JP4409287B2

JP4409287B2 - Ｈｉｖｒｔダイマー形成阻害剤を特定するアッセイ

Info

Publication number: JP4409287B2
Application number: JP2003517301A
Authority: JP
Inventors: ニコラススルイス−クレマー; マイケルパーニアック; アレックスペレティエール
Original assignee: ベーリンガーインゲルハイム（カナダ）リミテッド
Priority date: 2001-07-27
Filing date: 2002-07-26
Publication date: 2010-02-03
Anticipated expiration: 2022-07-26
Also published as: DE60220168T2; ES2284893T3; CA2450871C; DE60220168D1; EP1415006B1; US6811970B2; AU2002355761A1; WO2003012127A2; WO2003012127A3; DK1415006T3; JP2004535832A; ATE362550T1; EP1415006A2; US20030087379A1; CA2450871A1

Description

発明の詳細な説明

技術分野
本発明は、ＨＩＶ−１逆転写酵素（ＲＴ）のダイマー形成過程を測定する新規なアッセイに関する。本発明は特に、前記ダイマー形成過程を阻害する薬剤のための高処理スクリーニングへの応用に適した新規な方法に関する。

背景技術
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の逆転写酵素（ＲＴ）は、一本鎖ゲノムＲＮＡを二本鎖プロウイルスＤＮＡに変換することによってＨＩＶの複製に主要な役割を果たし、エイズ治療の開発において主要な標的の１つとなっている。これまでに報告されたＲＴ阻害剤の大半は、ヌクレオシド類似体であれ非ヌクレオシド阻害剤であれ、ＲＴのポリメラーゼ活性を標的にしていたが、毒性および耐性株の出現を含むいくつかの限界を有する。
感染性ビリオンで見出されるＨＩＶＲＴの生物学的に適切で活性な形態は２つのポリペプチド（ｐ６６およびｐ５１）を含むヘテロダイマーである。ｐ５１は、ウイルス成熟時にｐ６６のＣ−末端ドメインのタンパク分解切断によってｐ６６から派生する。66kDaおよび51kDa形の２つのサブユニットは１対１の比で存在する。このヘテロダイマーＲＴは二工程のダイマー形成過程で生成される。そのカイネティクスは、２つのサブユニットが急速に会合して未成熟ダイマーを形成する工程、続いて緩徐な構造変化により完全に活性な形態が生成される工程を含む（ｐ６６＋ｐ５１−＞未成熟ｐ６６／ｐ５１−＞活性なｐ６６／ｐ５１（Divita et al. 1995, J. Mol. Biol. 245:508-521,12,13））。
ＨＩＶ−１ＲＴのＤＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレアーゼＨ活性は本酵素のダイマー構造に依存する（Restle et al. 1990, J. Biol. Chem. 265:8986-8988; Restle et al. 1992, FEBS Letters 300:97-100）。これらのサブユニットのダイマー形成が酵素活性に必要であるため、ＨＩＶ−１ＲＴのダイマー形成阻害は抗ＨＩＶ化合物の開発に適切な目標となろう。該当事例：ＲＴのｐ５１サブユニットの親指ドメインに由来する合成ペプチドは“成熟”過程を阻害する（Morris et al. 1999, Biochemistry 38:15097-15103）。ＲＴダイマーの生成および／または安定性を損なう化合物はしたがって新規な部類の抗ウイルス化合物となろう。

いくつかの文献でｐ５１−ｐ６６ダイマー形成過程のカイネティクスの測定を目的とする会合−解離アッセイが開示された（Cabodevilla et al. 2001, Eur. J. Biochem. 2681:1163-1172; Morris et al. 1999, J. Biol. Chem. 274(35):24941-24946; Divita et al. 1995, Biochemistry 34:16337-16346; Divita et al. 1994, J. Biol. Chem. 269(18):13080-13083; Divita et al. 1993, FEBS Letters 324(2):153-158; Becerra et al. 1991, Biochemistry 30:11707-11719）。前記アッセイは全て以下のいずれかによってダイマー形成を測定する：サイズ排除ＨＰＬＣ；サンプルのＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定；免疫沈澱；またはタンパク質の固有蛍光放出のモニタリング。前記文献のいずれもＨＴＳ様式に適した結合アッセイを開示していない。
Tachedjianら（2000, PNAS 97(12):6334-6339）は、ＲＴダイマー形成の会合−解離過程を調べるために酵母２ハイブリッド系を開示した。しかしながら、前記系は大量の潜在的阻害剤を評価する高処理アッセイには容易に適合させることができない。
Howardら（1991, J. Biol. Chem., 266(34):23003-23009）は、ダイマー形成を阻害することによって作用する治療剤をモニターするアッセイ系を提唱した。この文献にもまた、ヘテロダイマー形成の潜在的阻害剤の特定に適した高処理スクリーニングに使用することができる結合アッセイは開示されていない。

発明の要旨
本発明は、ＨＩＶＲＴのダイマー形成に抗する活性について極めて多数の化合物を判定するために適切な高処理アッセイを提供する。本発明のアッセイの一般的原理は、限定濃度の解離剤（すなわち変性剤（例えば尿素））の存在下でｐ６６／ｐ６６ホモダイマー（検出可能な成分で適切に標識されてあるか、および／またはアフィニティータグが付加されてある）を解離させ、前記とｐ５１ＲＴサブユニットとを接触させ、さらに変性剤を含まない（または変性剤が減少した）緩衝液の存在下で前記混合物をインキュベートしてＲＴサブユニットを再会合させ、続いて再構成された一切のｐ５１／ｐ６６ＲＴヘテロダイマーをアフィニティー捕捉することを含む。洗浄して未結合物質を除去した後、アフィニティー結合物質の量は、検出可能成分のレベルを測定することによって（また別には、再構成されたＲＴポリメラーゼ活性を測定することによって（この場合ｐ６６サブユニットは必ずしも標識する必要はない））評価され、前記はアフィニティー結合標識ｐ６６／ｐ５１ＲＴヘテロダイマーの量に比例する。本アッセイはテスト化合物の存在下または非存在下で実施され、それによって、コントロールと比較してテスト化合物存在下のｐ６６モノマーサブユニットとｐ５１サブユニットとの会合における変化は、前記テスト化合物がＲＴダイマー形成の調節物質であることを示す。

