JP4460663B2 - ヒアルロン酸ゲルスラリー及びその用途 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒアルロン酸単独で形成されたゲルを含有するヒアルロン酸ゲルスラリーに関し、特にそれらの医用材料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸は、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとβ−Ｄ−グルクロン酸が交互に結合した直鎖状の高分子多糖である。ヒアルロン酸は哺乳動物の結合組織に分布するほか、ニワトリのとさか、連鎖球菌の夾膜などにも存在が知られている。ニワトリのとさか、臍帯等が抽出材料として用いられているほか、連鎖球菌の培養物からも精製物が調整されている。
ヒアルロン酸は、種及び臓器特異性をもたず、生体に移植または注入した場合であっても優れた生体適合性を示すことが知られている。
【０００３】
さらに、生体に適用する場合のヒアルロン酸自体の易水溶性に由来する短所、例えば、生体内滞留時間が比較的短いことなどから、多種多様なヒアルロン酸の化学修飾物も提案されている（米国特許第４，５８２，８６５号明細書、特公平６−３７５７５号公報、特開平７−９７４０１号公報、特開昭６０−１３０６０１号公報、特開平３−１０５００３号、欧州特許０３４１７４５Ａ１、特開平６−７３１０３号公報参照）。
【０００４】
ヒアルロン酸は、極めて高い粘ちょう性と保湿性を有し、本質的に抗原性が無く生体適合性が高いため、変形性膝関節症の治療薬や眼科手術補助剤等に用いられている。
また、ヒアルロン酸溶液そのものを手術後の癒着防止材として用いることも検討されているが、生体内での貯留性が比較的短いので効果が弱く、水溶性のため短時間で創面から拡散・流動してしまう（Journal of Gynecologic Surgery vol.7 No.2 97-101(1991)。
【０００５】
ヒアルロン酸自体が本来持っている優れた生体適合性の特徴を最大限生かすために、なんら化学的架橋剤や化学的修飾剤を使用することなく、またカチオン性の高分子と複合体化することなく、生体適合性医用材料として使用可能な、生体内滞留時間が長いヒアルロン酸ゲルを見出した（ＰＣＴ／ＪＰ９８／０３５３６号）。
【０００６】
癒着防止材、創傷治療材として用いられるヒアルロン酸単独で形成された医用材料はシート状に成形され、外科手術部位に直接貼付することにより効果を発現する。しかし、シートは内視鏡等を用いた局所の外科手術の場合は、操作性がよくない。また、微小部位、形状の複雑な部位への適用も難しい。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ゲル化したヒアルロン酸を破砕処理して得られた粒子、または低濃度ヒアルロン酸性水溶液を凍結して得られたヒアルロン酸ゲル粒子は、大きな平均粒径では微小部位、形状の複雑な部位に均一な投与が難しい。
そこで、平均粒径を１０ｍｍ以下にすることにより微小部位、形状の複雑な部位への均一な施用を可能とした。また、スラリー濃度を０．１〜５重量％に調製する事により好適な流動性を保持し、注入材としても有効であり、更にこのヒアルロン酸ゲルスラリーが医用材料、化粧料としても有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、（１）ヒアルロン酸単独で形成されたゲルを含有することを特徴とするヒアルロン酸ゲルスラリー、（２）ヒアルロン酸単独で形成されたゲルの平均粒径が１０ｍｍ以下である（１）記載のヒアルロン酸ゲルスラリー、（３）ヒアルロン酸単独で形成されたゲルのスラリー濃度が０．１〜５重量％である（１）又は（２）記載のヒアルロン酸ゲルスラリー、（４）（１）〜（３）のいずれか１項に記載のヒアルロン酸ゲルスラリーを含有することを特徴とする医用材料、（５）（１）〜（３）のいずれか１項に記載のヒアルロン酸ゲルスラリーを含有することを特徴とする化粧料である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるヒアルロン酸は、動物組織から抽出したものでも、また発酵法で製造したものでもその起源を問うことなく使用できる。
発酵法で使用する菌株は自然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロン酸生産能を有する微生物、又は特開昭６３−１２３３９２号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄第9027号) 、特開平２−２３４６８９号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００（微工研菌寄第2319号) のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。上記の変異株を用いて培養、精製されたものが用いられる。
【００１０】
本発明でいうヒアルロン酸単独で形成されたゲルとは、ヒアルロン酸の架橋構造によって三次元網目構造が形成されている。中性水溶液に難溶性であることを特徴とし、このヒアルロン酸ゲルを中性水溶液中に投入すると、ゲル化していないヒアルロン酸と比較して有意の難溶性を示す。難溶性は、中性の３７℃の水溶液中でのゲルの形態の保持とゲルの溶解率で規定する。
本発明でいうヒアルロン酸ゲルは、アルカリ性水溶液中、例えばｐＨ１１のアルカリ性緩衝水溶液中に投入すると速やかに溶解する特徴も有する。
【００１１】
本発明でいうヒアルロン酸単独で形成されたゲルとは、ヒアルロン酸以外に化学的架橋剤や化学的修飾剤等は使用しないことまた、カチオン性の高分子と複合体化しないことでゲルを形成させることであり、自己架橋したゲルを意味するものである。
【００１２】
本発明に用いられるヒアルロン酸の分子量は、約１×１０5 〜約１×１０7 ダルトンの範囲内のものが好ましい。また、上記範囲内の分子量をもつものであれば、より高分子量のものから、加水分解処理等をして得たものでも同様に好ましく使用できる。
なお、本発明にいうヒアルロン酸は、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウムの塩をも包含する概念で使用される。
【００１３】
本発明でいうヒアルロン酸ゲルは、ヒアルロン酸の促進酸加水分解反応条件下でヒアルロン酸ゲルを処理することで分解、可溶化することができる。可溶化されたヒアルロン酸が架橋構造を保持している場合、分岐点を有するヒアルロン酸として高分子溶液論的に直鎖状のヒアルロン酸と区別することができる。
【００１４】
本発明でいうヒアルロン酸の促進酸加水分解反応条件としては、水溶液のｐＨ１．５、温度６０℃が適当である。ヒアルロン酸のグリコシド結合の加水分解による主鎖切断反応が、中性の水溶液中と比較して、酸性やアルカリ性の水溶液中で著しく促進される。更に酸加水分解反応は、反応温度が高い方が促進される。
【００１５】
本発明ではＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ法を用い、ＧＰＣで分離された分子量フラクションの分子量と分岐度をオンラインで連続的に測定した。本発明では、同一溶出体積のフラクションの可溶化されたヒアルロン酸の分子量と対照となる直鎖状ヒアルロン酸の分子量を比較して分岐度を計算する溶出体積法を使って分岐度の測定を行った。分岐度は可溶化されたヒアルロン酸の高分子鎖１コ当たりに存在する分岐点の数であり、可溶化されたヒアルロン酸の分子量に対してプロットされる。
