JP4465276B2 - アスパラギニルヒドロキシラーゼ及びその修飾物質 - Google Patents
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Description
化学実体を同定、スクリーニング、特性決定、設計又は改変するための、FIHを含有する結晶をX線回折測定に掛け、その回折測定から構造座標を推測することにより得られた構造座標の使用;
FIHのアスパラギニルヒドロキシラーゼ活性を阻害する、本発明の方法により同定された化学実体;及び
治療法で使用するための本発明の化学実体
を提供する。
結晶学的不斉単位は、1個のFIH分子を含有する。しかしながら、結晶学的対称性の分析により、FIHの二量体形態が明らかになり、これは、本来のゲル電気泳動分析と一致した。二量体界面は、主に疎水性相互作用を伴うインターロック配置で各分子の2個のC末端らせんを伴う。この珍しい界面は、このサイズの他の二量体タンパク質に比較して、平均して広い3210Å2の表面積を占めている。二量化阻害剤には、Leu−340及びIle−344などの330〜346から選択される残基を含む二量化界面を形成する残基に結合するものが含まれる。阻害剤には、二量化界面に関与するFIH残基の全部又は一部に対応するペプチド又はペプチド模倣物質が含まれる。
構造研究により、FIH及びおそらく関連するHIFヒドロキシラーゼの活性部位にFe(II)が存在することが判明している。この鉄は、大抵八面体で、His199、Asp201及びHis279の側鎖、2OGの2−オキソ及び1−カルボキシレート基により結合している。酵素−基質複合体では、His279の反対側に空の位置があり、これにより、この酵素は、二酸素結合のためにプライミングされていることが分かる。His279の反対側のリガンドの適応は、Asp201とCAD Asn803との水素結合の破壊を必要とすることがある(鉄及びAsn803β−炭素は、約4.9Åしか離れていない)。2OGの後続の脱炭酸反応はおそらく、鉄−オキソ種[Fe(IV)=O<−>Fe(III)−O・]をもたらし、これは、HIFのC末端トランス活性化領域(CAD)でのAsn−803の炭素での酸化をもたらす。
NOGを伴うFIH:CAD構造は、2OGのように、二座で鉄に配位されることを示し、鉄結合過酸化物(スーパーオキシド)中間体によるか、金属への二酸素の結合を妨害することによる攻撃に対して感受性が低いことにより、阻害剤であることを示している。
のものが含まれる
[式中、
R’及びR”はそれぞれ同一又は異なって、H、F或いはC1からC3アルキル若しくは置換アルキル、CH2OH、CH2CO2H又はCONH2であり、Xは、COOH、SOOH若しくはCONHH又はそのエステル又は複素環であるか、或いはLys−214、Thr−196及びTyr−145、即ち、結晶学的分析で判明したように、2OGの5−カルボキシレートの結合に関与する残基の1つ又は複数の側鎖と好ましい相互作用をもたらす他の基であり、
Yは、−(CR’’’R’’’)nZであり、Zは、
−NR’’’COCOOH、−NR’’’CSCOOH、−NR’’’COCOSH、−CHSR’’’CONR’’’R’’’’、−CHOR’’’CONR’’’OR’’’、−CHSR’’’CONR’’’OR’’’又は−CHOR’’’CONR’’’NR’’’OR’’’であり、R’’’はそれぞれ同一又は異なって、H、アルキル、OH又はO−アルキルであり、nは、0〜3であり、好ましくは0である]。
[式中、R’’’’は、OH、OR’’’又はNHCOR’’’であり、Wは、S、NH又はOである]。
2つの結合部位が存在
ES複合体構造によって、それぞれ1640Å2及び1080Å2の接触表面積を有するCAD795−806(即ち、HIFのC末端トランス活性領域の残基795〜806)(サイト1)及びHIFのCAD813−822(サイト2)を含む2つの別々の結合部位が予期せず判明した(例は、図参照)。これらの領域のCAD残基は、全ての既知のHIF−1α及びHIF−2α配列に保存されている。サイト1での電子密度は、性質が良好であり、Tyr798の側鎖でのみ、乏しいと定義される一方で、サイト2では、より低いレベル及び性質で、これはおそらく、このサイトでの弱い結合を反映している。密度が観察されなかったCAD804−806及びおそらくCAD807−811も、FIHとは直接的な相互作用を生じない。サイト1及びサイト2の相対的重要性を調べるために使用された反応速度分析により、サイト1のみを含有する断片はFIHにより水酸化されるが、両方のサイトを含有するものよりも効率的でないことが判明し、これは、結合の際には両方が重要であり、両方を阻害研究で利用することができることを証明している。