本発明の第一の特徴では、ＨＩＶＲＴのヘテロダイマー形成を測定する方法が提供される。前記方法は以下の工程を含む：
ａ）解離剤の存在下でｐ６６サブユニットホモダイマーを含む第一の溶液を提供し；
ｂ）前記第一の溶液をｐ５１ＲＴサブユニットと接触させ、再会合緩衝液の存在下でインキュベートしてｐ６６／ｐ５１ＲＴサブユニット複合体の会合を可能にし、ここで前記サブユニットの１つはアフィニティータグを含み、前記サブユニットの他方は検出可能標識を含み；
ｃ）工程ｂ）のインキュベート物とアフィニティー媒体とを、ｐ６６／ｐ５１複合体が前記アフィニティー媒体と結合することができる条件下で接触させ；さらに
ｄ）前記アフィニティー媒体と結合した検出可能標識のレベルを測定することによって（または再構成されたＲＴポリメラーゼ活性を測定することによって）、生成された複合体の量を決定する。
本発明の第二の特徴では、以下を含むＨＩＶＲＴヘテロダイマー形成を調節することができる化合物を特定する方法が提供される：
上記ａ）からｄ）の工程をテスト化合物の存在下または非存在下で実施し；さらに
ｅ）テスト化合物サンプルと前記テスト化合物を欠くコントロールサンプルとを比較して、それにより、テスト化合物サンプルのｐ６６／ｐ５１複合体形成の調節が前記化合物のヘテロダイマー形成調節能力を示す。

本発明の第三の特徴では、以下を含むＨＩＶＲＴヘテロダイマー形成を妨害することができる化合物を特定する方法が提供される：
上記ａ）からｄ）の工程をテスト化合物の存在下または非存在下で実施し；さらに
ｅ）テスト化合物サンプルと前記テスト化合物を欠くコントロールサンプルとを比較して、それにより、テスト化合物サンプルのｐ６６／ｐ５１複合体形成の減少が前記化合物のヘテロダイマー形成阻害能力を示す。
本発明の第四の特徴では、以下を含むＨＩＶＲＴヘテロダイマー形成を強化することができる化合物を特定する方法が提供される：
上記ａ）からｄ）の工程をテスト化合物の存在下または非存在下で実施し；さらに
ｅ）テスト化合物サンプルと前記テスト化合物を欠くコントロールサンプルとを比較して、それにより、テスト化合物のサンプルのｐ６６／ｐ５１複合体形成の増加が前記化合物のヘテロダイマー形成強化能力を示す。
本発明の第五の特徴では、以下の工程を含むＨＩＶＲＴのホモダイマー形成を測定する方法が提供される：
ａ）解離剤の存在下で第一のｐ６６サブユニットホモダイマーを含む第一の溶液を提供し；
ｂ）前記第一の溶液を第二のｐ６６サブユニットホモダイマーと前記解離剤の存在下で接触させ、さらに再会合緩衝液の存在下でインキュベートしてｐ６６／ｐ６６ＲＴサブユニット複合体の会合を可能にし、ここで前記サブユニットの１つはアフィニティータグを含み、前記サブユニットの他方は検出可能標識を含み；
ｃ）工程ｂ）のインキュベート物とアフィニティー媒体とを、前記ｐ６６／ｐ６６複合体が前記アフィニティー媒体と結合することができる条件下で接触させ；さらに
ｄ）前記アフィニティー媒体と結合した検出可能標識のレベルを測定することによって（または再構成されたＲＴポリメラーゼ活性を測定することによって）、生成された複合体の量を決定する。
本発明の第六の特徴では、以下を含むＨＩＶＲＴホモダイマー形成を調節することができる化合物を特定する方法が提供される：
上記ａ）からｄ）の工程をテスト化合物の存在下または非存在下で実施し；さらに
ｅ）テスト化合物サンプルと前記テスト化合物を欠くコントロールサンプルとを比較して、それにより、テスト化合物サンプルのｐ６６／ｐ６６複合体形成の調節が前記化合物のホモダイマー形成調節能力を示す。

本発明の第七の特徴では、以下を含むＨＩＶＲＴホモダイマー形成を妨害することができる化合物を特定する方法が提供される：
上記ａ）からｄ）の工程をテスト化合物の存在下または非存在下で実施し；さらに
ｅ）テスト化合物サンプルと前記テスト化合物を欠くコントロールサンプルとを比較して、それにより、テスト化合物のサンプルのｐ６６／ｐ６６複合体形成の減少が前記化合物のホモダイマー形成阻害能力を示す。
本発明の第八番目の特徴では、以下を含むＨＩＶＲＴホモダイマー形成を強化することができる化合物を特定する方法が提供される：
上記ａ）からｄ）の工程をテスト化合物の存在下または非存在下で実施し；さらに
ｅ）テスト化合物サンプルと前記テスト化合物を欠くコントロールサンプルとを比較して、それにより、テスト化合物サンプルのｐ６６／ｐ６６複合体形成の増加が前記化合物のホモダイマー形成強化能力を示す。
本発明の第九番目の特徴では、ＨＩＶＲＴヘテロダイマー形成を調節する潜在能力をもつ化合物をテストするキットが提供される。前記キットは、複数のアフィニティータグ付加ｐ６６サブユニットホモダイマー、複数の標識ｐ５１ＲＴサブユニット、解離剤、再会合緩衝液、アフィニティー媒体、および前記転写酵素と結合するテスト化合物を特定するために前記サブユニットを使用する態様についての指示物を含む。
本発明の第十番目の特徴では、ＨＩＶＲＴホモダイマー形成を調節する潜在能力をもつ化合物をテストするキットが提供される。前記キットは、複数のアフィニティータグ付加ｐ６６サブユニットホモダイマー、複数の標識ｐ６６ＲＴサブユニット、解離剤、再会合緩衝液、アフィニティー媒体、および前記転写酵素と結合するテスト化合物を特定するために前記サブユニットを使用する態様についての指示物を含む。
本発明の他の目的、利点および特色は、添付の図面（前記は典型例であり、本発明の範囲を制限するものと解してはならない）を参考にしながら以下の好ましい実施態様の非制限的記述を読むことにより明白となるであろう。