【００１６】
可溶化されたヒアルロン酸は、ＧＰＣ溶媒で希釈して濃度を調製し、０．２μｍのメンブランフィルターでろ過した後測定に供した。
本発明でいうヒアルロン酸ゲル中に、ヒアルロン酸の促進酸加水分解条件下でも安定に存在する架橋構造がある場合、可溶化されたヒアルロン酸に分岐構造が高分子溶液論的に確認される。本発明でいうヒアルロン酸ゲルの分岐度は、０．５以上である。
【００１７】
ヒアルロン酸の水溶液は、ヒアルロン酸の粉末と水を混合し、撹拌して得られる。また、酸で酸性に調製した水にヒアルロン酸を投入する方法によっても得られる。このヒアルロン酸の濃度は５．０重量％以下が水溶液の処理上好都合である。また、ヒアルロン酸の水溶液のｐＨを調整するために使用する酸は、ｐＨ２．０以下に調整できる酸であれば、いずれの酸も使用することができる。酸の使用量を低減するために、好ましくは強酸、例えば、硝酸、塩酸、硫酸等を使用することが望ましい。
【００１８】
ヒアルロン酸酸性水溶液の凍結は任意の容器に注入した後、−３０℃〜−１０℃の温度で行う。凍結は底面から冷凍する方法、空冷方式による凍結いずれの方法によってもよい。４時間以上凍結した後解凍することによりヒアルロン酸ゲルが得られるが、短時間の凍結だとゲル化率の低いヒアルロン酸ゲルが、長時間の凍結だとゲル化率の高いヒアルロン酸ゲルが得られ、いずれも破砕、懸濁処理することにより好適なスラリーが製造できた。
【００１９】
ヒアルロン酸ゲルの破砕は、目的とする破砕粒度によって下記の粉砕機が選択される。圧縮粉砕方式の粗砕型（ブレーキ、ドッジ、シングル、トッグルジョークラッシャー）、旋動型（ジャイレトリ、コーン、ハイドロコーンクラッシャー）、回転型（ロールクラッシャー、シングルロールクラッシャー、ディスククラッシャー）。衝撃圧縮粉砕方式のひき臼型（スタンプミル）、ハンマー型（ハンマーミル、インパクトクラッシャー、インペラーブレーカー、レイモンド垂直ミル、チタンミル、ノボロータ、ミクロンミル、ディスインテグレーター、ディスメンブレーター）、流体エネルギー型（ジェットミル、ジェットパルペライザ、ミクロナイザー、リダクショナイザ噴射式粉砕機、エヤーミル）、回転円筒型（ボール、チューブ、コンパートメント、ロッド、コニカル、トリコン、ヒルデブランドミル）。せん断粉砕方式の回転型（カッティングミル、せん断ロールミル、ユーヒーミル）。摩擦粉砕方式の回転型（ひき臼、パンミル、アトリションミル、エージランナー）、旋動型（スクリュークラッシャー、塔式摩砕機、サイドグライダー）、遠心力型（遠心ローラーミル、遠心ボールミル）、回転円筒型（リングローラーミル、高速ボールミル、低速ボールミル、ハイスイングボールミル、振動ボールミル）、湿式コロイドミル型（プレミヤミル、シャロッテミル）および超音波破砕方式等を用いるが、破砕可能なものであればこれらに限定されない。
【００２０】
ヒアルロン酸ゲルの破砕平均粒径は１０ｍｍ以下であり、好ましくは１０〜５０００μｍである。
【００２１】
ヒアルロン酸ゲルを破砕することで得られた粒状ヒアルロン酸ゲルを、生理的食塩水に５０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加えて調製したｐＨ７のリン酸緩衝生理的食塩水で中和した後、注射用水で洗浄する。得られた粒状ヒアルロン酸ゲルを任意の溶液にスラリー濃度０．１〜５重量％で懸濁することによりヒアルロン酸ゲルスラリーが得られる。
【００２２】
次に、本発明に用いられる低濃度ヒアルロン酸酸性水溶液を凍結して得られる粒状ヒアルロン酸ゲルを用いたスラリーの製造方法について説明する。
ヒアルロン酸の水溶液の調製は、破砕により粒状化する方法の時と同様である。
【００２３】
ヒアルロン酸濃度は０．００５〜０．５重量％であり、０．０１〜０．２重量％が好ましい。０．００５重量％以下ではゲルが成形されず、０．５重量％以上では粒状のヒアルロン酸ゲルが得られず、容器形状に依存した一塊のヒアルロン酸ゲルが得られるためである。
【００２４】
次にヒアルロン酸の水溶液のｐＨを０．５〜２．０に調製する。ｐＨ２．０以下に調整できる酸であれば、いずれの酸も使用することができる。酸の使用量を低減するために、好ましくは強酸、例えば、硝酸、塩酸、硫酸等を使用することが好ましい。
【００２５】
この低濃度ヒアルロン酸酸性水溶液の凍結は、任意の容器に注入した後、−３０℃〜−１０℃の温度で行う。−３０℃より低い凍結温度ではゲル化の進行が遅く、長時間が必要になってしまうため好ましくない。また、−５℃より高い温度では溶液が凍結しない場合があり好ましくない。
【００２６】
また、凍結は底面から冷凍する方法、空冷方式の凍結いずれの方法によってもよい。２日以上凍結した後、解凍することにより粒状ヒアルロン酸ゲルが得られる。
【００２７】
低濃度ヒアルロン酸酸性溶液を凍結することで得られた粒状ヒアルロン酸ゲルを含む当該酸性水溶液をメンブレンフィルターで粒状ヒアルロン酸ゲルを回収した後、生理的食塩水に５０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加えて調製したｐＨ７のリン酸緩衝生理的食塩水で中和した後、注射用水で洗浄する。得られた粒状ヒアルロン酸ゲルを任意の溶液にスラリー濃度０．１〜５重量％で懸濁することによりヒアルロン酸ゲルスラリーが得られる。
なお、注射用水で洗浄した後、凍結乾燥したものを再び任意の溶液に懸濁させることでもスラリーの製造は可能である。
【００２８】
本発明で得られたヒアルロン酸ゲルスラリーは、一般の生体内分解性医用材料及びヒアルロン酸が用いられる分野であれば特に制限なく使用することができる。例えば、癒着防止材、薬理活性物質の担体、創傷被覆材、人工皮膚、組織置換型生体組織修復材、関節注入剤、皮膚注入剤、外科手術用縫合糸、止血剤、人工臓器、人工細胞外マトリックス又は人工基底膜、診断・治療に用いる医療器具・医療用具等の生物医学的製品又は医薬組成物、およびワンポイント化粧料、各種化粧用クリーム、乳液、化粧水、美容液、パック剤、アンダーメイクアップ、ファンデーション、ゼリー剤、軟膏等の化粧料への使用が挙げられる。
【００２９】
ヒアルロン酸ゲルスラリーは、単一形態での使用は当然ながら、異なるヒアルロン酸ゲル形態との混合又は併用、更にゲル化されていないヒアルロン酸との混合又は併用による組合せ処方により効果の増強が期待できる。
例えば、術後癒着防止材としてヒアルロン酸ゲルからなるスラリーをヒアルロン酸ゲルシート状成形物、ヒアルロン酸溶液の組み合わせを腹部に併用した場合、局所効果と腹腔内全体効果が期待できる。
【００３０】
次に、本発明の医用材料のうち癒着防止材について説明する。
本発明で得られた粒状ヒアルロン酸ゲルスラリーの癒着防止材は、外科手術に用いられ、外科手術部位に直接投与するのが好ましい。ヒアルロン酸ゲルスラリーの癒着防止材は、癒着が生じるいかなる動物にも適用でき、哺乳動物、特に人間に於いて好適に手術後の癒着を防止することができる。
【００３１】
生体内の投与場所は腹腔、胸腔内の各種臓器、腱鞘、頭蓋、神経、及び眼球、等に係わる、腹部手術、婦人科手術、胸部手術、腱や靭帯に係わる整形外科手術、硬膜に係わる神経外科手術、等どこでも有用である。
【００３２】
本発明で得られた粒状ヒアルロン酸ゲルスラリーの癒着防止材の投与時期は、術後の癒着を防止できるどの時期でも良く、手術中又は手術終了時に投与できるが、特に手術終了の直前に投与するのが好ましい。