の化合物が含まれる
[式中、R1は、Gln−237及び又はArg−238と静電又はH−結合相互作用を生じうるもの、好ましくは、CR8R9CONH2又はその類似体であり(式中、R8は、水素又はペプチド又はペプチド模倣物質(β−アミノ酸又はペプチドイソター(isotere)からなるものなど)であり、R9は、水素、官能化されていてもよいアルキル、官能化されていてもよいアリール、ヘテロアリール又はCH2CONH2などのこれらの組合せである)、R2は、水素又はFIHのTyr−102と有利に相互作用する基であり、R3は、H又はAsp−201とH−結合を生じうる基であり、Z1は、>C=O又は>CR5R9であり(式中、R5は、水素、官能化されていてもよいアルキル、アリール又はへテロアリール或いはこれらの組合せである)、R12は、R5と同様に定義されるか、又はNHR6であり(式中、R6は、COR5又はSO2R5である)、X1は、NR4、NR4C(R5)2、C(R5)2NR4或いはO又はNHである(式中、R4は、COR5又はSO2R5である)]。この式又は他の式では、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11及びR12はそれぞれ、同じか、異なってよい。特に、これらの化合物は、式:
のいずれかであってよい
[式中、基は前記と同様に定義され、R7及びR8は独立に、β−アミノ酸残基、ウレタン、スルホンアミド又はホスホンアミド結合を含有するか、それからなるもののようなペプチド又はペプチド模倣物質又は部分ペプチド模倣物質である]。
を有するものである
[式中、R1、R2、R5及びR9は前記と同様に定義され、Dは、S、O、NH又はCHR9=CHR9である]。したがって、6員環に結合している環は、5員複素環又はアリール環である。
場合によっては二基質阻害剤とも称される、複数の基質又は補助基質結合部位での結合と拮抗する酵素阻害剤が有用であることは、よく知られている。例は、Wangら、BIOCHEMISTRY−US:15676−15683 2001年;及びLernerら、ANGEW CHEM INT EDIT40、4040−4041、2001年に見ることができる。
これらは、前記式(II)〜(IV)の化合物であるが、但し、これらは、結晶学情報により定義されるような2OG結合ポケットにも結合しうるように改変されている。したがって、R2又はR1が、2OG結合ポケットに結合しうるように改変されている。この改変は、R1又はR2の一般式がA−X(式中、Xは、前記と同様に定義され、Aは、Xを(II)に結合する)であるような形態である。Aは、2OG結合部位を利用する表題の阻害剤下に、Xが式I、前記2OGのカルボキシレートの残基に結合しうるような適切な長さを有する。
X[B]−[C]
を有してよい[式中、Xは、前記と同様に定義され、Bは、リンカー基であり、Cは、FIHのCAD結合部位の一部に結合する単位、一般的にCONH2である]。
別の群の阻害剤は、酵素−基質複合体、即ちFIH.Fe(II).HIF(CAD)に結合する。構造分析により、このような阻害剤を同定することができる。前記ように、2OG及びCAD結合部位は、FIH.Fe.2OG/NOG.HIF(CAD)複合体中の2OG(又はNOG)の2−オキソ基からAsn−803のβ−炭素へと延びる「チャネル」を介して相互に結合する。
他の群の阻害剤は、触媒サイクルの一部を受けうるが、中間体段階で停止するか、損傷又は抑制をもたらす異常反応を惹起することができる基質類似体をベースとしている。FIHは、β位でAsn−803の水酸化を触媒するという観察と、構造分析とにより、このような阻害剤を設計することができる。このような化合物には、Asn−803がβ−フルオロ−アスパラギン、β−ジ−フルオロアスパラギン、β−メチル−アスパラギン、β−ジメチル−アスパラギン誘導体などの酸化を受けない類似体に置換されている基質の類似体(阻害剤)が含まれる。或いは、酸化を受けて、酸化されてエポキシド又は金属キレート化基などの不活性化基をもたらす薬剤をもたらす誘導体を調製することもできる(このようなメカニズムをベースとする阻害剤は時たま、自殺阻害剤と称される)。FIHの場合には、これらには、α−β−デヒドロアスパラギン及びβ−メチレンアスパラギンが含まれる。
を有する化合物が含まれる
[式中、Xは、バリン残基又はその類似体を表し、Yは、アラニン残基又はその類似体を表し、R10は、フッ素又はC1〜C3アルキル、特にメチルであり、R11は、フッ素、C1〜C3アルキル又は水素であり、即ち、前記残基は、β−モノ−若しくはジ−フルオロアスパラギン又はβ−モノ−若しくはジ−メチルアスパラギンである]。