好ましい実施態様の説明
定義
また別に特定しないかぎり、本明細書で用いられる全ての技術的および学術的用語は当業者が一般的に理解している意味と同じ意味を有する。
本明細書で用いられるように、“標識”、“検出可能標識”または“検出可能マーカー”という用語は、ｐ６６またはｐ５１に連結させて直接的または間接的にサブユニットを検出、測定および定量できるようにサブユニットの認識を可能にする任意のグループを指す。そのような“標識”の例には蛍光標識、化学発光標識、比色標識、酵素マーカー、放射性同位元素およびアフィニティータグ（例えばビオチン）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。そのような標識はｐ６６またはｐ５１に周知の方法によって結合される。本発明では１つの標識または複数の標識をｐ６６またはｐ５１の任意の場所に導入することができる。例えば前記標識は、このタンパク質のＣ−末端もしくはＮ−末端またはその主要な鎖の内部のいずれかに存在することができる。

本明細書で用いられるように、“アフィニティー標識”または“アフィニティータグ”という用語は標識を指し、前記は相補的なアフィニティーリガンドによって特異的に捕捉される。アフィニティータグ／アフィニティーリガンド対の例には、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）／マルトース；グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／グルタチオン；ストレプトアビジンタグ／ストレプトアビジンもしくはニュートラビジン；またはヒスチジン（Ｈｉｓ）／金属が含まれるが、ただしこれらに限定されない。アフィニティーリガンドとして用いられる金属は、コバルト、亜鉛、銅、鉄およびニッケルから成る群から選択することができる（Wong et al. (1991), Separation and Purification Methods, 20(1):49-106）。本発明のアフィニティータグはｐ６６またはｐ５１の任意の場所に導入することができる。例えば前記タグは、本タンパク質のＣ−末端もしくはＮ−末端またはその主要鎖内のいずれかに存在することができるが、好ましくは本タンパク質のＮ−末端に存在する。好ましくは前記選択される金属はニッケルである。前記アフィニティーリガンドは固相、例えばビーズ、マイクロプレートのウェル、またはアフィニティークロマトグラフィーによる分離を容易にするためにカラムにセットすることができる。前記アフィニティータグは、周知の方法を用い遺伝子組換えによりｐ６６またはｐ５１に導入することができる。

“モノマー”および“モノマーｐ６６”または“モノマーサブユニット”という用語は、ダイマーｐ６６の単体サブユニットを指す。前記モノマーサブユニットは天然に存在するモノマーサブユニットの正確な複製物であってもよいし、生物学的に活性な類似体もしくは生物学的に不活性な類似体（ネガティブドミナント）であってもよい。
本明細書で用いられる“サブユニット”という用語は、ｐ６６またはｐ５１のいずれかを指す場合は、ホモダイマーＲＴ（ｐ６６／ｐ６６）またはヘテロダイマーＲＴ（ｐ６６／ｐ５１）の１つまたは２つの構成成分を意味する。
本明細書で用いられる“ホモダイマー”という用語は、両サブユニットが同じものであるダイマー分子（例えばｐ６６／ｐ６６）を指す。
本明細書で用いられる“ホモダイマー形成”という用語は、同じサブユニット（すなわちｐ６６）がダイマーを形成する過程を指す。
本明細書で用いられる“ヘテロダイマー”という用語は、２つの構成サブユニットが異なっている（例えばｐ６６およびｐ６６）ダイマー分子を指す。
本明細書で用いられる“ヘテロダイマー形成”という用語は、２つの異なるサブユニット（すなわちｐ６６およびｐ５１）がダイマーを形成する過程を指す。
本明細書で用いられる“解離剤”という用語は、マルチ成分複合体を個々のサブユニットに解離させることができる物質を指す。
本明細書で用いられる“再会合緩衝液”という用語は、個々のサブユニットのマルチ成分複合体への会合を促進する緩衝液を指す。
本明細書で用いられる“変性剤を含まない”という用語は、解離剤が大半のサブユニットの結合を妨げるために十分な量ではもはや存在しない状態を指す。
本明細書で用いられる“アフィニティー媒体”という用語は、アフィニティータグの捕捉に適したアフィニティーリガンドで被覆された固相支持体、例えばマイクロタイタープレートのウェル、ビーズまたはカラムである。

好ましい実施態様
第一の実施態様の第一の好ましい特徴では、ＨＩＶＲＴのヘテロダイマー形成を測定する方法が提供される。前記方法では、好ましくは工程ａ）の第一の溶液はトリス−塩酸、ＨＥＰＥＳまたはビス−トリスから選択される緩衝液を含む。より好ましくは、前記緩衝液は０mMから50mMの濃度のトリス−塩酸である。もっとも好ましくは前記緩衝液は25mMの濃度のトリス−塩酸である。
好ましくは、工程ａ）の第一の溶液はＮａ₂ＳＯ₄またはＭｇＣｌ₂から選択される塩を含む。より好ましくは、前記塩は０mMから100mMの濃度のＭｇＣｌ₂である。
第一の実施態様の好ましい特徴では、工程ａ）の解離剤は、尿素、塩酸グアニジンまたはアセトニトリルから選択される。より好ましくは、前記解離剤は１から3.5Ｍの濃度の尿素である。
好ましくは、工程ｂ）の再会合緩衝液はｐ６６／ｐ６６サブユニットの解離に用いられた緩衝液と同じであるが、好ましくは変性剤を含まない。より好ましくは、前記再会合緩衝液は前記変性剤緩衝液に対して過剰な量で存在し、ｐ６６およびｐ５１サブユニットの再会合を許容するために十分に前記解離剤を希釈することができる。もっとも好ましくは、前記再会合緩衝液は前記解離緩衝液に対して１０倍過剰で添加される。
好ましくは、工程ｂ）の再会合緩衝液はさらにＮａ₂ＳＯ₄またはＭｇＣｌ₂から選択される塩を含む。より好ましくは、前記塩は０mMから100mMの濃度のＮａ₂ＳＯ₄である。もっとも好ましくは、前記塩は50mMの濃度のＮａ₂ＳＯ₄である。