【００３３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００３４】
実施例１
分子量が２×１０6 ダルトンのヒアルロン酸ナトリウムを注射用水に溶解し、１重量％のヒアルロン酸水溶液を調整した。この水溶液のｐＨを、１Ｎ塩酸でｐＨ１．５に調整し、ヒアルロン酸酸性水溶液を得た。このヒアルロン酸酸性水溶液８０ｍｌを、１００ｍｌサンプル瓶に入れ、−２０℃に設定した冷凍庫に入れた。１２０時間の凍結でヒアルロン酸ゲルが得られた。次にこれを注射用水１０ｍｌを加え１０分間放置後デカンテーションする洗浄を３回繰り返した後、生理的食塩水に５０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加えて調整したｐＨ７のリン酸緩衝生理的食塩水１００ｍｌを加えデカンテーションする中和を２回繰り返した後、注射用水で十分に洗浄しヒアルロン酸ゲルを得た。更にヒアルロン酸ゲルを下記表１の実験に従い任意の溶液中にスラリー濃度を調整するように添加し、マイクロホモジナイザー（NISSEI EXCEL AUTO HOMOGENIZER)を用い破砕処理をすると平均粒径が３００〜１，０００μｍの粒状ヒアルロン酸ゲルを含むスラリーを得た。
なお、これら一連の操作は無菌・無埃環境下で行い、使用する薬液等も予め滅菌処理を行ったものを用いた。
【００３５】
実施例２
分子量が２×１０6 ダルトンのヒアルロン酸ナトリウムを注射用水に溶解し、０．０１重量％のヒアルロン酸水溶液を調整した。この水溶液のｐＨを、１Ｎ塩酸でｐＨ１．５に調整し、低濃度ヒアルロン酸酸性水溶液を得た。この低濃度ヒアルロン酸酸性水溶液８リットルを、１０リットルの容器に入れ、−２０℃に設定した冷凍庫に入れた。１２０時間の凍結で平均粒径１００〜５００μｍの粒状のヒアルロン酸ゲルが得られた。粒状ヒアルロン酸ゲルを含む当該酸性水溶液をメンブレンフィルターで粒状ヒアルロン酸ゲルを回収した後、注射用水１０ｍｌを加え１０分間放置後デカンテーションする洗浄を３回繰り返した後、生理的食塩水に５０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加えて調整したｐＨ７のリン酸緩衝生理的食塩水１００ｍｌを加えデカンテーションする中和を２回繰り返し、注射用水で十分に洗浄した。
更に、ヒアルロン酸ゲルを下記実験に従い任意の溶液中にスラリー濃度を調整するように添加しするとヒアルロン酸ゲルスラリーを得た。
なお、これら一連の操作は無菌・無埃環境下で行い、使用する薬液等も予め滅菌処理を行ったものを用いた。
【００３６】
【表１】
【００３７】
実施例３
ヒアルロン酸ゲルの分岐度測定
実施例１及び２で得られた粒状ヒアルロン酸ゲルを以下の試験に供した。
【００３８】
ヒアルロン酸ゲルをｐＨ１．５の塩酸水溶液１５ｍｌに浸漬し、６０℃で６時間加水分解し、ゲルを完全に可溶化させた。これをＧＰＣ溶媒で２倍に希釈して濃度を０．０５重量％に調整し、０．２μｍのメンブレンフィルターでろ過した後、０．１ｍｌ注入してＧＰＣ−ＭＡＬＬＳで測定した結果、分岐度はいずれも０．５以上であった。
【００３９】
実施例４
ヒアルロン酸ゲルスラリーの溶解性試験
表１の各実験で得られたヒアルロン酸ゲルスラリーを以下の試験に供した。
【００４０】
生理食塩水に５０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加え、ｐＨ７のリン酸緩衝生理食塩水を調製した。実験Ｎｏ．１で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径１，０００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．２で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．４で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．６で得られた０．５重量％ヒアルロン酸溶液に懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．８で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径５００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．９で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．１１で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．１３で得られた０．５重量％ヒアルロン酸溶液に懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、それぞれ１ｍｌを５０ｍｌのリン酸緩生理食塩水に浸漬し緩やかに攪拌した。３７℃でリン酸緩衝生理食塩水中に溶出するヒアルロン酸の割合を、リン酸緩衝生理食塩水中ヒアルロン酸濃度から求めた。その結果を表２に示す。
【００４１】
ヒアルロン酸濃度の測定
リン酸緩衝生理食塩水中のヒアルロン酸濃度は、ＧＰＣを用いて、示差屈折率検出器のピーク面積から求めた。
【００４２】
【表２】
【００４３】
表２より、ヒアルロン酸ゲルスラリーは有効な貯留性を示すことが確認された。
【００４４】
実施例５
ヒアルロン酸ゲルスラリー癒着防止材のマウス子宮モデルによる癒着防止効果試験
ヒアルロン酸水溶液を比較として、実験Ｎｏ．２〜５及び実験Ｎｏ．９〜１２で得られたヒアルロン酸ゲルスラリーを以下の試験に供した。
【００４５】
７週令雌ＩＣＲマウス（体重２５〜３０ｇ）を腹腔内ペントバルビタール注射で麻酔後正中切開にて開腹し、子宮角に約１０ｍｍの長さでヨードチンキ擦過塗布により損傷を加えた。各群１０匹のマウスにコントロールとして無処置及び、実験Ｎｏ．２で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．３で得られた生理食塩水に懸濁した３．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．４で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．５で得られたＰＢＳに懸濁した３．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．９で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．１０で得られた生理食塩水に懸濁した３．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．１１で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．１２で得られたＰＢＳに懸濁した３．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、また比較として１．０重量％ヒアルロン酸水溶液を用いた。
【００４６】
ヒアルロン酸水溶液及びヒアルロン酸ゲルスラリー１ｍｌを損傷部位に添加し、５−０デキソンにて閉腹した。
【００４７】