本発明のアッセイは、HIFアスパラギンヒドロキシラーゼの基質、特に酵素のアスパラギン含有基質を使用することができる。特に、HIFアスパラギンヒドロキシラーゼ活性の修飾物質の活性を監視するためのアッセイで、このような基質を使用することができる。基質は、HIFポリペプチド又はそのペプチド類似体であってよい。通常は、HIFポリペプチドが基質として使用される。
本発明は、低酸素誘導因子のアスパラギン水酸化の修飾物質として同定される薬剤に関するアッセイ方法を提供する。この方法は、試験基質の不在下にアスパラギン水酸化が生じる条件下に、ヒドロキシラーゼの基質の存在下に、HIFアスパラギンヒドロキシラーゼと試験物質とを接触させ、基質のアスパラギン水酸化を定量することを含む。別のアッセイでは、試験基質の不在下では水酸化が生じない条件下に、ヒドロキシラーゼの基質の存在下に、HIFアスパラギンヒドロキシラーゼと試験物質とを接触させる。アスパラギン水酸化の定量を監視して、その薬剤がアスパラギンヒドロキシラーゼのプロモーターとして活性に作用するかどうかを同定する。
本発明のスクリーニング又はアッセイ法の正確なフォーマットは、当技術分野の専門家であれば、通常の技術及び知識を使用して変更することができる。専門家であれば、適切な制御実験を付加的に使用する必要性がよく分かるであろう。本発明のアッセイは、適切な基質のアスパラギン水酸化を監視すること、基質及び補基質の利用を監視すること、酵素とその基質との間で予測された生成物の産生を監視することを必要とし得る。本発明のアッセイ方法は、系の成分間の直接的な相互作用をスクリーニングすることを必要とすることもある。或いは、適切なリポーター構成を使用して、又はHIFにより直接若しくは間接に調節されることが知られている遺伝子のアップレギュレーション又は遺伝子の発現パターンの変化を監視することにより、p300によるHIFの結合などのダウンストリーム効果及びHIF仲介転写などのHIFにより仲介されるダウンストリーム効果を監視するアッセイを実施することもできる。
in vivoで行われる細胞ベース、臓器ベース又は全動物アッセイを使用して、アッセイを実施することもできる。このようなアッセイは、HIFヒドロキシラーゼヌクレオチド及び/又はポリペプチドの内生発現を利用することができる。本発明の他の形態では、特異的な内生HIFヒドロキシラーゼのアップレギュレーションを、その発現の刺激物質により達成することができる。このような刺激物質は、特異的なHIFアスパラギンヒドロキシラーゼをアップレギュレーションする成長因子又は化学物質であってよい。アッセイの他の形態では、ヌクレオチド構成物を細胞又はトランスジェニック動物に導入して、1種又は複数の特異的HIFアスパラギンヒドロキシラーゼの産生を増大させることができる。
単一のターゲットとして、又は選択されたヒドロキシラーゼ群で、さらにはファミリー全体で、HIFアスパラギンヒドロキシナーゼの選択性を調節することも有利である。したがって、HIFアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を調節する薬剤は好ましくは、特異的である。即ち、これらは、他の2OG依存性オキシゲナーゼに対してよりも、HIFアスパラギンヒドロキシラーゼに対して高いか強い作用を有する。
HIFアスパラギンヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ活性に影響を及ぼしうることが判明している化合物、物質又は薬剤、或いはFIH阻害剤と本願明細書で称されている化合物は、多くの状況で治療的及びその他の可能性を有する。治療処置では、このような化合物を、他の活性な物質と組み合わせて、例えば、抗腫瘍治療では他の抗腫瘍化合物若しくは放射線療法又は化学療法などの治療と組み合わせて使用することができる。
本発明はさらに、本発明の方法により得られたか、同定された化合物及び、この化合物が薬学的に許容できる担体又は希釈剤と混合されている薬剤組成物などの前記化合物を含有する組成物を提供する。担体は、液体、例えば、生理食塩水、エタノール、グリセリン及びこれらの混合物又は固体、例えば、錠剤の形態で、又はデポー処方物として処方されたゲルなどの半固体形態で、又は経皮パッチなどの経皮投与可能なビヒクルであってよい。
(i) 虚血状態、例えば、冠状、脳血管及び末梢血管不全を含む臓器虚血。治療を2つの方法で適用することができる;明らかな組織損傷、例えば、心筋梗塞の後に(組織損傷を限るために)、又は虚血を予防するために、例えば、アンギナを治療する際に冠状側枝を促進するために予防的に。