好ましくは、工程ｂ）のｐ５１はアフィニティータグが付加されてあるか、または検出可能標識を有する。より好ましくは、前記工程ｂ）のｐ５１はアフィニティータグが付加されてある。
好ましくは、工程ｂ）のｐ６６は検出可能標識を有するか、またはアフィニティータグが付加されてある。より好ましくは、前記工程ｂ）のｐ６６は検出可能標識を有する。
好ましくは、工程ｂ）のアフィニティータグは、ヘキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧ、Ｔ７、ＨＡ、ＧＳＴまたはビオチンから成る群から選択される。より好ましくは、前記アフィニティータグはヘキサヒスチジンである。
第一の実施態様の別の好ましい特徴では、工程ｂ）において、検出可能標識は以下から成る群から選択される：蛍光標識（例えばフルオレセイン、オレゴングリーン、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリンまたはＥｕ³⁺）、放射性原子（例えば³Ｈまたは¹²⁵Ｉ）、化学発光標識（例えばルシフェリン）、ｐ６６に特異的またはｐ６６に結合させたタグに特異的な検出可能な抗体（好ましくは前記ｐ６６のタグはヘキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧ、Ｔ７、ＨＡ、ＧＳＴまたはビオチンから成る群から選択される）、および酵素マーカー（例えばβ−ガラクトシダーゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼ）。より好ましくは、前記標識は、フルオレセイン、オレゴングリーン、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリンおよびＥｕ³⁺から成る群から選択される蛍光標識である。もっとも好ましくは前記蛍光標識はＥｕ³⁺である。
好ましくは、工程ｂ）の検出可能標識は、ｐ６６のＮ−末端プロリン残基の代わりに遺伝子組換えにより導入されたシステイン残基に付加される。
前記検出可能標識は、当業者に周知の適切な手段、例えばフルオロメーター、放射能カウンター、比色計または化学発光計測装置によって測定される。

第一の実施態様の別の好ましい特徴では、工程ｃ）において、アフィニティー媒体は固相である。前記は例えばマイクロプレートウェルまたはビーズであり、アフィニティータグの捕捉に適切なアフィニティーリガンドで被覆されている。より好ましくは、前記マイクロプレートウェルは、Ｎｉ²⁺、抗タグ抗体、グルタチオンまたはストレプトアビジンから成る群から選択されるレセプターで被覆される。もっとも好ましくは、前記マイクロタイターウェルはＮｉ²⁺で被覆され、好ましくはアフィニティータグはヒスチジンタグである。アフィニティータグとアフィニティーリガンドの適切な組合せは当業者には理解されよう。
第一の実施態様の別の好ましい特徴では、工程ｄ）はさらに未結合物質を除去するための洗浄工程を含み、アフィニティー媒体に結合した標識の量は適切な態様で測定され（または再構成されたＲＴのポリメラーゼ活性が測定され）、この場合、前記アフィニティー媒体に結合する物質は標識ｐ５１／ｐ６６ＲＴヘテロダイマーの量に比例する。
当業者には容易に理解されるところであるが、ｐ６６モノマーとｐ５１のインキュベーションをもたらす本アッセイの一連の工程を改変して同じ結果を得ることができる。例えば、ｐ５１ＲＴサブユニットはｐ６６サブユニットとのインキュベーションの前に固相に固定することができる。同様に、サブユニット会合を促進する緩衝液の希釈は、ｐ６６とｐ５１サブユニットの混合と同時に、またはｐ６６溶液をｐ５１と接触させた後で実施してもよい。
同様に、テスト化合物の接触は本アッセイの原理に影響を与えないで別個の工程で実施してもよい。例えば、テスト化合物は、解離剤の添加前に；ｐ５１サブユニットとの混合前に；再会合緩衝液による希釈前に；または再会合緩衝液による希釈と同時にｐ６６ホモダイマー溶液に添加することができる。

実施例
材料と方法
１．ＲＴ発現プラスミド
ＨＩＶ−１ＲＴ（HXB2株）の51kDaサブユニットの遺伝子をｐBADHisB原核細胞発現系（Invitrogen）のXhoIおよびHindIII制限部位の間でクローニングし、pBAD-HisRT51を得た。この構築物は、適切な細菌株（例えば大腸菌のJM109株）の形質転換後に、アラビノースで誘発してＮ−末端ポリペプチドヒスチジン（６ｘＨｉｓ）融合タンパク質としてＲＴｐ５１サブユニットの発現を可能にする。
蛍光検出を可能にする試薬を含む66kDaＲＴサブユニットの特異的標識を提供するために、クイックチェンジ（Quick Change（登録商標））位置特異的突然変異誘発キット（Stratagene）を用いて位置特異的突然変異誘発を実施し、P2C/C38S/C280SRTを作製した。前記は野生型（ＷＴ）ＲＴの２つのシステイン残基（Ｃ38、Ｃ280）が除去され、サブユニットのＮ−末端近くに１個のＣｙｓ残基が挿入されている。
ＨＩＶ−１ＲＴの野生型およびP2C/C38S/C280SRT（配列番号１）の66kDaサブユニットの遺伝子をpKK223-3原核細胞発現系（Amersham Pharmacia Biotech）のEcoR1とHindIII制限部位の間でクローニングし、それぞれｐKK-RT66WTおよびｐKK-RT66-P2Cを得た。これらのベクターはHISタグ非付加66kDaＲＴサブユニットのＩＰＴＧ依存発現を提供する。

