KR101153866B1 - 형질전환용 운반체, 이의 제조방법, 이를 이용한 형질전환방법 및 형질전환체 - Google Patents

형질전환용 운반체, 이의 제조방법, 이를 이용한 형질전환방법 및 형질전환체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PCR 증폭산물을 다양한 운반체에 삽입할 수 있도록 3'말단에 하나의 T염기가 돌출되도록 절단되는 적어도 하나의 제한효소 절단부위를 포함하는 형질전환용 운반체, 이의 제조방법, 이를 이용한 식물형질전환방법 및 형질전환체를 제공하며, 이러한 본 발명의 구성에 의하면 한 단계의 절차만으로 PCR 증폭 유전자의 클로닝에서 그 기능 확인까지 가능하여, 생명공학의 핵심 기반기술로서 광범위하게 활용이 가능하다.
PCR 증폭, 형질전환, 운반체

Description

형질전환용 운반체, 이의 제조방법, 이를 이용한 형질전환방법 및 형질전환체{A vector for Transformation, the preparation method thereof, method of transformation using the same, and transformant}
본 발명은 형질전환용 운반체, 이의 제조방법, 이를 이용한 형질전환방법 및 형질전환체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 한 단계의 절차만으로 PCR 증폭 유전자의 클로닝에서 그 기능 확인까지 가능하여, 생명공학의 핵심 기반기술로서 광범위하게 활용이 가능한 형질전환용 운반체, 이의 제조방법, 이를 이용한 형질전환방법 및 형질전환체에 관한 것이다.
최근 식물생명공학에서 핵산연쇄증폭반응(PCR)을 이용하여 목적 유전자를 선택적으로 증폭하여 분리하고 있다. 그러나 분리된 유전자의 기능을 최종적으로 확인하기 위해서는 분리된 유전자를 식물에 형질전환시켜 기능을 검정해야만 한다. 일반적으로 A(아데노신)염기가 돌출된 PCR 반응 산물은 Topo PCR2.1 벡터(Invitrogen, USA), pGEM-T 이지 벡터(Promega, USA) 등 상용화된 E. coli용 일 반 운반체에 1차적으로 클로닝 된다. 클로닝된 목적 유전자는 제한효소 절단부위를 맞추어 다시 식물형질전환운반체(Binary vector)에 옮기는 2차 클로닝단계를 거쳐 식물에서 기능을 검증하는 것이 일반적인 절차이다. 그러나 2차 클로닝은 목적유전자가 삽입되는 식물형질전환운반체, PCR 산물을 제공하는 일반운반체, PCR 산물이 가지고 있는 제한효소 절단부위를 면밀히 검토해야 하며, 더욱이 제한효소 절단부위가 서로 맞지 않을 경우에는 3차, 4차 클로닝으로 절단부위를 맞추어야한다. 이는 예상치 못하게 시간ㆍ절차ㆍ비용 등의 추가적 문제를 초래할 수 있다. 더욱이 이들 일반 운반체는 식물에서 기능을 검정할 수 있는 형태가 아니고 구조도 정형화 되어 있어 수요자의 요구도를 충족시키기에는 부족하다.
본 발명은 상기한 바와 같이 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 창안된 것으로, 그 목적은 한 단계의 절차만으로 PCR 증폭 유전자의 클로닝에서 그 기능 확인까지 가능하여, 시간적, 비용적, 및 절차적으로 매우 효율적이므로 생명공학의 핵심 기반기술로서 광범위하게 활용될 수 있는 형질전환 운반체 및 그 제조방법을 제공함에 있다.
상기한 바와 같은 본 발명의 기술적 과제는 다음과 같은 수단에 의해 달성되어진다.
(1) PCR 증폭산물을 삽입할 수 있도록 3'말단에 적어도 하나의 T염기가 돌출되도록 절단되는 적어도 2개의 제한효소 절단부위를 포함하는 형질전환용 운반체.
(2) 상기 제 1항에 있어서,
프로모터 부위와 터미네이터 부위 사이에 상기 PCR 증폭산물을 삽입할 수 있도록 3'말단에 하나의 T염기가 돌출되도록 절단되는 적어도 2개의 제한효소 절단부위를 포함하는 형질전환용 운반체.
(3) 상기 제 1항에 있어서,
제한효소는 Ahd Ⅰ인 것을 특징으로 하는 형질전환용 운반체.
(4) 상기 제 1항에 있어서,
제한효소에 의한 절단부위는 5'-CTTGG-3' 또는 5'-CCTGG-3'을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환용 운반체.