(ii) 創傷治癒及び臓器再生。
(iii) 自己−、同種及び異種移植。
(iv) 全身血圧。
(v) 癌;HIFαは普通、腫瘍細胞ではアップレギュレーションされ、腫瘍成長及び血管形成に主な作用を有する。
(vi) 炎症性疾患。
(vii) 肺動脈圧、神経変性疾患。
(a) 非細胞自律:細胞は、他の細胞にシグナルを送る物質の産生に影響を及ぼすためにHIF系を使用する。これらのシグナルは、(i)遠隔部位で(例えば、エリスロポイエチンは骨髄に作用する)又は(ii)局所で(血管由来成長因子は、血管の局所形成を増大する)作用を有しうる。したがって、ヒドロキシラーゼ活性を調節することを介しての非細胞自律行動の操作は、貧血並びに例えば眼、脳、心臓及び肢での局所虚血の治療で役立つ。生理的安定性の態様に関与する多くの他のシグナルは、HIF活性化により調節されうるか、調節されることが知られている。したがって、HIFプロリルヒドロキシラーゼ活性の調節を使用して、治療効果に対して有用な応答を強化又は開始するか、有害な応答を予防又は緩和することができる。例えば、この手法を使用して、食欲或いは全身又は肺床での血圧を変更することができる。
様々な他の態様では、本発明は、HIFアスパラギンヒドロキシラーゼ阻害剤を含む1種又は複数の前記薬剤、化合物又は物質或いは1種又は複数の式(A)から(F)の化合物又はその誘導体を含有する本明細書に記載の、このような目的のための薬剤組成物、薬剤、薬物又は他の組成物、医学的治療法でのこのような組成物の使用、例えば、前記ような医学的状態を治療(予防的治療も含んでよい)するためにこのような組成物を患者に投与することを含む方法、このような目的で、例えば、前記ような状態を治療するために投与するための組成物、薬剤又は薬物を製造する際のこのような薬剤化合物又は物質の使用、並びにこのような薬剤、化合物又は物質と薬学的に許容できる賦形剤、ビヒクル又は担体及び場合によって他の成分とを混合することを含む薬剤組成物を製造する方法を提供する。
(a) 本発明に従い薬剤を同定すること;及び
(b) こうして同定された薬剤を薬学的に許容できる賦形剤と処方すること
を含む。
タンパク質発現、精製及び結晶化
FIH、CAD775−826及びCAD786−826を記載されているように調製した(Hewitsonら、J BIOL CHEM 277(29):26351−26355、2002年)。代謝阻害プロトコル及びL−セレノメチオニン50mg/lを補足されているLeMaster培地を使用して、セレノメチオニン(SeMet)置換されているFIHを製造した。SeMet導入は、ESI−MSによると>95%であった。SeMet FIHの好気性結晶化(11mg ml−1で)を懸滴蒸気拡散により17℃で達成した。母液は、1.2Mの硫酸アンモニウム、4%のPEG400及び0.1MのHepes pH7.5からなった。Belle Technologyグローブボックス中、アルゴンの嫌気性雰囲気下(O20.3〜0.4ppm)に、FIH(11mg ml−1で)、Fe2+(1mM)、2OG/NOG(2mM)及びCAD断片(1mM)を含有する同じ母液及び溶液を使用して、FIH:Fe:CAD断片複合体の結晶化を行った。FIH:Zn:CAD断片の結晶化を、同じ条件下に好気性で行った。ペプチドを、固相ペプチド合成により合成するか、Biopeptide Co.(サンディエゴ、米国)から購入した。
液体窒素に入れて結晶を冷凍し、窒素流を使用して100KでX線データを集めた。1.2Mの硫酸アンモニウム、3%のPEG400、0.1MのHepes(pH7.5)及び10%、続いて24%のグリセリンを含有する溶液に連続して移すことにより、凍結保護を行った。三波長多重異常分散(MAD)データセットを、Synchrotron Radiation Source,Daresbury,U.K.のビームライン14.2で2.9Å分解能まで集めた。FIH:CAD複合体の結晶からのデータを、ADSC Quantum4(14.2及び9.6)又はMarCCD検出器(9.5)を使用して、ビームライン14.2、9.6又は9.5で集めた。全てのデータを、プログラムMOSFLM及びCCP4スートを使用して処理した[Collaborative Computational Project Number 4 Acta Crystallogr.D50,760〜763(1994年)]。結晶は、スペース群P41212に該当した。6個のセレニウム位を定め、プログラムSOLVEを使用して相を算出した(Terwilligerら、D55、849〜861、1999年)。RESOLVEを使用して、0.56から0.66へとメリットの数値を高める密度改変を行った(Terwilliger Acta Crystallogr.D56、965〜972、2000)。