２．ＲＴダイマー形成のＴＲＦアッセイのための試薬
デルフィア（Delfia）Ｅｕ−Ｎ１−ヨードアセトアミドキレートおよびＥｕ⁺³標準物、デルフィア強化溶液およびデルフィア洗浄濃縮液はパーキンエルマー（Perkin Elmer）から購入した。
超精製尿素、トリス（オキシメチル）アミノメタンおよび水はフルカ（Fluka）から入手した。塩化マグネシウム（SigmaUltra）およびジエチレントリアミン−四酢酸（ＤＴＰＡ）はシグマ（Sigma）から得た。
96ウェルのＮｉ−ＮＴＡ HisSorbプレート（無色）はキアゲン（Qiagen）またはピアス（Pierce）から購入した。蛍光測定は、スペクトラマックス（SpectraMAX）ジェミニ（Gemini）ＸＳマイクロプレートフルオロメーター（Molecular Devices）で実施した。
３．ＲＴｐ５１サブユニットモノマーおよびＲＴｐ６６／ｐ６６ホモダイマーの発現と精製
pBAD-HisRT51で形質転換させた大腸菌JM109を“テリフィックブロス（Terrific broth）”で中間対数増殖期まで増殖させた（ＯＤ₆₀₀は0.5）。続いてｐ５１ＲＴの発現を１％アラビノースの添加により誘発した。さらに３時間インキュベートした後、細胞を遠心沈澱で採集し、バグバスター（BugBuster（登録商標））タンパク抽出試薬（Novagen）を用いて溶解させた。His-Bind樹脂（Novagen）を用いＮｉ⁺²−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによりｐ５１ＲＴを溶解物から精製した。溶解および抽出はともに製造元の説明書にしたがって実施した。Ｎｉ⁺²−ＮＴＡ樹脂から溶出させた後、NAP（登録商標）25カラム（Amersham Pharmacia Biotech）を２回通過させて60mM塩化マグネシウムおよび50％グリセロールを含む50mMトリス−塩酸（ｐH7.5、４℃）にｐ５１ＲＴの緩衝液を交換し、最終的なタンパク質サンプルを部分標本として−80℃で保存した。精製ｐ５１ＲＴはもっぱらモノマーとして存在する。
野生型および変異体ｐ６６ＲＴの発現は、１リットルの適切に形質転換させた中間対数増殖期の大腸菌JM109細胞（“テリフィックブロス”で37℃で増殖）に１mMのＩＰＴＧを添加して誘発させた。ＩＰＴＧの添加後、細菌の増殖をさらに５時間32℃で継続した。遠心沈澱により細胞を採集した。ｐ６６ＲＴの精製は以前に報告されたように実施した（Fletcher et al. 1996, “Single step purification of HIV-1 recombinant wild type and mutant reverse transcriptase”, Protein Expression & Purification 7:27-32）。精製ｐ６６ＲＴはもっぱらホモダイマーとして存在する。

４．P2C/C38S/C280Sのｐ６６／ｐ６６ＲＴのＥｕ ⁺³ −Ｎ１−ヨードアセトアミドキレートによるアルキル化
精製したP2C/C38S/C280Sのｐ６６／ｐ６６ＲＴを、100mMのＮａＣｌおよび１mMのＴＣＥＰ−塩酸（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（Pierce））を含む50ｍMトリス−塩酸緩衝液（ｐH7.9、20℃）中で約20μM（約2.5mg／mL）に室温で濃縮した。Ｅｕ−Ｎ１−ヨードアセトアミドキレートタンパク質−改変試薬の部分標本（ＤＭＳＯで５mMのストック溶液として調製）を添加して、ｐ６６サブユニット濃度に対して約20倍モル過剰にした。アルキル化反応を室温で６時間進行させた。また別には、前記反応は４℃で一晩実施してもよい。反応終了時に、過剰のＤＴＴを添加して未反応Ｅｕ−Ｎ１−ヨードアセトアミドキレートを消費させた。60mM塩化マグネシウムおよび50％グリセロールを含む25mMトリス−塩酸緩衝液（ｐH7.5、20℃）で平衡化させたNAP（登録商標）25カラムに２回通して、アルキル化したｐ６６／ｐ６６ＲＴをＤＴＴ−試薬共役物から分離した。標識の化学量論については、ｐ６６ＲＴサブユニット1モルにつきＥｕ−Ｎ１−ヨードアセトアミドは概して0.7−１モルであることが判明した（すなわち、1.5−２モル／モルｐ６６／ｐ６６ＲＴホモダイマー）。

変異体と化学的改変ＲＴタンパク質のカイネティクスの特徴から、P2C/C38S/C280Sのｐ６６／ｐ６６ＲＴは、野生型ｐ６６／ｐ６６ホモダイマー酵素に匹敵するＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＤＤＰ）比活性を有することが示された（データは提示されていない）。Ｅｕ−Ｎ１−ヨードアセトアミドキレート樹脂で化学的にアルキル化したP2C/C38S/C280Sのｐ６６／ｐ６６ＲＴは、非改変タンパク質のＲＤＤＰ活性の約８０％を保持する（表１）。さらにまた、改変ＲＴは、未改変P2C/C38S/C280Sｐ６６／ｐ６６ＲＴ変異体のように、ＴＳＡＯｅ³Ｔによる阻害に等しく感受性を示し（表２）、したがって野生型ｐ６６／ｐ６６ＲＴと同等な感受性を有する（データは提示されていない）。したがって、ダイマー形成アッセイのための試薬の調製に要求されるＲＴの遺伝的および化学的加工は、本アッセイプロトコルのパラメーター内では酵素の反応に対してほとんど影響を与えないように思われる。

表１：P2C/C38S/C280Sｐ６６／ｐ６６ＲＴのＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
（ＲＤＤＰ）およびＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＤＤＰ）比活性

表２：P2C/C38S/C280Sｐ６６／ｐ６６ＲＴのＨＩＶＲＴ阻害剤による阻害

５．ｐ６６−ｐ５１ＲＴダイマー形成をモニターするマイクロプレートアッセイ
本アッセイの原理は、Ｈｉｓ６Ｘ−ｐ５１と蛍光発光団標識ｐ６６ＲＴの溶液中での混合、それに続く生成されたＨｉｓ６Ｘ−ｐ５１／蛍光発光団標識ｐ６６ＲＴヘテロダイマーのＮｉ²⁺−ＮＴＡマイクロプレート上での固相捕捉を含む。未結合物質除去のための洗浄後、マイクロプレートに結合した蛍光の量を適切な蛍光プレート読取装置で測定する。また別には、再構成されたＲＴのポリメラーゼ活性を蛍光性ＲＮＡ／ＤＮＡインターカレーター（例えばピコグリーン（PicoGreen（登録商標））を用いて決定することができる。
精製されたリコンビナントｐ５１ＲＴがモノマーとして存在する場合は、精製ｐ６６ＲＴはもっぱらダイマーである。ｐ６６／ｐ６６ＲＴホモダイマーのサブユニット会合エネルギーはｐ５１／ｐ６６ＲＴヘテロダイマーのそれよりほんのわずか小さいだけであるので、ｐ５１とｐ６６／ｐ６６ＲＴの単純な混合後のヘテロダイマーの形成は非常に遅く、高処理アッセイでは不便である。したがって、タンパク質の二次構造に顕著な影響を与えることなくｐ６６／ｐ６６ホモダイマーを解離させるために必要な変性剤の最適タイプおよび濃度を決定するために検索を実施した。尿素が変性剤として塩化グアニジンよりも優れていることが判明した。ｐ６６／ｐ６６解離およびタンパク質の変性（タンパク質の二次構造における変化）に対する尿素濃度の影響は図１に示されている。本ダイマー形成アッセイ系におけるＴＲＦシグナルの最大化に最適な尿素濃度は図３に提示される。