術後１０日目に、無処置、ヒアルロン酸ゲルスラリー、ヒアルロン酸水溶液を投与したマウス各１０匹を頚椎脱臼致死後、腹部を再開腹し、癒着形成の有無を判定した。癒着形成は、膜状のごく軽度の癒着は癒着と判定せず、繊維状で厚く、ピンセットで引ぱっても容易に引き剥がれない強い癒着を生じた場合を癒着と判定した。その結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
【００４９】
表３より、無処置で癒着の形成割合が１０匹中９匹の時、１．０重量％ヒアルロン酸水溶液が１０匹中６匹、実験Ｎｏ．２で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが１０匹中０匹、実験Ｎｏ．３で得られた生理食塩水に懸濁した３．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが１０匹中０匹、実験Ｎｏ．４で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが１０匹中１匹、実験Ｎｏ．５で得られたＰＢＳに懸濁した３．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが１０匹中０匹、実験Ｎｏ．９で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが１０匹中１匹、実験Ｎｏ．１０で得られた生理食塩水に懸濁した３．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが１０匹中１匹、実験Ｎｏ．１１で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが１０匹中１匹、実験Ｎｏ．１２で得られたＰＢＳに懸濁した３．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが１０匹中１匹と、ヒアルロン酸ゲルスラリーが優れた癒着防止作用があることが示唆された。
【００５０】
実施例６
ヒアルロン酸ゲルスラリーの癒着防止剤のラット盲腸モデルによる癒着防止効果試験
実験Ｎｏ．２で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．３で得られた生理食塩水に懸濁した３．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．４で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．５で得られたＰＢＳに懸濁した３．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．９で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．１０で得られた生理食塩水に懸濁した３．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．１１で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．１２で得られたＰＢＳに懸濁した３．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、また比較として１．０重量％ヒアルロン酸水溶液を試験に供した。
【００５１】
１０週令雄Wistarラット（体重約２５０ｇ）を腹腔内にケタミン（６０ｍｇ／体重１ｋｇ）とキシラジン（１０ｍｇ／体重１ｋｇ）注射で麻酔後正中切開にて開腹し、盲腸に約１０×１０ｍｍの領域をゲージで擦り（約２０回）点状の出血が生じるまでの擦過傷をつくった。各群５匹のラットに、ヒアルロン酸水溶液及びヒアルロン酸ゲルスラリー２ｍｌを損傷部位に添加し、３−０デキソンにて閉腹した。
【００５２】
術後１４日目に、無処置、ヒアルロン酸ゲルのスラリー、ヒアルロン酸水溶液を投与したラットを各５匹屠殺後、腹部を再開腹し、癒着形成の有無を判定した。癒着形成は、膜状のごく軽度の癒着は癒着と判定せず、繊維状で厚く、ピンセットで引ぱっても容易に引き剥がれない強い癒着を生じた場合を癒着と判定した。その結果を表４に示す。
【００５３】
【表４】
【００５４】
表４より、無処置で癒着の形成割合が５匹中５匹の時、１．０重量％ヒアルロン酸水溶液が５匹中３匹、実験Ｎｏ．２で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが５匹中１匹、実験Ｎｏ．３で得られた生理食塩水に懸濁した３．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが５匹中０匹、実験Ｎｏ．４で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが５匹中０匹、実験Ｎｏ．５で得られたＰＢＳに懸濁した３．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが５匹中１匹、実験Ｎｏ．９で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが５匹中０匹、実験Ｎｏ．１０で得られた生理食塩水に懸濁した３．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが５匹中０匹、実験Ｎｏ．１１で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが５匹中０匹、実験Ｎｏ．１２で得られたＰＢＳに懸濁した３．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが５匹中１匹と、ヒアルロン酸ゲルスラリーが優れた癒着防止作用があることが示唆された。
【００５５】
【発明の効果】
以上、本発明によれば、ヒアルロン酸単独で形成された難溶性のヒアルロン酸ゲルをスラリーとすることにより、特に生体適合性の高い医用材料が得られる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒアルロン酸単独で形成されたゲルを含有するヒアルロン酸ゲルスラリーに関し、特にそれらの医用材料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸は、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとβ−Ｄ−グルクロン酸が交互に結合した直鎖状の高分子多糖である。ヒアルロン酸は哺乳動物の結合組織に分布するほか、ニワトリのとさか、連鎖球菌の夾膜などにも存在が知られている。ニワトリのとさか、臍帯等が抽出材料として用いられているほか、連鎖球菌の培養物からも精製物が調整されている。
ヒアルロン酸は、種及び臓器特異性をもたず、生体に移植または注入した場合であっても優れた生体適合性を示すことが知られている。
【０００３】
さらに、生体に適用する場合のヒアルロン酸自体の易水溶性に由来する短所、例えば、生体内滞留時間が比較的短いことなどから、多種多様なヒアルロン酸の化学修飾物も提案されている（米国特許第４，５８２，８６５号明細書、特公平６−３７５７５号公報、特開平７−９７４０１号公報、特開昭６０−１３０６０１号公報、特開平３−１０５００３号、欧州特許０３４１７４５Ａ１、特開平６−７３１０３号公報参照）。
【０００４】
ヒアルロン酸は、極めて高い粘ちょう性と保湿性を有し、本質的に抗原性が無く生体適合性が高いため、変形性膝関節症の治療薬や眼科手術補助剤等に用いられている。