FIHの核は、8本のβ鎖、β8〜β11及びβ14〜β17から生じる二本鎖βらせん(DSBH又はジェリーロール)モチーフを含む。残基220〜259は、DSBHの鎖4及び5の間の挿入物を形成する。DSBHの底面は、N−末端領域からの付加的な4本のβ鎖と並んで、8員の逆平行βシートを形成する。N−末端鎖β1は、活性部位とは逆のDSBHの面を二分する。このβ1鎖は、β14とβ2とのその相互作用の間に、PXXP配列に位置する360°ねじれを有する。同様に位置するβ鎖は、常にタンパク質の同じ領域からではないが、大抵の2OGオキシゲナーゼに存在する。β1、α1及びβ2により生じるシート−らせん−シートモチーフは、プロリン3−ヒドロキシラーゼを除くこの群の全ての酵素で保存されており、この領域の同様のフォールドが、関連するCu(II)利用クエルセチン2,3−ジオキシゲナーゼ(QD)で判明している(Fusettiら、STRUCTURE10(2):259〜268、2002年)。FIHのトポロジーにより明白に、これは、既にQD及びMn(II)利用タイプIIホスホマンノースイソメラーゼを包含するクピン(cupin)構造ファミリーの鉄結合員と定義される(Clissold,P.M.,及びPonting,C.P.(2001年)Trends Biochem.Sci.26,79)。
FIHは、jumonji転写因子のJmjCホモロジー領域と著しい配列相似性を有する(Clissold,P.M.,及びPonting,C.P.(2001年)Trends Biochem.Sci.26,79;Hewitsonら、J BIOL CHEM277(29):26351−26355、2002年)。これらのタンパク質は、クピン構造スーパーファミリーのメンバーであり、細胞成長及び心臓の発達に関している。2OGオキシゲナーゼ鉄結合残基は、幾つかのJmjC領域に同定されるが、鉄結合モチーフとしては指定されていない。FIH構造に関する配列探索により、このモチーフと、2OGの5−カルボキシレートの結合に著しく関与するFIH残基Lys214及びThr196との両方を含有する保存残基を有する多くのJmjCタンパク質が明らかになる。こうして、構造によって、FIHは、転写の調節に関与する鉄及び2OG依存性オキシゲナーゼの大きなファミリーのうちの1つであることが明らかになる。FIH以外の指定されたJmjC領域のうちの幾つかは、疾患及び特定の表現型に随伴するので、その(例えば)阻害は、治療的に有効でありうる(例えば、Huら、ONCOGENE 20(47):6946〜6954OCT18 2001年及びClissold,P.M.,及びPonting,C.P.(2001年)Trends Biochem.Sci.26,79及びその参照文献参照)。
Claims (6)
- HIF阻害因子(FIH)に結合する化学実体を同定、スクリーニング、特性決定又は設計する方法であって、該方法はFIHの構造モデルと、前記化学実体の構造モデルとを比較することを含み、FIHの前記構造モデルは、表3に示される構造因子又は構造座標に由来する、上記方法。
- HIF阻害因子(FIH)に結合する化学実体を同定、スクリーニング、特性決定、設計又は改変するための、請求項1に記載の表3に示されるFIHの構造座標の使用。
- 前記化学実体は、FIHのアスパラギニルヒドロキシラーゼ活性を阻害するために選択されている、請求項1又は2のいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 前記化学実体は、Leu−186、Leu−188、Thr−196、Phe−207及びIle−281から選択されるポリペプチドの一つ以上のアミノ酸残基の側鎖のいずれか又は全てと疎水性相互作用を形成する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 前記化学実体は、Tyr145、Thr196及びLys214から選択されるポリペプチドの一つ以上のアミノ酸残基と静電又は水素結合相互作用を形成する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 前記化学実体を、HIFと、及びFIHと接触させ、アスパラギン803の水酸化を監視することをさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法又は使用。
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