(5) 상기 제 1항에 있어서,
도 2의 계열지도로 표시되어지는 것을 특징으로 하는 형질전환용 운반체.
(6) 형질전환용 운반체의 제조방법에 있어서,
PCR 증폭산물을 삽입할 수 있도록 3'말단에 하나의 T염기가 돌출되도록 절단되는 적어도 2개의 제한효소 절단부위가 프로모터 부위와 터미네이터 부위 사이에 삽입된 DNA 절편을 식물형질전환용 운반체에 삽입하는 것을 특징으로 하는 형질전환용 운반체의 제조방법.
(7) 상기 제 6항에 있어서,
제한효소는 Ahd Ⅰ인 것을 특징으로 하는 식물형질전환용 운반체의 제조방법.
(8) 상기 제 6항에 있어서,
제한효소에 의한 절단부위는 5'-CTTGG-3' 또는 5'-CCTGG-3'을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환용 운반체의 제조방법.
(9) 상기 제 1항 내지 제 5항에서 선택된 어느 한 항의 운반체에 목적 유전자를 삽입하여 숙주를 형질전환하는 방법.
(10) 상기 제 1항 내지 제 5항에서 선택된 어느 한 항의 운반체를 매개하여 형질전환된 형질전환체.
본 발명에 의한 형질전환용 운반체는 한 단계의 절차만으로 PCR 증폭 유전자의 클로닝에서 그 기능 확인까지 가능하여, 시간적, 비용적, 및 절차적으로 매우 효율적이므로 생명공학의 핵심 기반기술로서 광범위하게 활용될 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명은 PCR 증폭산물을 삽입할 수 있도록 3'말단에 적어도 하나의 T염기가 돌출되도록 절단되는 적어도 하나의 제한효소 절단부위를 포함하는 형질전환용 운반체를 제공한다.
본 발명 「형질전환용 운반체」가 삽입되어지는 대상 세포는 동물 또는 식물세포 모두가 여기에 해당되어질 수 있다. 따라서, 형질전환이 될 수 있는 숙주의 범위에는 특별히 한정될 필요는 없다.
본 발명에 따른 형질전환용 운반체는 특정한 제한효소에 의해 인식되고 절단되어 3' 말단에 바람직하게는 하나의 T염기가 돌출되어지는 DNA 절편을 가진다.
본 발명에 따른 형질전환용 운반체에 포함되는 제한효소에 의한 절단부위는 적어도 1개 이상 존재할 수 있다. 예를 들어 서로 상보되는 제1가닥의 인식부위가 5'-NNAT▼NN-3'이고, 제2가닥의 인식부위가 3'-NN▼TANN-5'인 경우, 제한효소가 이 인식부위 중 각 가닥의 염기T의 3'방향 결합을 절단할 경우 두 가닥의 3'말단은 모 두 염기T로 돌출되는 구조를 갖게 된다.
만일 제한효소에 의해 절단된 두 가닥의 3' 말단 어느 하나에만 염기T가 돌출되는 경우에는 이러한 제한효소 인식부위는 적어도 2개가 요구되어진다. 예를 들어, 형질전환용 운반체의 제1가닥에 5'-CTT▼GG-3' (▼는 AhdⅠ에 의한 절단위치)를 갖는 경우, 하나의 가닥의 3' 말단에만 염기T가 돌출되어진다. 따라서, 이 경우에는 제2가닥에 3' 말단에 염기T를 제공할 수 있는 절단부위를 갖고 있을 것이 요구된다. 이때 제2가닥에 존재하는 절단부위는 제1가닥에서와 동일한 제한효소이어도 좋고, 다른 제한효소이어도 좋다.
상기 본 발명의 형질전환용 운반체에 사용될 수 있는 제한효소 절단부위는 AhdⅠ, Eam1105(AhdⅠ의 isoschizomer), BciVI, BmrI, HphI, Hpy188I, HpyCH4III, MboII 효소에 의한 절단부위(절단부위와 인지부위가 다른 경우에는 인지부위도 포함한다)를 들 수 있다. 단, 일반적으로 절단위치가 흔한 제한효소는 선택적 절단이 요구되기 때문에 사용시 주의 하여야 하며 상기 제한효소는 3'말단에 T염기를 돌출시킬 수 있다.