また、ヒアルロン酸溶液そのものを手術後の癒着防止材として用いることも検討されているが、生体内での貯留性が比較的短いので効果が弱く、水溶性のため短時間で創面から拡散・流動してしまう（Journal of Gynecologic Surgery vol.7 No.2 97-101(1991)。
【０００５】
ヒアルロン酸自体が本来持っている優れた生体適合性の特徴を最大限生かすために、なんら化学的架橋剤や化学的修飾剤を使用することなく、またカチオン性の高分子と複合体化することなく、生体適合性医用材料として使用可能な、生体内滞留時間が長いヒアルロン酸ゲルを見出した（ＰＣＴ／ＪＰ９８／０３５３６号）。
【０００６】
癒着防止材、創傷治療材として用いられるヒアルロン酸単独で形成された医用材料はシート状に成形され、外科手術部位に直接貼付することにより効果を発現する。しかし、シートは内視鏡等を用いた局所の外科手術の場合は、操作性がよくない。また、微小部位、形状の複雑な部位への適用も難しい。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ゲル化したヒアルロン酸を破砕処理して得られた粒子、または低濃度ヒアルロン酸性水溶液を凍結して得られたヒアルロン酸ゲル粒子は、大きな平均粒径では微小部位、形状の複雑な部位に均一な投与が難しい。
そこで、平均粒径を１０ｍｍ以下にすることにより微小部位、形状の複雑な部位への均一な施用を可能とした。また、スラリー濃度を０．１〜５重量％に調製する事により好適な流動性を保持し、注入材としても有効であり、更にこのヒアルロン酸ゲルスラリーが医用材料、化粧料としても有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、（１）ヒアルロン酸単独で形成されたゲルを含有することを特徴とするヒアルロン酸ゲルスラリー、（２）ヒアルロン酸単独で形成されたゲルの平均粒径が１０ｍｍ以下である（１）記載のヒアルロン酸ゲルスラリー、（３）ヒアルロン酸単独で形成されたゲルのスラリー濃度が０．１〜５重量％である（１）又は（２）記載のヒアルロン酸ゲルスラリー、（４）（１）〜（３）のいずれか１項に記載のヒアルロン酸ゲルスラリーを含有することを特徴とする医用材料、（５）（１）〜（３）のいずれか１項に記載のヒアルロン酸ゲルスラリーを含有することを特徴とする化粧料である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるヒアルロン酸は、動物組織から抽出したものでも、また発酵法で製造したものでもその起源を問うことなく使用できる。
発酵法で使用する菌株は自然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロン酸生産能を有する微生物、又は特開昭６３−１２３３９２号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄第9027号) 、特開平２−２３４６８９号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００（微工研菌寄第2319号) のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。上記の変異株を用いて培養、精製されたものが用いられる。
【００１０】
本発明でいうヒアルロン酸単独で形成されたゲルとは、ヒアルロン酸の架橋構造によって三次元網目構造が形成されている。中性水溶液に難溶性であることを特徴とし、このヒアルロン酸ゲルを中性水溶液中に投入すると、ゲル化していないヒアルロン酸と比較して有意の難溶性を示す。難溶性は、中性の３７℃の水溶液中でのゲルの形態の保持とゲルの溶解率で規定する。
本発明でいうヒアルロン酸ゲルは、アルカリ性水溶液中、例えばｐＨ１１のアルカリ性緩衝水溶液中に投入すると速やかに溶解する特徴も有する。
【００１１】
本発明でいうヒアルロン酸単独で形成されたゲルとは、ヒアルロン酸以外に化学的架橋剤や化学的修飾剤等は使用しないことまた、カチオン性の高分子と複合体化しないことでゲルを形成させることであり、自己架橋したゲルを意味するものである。
【００１２】
本発明に用いられるヒアルロン酸の分子量は、約１×１０5 〜約１×１０7 ダルトンの範囲内のものが好ましい。また、上記範囲内の分子量をもつものであれば、より高分子量のものから、加水分解処理等をして得たものでも同様に好ましく使用できる。
なお、本発明にいうヒアルロン酸は、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウムの塩をも包含する概念で使用される。
【００１３】
本発明でいうヒアルロン酸ゲルは、ヒアルロン酸の促進酸加水分解反応条件下でヒアルロン酸ゲルを処理することで分解、可溶化することができる。可溶化されたヒアルロン酸が架橋構造を保持している場合、分岐点を有するヒアルロン酸として高分子溶液論的に直鎖状のヒアルロン酸と区別することができる。
【００１４】
本発明でいうヒアルロン酸の促進酸加水分解反応条件としては、水溶液のｐＨ１．５、温度６０℃が適当である。ヒアルロン酸のグリコシド結合の加水分解による主鎖切断反応が、中性の水溶液中と比較して、酸性やアルカリ性の水溶液中で著しく促進される。更に酸加水分解反応は、反応温度が高い方が促進される。
【００１５】
本発明ではＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ法を用い、ＧＰＣで分離された分子量フラクションの分子量と分岐度をオンラインで連続的に測定した。本発明では、同一溶出体積のフラクションの可溶化されたヒアルロン酸の分子量と対照となる直鎖状ヒアルロン酸の分子量を比較して分岐度を計算する溶出体積法を使って分岐度の測定を行った。分岐度は可溶化されたヒアルロン酸の高分子鎖１コ当たりに存在する分岐点の数であり、可溶化されたヒアルロン酸の分子量に対してプロットされる。
【００１６】
可溶化されたヒアルロン酸は、ＧＰＣ溶媒で希釈して濃度を調製し、０．２μｍのメンブランフィルターでろ過した後測定に供した。
本発明でいうヒアルロン酸ゲル中に、ヒアルロン酸の促進酸加水分解条件下でも安定に存在する架橋構造がある場合、可溶化されたヒアルロン酸に分岐構造が高分子溶液論的に確認される。本発明でいうヒアルロン酸ゲルの分岐度は、０．５以上である。
【００１７】
ヒアルロン酸の水溶液は、ヒアルロン酸の粉末と水を混合し、撹拌して得られる。また、酸で酸性に調製した水にヒアルロン酸を投入する方法によっても得られる。このヒアルロン酸の濃度は５．０重量％以下が水溶液の処理上好都合である。また、ヒアルロン酸の水溶液のｐＨを調整するために使用する酸は、ｐＨ２．０以下に調整できる酸であれば、いずれの酸も使用することができる。酸の使用量を低減するために、好ましくは強酸、例えば、硝酸、塩酸、硫酸等を使用することが望ましい。
【００１８】
ヒアルロン酸酸性水溶液の凍結は任意の容器に注入した後、−３０℃〜−１０℃の温度で行う。凍結は底面から冷凍する方法、空冷方式による凍結いずれの方法によってもよい。４時間以上凍結した後解凍することによりヒアルロン酸ゲルが得られるが、短時間の凍結だとゲル化率の低いヒアルロン酸ゲルが、長時間の凍結だとゲル化率の高いヒアルロン酸ゲルが得られ、いずれも破砕、懸濁処理することにより好適なスラリーが製造できた。
【００１９】
