は2本鎖DNAのそれぞれの末端を示し、
N1は存在しなくともよいが、存在する場合には、1〜1000塩基の任意のヌクレオチド配列であり、
N2は存在しなくともよいが、存在する場合には、N1のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。)
配列(IX)〜(XIV)において、N1は、例えば、市販のベクター(例えば、pET21b、pET32aなど)の適当な制限酵素サイトに遺伝子(例えば、チオレドキシン遺伝子)と人工遺伝子(例えば、PACAPなど)を挿入して作成した誘導体に由来する配列であるとよい。N1配列の一部には、第二の制限酵素サイトが含まれていることが好ましいことがある。この場合は、本発明のベクター(以下、「PRESAT−vector」ということもある。)を第一の制限酵素で処理することにより得られる開環状ベクター(以下、「開環状PRESAT−vector」ということもある。)の精製が不完全であった場合でも、そこから自己ライゲーションで出てくる「空の」PRESAT−vectorは、第二の制限酵素消化により切断されてしまうために、ORF選択後にコロニーにならない。したがって、開環状PRESAT−vectorの精製が不完全であっても、バックグラウンドが上昇しないというメリットをもたらす。
N1の一例としては、以下の配列を挙げることができる。
5’−CACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGGCTAGCCATCACCACCACCACCACAGCAGCGGCATTGACGGCCGGCATAGCGATGGCATCTTTACCGATAGCTATAGCCGCTATCGCAAACAGATGGCGGTGAAAAAGTATCTGGCGGCGGTGCTGGGCTAATAA−3’(配列番号55)
配列番号55の配列は、pET21bのNdeIサイトに、pET32aに由来するチオレドキシン遺伝子を含むNdeI断片と、同じpET21bのNheIサイトに、PACAPの人工遺伝子を挿入して作成した、pET32aの誘導体pET32aPACAPに由来する配列である。
配列(IX)〜(XIV)において、N2は、N1のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。N2の一例としては、以下の配列を挙げることができる。
3’−GTGGACTGACTGCTGTCAAAACTGTGCCTACATGAGTTTCGCCTGCCCCGCTAGGAGCAGCTAAAGACCCGTCTCACCACGCCAGGCACGTTTTACTAGCGGGGCTAAGACCTACTTTAGCGACTGCTTATAGTCCCGTTTGACTGGCAACGTTTTGACTTGTAGCTAGTTTTGGGACCGTGACGCGGCTTTATACCGTAGGCACCATAGGGCTGAGACGACGACAAGTTTTTGCCACTTCACCGCCGTTGGTTTCACCCACGTGACAGATTTCCAGTCAACTTTCTCAAGGAGCTGCGATTGGACCGGCCAAGACCAAGACCGGTATACCGATCGGTAGTGGTGGTGGTGGTGTCGTCGCCGTAACTGCCGGCCGTATCGCTACCGTAGAAATGGCTATCGATATCGGCGATAGCGTTTGTCTACCGCCACTTTTTCATAGACCGCCGCCACGACCCGATTATT−5’(配列番号56)
配列番号56の配列は、配列番号55の配列に相補的な配列である。
本願の第1発明のベクターは、ある蛋白質(例えば、哺乳類、ジストマジャポニクスまたは大腸菌に由来するグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、チオレドキシン(TRX)、His−His−His−His−His−His(His6)、lanthanide binding tag(LBT)、Asp−Tyr−Lys−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys(PLAG(登録商標))、enhanced green fluorescense protein(EGFP)など)のコード領域を含んでおり、蛋白質及び/又は蛋白質ドメインをコードする外来遺伝子を組み込んだときに、前記外来遺伝子がコードする蛋白質及び/又は蛋白質ドメインを前記領域がコードする蛋白質と結合した融合蛋白質の形態で発現することができるものであってもよい。この場合、ある蛋白質のコード領域のカルボキシ末端側に、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる2つの切断認識配列を持ち、そのうち前記蛋白質のコード領域に近い側の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、前記蛋白質のコード領域に遠い側の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まないようにするとよい。
本願の第2発明は、本願の第1発明のベクターを第一の制限酵素で処理することにより得られる二本鎖DNAからなる開環状ベクターを提供する。
本発明の開環状ベクターとしては、下記の配列(XV)及び(XVI)で表される二本鎖DNAからなる開環状ベクターを例示することができる。
5’−X7aX8aGTC−N3−GACX1aX2aT−3’(XV)
3’−TX7bX8bCAG−N4−CTGX1bX2b−5’(XVI)
(配列(XV)及び(XVI)中、Gはグアニン、Aはアデニン、Cはシトシン、Tはチミンであり、
X7a、X8a、X7b及びX8bはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であるが、X7aとX7bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X8aとX8bは互いに対合を形成しうる塩基であり、
X1a、X2a、X1b及びX2bはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であるが、X1aとX1bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X2aとX2bは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列CX1aX2aTはNcoI,DsaI,EcoT14I,NdeI,SfeI,AvaI,SmlI,XhoI,PstI,EcoT22I,PshBI,AccI,ApaLI,PsiI,ScaI,SplI,Bsp1107I,Bsp1286I,BspT107I,Bsp1407I,TatI,HgiCI,KpnI,SpeI,BlnI,NheI,XbaI,SspI,EcoRVまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の5’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列CX8bX7bTは配列CX1aX2aTに含まれるところのNcoI,DsaI,EcoT14I,NdeI,SfeI,AvaI,SmlI,XhoI,PstI,EcoT22I,PshBI,AccI,ApaLI,PsiI,ScaI,SplI,Bsp1107I,Bsp1286I,BspT107I,Bsp1407I,TatI,HgiCI,KpnI,SpeI,BlnI,NheI,XbaI,SspI,EcoRVまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の部分配列を含まない配列であり、
−5’及び−3’は2本鎖DNAのそれぞれの末端を示し、
N3は2000〜7000塩基の任意のヌクレオチド配列であり、N4はN3のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。)
配列(XV)及び(XVI)において、X7aがAであり、X8aがTであり、X1aがCであり、X2aがAであり、X7bがTであり、X8bがAであり、X1bがGであり、X2bがTであることが好ましい。
また、本発明の開環状ベクターとして、下記の配列(XVII)及び(XVIII)で表される二本鎖DNAからなる開環状ベクターを例示することができる。
5’−Y13aY14aY15aY16aTGG−N3−CCAY1aY2aY3aY4aT−3’(XVII)
3’−TY13bY14bY15bY16bACC−N4−GGTY1bY2bY3bY4b−5’(XVIII)
(配列(XVII)及び(XVIII)中、Gはグアニン、Aはアデニン、Cはシトシン、Tはチミンであり、