상기 제1가닥에 존재하는 제한효소에 의한 절단부위의 업스트림 방향(5'방향)에 형질전환의 대상이 되는 숙주세포에서 PCR 증폭산물이 발현될 수 있도록 요구되어지는 프로모터 부위가 존재하고, 제2가닥에 존재하는 제한효소에 의한 절단부위의 업스트림 방향에 터미네이터 부위를 가지는 것이 바람직하다.
이와 같이 본 발명의 바람직한 실시예로서 제시되는 형질전환용 운반체는 상 기 프로모터 부위-제한효소에 의한 절단부위-터미네이터 부위를 포함하는 DNA 절편을 포함하여, 제한효소를 이용하여 형질전환용 운반체를 절단하고, 절단된 부위에 내에 PCR 증폭산물을 직접 삽입하고, 이와 함께 숙주세포내에서 당해 증폭산물을 발현시킬 수 있어 그 기능까지 확인이 가능하다.
이러한 DNA 절편은 형질전환의 대상이 되는 각 숙주세포에 사용되어질 수 있는 어떠한 형질전환 운반체도 포함될 수 있다. 일반적으로 시판되고 있는 형질전환용 운반체의 경우 각 숙주세포에 적합한 프로모터 부위와 터미네이터 부위를 갖고 있으므로, 이들을 그대로 이용할 수 있다. 예를 들어 칼리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 슈가케인 바실리폼 바이러스 프로모터, 코메리나 옐로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제의 소단위(ssRUBISCO)로부터의 빛-유도성 프로모터, 쌀 사이토졸릭 트리오세포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스(Arabidopsis)로부터의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터, 쌀 액틴 1 유전자 프로모터, 알파-아밀라제 3D 프로모터 (alpha-amylase, 3D promoter), 글로부린 프로모터, 글루테린 A 또는 B 프로모터, 만노핀 신타아제 및 옥토핀 신타아제 프로모터와 같은 다양한 프로모터가 사용될 수 있다.
이 경우 상기 제한효소에 의한 절단부위를 포함하는 DNA 절편을 선택된 형질전환 운반체의 프로모터 부위와 터미네이터 부위의 사이에 도입하면 된다. 이러한 DNA 절편의 도입과정은 이미 절단부위가 잘 알려진 제한효소와 DNA 리가제(ligase)를 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 DNA 절편을 포함하도록 양측을 EcoR Ⅰ으로 절단하고, EcoRⅠ 절단부위를 프로모터와 터미테이터 사이에 갖는 형질전환용 운반체에 동 제한효소를 가하여 절단 한 후 상기 DNA 절편을 삽입하여 얻을 수 있다.
별도의 프로모터 부위와 터미네이터 부위를 포함하는 DNA 절편을 상기 형질전환용 운반체에 도입하여도 좋다. 예를 들어, 프로모터 부위의 업스트림 방향과 터미네이터 부위의 다운스트림 방향에 각각 EcoRⅠ의 절단부위를 갖는 DNA 절편을 동일한 제한효소로 절단된 형질전환용 운반체에 삽입하여 얻어도 좋다.
상기 본 발명에 따른 형질전환용 운반체를 식물에 도입하는 방법으로는 당분야에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 식물형질전환의 경우 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움 속 (Agrobacterium sp.) 미생물을 이용한 형질전환, 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리 (sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG (Polyethylenglyco l)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 아그로박테리움-매개 형질전환법을 이용할 수 있으며, 문헌에 예시된 방법을 사용할 수 있다 (Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985). 아그로박테리움-매개 형질전환법에 사용될 수 있는 아그로박테리움은 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefacience) 또는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 등이 사용된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것 은 아니다.
<실시예 1> PCR 산물 클로닝을 위한 T(티민) 염기 돌출형 부위 DNA 제작
T염기 돌출구조 DNA 부위를 제작하기 위하여 3'-말단에 한개의 염기만 돌출시키는 제한효소인 AhdI(5'-GAC NNN▼NN GTC-3')을 이용하였다. 절단부위 3'-말단에 T염기를 돌출시키기 위해 NNN▼NN염기를 CTT▼GG로 교체하여(5'-GAC CTT▼GG GTC-3')의 구조로 작성하였다(도 1 참조). PCR 증폭 유전자는 3'-양말단이 A염기 돌출형으로 생성되기 때문에 삽입되는 부위도 T염기 돌출형이 되어야 한다. 이를 위해 Junk-DNA(2?3kb 정도)의 양말단에 AhdI 절단부위를 삽입하면(도 1의 A), AhdI 절단시 Junk-DNA가 빠져나오면서 3'-말단에는 T염기로 돌출된 구조가 된다(도 1의 B). 본 발명에서 Junk-DNA의 예로는 35S-GUS 카세트를(?2.5 kb)를 사용하였다. 즉 AhdI-GUS 카세트-AhdI의 구조는 GUS 카세트에 PCR 프라이머(서열번호 1: 5'-GAC CTT GGG TCG ATA TCG TAC CCC TAC TC-3', 서열번호 2: 5'-AG GTC ATG ATT TTA GGT CCT GGG TCC CAG-3', 밑줄은 제한효소(AhdI) 인식부위)를 첨가하여 PCR로 합성하였고 합성된 PCR 산물(AhdI-GUS 카세트-AhdI)은 일반 PCR 클로닝 운반체에 1차적으로 삽입하였다.