ヒアルロン酸ゲルの破砕は、目的とする破砕粒度によって下記の粉砕機が選択される。圧縮粉砕方式の粗砕型（ブレーキ、ドッジ、シングル、トッグルジョークラッシャー）、旋動型（ジャイレトリ、コーン、ハイドロコーンクラッシャー）、回転型（ロールクラッシャー、シングルロールクラッシャー、ディスククラッシャー）。衝撃圧縮粉砕方式のひき臼型（スタンプミル）、ハンマー型（ハンマーミル、インパクトクラッシャー、インペラーブレーカー、レイモンド垂直ミル、チタンミル、ノボロータ、ミクロンミル、ディスインテグレーター、ディスメンブレーター）、流体エネルギー型（ジェットミル、ジェットパルペライザ、ミクロナイザー、リダクショナイザ噴射式粉砕機、エヤーミル）、回転円筒型（ボール、チューブ、コンパートメント、ロッド、コニカル、トリコン、ヒルデブランドミル）。せん断粉砕方式の回転型（カッティングミル、せん断ロールミル、ユーヒーミル）。摩擦粉砕方式の回転型（ひき臼、パンミル、アトリションミル、エージランナー）、旋動型（スクリュークラッシャー、塔式摩砕機、サイドグライダー）、遠心力型（遠心ローラーミル、遠心ボールミル）、回転円筒型（リングローラーミル、高速ボールミル、低速ボールミル、ハイスイングボールミル、振動ボールミル）、湿式コロイドミル型（プレミヤミル、シャロッテミル）および超音波破砕方式等を用いるが、破砕可能なものであればこれらに限定されない。
【００２０】
ヒアルロン酸ゲルの破砕平均粒径は１０ｍｍ以下であり、好ましくは１０〜５０００μｍである。
【００２１】
ヒアルロン酸ゲルを破砕することで得られた粒状ヒアルロン酸ゲルを、生理的食塩水に５０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加えて調製したｐＨ７のリン酸緩衝生理的食塩水で中和した後、注射用水で洗浄する。得られた粒状ヒアルロン酸ゲルを任意の溶液にスラリー濃度０．１〜５重量％で懸濁することによりヒアルロン酸ゲルスラリーが得られる。
【００２２】
次に、本発明に用いられる低濃度ヒアルロン酸酸性水溶液を凍結して得られる粒状ヒアルロン酸ゲルを用いたスラリーの製造方法について説明する。
ヒアルロン酸の水溶液の調製は、破砕により粒状化する方法の時と同様である。
【００２３】
ヒアルロン酸濃度は０．００５〜０．５重量％であり、０．０１〜０．２重量％が好ましい。０．００５重量％以下ではゲルが成形されず、０．５重量％以上では粒状のヒアルロン酸ゲルが得られず、容器形状に依存した一塊のヒアルロン酸ゲルが得られるためである。
【００２４】
次にヒアルロン酸の水溶液のｐＨを０．５〜２．０に調製する。ｐＨ２．０以下に調整できる酸であれば、いずれの酸も使用することができる。酸の使用量を低減するために、好ましくは強酸、例えば、硝酸、塩酸、硫酸等を使用することが好ましい。
【００２５】
この低濃度ヒアルロン酸酸性水溶液の凍結は、任意の容器に注入した後、−３０℃〜−１０℃の温度で行う。−３０℃より低い凍結温度ではゲル化の進行が遅く、長時間が必要になってしまうため好ましくない。また、−５℃より高い温度では溶液が凍結しない場合があり好ましくない。
【００２６】
また、凍結は底面から冷凍する方法、空冷方式の凍結いずれの方法によってもよい。２日以上凍結した後、解凍することにより粒状ヒアルロン酸ゲルが得られる。
【００２７】
低濃度ヒアルロン酸酸性溶液を凍結することで得られた粒状ヒアルロン酸ゲルを含む当該酸性水溶液をメンブレンフィルターで粒状ヒアルロン酸ゲルを回収した後、生理的食塩水に５０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加えて調製したｐＨ７のリン酸緩衝生理的食塩水で中和した後、注射用水で洗浄する。得られた粒状ヒアルロン酸ゲルを任意の溶液にスラリー濃度０．１〜５重量％で懸濁することによりヒアルロン酸ゲルスラリーが得られる。
なお、注射用水で洗浄した後、凍結乾燥したものを再び任意の溶液に懸濁させることでもスラリーの製造は可能である。
【００２８】
本発明で得られたヒアルロン酸ゲルスラリーは、一般の生体内分解性医用材料及びヒアルロン酸が用いられる分野であれば特に制限なく使用することができる。例えば、癒着防止材、薬理活性物質の担体、創傷被覆材、人工皮膚、組織置換型生体組織修復材、関節注入剤、皮膚注入剤、外科手術用縫合糸、止血剤、人工臓器、人工細胞外マトリックス又は人工基底膜、診断・治療に用いる医療器具・医療用具等の生物医学的製品又は医薬組成物、およびワンポイント化粧料、各種化粧用クリーム、乳液、化粧水、美容液、パック剤、アンダーメイクアップ、ファンデーション、ゼリー剤、軟膏等の化粧料への使用が挙げられる。
【００２９】
ヒアルロン酸ゲルスラリーは、単一形態での使用は当然ながら、異なるヒアルロン酸ゲル形態との混合又は併用、更にゲル化されていないヒアルロン酸との混合又は併用による組合せ処方により効果の増強が期待できる。
例えば、術後癒着防止材としてヒアルロン酸ゲルからなるスラリーをヒアルロン酸ゲルシート状成形物、ヒアルロン酸溶液の組み合わせを腹部に併用した場合、局所効果と腹腔内全体効果が期待できる。
【００３０】
次に、本発明の医用材料のうち癒着防止材について説明する。
本発明で得られた粒状ヒアルロン酸ゲルスラリーの癒着防止材は、外科手術に用いられ、外科手術部位に直接投与するのが好ましい。ヒアルロン酸ゲルスラリーの癒着防止材は、癒着が生じるいかなる動物にも適用でき、哺乳動物、特に人間に於いて好適に手術後の癒着を防止することができる。
【００３１】
生体内の投与場所は腹腔、胸腔内の各種臓器、腱鞘、頭蓋、神経、及び眼球、等に係わる、腹部手術、婦人科手術、胸部手術、腱や靭帯に係わる整形外科手術、硬膜に係わる神経外科手術、等どこでも有用である。
【００３２】
本発明で得られた粒状ヒアルロン酸ゲルスラリーの癒着防止材の投与時期は、術後の癒着を防止できるどの時期でも良く、手術中又は手術終了時に投与できるが、特に手術終了の直前に投与するのが好ましい。
【００３３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００３４】
実施例１
分子量が２×１０6 ダルトンのヒアルロン酸ナトリウムを注射用水に溶解し、１重量％のヒアルロン酸水溶液を調整した。この水溶液のｐＨを、１Ｎ塩酸でｐＨ１．５に調整し、ヒアルロン酸酸性水溶液を得た。このヒアルロン酸酸性水溶液８０ｍｌを、１００ｍｌサンプル瓶に入れ、−２０℃に設定した冷凍庫に入れた。１２０時間の凍結でヒアルロン酸ゲルが得られた。次にこれを注射用水１０ｍｌを加え１０分間放置後デカンテーションする洗浄を３回繰り返した後、生理的食塩水に５０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加えて調整したｐＨ７のリン酸緩衝生理的食塩水１００ｍｌを加えデカンテーションする中和を２回繰り返した後、注射用水で十分に洗浄しヒアルロン酸ゲルを得た。更にヒアルロン酸ゲルを下記表１の実験に従い任意の溶液中にスラリー濃度を調整するように添加し、マイクロホモジナイザー（NISSEI EXCEL AUTO HOMOGENIZER)を用い破砕処理をすると平均粒径が３００〜１，０００μｍの粒状ヒアルロン酸ゲルを含むスラリーを得た。
なお、これら一連の操作は無菌・無埃環境下で行い、使用する薬液等も予め滅菌処理を行ったものを用いた。
【００３５】
実施例２
