JP4372545B2 - オーファンgタンパク質共役型レセプターgpr86の天然リガンドと使用方法 - Google Patents
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Description
GPR86は、ロドプシン様レセプターファミリーのメンバーであり、1997年にクローン化されたGPR86(非特許文献24)は、最近同定された血小板ADPレセプターであるP2Tと49%ホモロジーを示す。
本発明は、GPR86(P2Y13)レセプター(ここでは配列ID NO1で同定されている)(又はいずれかの相同配列)と、当該レセプターをコードするヌクレオチド配列を含む組換え細胞(好適なベクターによってトランスフォームされた)に関し、また、本発明は新たな薬剤の開発や種々の病気診断の改良に有用なアゴニスト、逆アゴニスト又はアンタゴニスト化合物の同定のためのスクリーニングアッセイの中で用いられている天然リガンド(ADPや、米国特許5700786に公開されているいずれのADP類似物も含むADPβS,2MeSADPのような等価分子)にも関する。
本発明の他の実施態様によれば、当業者に明らかなように、GPR86は、細胞膜内に存在しえる。
a)GPR86の量、又はGPR86ポリペプチドリガンドmRNA若しくはポリペプチドレベルにおける10%の増加又は減少は、本明細書で定義されたように与えられた解析の標準に対して測定される、あるいは
b)GPR86又はGPR86ポリペプチドリガンドをコードする配列における少なくとも単一の塩基対変化は、本明細書で定義されるように、与えられた解析及び結果の標準に対して検出され、パラグラフa),c),またはd)において定義されるようにGPRシグナリング活性の変更となる、あるいは;
c)GPR86リガンド結合活性の量における10%の増加又は減少は、本明細書で定義されるような、与えられた解析の標準に対して測定される、あるいは;
d)セカンドメッセンジャー解析における10%の増加又は減少は、ここで定義されるように、与えられた解析において、ここで述べられているように、標準に対して測定される。
GPR86(P2Y13)ヒトレセプターを発現する1321N1−Gα16細胞内でのIP3の蓄積に対するADP、2MeSADP及びADPβSの濃度作動曲線;
GPR86(P2Y13)ヒトレセプターを発現する1321N1細胞におけるGα16とともにIP3の蓄積に対するADP、ATP及び2MeSADPのアゴニストの効果;及び
GPR86(P2Y13)ヒトレセプターを発現する1321N1細胞に対して、Gα16とともに、ADPによって誘導されるIP3の蓄積に対する百日咳毒素の影響。
本発明は、ADPがオーファンGタンパク質共役型レセプターGPR86に対する天然リガンドであるという発見に関し、また薬剤スクリーニング方法におけるレセプターに対するこのリガンドの結合の使用方法に関する。この既知のリガンド及び当該リガンドとレセプターGPR86との相互作用は、調節不良となったレセプター活性を含む条件の診断方法も提供する。本発明は、またGPR86(P2Y13)と相同配列、該配列に相当するポリヌクレオチド、及び/又はそのポリヌクレオチドを発現する組換え細胞を含むキットに関し、レセプター及び/又はその相当するポリヌクレオチドのアゴニスト化合物、アンタゴニスト化合物及び逆アゴニスト化合物を同定する。このようなキットは、種々の疾患又は疾病の診断、予防、及び/又は治療に有用である。
本発明は、GPR86をコードするヌクレオチド及びアミノ酸配列に関する(図1に示す)。本発明は、またGPR86をコードするヌクレオチド及びアミノ酸配列に相同であるオルソローグ(ortholog)及び配列に関する。
本明細書で示されている配列のいずれかに関する配列同定は、他の配列とのいずれか1つ以上の配列の単純な「眼球」による比較(すなわち厳密な比較)をして、他の配列が例えばその配列の少なくとも70%アイデンティティを有するかどうかをみることによって決めることができる。
HISTOGRAM−各サーチのためのスコアのヒストグラムの表示;デフォールトはyes(BLASTマニュアルでのパラメータH)。
本発明は、本明細書で示されている配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列、または配列の断片又は誘導体、又は上記いずれかの相補体(complement)にも拡張する。
本発明によれば有用な細胞は、バクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳類細胞からなる群より選択されることができる。