<실시예 2> 맞춤형 식물형질전환벡터에 T염기 돌출부위 삽입
일반 PCR 산물 클노닝운반체(Topo PCR2.1 vector, Invitrogen)에 삽입된 AhdI-Junk DNA-AhdI DNA절편을 제한효소인 EcoRI로 절단하고, 식물형질전환운반체에 삽입하였다(도 2의 A). 본 발명에서는 pGreen0229-35S를 식물형질전환운반체로 이용하였으며 35S 프로모터 뒤에 EcoRI 절단부위가 존재하여 삽입된 AhdI-Junk DNA-AhdI DNA절편을 AhdI으로 절단시키고(도 1의 C 및 도 2의 B), PCR 증폭된 유전자를 삽입시키면 바로 식물형질전환운반체에 35S 프로모터에 의해 삽입된 유전자를 식물체내에서 발현시킬 수 있다(도 2의 C). 즉 제한효소인 AhdI 절단부위를 T염기가 돌출되도록 염기를 변경하고 수요자의 식물형질전환운반체에 삽입하면 간단히 AhdI으로 절단하는 것만으로도 PCR 증폭된 유전자를 식물형질전환운반체에 바로 삽입할 수 있는 맞춤형 운반체를 제작할 수 있다.
<실시예 3> PCR 증폭유전자 삽입에 의한 맞춤형 운반체 성능검정
GFP유전자(Green fluorescent protein)의 PCR산물(?1.4kb)을 AhdI으로 절단한 식물형질전환 맞춤형운반체(pGreen0229-35S, AhdI-Junk DNA-AhdI 함유)에 삽입시켰다. 삽입조건은 T4 DNA 리가아제(New England BioLabs, UK)의 프로토콜에 따라 16 ℃에서 16시간 반응시켰다. 반응후 CaCl2 방법으로 E. coli DH5α competent cell에 식물형질전환운반체를 도입시켰다. 도입된 E. coli는 고체 LB배지(50 ㎍/mL)에서 37 ℃, 14시간 배양하여 생성된 E. coli 콜로니를 대상으로 목적하는 PCR 증폭 유전자(GFP유전자)가 삽입된 식물형질전환운반체를 선별하였다. 선별방법은 PCR premix(Bioneer K-2016, 한국)를 이용하여 콜로니 PCR 방법으로 PCR산물이 삽 입된 E. coli 콜로니를 확인하였다. 콜로니 PCR시 프라이머는 35S 프로모터와 터미네이터 부위 염기서열을 이용하여 설계 하였으며(서열번호 3: 5'-TCATCGAAAGGACAGTAGAAAAG-3', 서열번호 4: 5'-GCGAAACCCTATAAGAACCCTAAT-3'), PCR 증폭 유전자(GFP유전자)가 삽입되지 않은 경우에는 35S 프로모터와 터미네이터의 일부분이 증폭되어 ?0.5kb의 DNA절편이 나타나지만, GFP유전자(1.4kb)가 삽입되면 ?1.9kb로 크기가 증가되게 되어(도 3의 A), AhdI-Junk DNA-AhdI를 이용한 맞춤형 식물형질전환운반체의 성능이 검정되었다(도 3의 B).