Y1a、Y2a、Y3a、Y4a、Y1b、Y2b、Y3b、及びY4bはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であるが、Y1aとY1bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y2aとY2bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y3aとY3bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y4aとY4bは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列Y1aY2aY3aY4aTはNcoI,DsaI,EcoT14I,NdeI,SfeI,AvaI,SmlI,XhoI,PstI,EcoT22I,PshBI,AccI,ApaLI,PsiI,ScaI,SplI,Bsp1107I,Bsp1286I,BspT107I,Bsp1407I,TatI,HgiCI,KpnI,SpeI,BlnI,NheI,XbaI,SspI,EcoRV,AflIII,BspLU11I,NspI,SphI,BspHI,BsaAI,PmaCI,SnaBI,NspBII、PvuII,BanII,HgiAI,SacIまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の5’側の部分配列を含む塩基配列であり、
Y13a、Y14a、Y15a、Y16a、Y13b、Y14b、Y15b及びY16bはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であるが、Y13aとY13bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y14aとY14bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y15aとY15bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y16aとY16bは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列Y16bY15bY14bY13bTは配列Y1aY2aY3aY4aTに含まれるところのNcoI,DsaI,EcoT14I,NdeI,SfeI,AvaI,SmlI,XhoI,PstI,EcoT22I,PshBI,AccI,ApaLI,PsiI,ScaI,SplI,Bsp1107I,Bsp1286I,BspT107I,Bsp1407I,TatI,HgiCI,KpnI,SpeI,BlnI,NheI,XbaI,SspI,EcoRV,AflIII,BspLU11I,NspI,SphI,BspHI,BsaAI,PmaCI,SnaBI,NspBII、PvuII,BanII,HgiAI,SacIまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
−5’及び−3’は2本鎖DNAのそれぞれの末端を示し、
N3は2000〜7000塩基の任意のヌクレオチド配列であり、N4はN3のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。)
配列(XVII)及び(XVIII)において、Y2aがCであり、Y3aがでCあり、Y4aがAであり、Y2bがGであり、Y3bがGであり、Y4bがTであり、Y13aがTであり、Y14aがGであり、Y15aがTであり、Y13bがAであり、Y14bがCであり、Y15bがAであることが好ましい。
さらに、本発明の開環状ベクターとして、下記の配列(XIX)及び(XX)で表される二本鎖DNAからなる開環状ベクターを例示することができる。
5’−Y13aY14aY15aY16aTGG−N3−GACX1aX2aT−3’(XIX)
3’−TY13bY14bY15bY16bACC−5’N4−CTGX1bX2b−5’(XX)
(配列(XIX)及び(XX)中、Gはグアニン、Aはアデニン、Cはシトシン、Tはチミンであり、
Y13a、Y14a、Y15a、Y16a、Y13b、Y14b、Y15b及びY16bはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であるが、Y13aとY13bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y14aとY14bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y15aとY15bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y16aとY16bは互いに対合を形成しうる塩基であり、
X1a、X2a、X1b及びX2bはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であるが、X1aとX1bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X2aとX2bは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列CX1aX2aTはNcoI,DsaI,EcoT14I,NdeI,SfeI,AvaI,SmlI,XhoI,PstI,EcoT22I,PshBI,AccI,ApaLI,PsiI,ScaI,SplI,Bsp1107I,Bsp1286I,BspT107I,Bsp1407I,TatI,HgiCI,KpnI,SpeI,BlnI,NheI,XbaI,SspI,EcoRVまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の5’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列Y14bY13bTは配列CX1aX2aTに含まれるところのNcoI,DsaI,EcoT14I,NdeI,SfeI,AvaI,SmlI,XhoI,PstI,EcoT22I,PshBI,AccI,ApaLI,PsiI,ScaI,SplI,Bsp1107I,Bsp1286I,BspT107I,Bsp1407I,TatI,HgiCI,KpnI,SpeI,BlnI,NheI,XbaI,SspI,EcoRVまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
−5’及び−3’は2本鎖DNAのそれぞれの末端を示し、
N3は2000〜7000塩基の任意のヌクレオチド配列であり、N4はN3のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。)
配列(XIX)及び(XX)において、X1aがCであり、X2aがAであり、X1bがGであり、X2bがTであり、Y13aがTであり、Y14aがGであり、Y15aがTであり、Y13bがAであり、Y14bがCであり、Y15bがAであることが好ましい。
配列(XV)〜(XX)において、N3は、例えば、市販のベクター(例えば、pGEX−4T3、pGEX−2T、pGEX−3X、pET21b、pET32aなど)に由来する配列であるとよい。N3の一例としては、以下の配列を挙げることができる。
5’−GGATCCCCGAATTCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGCATCGTGACTGACTGACGATCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACCACGGGGAGCCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATAAATTCCGACACCATCGAATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTAACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTGGAATTACGTTATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGTATTCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCC−3’(配列番号57)
配列番号57の配列は、pGEX−4T3に由来する配列である。
配列(XV)〜(XX)において、N4は、N3のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。N4の一例としては、以下の配列を挙げることができる。