GPR86の活性をモジュレートする物質は、ADP又は他のリガンドとレセプターの相互作用を利用するたくさんの方式で同定されることができる。例えば、培養された細胞におけるインビトロ又はインビボで、GPR86/ADP結合を再構築する可能性は、その結合を引き裂く物質の同定のための標的を提供する。結合の開裂に基づく解析は、そのような分子のライブラリ又はコレクションからの有機低分子のような物質を同定できる。その代わりに、そのような解析は、天然源、例えば植物、カビ又はバクテリアの抽出物またはヒト組織サンプル(例えば腫瘍組織)からの抽出物又はサンプルにおいて物質を同定することができる。ある見地では、その抽出物は、核酸変形、ペプチド、又はポリペプチドのライブラリを発現する細胞から作られることができる。そして、GPR86/ADP結合のモジュレーターは、結合解析又はレセプターを通じての下流のシグナリングを測定する機能的解析を用いてスクリーニングされることができる。
GPR86を発現する細胞、そのような細胞からの膜抽出物、出芽したウィルスの膜に含まれるGPR86ポリペプチド、又はGPR86を含む固定化した脂質膜を標識されたADP及び候補化合物に曝されるところで行われる。GPR86とリガンドとを接触させた後、GPR86レセプターに対する標識ADPの特異的結合を測定する。GPR86と標識ADPとの結合を阻止又は標識ADPにとってかわる化合物は、GPR86活性のアゴニスト、アンタゴニスト、又は逆アゴニストであることができる。そして、次の機能的解析は、これらのカテゴリーのうちのいずれに属するのかを決定する化合物について行われることができる。
a)アゴニストスクリーニングにとって、GPR86発現細胞又はこれらから調製された膜が、候補化合物とともに培養され、GPR86のシグナリング活性が測定される。レセプター活性をモジュレートする化合物によって誘導される活性は、ADPによって誘導される活性と比較される。アゴニスト又は部分的アゴニストは、アゴニスト又は部分的アゴニストが10nM以下で存在するとき、ADPの最大活性の少なくとも10%に該当する最大の生物活性を有するだろう、また、少なくともADPと同じ程度の強さの効能を有するだろう。
細胞上、又はレセプターポリペプチドを含む単離された膜上で発現されるGPR86ポリペプチドを、ADPがGPR86へ結合するのを阻害する化合物のスクリーニングのために、ADPとともに、使用することができる。候補化合物がアゴニスト、アンタゴニスト、又は逆アゴニストとして作用するかどうかを決定する機能的テストにおいては、GPR86との結合又はADP変位だけを測定する解析により同定することができる。
水相からセンサ上の膜内に固定化されたGPR86ポリペプチドまでADPが結合又は結合を喪失することによって引き起こされる固定化したセンサ付近での質量変化によって2つの分子間結合を測定する。質量におけるこの変化は、ADP又は候補モジュレーターの注入又は除去後の時間に対する共鳴ユニットとして測定される、Biacore Biosensor(バイアコアAB)を用いて測定される。GPR86は、Salamonらによって説明された方法によれば薄層脂質膜において、センサチップ上に固定化される(例えばリサーチグレードCM5チップ;バイアコアAB)(Salamonら,1996年,Biophys J.71:283−294;Salamonら,2001年,Biophys.J.80:1557−1567;Salamonら,1999年,Trends Biochem.Sci.24:213−219、これらはそれぞれ参考として本明細書に組み入れられる)。Sarrioら、SPRがチップ上での脂質層内に固定化されたGPCR A(1)アデノシンレセプターに結合しているリガンドを検出するのに用いられることができる(Sarrioら,2000年,Mol.Cell.Biol.20:5164−5174,参考として本明細書に組み入れられる)。SPR解析において、GPR86にADPが結合するための条件は、開始点として、Sarrioらによって報告された条件を用いて、当業者によって微調整されることができる。
ここで説明されている方法又は結合解析のいずれも、GPR86の非ADPリガンド(例えばアゴニスト、アンタゴニストなど)を用いて実行されることができると理解されるべきである。例えば、ここで説明されているように同定された小さな分子又はADPアナローグは、米国特許No.5700786に表示されるADPアナローグ、天然又は合成ペプチド、ポリペプチド、抗体又はその抗原結合部位、脂質、炭水化物、及び小さな有機分子のいずれも含むが、これらに限定されない。
i.GTPアーゼ/GTP結合解析