分子量が２×１０6 ダルトンのヒアルロン酸ナトリウムを注射用水に溶解し、０．０１重量％のヒアルロン酸水溶液を調整した。この水溶液のｐＨを、１Ｎ塩酸でｐＨ１．５に調整し、低濃度ヒアルロン酸酸性水溶液を得た。この低濃度ヒアルロン酸酸性水溶液８リットルを、１０リットルの容器に入れ、−２０℃に設定した冷凍庫に入れた。１２０時間の凍結で平均粒径１００〜５００μｍの粒状のヒアルロン酸ゲルが得られた。粒状ヒアルロン酸ゲルを含む当該酸性水溶液をメンブレンフィルターで粒状ヒアルロン酸ゲルを回収した後、注射用水１０ｍｌを加え１０分間放置後デカンテーションする洗浄を３回繰り返した後、生理的食塩水に５０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加えて調整したｐＨ７のリン酸緩衝生理的食塩水１００ｍｌを加えデカンテーションする中和を２回繰り返し、注射用水で十分に洗浄した。
更に、ヒアルロン酸ゲルを下記実験に従い任意の溶液中にスラリー濃度を調整するように添加しするとヒアルロン酸ゲルスラリーを得た。
なお、これら一連の操作は無菌・無埃環境下で行い、使用する薬液等も予め滅菌処理を行ったものを用いた。
【００３６】
【表１】
実施例３
ヒアルロン酸ゲルの分岐度測定
実施例１及び２で得られた粒状ヒアルロン酸ゲルを以下の試験に供した。
【００３８】
ヒアルロン酸ゲルをｐＨ１．５の塩酸水溶液１５ｍｌに浸漬し、６０℃で６時間加水分解し、ゲルを完全に可溶化させた。これをＧＰＣ溶媒で２倍に希釈して濃度を０．０５重量％に調整し、０．２μｍのメンブレンフィルターでろ過した後、０．１ｍｌ注入してＧＰＣ−ＭＡＬＬＳで測定した結果、分岐度はいずれも０．５以上であった。
【００３９】
実施例４
ヒアルロン酸ゲルスラリーの溶解性試験
表１の各実験で得られたヒアルロン酸ゲルスラリーを以下の試験に供した。
【００４０】
生理食塩水に５０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加え、ｐＨ７のリン酸緩衝生理食塩水を調製した。実験Ｎｏ．１で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径１，０００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．２で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．４で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．６で得られた０．５重量％ヒアルロン酸溶液に懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．８で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径５００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．９で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．１１で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．１３で得られた０．５重量％ヒアルロン酸溶液に懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、それぞれ１ｍｌを５０ｍｌのリン酸緩生理食塩水に浸漬し緩やかに攪拌した。３７℃でリン酸緩衝生理食塩水中に溶出するヒアルロン酸の割合を、リン酸緩衝生理食塩水中ヒアルロン酸濃度から求めた。その結果を表２に示す。
【００４１】
ヒアルロン酸濃度の測定
リン酸緩衝生理食塩水中のヒアルロン酸濃度は、ＧＰＣを用いて、示差屈折率検出器のピーク面積から求めた。
【００４２】
【表２】
表２より、ヒアルロン酸ゲルスラリーは有効な貯留性を示すことが確認された。
【００４４】
実施例５
ヒアルロン酸ゲルスラリー癒着防止材のマウス子宮モデルによる癒着防止効果試験
ヒアルロン酸水溶液を比較として、実験Ｎｏ．２〜５及び実験Ｎｏ．９〜１２で得られたヒアルロン酸ゲルスラリーを以下の試験に供した。
【００４５】
７週令雌ＩＣＲマウス（体重２５〜３０ｇ）を腹腔内ペントバルビタール注射で麻酔後正中切開にて開腹し、子宮角に約１０ｍｍの長さでヨードチンキ擦過塗布により損傷を加えた。各群１０匹のマウスにコントロールとして無処置及び、実験Ｎｏ．２で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．３で得られた生理食塩水に懸濁した３．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．４で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．５で得られたＰＢＳに懸濁した３．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．９で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．１０で得られた生理食塩水に懸濁した３．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．１１で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．１２で得られたＰＢＳに懸濁した３．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、また比較として１．０重量％ヒアルロン酸水溶液を用いた。
【００４６】
ヒアルロン酸水溶液及びヒアルロン酸ゲルスラリー１ｍｌを損傷部位に添加し、５−０デキソンにて閉腹した。
【００４７】
術後１０日目に、無処置、ヒアルロン酸ゲルスラリー、ヒアルロン酸水溶液を投与したマウス各１０匹を頚椎脱臼致死後、腹部を再開腹し、癒着形成の有無を判定した。癒着形成は、膜状のごく軽度の癒着は癒着と判定せず、繊維状で厚く、ピンセットで引ぱっても容易に引き剥がれない強い癒着を生じた場合を癒着と判定した。その結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
表３より、無処置で癒着の形成割合が１０匹中９匹の時、１．０重量％ヒアルロン酸水溶液が１０匹中６匹、実験Ｎｏ．２で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが１０匹中０匹、実験Ｎｏ．３で得られた生理食塩水に懸濁した３．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが１０匹中０匹、実験Ｎｏ．４で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが１０匹中１匹、実験Ｎｏ．５で得られたＰＢＳに懸濁した３．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが１０匹中０匹、実験Ｎｏ．９で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが１０匹中１匹、実験Ｎｏ．１０で得られた生理食塩水に懸濁した３．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが１０匹中１匹、実験Ｎｏ．１１で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが１０匹中１匹、実験Ｎｏ．１２で得られたＰＢＳに懸濁した３．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが１０匹中１匹と、ヒアルロン酸ゲルスラリーが優れた癒着防止作用があることが示唆された。