3’−CCTAGGGGCTTAAGGGCCCAGCTGAGCTCGCCGGCGTAGCACTGACTGACTGCTAGACGGAGCGCGCAAAGCCACTACTGCCACTTTTGGAGACTGTGTACGTCGAGGGCCTCTGCCAGTGTCGAACAGACATTCGCCTACGGCCCTCGTCTGTTCGGGCAGTCCCGCGCAGTCGCCCACAACCGCCCACAGCCCCGCGTCGGTACTGGGTCAGTGCATCGCTATCGCCTCACATATTAAGAACTTCTGCTTTCCCGGAGCACTATGCGGATAAAAATATCCAATTACAGTACTATTATTACCAAAGAATCTGCAGTCCACCGTGAAAAGCCCCTTTACACGCGCCTTGGGGATAAACAAATAAAAAGATTTATGTAAGTTTATACATAGGCGAGTACTCTGTTATTGGGACTATTTACGAAGTTATTATAACTTTTTCCTTCTCATACTCATAAGTTGTAAAGGCACAGCGGGAATAAGGGAAAAAACGCCGTAAAACGGAAGGACAAAAACGAGTGGGTCTTTGCGACCACTTTCATTTTCTACGACTTCTAGTCAACCCACGTGCTCACCCAATGTAGCTTGACCTAGAGTTGTCGCCATTCTAGGAACTCTCAAAAGCGGGGCTTCTTGCAAAAGGTTACTACTCGTGAAAATTTCAAGACGATACACCGCGCCATAATAGGGCACAACTGCGGCCCGTTCTCGTTGAGCCAGCGGCGTATGTGATAAGAGTCTTACTGAACCAACTCATGAGTGGTCAGTGTCTTTTCGTAGAATGCCTACCGTACTGTCATTCTCTTAATACGTCACGACGGTATTGGTACTCACTATTGTGACGCCGGTTGAATGAAGACTGTTGCTAGCCTCCTGGCTTCCTCGATTGGCGAAAAAACGTGTTGTACCCCCTAGTACATTGAGCGGAACTAGCAACCCTTGGCCTCGACTTACTTCGGTATGGTTTGCTGCTCGCACTGTGGTGCTACGGACGTCGTTACCGTTGTTGCAACGCGTTTGATAATTGACCGCTTGATGAATGAGATCGAAGGGCCGTTGTTAATTATCTGACCTACCTCCGCCTATTTCAACGTCCTGGTGAAGACGCGAGCCGGGAAGGCCGACCGACCAAATAACGACTATTTAGACCTCGGCCACTCGCACCCAGAGCGCCATAGTAACGTCGTGACCCCGGTCTACCATTCGGGAGGGCATAGCATCAATAGATGTGGTGCCCCTCGGTCCGTTGATACCTACTTGCTTTATCTGTCTAGCGACTCTATCCACGGAGTGACTAATTCGTAACCATTGACAGTCTGGTTCAAATGAGTATATATGAAATCTAACTAAATTTTGAAGTAAAAATTAAATTTTCCTAGATCCACTTCTAGGAAAAACTATTAGAGTACTGGTTTTAGGGAATTGCACTCAAAAGCAAGGTGACTCGCAGTCTGGGGCATCTTTTCTAGTTTCCTAGAAGAACTCTAGGAAAAAAAGACGCGCATTAGACGACGAACGTTTGTTTTTTTGGTGGCGATGGTCGCCACCAAACAAACGGCCTAGTTCTCGATGGTTGAGAAAAAGGCTTCCATTGACCGAAGTCGTCTCGCGTCTATGGTTTATGACAGGAAGATCACATCGGCATCAATCCGGTGGTGAAGTTCTTGAGACATCGTGGCGGATGTATGGAGCGAGACGATTAGGACAATGGTCACCGACGACGGTCACCGCTATTCAGCACAGAATGGCCCAACCTGAGTTCTGCTATCAATGGCCTATTCCGCGTCGCCAGCCCGACTTGCCCCCCAAGCACGTGTGTCGGGTCGAACCTCGCTTGCTGGATGTGGCTTGACTCTATGGATGTCGCACTCGATACTCTTTCGCGGTGCGAAGGGCTTCCCTCTTTCCGCCTGTCCATAGGCCATTCGCCGTCCCAGCCTTGTCCTCTCGCGTGCTCCCTCGAAGGTCCCCCTTTGCGGACCATAGAAATATCAGGACAGCCCAAAGCGGTGGAGACTGAACTCGCAGCTAAAAACACTACGAGCAGTCCCCCCGCCTCGGATACCTTTTTGCGGTCGTTGCGCCGGAAAAATGCCAAGGACCGGAAAACGACCGGAAAACGAGTGTACAAGAAAGGACGCAATAGGGGACTAAGACACCTATTGGCATAATGGCGGAAACTCACTCGACTATGGCGAGCGGCGTCGGCTTGCTGGCTCGCGTCGCTCAGTCACTCGCTCCTTCGCCTTCTCGCGGACTACGCCATAAAAGAGGAATGCGTAGACACGCCATAAAGTGTGGCGTATTTAAGGCTGTGGTAGCTTACCACGTTTTGGAAAGCGCCATACCGTACTATCGCGGGCCTTCTCTCAGTTAAGTCCCACCACTTACACTTTGGTCATTGCAATATGCTACAGCGTCTCATACGGCCACAGAGAATAGTCTGGCAAAGGGCGCACCACTTGGTCCGGTCGGTGCAAAGACGCTTTTGCGCCCTTTTTCACCTTCGCCGCTACCGCCTCGACTTAATGTAAGGGTTGGCGCACCGTGTTGTTGACCGCCCGTTTGTCAGCAACGACTAACCGCAACGGTGGAGGTCAGACCGGGACGTGCGCGGCAGCGTTTAACAGCGCCGCTAATTTAGAGCGCGGCTAGTTGACCCACGGTCGCACCACCACAGCTACCATCTTGCTTCGCCGCAGCTTCGGACATTTCGCCGCCACGTGTTAGAAGAGCGCGTTGCGCAGTCACCCGACTAGTAATTGATAGGCGACCTACTGGTCCTACGGTAACGACACCTTCGACGGACGTGATTACAAGGCCGCAATAAAGAACTACAGAGACTGGTCTGTGGGTAGTTGTCATAATAAAAGAGGGTACTTCTGCCATGCGCTGACCCGCACCTCGTAGACCAGCGTAACCCAGTGGTCGTTTAGCGCGACAATCGCCCGGGTAATTCAAGACAGAGCCGCGCAGACGCAGACCGACCGACCGTATTTATAGAGTGAGCGTTAGTTTAAGTCGGCTATCGCCTTGCCCTTCCGCTGACCTCACGGTACAGGCCAAAAGTTGTTTGGTACGTTTACGACTTACTCCCGTAGCAAGGGTGACGCTACGACCAACGGTTGCTAGTCTACCGCGACCCGCGTTACGCGCGGTAATGGCTCAGGCCCGACGCGCAACCACGCCTATAGAGCCATCACCCTATGCTGCTATGGCTTCTGTCGAGTACAATATAGGGCGGCAATTGGTGGTAGTTTGTCCTAAAAGCGGACGACCCCGTTTGGTCGCACCTGGCGAACGACGTTGAGAGAGTCCCGGTCCGCCACTTCCCGTTAGTCGACAACGGGCAGAGTGACCACTTTTCTTTTTGGTGGGACCGCGGGTTATGCGTTTGGCGGAGAGGGGCGCGCAACCGGCTAAGTAATTACGTCGACCGTGCTGTCCAAAGGGCTGACCTTTCGCCCGTCACTCGCGTTGCGTTAATTACACTCAATCGAGTGAGTAATCCGTGGGGTCCGAAATGTGAAATACGAAGGCCGAGCATACAACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGTCCTTTGTCGATACTGGTACTAATGCCTAAGTGACCGGCAGCAAAATGTTGCAGCACTGACCCTTTTGGGACCGCAATGGGTTGAATTAGCGGAACGTCGTGTAGGGGGAAAGCGGTCGACCGCATTATCGCTTCTCCGGGCGTGGCTAGCGGGAAGGGTTGTCAACGCGTCGGACTTACCGCTTACCGCGAAACGGACCAAAGGCCGTGGTCTTCGCCACGGCCTTTCGACCGACCTCACGCTAGAAGGACTCCGGCTATGACAGCAGCAGGGGAGTTTGACCGTCTACGTGCCAATGCTACGCGGGTAGATGTGGTTGCATTGGATAGGGTAATGCCAGTTAGGCGGCAAACAAGGGTGCCTCTTAGGCTGCCCAACAATGAGCGAGTGTAAATTACAACTACTTTCGACCGATGTCCTTCCGGTCTGCGCTTAATAAAAACTACCGCAACCTTAATGCAATAGCTGACGTGCCACGTGGTTACGAAGACCGCAGTCCGTCGGTAGCCTTCGACACCATACCGACACGTCCAGCATTTAGTGACGTATTAAGCACAGCGAGTTCCGCGTGAGGGCAAGACCTATTACAAAAAACGCGGCTGTAGTATTGCCAAGACCGTTTATAAGACTTTACTCGACAACTGTTAATTAGTAGCCGAGCATATTACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGTCCTTTGTCATAAGTACAGGGGATATGATCCAATAACCTTTTAATTCCCGGAACACGTTGGGTGAGCTGAAGAAAACCTTATAGAACTTCTTTTTATACTTCTCGTAAACATACTCGCGCTACTTCCACTATTTACCGCTTTGTTTTTCAAACTTAACCCAAACCTCAAAGGGTTAGAAGGAATAATATAACTACCACTACAATTTAATTGTGTCAGATACCGGTAGTATGCAATATATCGACTGTTCGTGTTGTACAACCCACCAACAGGTTTTCTCGCACGTCTCTAAAGTTACGAACTTCCTCGCCAAAACCTATAATCTATGCCACAAAGCTCTTAACGTATATCATTTCTGAAACTTTGAGAGTTTCAACTAAAAGAATCGTTCGATGGACTTTACGACTTTTACAAGCTTCTAGCAAATACAGTATTTTGTATAAATTTACCACTAGTACATTGGGTAGGACTGAAGTACAACATACTGCGAGAACTACAACAAAATATGTACCTGGGTTACACGGACCTACGCAAGGGTTTTAATCAAACAAAATTTTTTGCATAACTTCGATAGGGTGTTTAACTATTCATGAACTTTAGGTCGTTCATATATCGTACCGGAAACGTCCCGACCGTTCGGTGCAAACCACCACCGCTGGTAGGAGGTTTTAGCCTAGACCAAGGCGCACCTAGG−5’(配列番号58)
配列番号58の配列は、配列番号57の配列に相補的な配列である。
本願の第3発明は、本願の第1発明のベクターを第一の制限酵素で処理したものに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含む外来遺伝子を本願の第1発明のベクターに組み込んだ組換えベクターを提供する。本願の第1発明のベクターを第一の制限酵素で処理したものに外来遺伝子が順方向で挿入された組換えベクターが好ましい。外来遺伝子は蛋白質及び/又は蛋白質ドメインをコードするとよい。
本願の第4発明は、本願の第3発明の組換えベクターを含む形質転換体またはその子孫を提供する。
本願の第5発明は、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる2つの切断認識配列であって、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まない前記の2つの切断認識配列を含む二本鎖DNAをプラスミド、ファージ、コスミド、P1ベクター、細菌人工染色体ベクターまたは酵母人工染色体ベクターのマルチクローニングサイトに導入することを含む、本願の第1発明のベクターの製造方法を提供する。
本願の第6発明は、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる2つの切断認識配列であって、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まない前記の2つの切断認識配列を含む二本鎖DNAを提供する。
本願の第6発明の二本鎖DNAとしては、下記の配列(IX)及び(X)で表される二本鎖DNAを例示することができる。。
5’−GACX1aX2aTX3aX4aGTC−N1−GACX5aX6aAX7aX8aGTC−3’(IX)
3’−CTGX1bX2bAX3bX4bCAG−N2−CTGX5bX6bTX7bX8bCAG−5’(X)
(配列(IX)及び(X)中、Gはグアニン、Aはアデニン、Cはシトシン、Tはチミンであり、
X1a〜X8a及びX1b〜X8bはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、X1aとX1bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X2aとX2bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X3aとX3bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X4aとX4bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X5aとX5bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X6aとX6bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X7aとX7bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X8aとX8bは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列CX1aX2aTはNcoI,DsaI,EcoT14I,NdeI,SfeI,AvaI,SmlI,XhoI,PstI,EcoT22I,PshBI,AccI,ApaLI,PsiI,ScaI,SplI,Bsp1107I,Bsp1286I,BspT107I,Bsp1407I,TatI,HgiCI,KpnI,SpeI,BlnI,NheI,XbaI,SspI,EcoRVまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の5’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列CX8bX7bTは配列CX1aX2aTに含まれるところのNcoI,DsaI,EcoT14I,NdeI,SfeI,AvaI,SmlI,XhoI,PstI,EcoT22I,PshBI,AccI,ApaLI,PsiI,ScaI,SplI,Bsp1107I,Bsp1286I,BspT107I,Bsp1407I,TatI,HgiCI,KpnI,SpeI,BlnI,NheI,XbaI,SspI,EcoRVまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
5’−及び3’−は2本鎖DNAのそれぞれの末端を示し、
N1は存在しなくともよいが、存在する場合には、1〜1000塩基の任意のヌクレオチド配列であり、
N2は存在しなくともよいが、存在する場合には、N1のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。)
また、本願の第6発明の二本鎖DNAとして、下記の配列(XI)及び(XII)で表される二本鎖DNAを例示することができる。
5’−CCAY1aY2aY3aY4aTY5aY6aY7aY8aTGG−N1−CCAY9aY10Y11aY12aAY13aY14aY15aY16aTGG−3’(XI)
3’−GGTY1bY2bY3bY4bAY5bY6bY7bY8bACC−N2−GGTY9bY10bY11bY12bTY13bY14bY15bY16bACC−5’(XII)
(配列(XI)及び(XII)中、Gはグアニン、Aはアデニン、Cはシトシン、Tはチミンであり、
Y1a〜Y16a及びY1b〜Y16bはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Y1aとY1bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y2aとY2bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y3aとY3bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y4aとY4bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y5aとY5bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y6aとY6bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y7aとY7bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y8aとY8bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y9aとY9bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y10aとY10bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y11aとY11bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y12aとY12bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y13aとY13bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y14aとY14bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y15aとY15bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y16aとY16bは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列Y1aY2aY3aY4aTはNcoI,DsaI,EcoT14I,NdeI,SfeI,AvaI,SmlI,XhoI,PstI,EcoT22I,PshBI,AccI,ApaLI,PsiI,ScaI,SplI,Bsp1107I,Bsp1286I,BspT107I,Bsp1407I,TatI,HgiCI,KpnI,SpeI,BlnI,NheI,XbaI,SspI,EcoRV,AflIII,BspLU11I,NspI,SphI,BspHI,BsaAI,PmaCI,SnaBI,NspBII、PvuII,BanII,HgiAI,SacIまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の5’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列Y16bY15bY14bY13bTは配列Y1aY2aY3aY4aTに含まれるところのNcoI,DsaI,EcoT14I,NdeI,SfeI,AvaI,SmlI,XhoI,PstI,EcoT22I,PshBI,AccI,ApaLI,PsiI,ScaI,SplI,Bsp1107I,Bsp1286I,BspT107I,Bsp1407I,TatI,HgiCI,KpnI,SpeI,BlnI,NheI,XbaI,SspI,EcoRV,AflIII,BspLU11I,NspI,SphI,BspHI,BsaAI,PmaCI,SnaBI,NspBII、PvuII,BanII,HgiAI,SacIまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の部分配列を含まない塩基配列であり、
5’−及び3’−は2本鎖DNAのそれぞれの末端を示し、
N1は存在しなくともよいが、存在する場合には、1〜1000塩基の任意のヌクレオチド配列であり、
N2は存在しなくともよいが、存在する場合には、N1のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。)
さらに、本願の第6発明の二本鎖DNAとして、下記の配列(XIII)及び(XIV)で表される二本鎖DNAを例示することができる。
5’−GACX1aX2aTX3aX4aGTC−N1−CCAY9aY10aY11aY12aAY13aY14aY15aY16aTGG−3’(XIII)
3’−CTGX1bX2bAX3bX4bCAG−N2−GGTY9bY10bY11bY12bTY13bY14bY15bY16bACC−5’(XIV)
(配列(XIII)及び(XIV)中、Gはグアニン、Aはアデニン、Cはシトシン、Tはチミンであり、
X1a〜X4a及びX1b〜X4bはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、X1aとX1bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X2aとX2bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X3aとX3bは互いに対合を形成しうる塩基であり、X4aとX4bは互いに対合を形成しうる塩基であり、
Y9a〜Y16a及びY9b〜Y16bはそれぞれ独立にグアニン、アデニン、シトシンまたはチミンのいずれかの塩基であり、Y9aとY9bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y10aとY10bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y11aとY11bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y12aとY12bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y13aとY13bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y14aとY14bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y15aとY15bは互いに対合を形成しうる塩基であり、Y16aとY16bは互いに対合を形成しうる塩基であり、
配列CX1aX2aTはNcoI,DsaI,EcoT14I,NdeI,SfeI,AvaI,SmlI,XhoI,PstI,EcoT22I,PshBI,AccI,ApaLI,PsiI,ScaI,SplI,Bsp1107I,Bsp1286I,BspT107I,Bsp1407I,TatI,HgiCI,KpnI,SpeI,BlnI,NheI,XbaI,SspI,EcoRVまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の5’側の部分配列を含む塩基配列であり、
配列Y14bY13bTは配列CX1aX2aTに含まれるところのNcoI,DsaI,EcoT14I,NdeI,SfeI,AvaI,SmlI,XhoI,PstI,EcoT22I,PshBI,AccI,ApaLI,PsiI,ScaI,SplI,Bsp1107I,Bsp1286I,BspT107I,Bsp1407I,TatI,HgiCI,KpnI,SpeI,BlnI,NheI,XbaI,SspI,EcoRVまたはそれらのイソスキゾマーの切断認識配列の5’側の部分配列を含まない塩基配列であり、
5’−及び3’−は2本鎖DNAのそれぞれの末端を示し、
N1は存在しなくともよいが、存在する場合には、1〜1000塩基の任意のヌクレオチド配列であり、
N2は存在しなくともよいが、存在する場合には、N1のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。)
本願の第7発明は、本願の第1発明のベクターを用いて、外来遺伝子がコードする蛋白質及び/又は蛋白質ドメインを製造する方法を提供する。
本願の第7発明の1態様においては、蛋白質及び/又は蛋白質ドメインをコードする外来遺伝子であって、本願の第1発明のベクターを第一の制限酵素で処理したものに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含む前記外来遺伝子を本願の第1発明のベクターに組み込んだ組換えベクターを作製し、この組換えベクターを第二の制限酵素で処理した後、宿主に導入し、宿主の単コロニーを形成させ、単コロニー由来の宿主を培養することにより、外来遺伝子がコードする蛋白質及び/又は蛋白質ドメインを発現させることができる。
本願の第7発明の別の態様においては、本願の第1発明のベクターを第一の制限酵素で処理したものに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含むプライマーであって、蛋白質及び/又は蛋白質ドメインをコードする外来遺伝子のcDNAを増幅することができる前記プライマーを用いて、cDNAを鋳型として、cDNAにおける位置及び/又は長さ及び/又は配列の一部が異なるcDNAの部分配列に相当するDNAの混合物を増幅し、混合物の各々を第一の制限酵素で処理した本願の第1発明のベクターに組み込んだ組換えベクターを作製し、第二の制限酵素で組換えベクターを処理した後、宿主に導入し、宿主の単コロニーを形成させ、単コロニー由来の宿主を培養することにより、外来遺伝子がコードする蛋白質及び/又は蛋白質ドメインを発現させることができる。
本願の第8発明は、本願の第1発明のベクターを用いて、外来遺伝子がベクターに逆方向で挿入された組換えベクターを開環させ、外来遺伝子がベクターに順方向で挿入された組換えベクターを閉環したままの状態で残す方法を提供する。
本願の第8発明の1態様においては、本願の第3発明の組換えベクターを第二の制限酵素で処理することにより、外来遺伝子がベクターに逆方向で挿入された組換えベクターを開環させ、外来遺伝子がベクターに順方向で挿入された組換えベクターを閉環したままの状態で残すことができる。
本願の第9発明は、本願の第1発明のベクターを用いて、外来遺伝子がコードする蛋白質及び/又は蛋白質ドメインの発現量及び/又は溶解度を試験する方法を提供する。
本願の第9発明の1態様においては、蛋白質及び/又は蛋白質ドメインをコードする外来遺伝子であって、本願の第1発明のベクターを第一の制限酵素で処理したものに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含む前記外来遺伝子を本願の第1発明のベクターに組み込んだ組換えベクターを作製し、この組換えベクターを第二の制限酵素で処理した後、宿主に導入し、宿主及び/又はその子孫を培養することにより、外来遺伝子がコードする蛋白質及び/又は蛋白質ドメインを発現させ、発現した蛋白質及び/又は蛋白質ドメインの量及び/又は溶解度を調べることができる。