GPR86のようなGPCRにとって、レセプター活性の測定は、レセプターを含む細胞膜によるGTPの結合として測定される。TraynorとNahorskiによって、1995年,Mol.Pharmacol.47:848−854頁(これは参考として本明細書に組み入れられる)で説明された方法において、標識GTPの結合を検出することによって膜に共役するGタンパク質を本質的に測定する。GTP結合解析にとって、レセプターを発現する細胞から単離された膜は、HEPESを20mM,pH7.4,NaCl100mM,MgCl2を10mM,35S−GTPγSを80pM及びGDPを3μM含むバッファーの中で培養される。この解析混合物は、結合されていない標識GTPがGF/Bフィルター上での濾過によって除去される後、30℃で60分間培養される。結合した、標識GTPは、液体シンチレーションカウンターによって測定される。ADP誘導GPR86活性のモジュレーションの解析のために、GPR86ポリペプチド発現細胞から調製さた膜が、ADPと混合され、GTP結合解析は、GPR86活性の候補モジュレーターの存在及び不在下で実行される。候補モジュレーターを含むこの種の解析においてシンチレーションカウントされることによって測定されるように、候補モジュレーターなしでの解析に対して標識GTP結合が10%以上減少すると、候補モジュレーターがGPR86活性を阻害することを示す。類似のGTP結合解析は、ADPを用いることなく実行されて、アゴニストとして作動する化合物を同定することができる。この場合、ADP刺激GTP結合は、標準として用いられる。もしその化合物が1μM以下で存在するときにADPによって誘導されるGTP結合を少なくとも50%のレベルで誘導すれば、またはADPによって誘導されるレベルと同じ若しくはそれよりも高いレベルで誘導すれば、その化合物はアゴニストと考えられる。GTPアーゼ活性は、GPR86を含む膜を、γ32P−GTPとともに培養することによって、測定される。活性GTPアーゼが無機リン酸としてラベルを解離するであろう。そして、無機リン酸は、20mMのH3PO4中の活性炭の5%懸濁液の中のフリー無機リン酸の分離によって検出され、続いてシンチレーションカウントされる。コントロールは、候補化合物の潜在的な非特異的影響を排除するために、GPR86を発現しない細胞(mock−トランスフェクト)から単離された膜を用いる解析を含む。
a.カルシウムフラックス−エクオリンベース解析:
エクオリン解析は、GPCRの活性化によって誘導される細胞内カルシウムの放出に対するミトコンドリアのアポエクオリンの応答を利用する(Stableら,1997年,Anal.Biochem.252:115−126;Detheuxら,2000年,J.Exp.Med.,192:1501−1508;これらは双方とも本明細書に参考として組み入れられる)。要するに、GPR86発現クローンは、トランスフェクトされて、ミトコンドリアのアポエクオリンとGα16を共発現する。細胞は、5μMのCoelenterazine H(モレキュラープローブス社)とともに室温で4時間培養され、DMEM−F12培養培地内で洗浄され、再び0.5×106cell/mlの濃度で再懸濁される。そして、細胞はテストアゴニスト分子と混合され、エクオリンによる発光がルミノメータを用いて30秒間記録される。結果は、Relative Light Units(RLU)として発現される。コントロールは、候補化合物の潜在的非特異的効果を排除するために、GPR86を発現しない細胞(mockトランスフェクトされた)から単離された膜を用いた解析を含む。
アデニレートシクラーゼ活性の解析は、Kenimer&Nirenbergによって、1981年,Mol.Pharmacol.20:585−591(これは参考として本明細書に組み入れられる)で説明されている。この解析は、Solomonらによって、1974年,Anal.Biochem.58:541−548によって教示される解析のモディフィケーションである(これは参考として本明細書に組み入れられる)。要するに、100μlの反応系には、50mMのTris塩酸(pH7.5),5mMのMgCl2,20mMのクレアチンリン酸(ナトリウム塩),10ユニット(71μgのタンパク質)のクレアチンホスホキナーゼ,1mMのα−32P−ATP(テトラナトリウム塩,2μCi),0.5mMのサイクリックAMP,G−3H−標識サイクリックAMP(約10000cpm)0.5mMのRo20−1724,0.25%エタノール,及び50−200μgのタンパク質ホモゲネートを含んでテストされる(すなわち、GPR86ポリペプチドを発現する細胞又は発現せず、候補モジュレーターともに又は伴わずにADPで処理又は処理されない細胞からのホモゲネート)。反応混合物は、一般に、37℃で6分間培養される。培養につづいて、反応混合物は、コールドの6%トリクロロ酢酸0.9mlの追加によって脱タンパクされる。試験管は、1800×gで20分間遠心分離され、各上澄み液は、Dowex AG50W−X4カラムに添加される。このカラムからのcAMPフラクションは、0.1mMイミダゾール塩酸(pH7.5)4mlでカウンティングバイアルに溶出される。解析は3回行われるべきである。コントロール反応は、また、GPR86ポリペプチドを発現しない細胞からのホモゲネートタンパク質を用いて行われるべきである。
細胞内又は細胞外cAMPは、当該分野で広範に知られている方法によれば、cAMPラジオイムノアッセイ(RIA)又はcAMP結合タンパク質を用いて測定される。例えば、Horton&Baxendale,1995年,Methods Mol.Biol.41:91−105(これは参考として本明細書に組み入れられる)に、cAMP用のRIAを説明している。