図１、２および３に示したデータを含む種々のデータにより１−3.5Ｍの尿素が最適であることが判明した。ＨＩＶ−１ＲＴのサブユニットの境界面に多数のトリプトファン残基が存在する。これらは本質的に“埋没されてあり”、したがってＲＴが280−295ｎｍの間の波長で励起されるとき約335ｎｍの蛍光が放射される。図1Ａに示されているように、これらの残基は、λ_max ^emのレッドシフトが350ｎｍに向かうことによって示されるように、尿素濃度の増加にしたがいだんだんと“溶媒に露出される”ようになる。しかしながら同時に、この尿素濃度はＲＴ分子の楕円率にほとんど影響をもたず（図１Ｂ）、タンパク質の二次構造は顕著には変化しないであろうと示唆される（すなわち、タンパク質の顕著な“変性”は発生しなかった）。このことは、タンパク質のトリプトファン残基の溶媒露出の増加は主としてＲＴサブユニットの解離から生じることを示唆している。尿素濃度を関数としたＲＴへのＡＮＳ結合の変化（図1Ｃ）はこの解釈と一致する。
図２は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した場合の尿素を関数としたｐ６６／ｐ６６ＲＴのダイマー形成の変化を示す。この事例では、ホモダイマーの解離は本質的に２Ｍの尿素で完了するようであり、ｐ６６モノマーの変性／凝集の進行は、尿素濃度の増加にしたがってピークがより大きな分子量にゆっくりとシフトするときに生じるように思われる。図３は、標識ＲＴｐ６６／ｐ６６ホモダイマーとＨｉｓタグ付加ｐ５１モノマーを０−６Ｍの間の尿素濃度でインキュベートし、その後でニッケル被覆マイクロプレートに前記混合物を添加したときに時間決定（time resolved）ＲＴサブユニット再会合アッセイで得られたシグナルを示す。したがって、ＲＴ二次構造に対する有害な影響が最小で最高レベルの再会合を提供するように思われる濃度範囲として１−3.5Ｍの尿素を選択した。

さらに別の実験によって、再生緩衝液で100mMのＭｇＣｌ₂よりも50mMのＮａ₂ＳＯ₄を使用した方が、アッセイのバックグラウンドに対してＴＲＦ特異的シグナルが顕著に強化されることが示された（表３）。

表3：再生緩衝液の塩濃度を関数としたＲＴダイマー形成アッセイの
シグナル対ノイズ比

６．ＲＴサブユニット破壊物質およびＲＴサブユニット会合阻害剤の抗ウイルス活性
アッセイプロトコル
アッセイ概念は図５Ａに示されている。総容積を２０μＬとして、100pmolの精製Ｈｉｓ６ｘ−ｐ５１ＲＴサブユニットおよび200pmolのＥｕ−Ｎ１−ヨードアセトアミドキレート標識ｐ６６ＲＴサブユニット（すなわち100pmolのＲＴｐ６６／ｐ６６ホモダイマー）を尿素（25mMのトリス−塩酸（pH7.5、20℃、100mMのＭｇＣｌ₂含有）で調製）とともに混合し、3.5Ｍの尿素最終濃度を提供する。前記混合物を室温で１時間インキュベートする。
この溶液を、96ウェルのNi-NTA HiSorbプレートのウェル中の問題の化合物溶液200μＬ（50mM, Ｎａ₂ＳＯ₄を含むトリス−塩酸緩衝液（25mM、pH7.5、20℃）で調製）で希釈する。
前記希釈工程は10倍希釈を提供し、尿素濃度を3.5Ｍから0.35Ｍに低下させ、それによってＲＴｐ６６／ｐ５１ヘテロダイマーの形成を可能にする。ダイマー形成を６時間進行させ、続いてプレートを200μＭのＤＴＰＡを含むデルフィア（Delfia）洗浄緩衝液で３回洗浄する。洗浄後、200μＬのデルフィア強化溶液を各ウェルに添加し、続いて室温で30分インキュベートする。蛍光測定は、モレキュラーデバイシーズ（Molecular Devices）スペクトラマックス（SpectraMAX）ジェミニ（Gemini）ＸＳ装置により、それぞれ335ｎｍ、615ｎｍおよび530ｎｍの励起、照射およびカットオフ波長を用いて実施した。前記様式を用いて、ＴＳＡＯｍ³Ｔは本アッセイでシグナルを低下させる（図５Ｂ）。ＴＳＡＯｍ³Ｔは、ＴＳＡＯ類の一部分であり、ＴＳＡＯｅ³Ｔと同程度にＲＴダイマー形成を阻害すると考えられる。さらにネビラピン（nevirapine）およびエファビレンズ（efavirenz）はともに非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤で、ＲＴダイマー形成を介する酵素を阻害しない。実際、前記２つのＮＮＲＴ阻害剤はＨＩＶ−１ＲＴのダイマー形成の化学的強化剤で、有害な構造変化によりポリメラーゼ活性の阻害をひき起こすことが報告された（Tachedjian et al. 2001, PNAS, 7188-7193）。本固有アッセイ様式では、図５Ｂに示したコントロールに対する％シグナルは前記の仮説を支持し、ＨＩＶＲＴダイマー形成過程の阻害剤／強化剤の特定に本アッセイが有用であることを示している。

また別には、再構成されたｐ６６／ｐ５１逆転写酵素のポリメラーゼ活性を測定してもよい。この様式では、ダイマー形成工程に続いて適切な緩衝液（ＤＴＴ、ＧＳＨおよびＣｈａｐを含むトリス、pH7.8）中に存在する必要物質（鋳型プライマー、ヌクレオチド、塩化マグネシウム）を直接ウェルに添加し、さらに１時間インキュベートし、その後で重合化反応の量を蛍光性ＲＮＡ／ＤＮＡインターカレーターを添加して測定する。一例は以下のとおりである：ホモダイマーｐ６６／ｐ６６（10−20pmol）を１Ｍ尿素（250mMの塩化ナトリウムを含む20mMトリス−塩酸（pH8.0）で調製）中のＨｉｓ−ｐ５１（25−50pmol）の存在下で最終容積10μＬで１時間インキュベートし、ホモダイマーを解離させる。続いて再会合緩衝液（50mMトリス−酢酸（pH8.0）、500mM塩化ナトリウム、0.05％Tween-20、0.01％ＢＳＡ）で最初の５倍希釈を会合緩衝液中のテスト化合物とともに１−２時間実施し、尿素濃度を200mMに低下させることによってヘテロダイマーを形成させる。最終工程は、100μＬの再会合緩衝液を含むニッケルプレートのウェルにサンプルを移すことによる再構成Ｈｉｓタグ付加ヘテロダイマーの捕捉および１時間のインキュベーションから成る。３回の洗浄後に37℃で１−２時間反応を進行させてから、ポリメラーゼアッセイカクテルを添加し、伸長ＲＮＡ／ＤＮＡ生成物を蛍光性インターカレーター、ピコグリーン（PicoGreen（登録商標））により検出する。