配列(I)を配列表の配列番号1に示す。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2003−308773号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
1.ベクターの調製
まず、ベクターを用意する。例えば、市販のベクターを購入し、このベクターが第一及び第二の制限酵素により認識される切断認識配列を有する場合には、この切断認識配列に変異を導入するとよい。このベクターが融合蛋白質発現ベクターであると、目的蛋白質及び/又は蛋白質ドメインの発現量・溶解性を検出・測定するのが容易である点、目的蛋白質及び/又は蛋白質ドメインの精製が容易である点、目的蛋白質の機能解析・相互作用解析のための生化学実験を行う際に有利である点から便利である。後述の実施例1では、pGEX−4T3ベクターに、配列番号21の配列で表されるDNAを5’リン酸化したものを用いて、site−directed mutagenesis法を用いて変異を導入した。これによりpGEX−4T3がもともとの配列中に持っていたAhdIサイトが切断されなくなる。
外来遺伝子を調製する。外来遺伝子は、1で用意したベクターに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含む。また、外来遺伝子は、蛋白質及び/又は蛋白質ドメインをコードしているとよい。
(1)第一の制限酵素がAhdIであり、第二の制限酵素がNcoIである場合(NcoI選択)
ORFのN末端側のプライマーを設計するには、以下の4つの規則に従うとよい。
(ia)プライマー配列の1塩基目がアミノ酸コドン一文字目に対応して先行するGSTとフレームが合うようにする。
(iia)5’末端の塩基をGまたはAとする。(必要ならば少数のアミノ酸をコードするDNA配列の挿入を行う)。
(iiia)5’末端の配列をGGにしない。
(iva)PCR増幅断片内にNcoI制限酵素サイトを含まない。
(va)5’末端の塩基をGGとする。
(via)目的蛋白質ドメインが停止コドンを含まないときは、5’末端の配列をGG−Xn−TTA(Xnは任意のn個(nは0〜30のいずれかの整数)の塩基でよく、例えば、Aとする。)(nが5の場合の配列を配列番号53に示す。)ではじまるようにする。
(2)第一の制限酵素がAhdIであり、第二の制限酵素がNdeIである場合(NdeI選択)
ORFのN末端側のプライマーを設計するには、以下の4つの規則に従うとよい。
(ib)プライマー配列の1塩基目がアミノ酸コドン一文字目に対応して先行するGSTとフレームが合うようにする。
(iib)5’末端の塩基をGまたはAとする。(必要ならば少数のアミノ酸をコードするDNA配列の挿入を行う)。
(iiib)5’末端をATGにしない。
(ivb)PCR増幅断片内にNdeI制限酵素サイトを含まない。
(vb)5’末端の塩基をATGとする。
(vib)目的蛋白質ドメインが停止コドンを含まないときは、5’末端の配列をATG−Xn−TTA(Xnは任意のn個(nは0〜30のいずれかの整数)の塩基でよく、例えば、Aとする。)(nが4の場合の配列を配列番号54に示す。)ではじまるようにする。
2で用意した外来遺伝子を1で用意したベクター(後述の実施例2では、pGEX−4T3−PRESATベクター)とligation反応させ、大腸菌に形質転換する。形質転換した大腸菌は寒天培地には接種せず、また単コロニー化はせずに液体培地で培養を行った後、そこからプラスミド混合物を精製する。このプラスミド混合物を第二の制限酵素(後述の実施例2では、NcoI)で処理すると、外来遺伝子がベクターに逆方向で挿入されたプラスミドは、新たに出現した第二の制限酵素切断部位で切断されて開環する。一方、外来遺伝子がベクターに順方向で挿入されたプラスミドは閉環したままの状態で残る。したがって、第二の制限酵素処理したプラスミド混合物を発現用大腸菌宿主に形質転換して寒天培地に播種すると、外来遺伝子がベクターに順方向で挿入されたプラスミドを含む大腸菌のみがコロニーを形成する。その単コロニーを形成させた寒天培地のおのおののコロニーから大腸菌を採取して培養し、融合蛋白質を発現させる。発現の終えた大腸菌を集菌し、超音波などで菌体を破砕後、全菌体画分とする。また全菌体画分を遠心分離し、上清を可溶化画分とする。沈殿物を可溶化画分と同じ容量のSDSを含む緩衝液で完全に溶解し、不要化画分とする。全菌体画分のみ、または全菌体画分・可溶化画分・不要化画分のそれぞれをSDS−PAGEにより泳動し、目的融合蛋白質のバンドをゲル上で確認する。その後、該融合蛋白質のゲル上のバンドの濃度から、可溶化画分と不要化画分の比率を求め、目的融合蛋白質の溶解度の指標とする(可溶性試験)。必要ならばデンシトメトリーなどを利用してゲル上の蛋白質バンドを定量し数値化するとなおよい。
3で採用した蛋白質及び/又は蛋白質ドメイン発現ベクターを発現用大腸菌宿主に形質転換し、大腸菌を培養して、蛋白質及び/又は蛋白質ドメインを発現させる。蛋白質及び/又は蛋白質ドメイン発現ベクターが融合蛋白質発現ベクターであると、目的蛋白質及び/又は蛋白質ドメインの発現量・溶解性を検出・測定する(例えば、蛍光で検出、GSTの酵素活性を指標にした比色定量など)のが容易である点、目的蛋白質及び/又は蛋白質ドメインの精製が容易である(例えば、GSH固定化ビーズを利用した一段階の精製が可能)点、目的蛋白質の機能解析・相互作用解析のための生化学実験(例えば、BIACOREを利用した試験管内結合実験、プルダウンアッセイを利用した試験管内結合実験など)を行う際に有利である点から便利である。
pGEX−4T3ベクターに、配列番号21の配列で表されるDNAを5’リン酸化したものを用いて、site directed mutagenesis法を用いて変異を導入した。これによりpGEX−4T3がもともとの配列中に持っていたAhdI制限酵素サイトが切断されなくなる。次いで、pET32aPACAPベクターを鋳型として配列番号22及び24の配列で表されるプライマーの対でPCR反応を行った。得られたPCR産物(約500bp、二本鎖DNAの一方の鎖の配列を配列番号25に示す。)は2つのBamHI部位のそれぞれにAhdI部位が結合していた(図1)。このPCR産物をTAクローニングベクターpGEM−Tにサブクローニングして、その配列を確認した後、プラスミドを調製精製した。精製したプラスミドを制限酵素BamHIで切断し、約500baseの断片(AhdIリンカー、配列番号26及び27)を精製した。上記の変異を導入したpGEX−4T3をBamHIで開環し、脱リン酸化処理したものと、上記のAhdIリンカーをligationして、大腸菌に形質転換した。配列を確認して、正しい向きでAhdIリンカーがGST遺伝子下流に導入したものを選択した。正しい向きでAhdIリンカーがGST遺伝子下流に導入されベクター(約2マイクログラム)を、25ユニットのAhdI制限酵素で37℃で3時間処理して切断し、1%アガロースゲルを用いて精製した。Wizard SV gel/PCR clean−upシステムを用いて約5kbの開環状ベクター(pGEX−4T3−PRESAT、図1)を精製して、以下の実施例に用いた。
まず、NcoI−選択法対応のプライマーを利用して、5種類の遺伝子(ヒト・マウスのSNX15a由来及び酵母・マウス・ヒト由来のVps4bの5つのMITドメインを含む領域、配列番号28,30,32,34,36)を、同時並行でヒトマウスなどのcDNAを鋳型としてPCRで増幅した。使用したプライマー(配列番号38〜47)は、当該遺伝子のcDNAのうち蛋白質として発現を計画している領域に相補的な配列と、終止コドンの相補配列、および5’末端にNcoI選択を行うためのGG残基を含むように適宜設計したものである。すなわち、フロントプライマーは、先行するGSTと読み枠が合うように最初のアミノ酸のコドンで始まり、5’末端の塩基は5’−GGで始まってはならない。リアプライマーは当該ドメインの推定C末端境界後のストップコドンを含み、5’末端の塩基は5’−GGで始まらなければならない。そうすることによって、これらのプライマーで増幅されたPCR産物は、逆方向でpGEX−4T3−PRESATにligationしたときにのみ第二のNcoI部位が形成されることになる。この新たに生じたNcoI部位は続く選択工程に利用される。
ユビキチンと相互作用するモチーフ(UIM:ubiquitin interacting motif)を含む蛋白質断片のGST融合蛋白質発現系作製を行う際に、NcoI選択とNdeI選択とで、実施上の発現系構築の効率に違いがあるかどうか、比較実験を行った。
実施例2で作製したヒトVps4bの遺伝子を挿入されたNcoI処理によるORF選択の終了した開環状ベクター混合物約0.2μgを用いて、そのなかに出来あがっていると考えられるGST−Vps4bの発現性試験ならびに溶解度試験を短時間で行うための条件を決定した。