<실시예 4> 식물에서 맞춤형운반체의 완성도 검정
식물형질전환운반체에 삽입된 GFP유전자는 정방향과 역방향이 각각 50 : 50 확률로 삽입되는데, 정방향으로 삽입된 재조합운반체만을 추가적인 제한효소절단으로 선별할 수 있으며 이는 상품화된 벡터와 동일한 조건이다. 정방향으로 삽입된 GFP유전자 함유 식물형질전환운반체를 바로 아그로박테리움(Agrobacterium)에 도입하여 담배잎에 주입하면 본 발명에서 개발한 맞춤형 운반체에 삽입된 PCR 증폭 유전자의 기능을 확인할 수 있다. 담배잎에 아그로 인필트레이션(Agro-infiltration)하는 방법은 본 발명자에 의해 개발된 방법(국내특허등록 : 제10-0679715호, 2007 참조)을 사용하였다. 식물형질전환운반체(GFP유전자 삽입)를 함유한 아그로박테리움 투메파시엔스 AGL-1(Agrobacterium tumefaciens strain AGL-1)을 50 ug/ mL 카나마이신, 50 ug/mL 암피실린, 5 ug/mL 테트라사이클린, 0.02 mM 아세토시린곤(acetosyringone)이 포함된 LB 브로스로 29 ℃ shaking incubator에서 배양한 후, 배양액을 원심분리 (5000 gx 5 min)하여 아그로박테리움을 침전시킨 후 펠렛을 10 mM MgCl2, 0.1 mM 아세토시린곤 용액에 재현탁 한 후 농도를 조정하고 (OD600 = 0.2) 얼음에 2 시간 동안 방치하여 아그로박테리움을 준비하였다. 유전자 기능을 확인하기 위한 아그로 인필트레이션은 파종 후 3-4 주 지난 담배의 잎 뒷면에 1 mL 시린지를 사용해 기공을 통해 아그로박테리움을 주입하였다. 아그로박테리움에 의해 형질전환된 조직은 자외선(365 nm)에 의하여 GFP에 의한 녹색형광을 나타냄을 확인하였다(도 4 참조). 이와 같은 결과는 PCR 증폭 유전자를 클로닝하고 수요자의 용도에 부합될 수 있도록 설계한 맞춤형 운반체가 성공적으로 제작될 수 있음을 증명한 결과로 인정된다.
상기와 같이, 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
도 1은 형질전환용 운반체에 T염기 돌출구조를 생성하는 과정을 보여주는 예시도.
(A, AhdI 절단부위를 가진 Junk-DNA가 삽입된 운반체; B, AhdI 절단시 T염기 돌출 모식도; C, AhdI으로 절단 후 운반체와 Junk-DNA의 전기영동 결과; L, DNA 크기마커; V, AhdI으로 절단된 운반체)
도 2는 본 발명에 따라 PCR 증폭 유전자를 삽입할 수 있도록 고안된 형질전환용 운반체의 예시도.
도 3은 본 발명에 따라 제작된 형질전환용 운반체에 삽입된 PCR 증폭 유전자의 확인실험결과.
(GFP 마커유전자가 삽입된 운반체는 *로 표시)
도 4는 본 발명에 따라 제작된 형질전환운반체에 삽입된 PCR 증폭 GFP유전자의 식물내 발현분석결과.
(독립적으로 GFP 유전자가 도입된 6종의 식물형질전환운반체를 가진 아그로박테리움을 아그로 인필트레이션 후 자연광에서의 담배(A), 자외선(365 nm)에서 GFP 발현(B); 화살표는 GFP 발현부위; CON-1 및 2, 대조담배)
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> A vector for Transformation, the preparation method thereof, method of transformation using the same, and transformant <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 gaccttgggt cgatatcgta cccctactc 29 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 aggtcatgat tttaggtcct gggtcccag 29 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 tcatcgaaag gacagtagaa aag 23 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 gcgaaaccct ataagaaccc taat 24

Claims (10)

  1. 도 2의 계열지도로 표시되어지며, 35S프로모터 부위와 35S 터미네이터 부위 사이에 PCR 증폭산물을 삽입할 수 있도록 3‘말단에 적어도 하나의 T염기가 돌출되도록 절단되는 2개의 동일한 제한효소 절단부위로 5'-CTTGG-3' 또는 5'-CCTGG-3'을 포함하며, 상기 제한효소는 AhdⅠ, Eam1105, BciVI, BmrI, HphI, Hpy188I, HpyCH4III, 및 MboII 효소의 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 운반체.
  2. 삭제
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KR20010069239A (ko) * 2000-08-30 2001-07-25 이광희 녹색 형광 단백질을 표지인자로 하는 티-벡터 및 그제조방법
US20040241672A1 (en) 2001-01-25 2004-12-02 Neil Goldsmith Library of a collection of cells
KR20060125694A (ko) * 2003-09-01 2006-12-06 고리츠다이가쿠호진 요코하마시리츠다이가쿠 신규 벡터 및 그 이용

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Plant Pathology Journal, 2008, Vol. 24, No. 3, pp. 296-304 *
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