７．別のアッセイ様式
感染性ビリオンで見出されるＨＩＶＲＴの生物学的に適切で活性を有する形態は２つのポリペプチド（ｐ６６およびｐ５１）を含むヘテロダイマーである。ｐ５１は、ウイルス成熟時にそのＣ−末端ドメインのタンパク分解切断によってｐ６６から派生する。66kDaおよび51kDa形の２つのサブユニットは１対１の比で存在する。このヘテロダイマーＲＴは二工程のダイマー形成過程で生成される。そのカイネティクスは、ｐ６６およびｐ５１サブユニットが急速に会合して未成熟ダイマーを形成し、続いて緩徐な構造変化により完全に活性な形態が生成される工程を含む（ｐ６６＋ｐ５１−＞未成熟ｐ６６／ｐ５１−＞活性なｐ６６／ｐ５１（Divita et al. 1995, J. Mol. Biol. 245:508-521,12,13））。
しかしながら、さらに最近になって得られた証拠によってまた別のＲＴ生成機構が示唆された。前記機構は第一にｐ６６サブユニットからｐ６６／ｐ６６ホモダイマー形成、続いてＨＩＶプロテアーゼ切断によるｐ６６／ｐ５１ヘテロダイマーの形成を含む（口頭発表、Retrovirus 2001 Cold Spring Harbor, NY, May 26, 2001）。どの機構がウイルス複製中に支配的であるかはこの時点では明確ではなく、各経路を個々に調べるためにデザインされたスクリーニングアッセイは新規な治療方法を提供できよう。したがって、ｐ６６サブユニットのホモダイマー形成を阻害する潜在的能力をもつ化合物を探索することは本発明のまた別の特徴である。

図１は、ＨＩＶ−１ｐ６６／ｐ６６ＲＴタンパク質構造に対する尿素濃度の影響を示す。パネルＡは、尿素濃度の関数として固有タンパク質蛍光放射の最大波長における変化を示す。Ｆ350／335比の増加は、通常は埋没しているトリプトファン残基の水性溶媒への露出の増加を示す。222ｎｍでの分子の楕円率の増加は、ＲＴ二次構造消失の大きさである。パネルＣは、８−アニリノ−１−ナフタレン−スルホン酸（ＡＮＳ）とＲＴとの結合の変化を示す。前記変化はＲＴダイマーサブユニットの完全性に対応する。図２は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した、尿素濃度を関数としてｐ６６サブユニットのダイマー形成状態を示す。図３は、ＨＩＶ−１ＲＴｐ６６／ｐ５１ヘテロダイマー形成についてのＴＲＦ（Time Resolved Fluorescence（時間決定蛍光））アッセイで使用される最適尿素濃度を示す。図４は、尿素で変性させたＨｉｓ６Ｘ−ｐ５１ＲＴサブユニットとＥｕ−Ｎ１−ヨードアセトアミドキレート標識ｐ６６ＲＴサブユニットを100mMのＭｇＣｌ₂を含む“サブユニット会合”緩衝液に希釈した後の時間を関数として特異的ＴＲＦシグナルを示す。詳細は実施例に記載されている。図５は、アッセイ概念（パネルＡ）およびＴＲＦによって測定した、ＴＳＡＯ−ｍ³Ｔおよび他のＮＮＲＴＩによるＨＩＶ−１ＲＴダイマー形成阻害（パネルＢ）を示す。