本発明者らが作製したベクターの名称、ベクター作製の基となった市販のプラスミドの名称、タグの名称、第一の制限酵素、第二の制限酵素、リンカーの配列及び参考文献を以下の表にまとめる。
略号
GST:glutathione−S−transferase(Schistosoma japonicum)
TRX:thioredoxine(E.coli)
His6:His−His−His−His−His−His
LBT:lanthanide binding tag
FLAG(登録商標):Asp−Tyr−Lys−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys
EGFP:enhanced green fluorescense protein(オワンクラゲ)
リンカーの配列(下線部の配列が、AhdIでの切断サイト)
I(487bp)説明:Trx遺伝子と−PACAP人工遺伝子の一部
GACCATTGGTCCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGC
GATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTG
GATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAA
CCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAAC
GGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCG
ACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGGCTAGCCATCACCACCACCACCACAG
CAGCGGCATTGACGGCCGGCATAGCGATGGCATCTTTACCGATAGCTATAGCCGCTATCGC
AAACAGATGGCGGTGAAAAAGTATCTGGCGGCGGTGCTGGGCTAATAAGACCAAATGTC(配列番号59)
II(110bp)説明:PACAP人工遺伝子
GACGGTCGGTCTAGCGATGGCATCTTTACCGATAGCTATAGCCGCTATCGCAAACAGATGGC
GGTGAAAAAGTATCTGGCGGCGGTGCTGGGCTAATAAGACCAATGGTC(配列番号60)
III(259bp)説明:ヒトユビキチン遺伝子
GACGATAAGTCTCATATGCAGATTTTCGTGAAAACCCTGACCGGCAAAACCATCACCCTGGA
AGTGGAACCGTCCGACACCATCGAAAACGTTAAAGCGAAAATCCAGGACAAAGAAGGCATC
CCGCCGGATCAGCAGCGTCTGATCTTCGCGGGCAAACAGCTGGAAGACGGCCGTACCCTG
TCCGATTACAACATCCAGAAAGAATCTACCCTGCACCTGGTGCTGCGTCTGCGTGGCGGCT
AATAGACTTAAGGTC(配列番号61)
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本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列番号1は、配列(I)の塩基配列を示す。
<配列番号2>
配列番号2は、配列(II)の塩基配列を示す。
<配列番号3>
配列番号3は、配列(III)の塩基配列を示す。
<配列番号4>
配列番号4は、配列(IV)の塩基配列を示す。
<配列番号5>
配列番号5は、配列(V)の塩基配列を示す。
<配列番号6>
配列番号6は、配列(VI)の塩基配列を示す。
<配列番号7>
配列番号7は、配列(VII)の塩基配列を示す。
<配列番号8>
配列番号8は、配列(VIII)の塩基配列を示す。
<配列番号9>
配列番号9は、配列(IX)の一例(N1が1塩基である場合)の塩基配列を示す。
<配列番号10>
配列番号10は、配列(X)の一例(N2が1塩基である場合)の塩基配列を示す。
<配列番号11>
配列番号11は、配列(XI)の一例(N1が1塩基である場合)の塩基配列を示す。
<配列番号12>
配列番号12は、配列(XII)の一例(N2が1塩基である場合)の塩基配列を示す。
<配列番号13>
配列番号13は、配列(XIII)の一例(N1が1塩基である場合)の塩基配列を示す。
<配列番号14>
配列番号14は、配列(XIV)の一例(N2が1塩基である場合)の塩基配列を示す。
<配列番号15>
配列番号15は、配列(XV)の一例(N3が1塩基である場合)の塩基配列を示す。
<配列番号16>
配列番号16は、配列(XVI)の一例(N4が1塩基である場合)の塩基配列を示す。
<配列番号17>
配列番号17は、配列(XVII)の一例(N3が1塩基である場合)の塩基配列を示す。
<配列番号18>
配列番号18は、配列(XVIII)の一例(N4が1塩基である場合)の塩基配列を示す。
<配列番号19>
配列番号19は、配列(XIX)の一例(N3が1塩基である場合)の塩基配列を示す。
<配列番号20>
配列番号20は、配列(XX)の一例(N4が1塩基である場合)の塩基配列を示す。
<配列番号21>
配列番号21は、pGEX−4T3の部位特異的変異法に用いたDNAの配列を示す。
<配列番号22>
配列番号22は、pET32aPACAPを鋳型とするPCR反応に用いたプライマー(フロント)の塩基配列を示す。
<配列番号23>
配列番号23は、pET32aPACAPを鋳型とするPCR反応に用いたプライマー(リア)の塩基配列を示す。
<配列番号24>
配列番号24は、pET32aPACAPを鋳型とするPCR反応に用いたプライマー(NcoI選択法対応のリア)の塩基配列を示す。
<配列番号25>
配列番号25は、実施例1の約500bpのPCR産物の一方のDNA鎖の塩基配列を示す。他方のDNA鎖はこれの相補鎖であった。
<配列番号26>
配列番号26は、実施例1のAhdIリンカーである二本鎖DNAの一方の鎖の塩基配列を示す。
<配列番号27>
配列番号27は、実施例1のAhdIリンカーである二本鎖DNAの他方の鎖の塩基配列を示す。
<配列番号28>
配列番号28は、PCRの鋳型となる、MITドメインを含む遺伝子(ヒトSNX15a)の約220bpの断片(コード鎖)の塩基配列を示す。プライマーにより付加される配列は含まない。
<配列番号29>
配列番号29は、PCRの鋳型となる、MITドメインを含む遺伝子(ヒトSNX15a)の約220bpの断片(コード鎖)がコードしているアミノ酸配列を示す。
<配列番号30>
配列番号30は、PCRの鋳型となる、MITドメインを含む遺伝子(マウスSNX15a)の約220bpの断片(コード鎖)の塩基配列を示す。プライマーにより付加される配列は含まない。
<配列番号31>
配列番号31は、PCRの鋳型となる、MITドメインを含む遺伝子(マウスSNX15a)の約220bpの断片(コード鎖)がコードしているアミノ酸配列を示す。
<配列番号32>
配列番号32は、PCRの鋳型となる、MITドメインを含む遺伝子(酵母Vps4)の約220bpの断片(コード鎖)の塩基配列を示す。プライマーにより付加される配列は含まない。
<配列番号33>
配列番号33は、PCRの鋳型となる、MITドメインを含む遺伝子(酵母Vps4)の約220bpの断片(コード鎖)がコードしているアミノ酸配列を示す。
<配列番号34>
配列番号34は、PCRの鋳型となる、MITドメインを含む遺伝子(ヒトVps4b)の約220bpの断片(コード鎖)の塩基配列を示す。プライマーにより付加される配列は含まない。
<配列番号35>
配列番号35は、PCRの鋳型となる、MITドメインを含む遺伝子(ヒトVps4b)の約220bpの断片(コード鎖)がコードしているアミノ酸配列を示す。
<配列番号36>
配列番号36は、PCRの鋳型となる、MITドメインを含む遺伝子(マウスVps4b)の約220bpの断片(コード鎖)の塩基配列を示す。プライマーにより付加される配列は含まない。
<配列番号37>
配列番号37は、PCRの鋳型となる、MITドメインを含む遺伝子(マウスVps4b)の約220bpの断片(コード鎖)がコードしているアミノ酸配列を示す。
<配列番号38>
配列番号38は、プライマー(HSS15F)の塩基配列を示す。
<配列番号39>
配列番号39は、プライマー(HSS15R)の塩基配列を示す。
<配列番号40>
配列番号40は、プライマー(MMS15F)の塩基配列を示す。
<配列番号41>
配列番号41は、プライマー(MMS15R)の塩基配列を示す。
<配列番号42>
配列番号42は、プライマー(ScVPS4F)の塩基配列を示す。
<配列番号43>
配列番号43は、プライマー(ScVPS4R)の塩基配列を示す。
<配列番号44>
配列番号44は、プライマー(HsVPS4F)の塩基配列を示す。
<配列番号45>
配列番号45は、プライマー(HsVPS4R)の塩基配列を示す。