【００５０】
実施例６
ヒアルロン酸ゲルスラリーの癒着防止剤のラット盲腸モデルによる癒着防止効果試験
実験Ｎｏ．２で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．３で得られた生理食塩水に懸濁した３．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．４で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．５で得られたＰＢＳに懸濁した３．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．９で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．１０で得られた生理食塩水に懸濁した３．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．１１で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、実験Ｎｏ．１２で得られたＰＢＳに懸濁した３．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリー、また比較として１．０重量％ヒアルロン酸水溶液を試験に供した。
【００５１】
１０週令雄Wistarラット（体重約２５０ｇ）を腹腔内にケタミン（６０ｍｇ／体重１ｋｇ）とキシラジン（１０ｍｇ／体重１ｋｇ）注射で麻酔後正中切開にて開腹し、盲腸に約１０×１０ｍｍの領域をゲージで擦り（約２０回）点状の出血が生じるまでの擦過傷をつくった。各群５匹のラットに、ヒアルロン酸水溶液及びヒアルロン酸ゲルスラリー２ｍｌを損傷部位に添加し、３−０デキソンにて閉腹した。
【００５２】
術後１４日目に、無処置、ヒアルロン酸ゲルのスラリー、ヒアルロン酸水溶液を投与したラットを各５匹屠殺後、腹部を再開腹し、癒着形成の有無を判定した。癒着形成は、膜状のごく軽度の癒着は癒着と判定せず、繊維状で厚く、ピンセットで引ぱっても容易に引き剥がれない強い癒着を生じた場合を癒着と判定した。その結果を表４に示す。
【００５３】
【表４】
表４より、無処置で癒着の形成割合が５匹中５匹の時、１．０重量％ヒアルロン酸水溶液が５匹中３匹、実験Ｎｏ．２で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが５匹中１匹、実験Ｎｏ．３で得られた生理食塩水に懸濁した３．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが５匹中０匹、実験Ｎｏ．４で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが５匹中０匹、実験Ｎｏ．５で得られたＰＢＳに懸濁した３．０重量％、平均粒径３００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが５匹中１匹、実験Ｎｏ．９で得られた生理食塩水に懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが５匹中０匹、実験Ｎｏ．１０で得られた生理食塩水に懸濁した３．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが５匹中０匹、実験Ｎｏ．１１で得られたＰＢＳに懸濁した１．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが５匹中０匹、実験Ｎｏ．１２で得られたＰＢＳに懸濁した３．０重量％、平均粒径１００μｍのヒアルロン酸ゲルスラリーが５匹中１匹と、ヒアルロン酸ゲルスラリーが優れた癒着防止作用があることが示唆された。
【００５５】
【発明の効果】
以上、本発明によれば、ヒアルロン酸単独で形成された難溶性のヒアルロン酸ゲルをスラリーとすることにより、特に生体適合性の高い医用材料が得られる。
Claims (14)
- ヒアルロン酸単独で形成され、且つ平均粒径が１，０００μｍ以下のゲルを含有する、スラリー濃度が０．１〜５重量％のヒアルロン酸ゲルスラリー。
- 請求項１に記載のヒアルロン酸ゲルスラリーであって、
a)ヒアルロン酸水溶液を冷凍し、ヒアルロン酸ゲルを調整する工程と、
b)前記ヒアルロン酸ゲルと水溶液とを混合し、前記ヒアルロン酸ゲルを含む水溶液を調整する工程と、
を含む生産方法で得られる、ヒアルロン酸ゲルスラリー。 - 請求項２に記載のヒアルロン酸ゲルスラリーであって、
c) 前記ヒアルロン酸ゲルを含む水溶液に対して破砕処理する工程、
をさらに含む生産方法で得られる、ヒアルロン酸ゲルスラリー。 - 請求項２または３に記載のヒアルロン酸ゲルスラリーであって、
前記ヒアルロン酸水溶液中のヒアルロン酸濃度が５重量％以下である、
ヒアルロン酸ゲルスラリー。 - 請求項１に記載のヒアルロン酸ゲルスラリーであって、
d)ヒアルロン酸水溶液を冷凍し、粒状ヒアルロン酸ゲルを含む水溶液を調整する工程と、
e)前記粒状ヒアルロン酸ゲルを含む水溶液をフィルターに供し、粒状ヒアルロン酸ゲルを分離する工程と、
f)工程e)で分離した粒状ヒアルロン酸ゲルと水溶液を混合する工程と、
を含む生産方法で得られる、ヒアルロン酸ゲルスラリー。 - 請求項５に記載のヒアルロン酸ゲルスラリーであって、
前記ヒアルロン酸水溶液中のヒアルロン酸濃度が０．００５〜０．５重量％である、
ヒアルロン酸ゲルスラリー。 - 請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒアルロン酸ゲルスラリーを含有することを特徴とする医用材料。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒアルロン酸ゲルスラリーを含有することを特徴とする化粧料。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒアルロン酸ゲルスラリーを含有することを特徴とする、癒着防止剤。
- 請求項１に記載のヒアルロン酸ゲルスラリーの生産方法であって、
g)ヒアルロン酸水溶液を冷凍し、ヒアルロン酸ゲルを調整する工程と、
h)前記ヒアルロン酸ゲルと水溶液とを混合し、前記ヒアルロン酸ゲルを含む水溶液を調整する工程と、
を含む生産方法。 - 請求項１０に記載のヒアルロン酸ゲルスラリーの生産方法であって、
i) 前記ヒアルロン酸ゲルを含む水溶液に対して破砕処理する工程、
をさらに含む生産方法。 - 請求項１０または１１に記載のヒアルロン酸ゲルスラリーの生産方法であって、
前記ヒアルロン酸水溶液中のヒアルロン酸濃度が５重量％以下である、
生産方法。 - 請求項１に記載のヒアルロン酸ゲルスラリーの生産方法であって、
j)ヒアルロン酸水溶液を冷凍し、粒状ヒアルロン酸ゲルを含む水溶液を調整する工程と、
k)前記粒状ヒアルロン酸ゲルを含む水溶液をフィルターに供し、粒状ヒアルロン酸ゲルを分離する工程と、
l)工程k)で分離した粒状ヒアルロン酸ゲルと水溶液を混合する工程と、
を含む生産方法。 - 請求項１３に記載のヒアルロン酸ゲルスラリーの生産方法であって、
前記ヒアルロン酸水溶液中のヒアルロン酸濃度が０．００５〜０．５重量％である、
生産方法。
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