Claims

ＨＩＶＲＴのｐ６６／ｐ５１サブユニットのヘテロダイマー形成を測定する方法であって、
ａ）タンパク質の二次構造に影響を与えることなくｐ６６サブユニットホモダイマーを解離させるのに十分な１〜３．５Ｍの濃度の解離剤としての尿素の存在下でｐ６６サブユニットホモダイマーを含む第一の溶液を提供する工程、
ｂ）前記第一の溶液をｐ５１ＲＴサブユニットと接触させ、さらに前記解離剤の濃度を元の濃度の１０分の１に減少させる量の、前記解離剤を含まない再会合緩衝液（50mM Ｎａ ₂ ＳＯ ₄ を含む25mM トリス−塩酸、pH7.5、20℃）の存在下でインキュベートしてｐ６６／ｐ５１ＲＴサブユニットの再構成ＲＴ複合体の会合を可能にする工程であって、前記サブユニットの一方はアフィニティータグを含み、さらに前記サブユニットの他方は検出可能標識を含む工程、
ｃ）工程ｂ）のインキュベート物とアフィニティー媒体とを、ｐ６６／ｐ５１複合体が前記アフィニティー媒体と結合することができる条件下で接触させる工程、及び
ｄ）洗浄して前記アフィニティー媒体と結合しなかった物質を除去した後、前記アフィニティー媒体と結合した検出可能標識のレベルを測定することによって生成した複合体の量を決定する工程
を含むことを特徴とする方法。
工程ｄ）において、前記複合体の量を、前記再構成ＲＴ複合体のポリメラーゼ活性を測定することによって決定する、請求項１に記載の方法。
前記尿素が3.5Ｍの濃度である、請求項１に記載の方法。
工程ｂ）のｐ５１が、アフィニティータグが付加されてあるかまたは検出可能標識を有する、請求項１に記載の方法。
工程ｂ）のｐ５１にアフィニティータグが付加されている、請求項４に記載の方法。
工程ｂ）のｐ６６が、検出可能標識を有するかまたはアフィニティータグが付加されてある、請求項１に記載の方法。
工程ｂ）のｐ６６が検出可能標識を有する、請求項６に記載の方法。
工程ｂ）のアフィニティータグが、ヘキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧ、Ｔ７、ＨＡ、ＧＳＴおよびビオチンから成る群から選択される、請求項４または６に記載の方法。
前記アフィニティータグがヘキサヒスチジンである、請求項８に記載の方法。
前記検出可能標識が、蛍光標識、放射性原子、化学発光標識、ｐ６６特異的またはｐ６６に結合させたタグに特異的な検出可能抗体、および酵素マーカーから成る群から選択される、請求項４または６に記載の方法。
前記検出可能標識が、フルオレセイン、オレゴングリーン、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリンおよびＥｕ³⁺から成る群から選択される蛍光標識である、請求項１０に記載の方法。
前記蛍光標識がＥｕ³⁺である、請求項１１に記載の方法。
前記工程ｂ）の検出可能標識が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるｐ６６のＮ−末端システイン残基に付加される、請求項１に記載の方法。
前記工程ｃ）のアフィニティー媒体が、再構成された一切の標識ｐ６６／タグ付加ｐ５１／ＲＴヘテロダイマーを捕捉する、請求項１に記載の方法。
工程ｃ）において、前記アフィニティー媒体が、前記アフィニティータグの捕捉に適したレセプターで被覆された固相である、請求項１に記載の方法。
前記固相が、Ｎｉ²⁺、抗タグ抗体、グルタチオンおよびストレプトアビジンから成る群から選択されるレセプターで被覆される、請求項１５に記載の方法。
前記固相が、Ｎｉ²⁺で被覆される、請求項１６に記載の方法。
前記アフィニティータグがヒスチジンである、請求項１５に記載の方法。
前記固相がマイクロプレートである、請求項１５に記載の方法。
工程ｄ）が、さらに未結合物質を除去する目的の洗浄工程を含み、アフィニティー媒体結合標識の量を適切な態様で測定し（または再構成ＲＴのポリメラーゼ活性を測定し）、前記アフィニティー媒体と結合した物質が標識ｐ５１／ｐ６６ＲＴヘテロダイマーの量と比例する、請求項１に記載の方法。
ＨＩＶＲＴヘテロダイマー形成を調節することができる化合物を特定する方法であって、
請求項１に記載の工程ａ）からｄ）を、テスト化合物の存在下または非存在下で実施する工程、及び
ｅ）前記テスト化合物のサンプルと前記テスト化合物を欠くコントロールサンプルとを比較し、それにより、前記テスト化合物サンプルのｐ６６／ｐ５１複合体形成の調節が、前記化合物のヘテロダイマー形成調節能力を示す工程
を含むことを特徴とする方法。
ＨＩＶＲＴヘテロダイマー形成を妨害することができる化合物を特定する方法であって、
請求項１に記載の工程ａ）からｄ）を、テスト化合物の存在下または非存在下で実施する工程、及び
ｅ）前記テスト化合物サンプルと前記テスト化合物を欠くコントロールサンプルとを比較し、それにより、テスト化合物のサンプルのｐ６６／ｐ５１複合体形成の減少が、前記化合物のヘテロダイマー形成阻害能力を示す工程
を含むことを特徴とする方法。
ＨＩＶＲＴヘテロダイマー形成を促進することができる化合物を特定する方法であって、
請求項１に記載の工程ａ）からｄ）を、テスト化合物の存在下または非存在下で実施する工程、及び
ｅ）前記テスト化合物サンプルと前記テスト化合物を欠くコントロールサンプルとを比較し、それにより、テスト化合物サンプルのｐ６６／ｐ５１複合体形成の増加が前記化合物のヘテロダイマー形成促進能力を示す工程、
を含むことを特徴とする方法。
ＨＩＶＲＴのｐ６６サブユニットのホモダイマー形成を測定する方法であって、
ａ）１〜３．５Ｍの濃度の解離剤としての尿素の存在下で第一のｐ６６サブユニットホモダイマーを含む第一の溶液を提供する工程、
ｂ）前記第一の溶液と第二のｐ６６サブユニットホモダイマーとを前記解離剤の存在下で接触させ、さらに前記解離剤の濃度を元の濃度の１０分の１に減少させる量の、前記解離剤を含まない再会合緩衝液（50mM Ｎａ ₂ ＳＯ ₄ を含む25mM トリス−塩酸、pH7.5、20℃）の存在下でインキュベートしてｐ６６／ｐ６６ＲＴサブユニット複合体の会合を可能にする工程であって、前記サブユニットの一方はアフィニティータグを含み、前記サブユニットの他方は検出可能標識を含む工程、
ｃ）工程ｂ）のインキュベート物とアフィニティー媒体とを、前記ｐ６６／ｐ６６複合体が前記アフィニティー媒体と結合することができる条件下で接触させる工程、及び
ｄ）前記アフィニティー媒体と結合した検出可能標識のレベルを測定することによって（または再構成ＲＴポリメラーゼ活性を測定することによって）、生成した複合体の量を決定する工程
を含むことを特徴とする方法。
ＨＩＶＲＴホモダイマー形成を調節することができる化合物を特定する方法であって、
請求項２４に記載の工程ａ）からｄ）を、テスト化合物の存在下または非存在下で実施する工程、及び
ｅ）前記テスト化合物サンプルと前記テスト化合物を欠くコントロールサンプルとを比較し、それにより、テスト化合物サンプルのｐ６６／ｐ６６複合体形成の調節が、前記化合物のホモダイマー形成調節能力を示す工程
を含むことを特徴とする方法。
ＨＩＶＲＴホモダイマー形成を妨害することができる化合物を特定する方法であって、
請求項２４に記載の工程ａ）からｄ）を、テスト化合物の存在下または非存在下で実施する工程、及び
ｅ）前記テスト化合物サンプルと前記テスト化合物を欠くコントロールサンプルとを比較し、それにより、テスト化合物サンプルのｐ６６／ｐ６６複合体形成の減少が、前記化合物のホモダイマー形成阻害能力を示す工程
を含むことを特徴とする方法。
ＨＩＶＲＴホモダイマー形成を促進することができる化合物を特定する方法であって、
請求項２４に記載の工程ａ）からｄ）を、テスト化合物の存在下または非存在下で実施する工程、及び
ｅ）前記テスト化合物サンプルと前記テスト化合物を欠くコントロールサンプルとを比較し、それにより、テスト化合物サンプルのｐ６６／ｐ６６複合体形成の増加が、前記化合物のホモダイマー形成促進能力を示す工程
を含むことを特徴とする方法。