<配列番号46>
配列番号46は、プライマー(MmVPS4F)の塩基配列を示す。
<配列番号47>
配列番号47は、プライマー(MmVPS4R)の塩基配列を示す。
略号 Sc:yeast Hs:human Mm:mouse:VPS4:VPS4,S15:SNX15F:FORWARD R:REVERSE
<配列番号48>
配列番号48は、プライマー(HrsF)の塩基配列を示す。
<配列番号49>
配列番号49は、NcoI選択対応のプライマー(HrsR−Nco)の塩基配列を示す。
<配列番号50>
配列番号50は、NdeI選択対応のプライマー(HrsR−Nde)の塩基配列を示す。
<配列番号51>
配列番号51は、PCRの鋳型となる、UIM配列を含むヒトHrs遺伝子の約200bpの断片(コード鎖)の塩基配列を示す。プライマーにより付加される配列は含まない。
<配列番号52>
配列番号52は、PCRの鋳型となる、UIM配列を含むヒトHrs遺伝子の約200bpの断片(コード鎖)がコードしているアミノ酸配列を示す。
<配列番号53>
配列番号53は、第一の制限酵素がAhdIであり、第二の制限酵素がNcoIである場合のORFのC末端側のプライマーの塩基配列(目的蛋白質ドメインが停止コドンを含まないとき)を示す。
<配列番号54>
配列番号54は、第一の制限酵素がAhdIであり、第二の制限酵素がNdeIである場合のORFのC末端側のプライマーの塩基配列(目的蛋白質ドメインが停止コドンを含まないとき)を示す。
<配列番号55>
配列番号55は、配列(IX)〜(XIV)におけるN1の塩基配列の一例を示す。
<配列番号56>
配列番号56は、配列(IX)〜(XIV)におけるN2の塩基配列の一例を示す。
<配列番号57>
配列番号57は、配列(XV)〜(XX)におけるN3の塩基配列の一例を示す。
<配列番号58>
配列番号58は、配列(XV)〜(XX)におけるN4の塩基配列の一例を示す。
<配列番号59>
配列番号59は、リンカーIの塩基配列を示す。
<配列番号60>
配列番号60は、リンカーIIの塩基配列を示す。
<配列番号61>
配列番号61は、リンカーIIIの塩基配列を示す。
Claims (19)
- 第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる2つの切断認識配列を持ち、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まないことを特徴とするベクターであって、前記のベクターを前記の第一の制限酵素で処理したものに順方向で挿入された場合には前記の第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には前記の第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含む外来遺伝子を前記のベクターに組み込んだ組換えベクターを宿主に導入したとき、前記の外来遺伝子が前記のベクターに順方向で挿入された組換えベクターが導入された宿主のみを選択することができ、前記の第一の制限酵素が、切断したDNAに3’突出チミン末端を生成する制限酵素である前記ベクター。
- 第一の制限酵素がAhdIまたはそのイソスキゾマー、XcmIまたはそのイソスキゾマー、およびその組み合わせからなる群より選択される請求項1記載のベクター。
- 第一の制限酵素がAhdIまたはそのイソスキゾマー、XcmIまたはそのイソスキゾマー、およびその組み合わせからなる群より選択され、第二の制限酵素が、NcoI,DsaI,EcoT14I,NdeI,SfeI,AvaI,SmlI,XhoI,PstI,EcoT22I,PshBI,AccI,ApaLI,PsiI,ScaI,SplI,Bsp1107I,Bsp1286I,BspT107I,Bsp1407I,TatI,HgiCI,KpnI,SpeI,BlnI,NheI,XbaI,SspI,EcoRVおよびそれらのイソスキゾマーからなる群より選択される請求項2記載のベクター。
- 第一の制限酵素がXcmIまたはそのイソスキゾマーであり、第二の制限酵素が、AflIII,BspLU11I,NspI,SphI,BspHI,BsaAI,PmaCI,SnaBI,NspBII、PvuII,BanII,HgiAI,SacIおよびそれらのイソスキゾマーからなる群より選択される請求項2記載のベクター。
- 第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる2つの切断認識配列がマルチクローニングサイトに挿入されている請求項1〜4のいずれかに記載のベクター。
- ベクターがある蛋白質のコード領域を含んでおり、蛋白質及び/又は蛋白質ドメインをコードする外来遺伝子を組み込んだときに、前記外来遺伝子がコードする蛋白質及び/又は蛋白質ドメインを前記領域がコードする蛋白質と結合した融合蛋白質の形態で発現することができる請求項1〜5のいずれかに記載のベクター。
- ある蛋白質のコード領域のカルボキシ末端側に、第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる2つの切断認識配列を持ち、そのうち前記蛋白質のコード領域に近い側の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、前記蛋白質のコード領域に遠い側の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まない請求項6記載のベクター。
- グルタチオンSトランスフェラーゼのコード領域を含んでおり、蛋白質及び/又は蛋白質ドメインをコードする外来遺伝子を組み込んだときに、前記外来遺伝子がコードする蛋白質及び/又は蛋白質ドメインをグルタチオンSトランスフェラーゼと結合した融合蛋白質の形態で発現することができる請求項6または7記載のベクター。
- グルタチオンSトランスフェラーゼが哺乳類、ジストマジャポニクスまたは大腸菌に由来する請求項8記載のベクター。
- 請求項1〜9のいずれかに記載のベクターを第一の制限酵素で処理することにより得られる二本鎖DNAからなる開環状ベクター。
- 請求項1記載のベクターを第一の制限酵素で処理したものに順方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含む外来遺伝子を請求項1記載のベクターに組み込んだ組換えベクター。
- 請求項1記載のベクターを第一の制限酵素で処理したものに外来遺伝子が順方向で挿入された請求項11記載の組換えベクター。
- 外来遺伝子が蛋白質及び/又は蛋白質ドメインをコードする請求項11または12記載の組換えベクター。
- 請求項11記載の組換えベクターを含む形質転換体またはその子孫。
- 第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる2つの切断認識配列であって、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まない前記の2つの切断認識配列を含む二本鎖DNAをプラスミド、ファージ、コスミド、P1ベクター、細菌人工染色体ベクターまたは酵母人工染色体ベクターのマルチクローニングサイトに導入することを含む、請求項1記載のベクターの製造方法であって、前記の第一の制限酵素が、切断したDNAに3’突出チミン末端を生成する制限酵素である前記製造方法。
- 第一の制限酵素によって認識される塩基配列の異なる2つの切断認識配列であって、そのうち一方の切断認識配列は第一の制限酵素とは異なる第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含むが、他方の切断認識配列は前記の第二の制限酵素によって認識される切断認識配列の一部を含まない前記の2つの切断認識配列を含む二本鎖DNAであって、前記の二本鎖DNAを前記の第一の制限酵素で処理したものに順方向で挿入された場合には前記の第二の制限酵素の切断認識配列が出現しないが、逆方向で挿入された場合には前記の第二の制限酵素の切断認識配列が出現するように設計された配列を含む外来遺伝子を前記の二本鎖DNAに挿入したものを組み込んだ組換えベクターを宿主に導入したとき、前記の外来遺伝子が前記の二本鎖DNAに順方向で挿入されたものを組み込んだ組換えベクターが導入された宿主のみを選択することができ、前記の第一の制限酵素が、切断したDNAに3’突出チミン末端を生成する制限酵素である前記二本鎖DNA。
- 請求項1記載のベクターを用いて、外来遺伝子がコードする蛋白質及び/又は蛋白質ドメインを製造する方法。
- 請求項1記載のベクターを用いて、外来遺伝子がベクターに逆方向で挿入された組換えベクターを開環させ、外来遺伝子がベクターに順方向で挿入された組換えベクターを閉環したままの状態で残す方法。
- 請求項1記載のベクターを用いて、外来遺伝子がコードする蛋白質及び/又は蛋白質ドメインの発現量及び/又は溶解度を試験する方法。
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