リン脂質の分解を活性化するレセプターは、リン脂質をモニタすることによって、既知の又は疑いあるGPR86のモジュレーターの活性のために、変化としてモニタされることができ、その結果産物はセカンドメッセンジャーDAG及び/又はイノシトール3リン酸(IP3)である。これらの各検出方法は、Ian M.Bird Totowa,ニュージャージ州、Humanaプレス社,1998年に編集された「リン脂質シグナリングプロトコル」(これは参考として本明細書に組み入れられる)に説明されている。Rudolphら,1999年,J.Biol.Chem.274:11824−11831も参照(これは参考として本明細書に組み入れられる)。これには、ホスファチジルイノシトール分解についての解析も説明されている。解析は、ADPで処理された又は処理されないで候補モジュレーターを伴って又は伴わずに、GPR86を発現する細胞又は細胞抽出物を用いて行われるべきである。コントロール反応は、候補モジュレーターの潜在的非特異的効果を排除するために、mockトランスフェクトされた細胞又はこれらからの抽出物を用いて、行われるべきである。
成長因子レセプターチロシンキナーゼは、プロテインキナーゼC(PKC)の活性を含む経路を経由してシグナルをだす。プロテインキナーゼCは、リン脂質活性化及びカルシウム活性化されたプロテインキナーゼのファミリーである。PKC活性化は、最終的に、c−fos,c−myc,及びc−junを含むガン原遺伝子転写因子コード遺伝子;プロテアーゼ;コラゲナーゼIやプラスミノーゲン活性化阻害剤を含む細胞内接着分子I(CAM I)を含む接着分子のアレイの転写をもたらす。PKCによって誘導される遺伝子産物における増加を検出するように設計されたアッセイは、PKC活性化及びこれによるレセプター活性化をモニタするのに用いられることができる。さらにPKC経由でシグナルを出すレセプターの活性化は、PKC活性化によって活性される遺伝子のコントロール配列により駆動されるレポータ遺伝子構成要素は、レポータ遺伝子の使用を通じてモニタされることができる。このタイプのレポータ遺伝子ベース解析は、以下に詳細に述べられる。
MAPキナーゼ活性は、商業上入手可能ないくつかのキットのいずれを用いても解析することができる。当該キットとしては、例えば、ニューイングランドバイオラボ社(Cat#9820)から販売されているp38MAPキナーゼ解析キット又はパーキン−エルマーライフサイエンス社から販売されているFlashPlate(登録商標)MAPキナーゼ解析が挙げられる。
レセプター、例えばGPR86にアゴニストを結合することによって開始された細胞内シグナルは、細胞内イベントのカスケード運動に向かい、その究極の結果は、1つ以上の遺伝子の転写又は翻訳における迅速で検出可能な変化となる。従ってレセプターの活性は、GPR86活性化に反応するコントロール配列によって駆動されるレポータ遺伝子の発現を検出することによってモニタされることができる。
本発明の細胞、例えば1321N1細胞は、5%FCS,抗生物質,アンフォテリシン,ピルビン酸ナトリウム及びG418を含む400μg/mlイノシトールフリーのDMEMの中で、10μCi/ml〔3H〕イノシトールで、24時間標識した。細胞は、2時間、下記組成のKrebs−Ringer Hepes(KRH)バッファー(NaClが124mM,KClが5mM,MgSO4が1.25mM,CaCl2が1.45mM,KH2PO4が1,25mM,Hepesが25mM(pH7.4)及び8mMグルコース)中で培養された。そして、この細胞は、種々のヌクレオチドを用いて、30秒間チャレンジされた。培養は、氷冷3%過塩素酸溶液の添加によって停止させられる。IPは抽出され、上述(非特許文献25)のDowexカラム上で分離される。2MeSATPとATP溶液(1mM)は、室温で、20ユニット/mlCPK及び10mMのCPを用いて90分間処理され、汚染とヌクレオチド3リン酸の分解から問題がおこることを回避した。
本発明は、サンプル中の本発明のレセプターの活性を検出するための解析を提供する。例えば、GPR86活性は、GPR86を発現する細胞又は細胞膜を含むサンプル中で測定される。この解析は、ADPの存在又は不在下でサンプルを培養することによって達成され、上記のようにセカンドメッセンジャー解析を実行している。ADP存在又は不在下で行われたセカンドメッセンジャー解析の結果が比較されて、GPR86レセプターが活性であるかどうかを決める。本明細書で定義するように、ADP不在下で行われた解析で検出された量に対して、ADP存在下での与えられたセカンドメッセンジャーの検出レベルが10%以上増加していることが、GPR86活性の指標となる。
GPCRを通じてのシグナリングは、大量の疾患又は疾病の病理に役立つ。GPR86は、白血球細胞と同様にリンパ球系列の細胞、血小板、脾臓内で発現され、免疫プロセス、癌、血栓症、及びこれらの関連疾患又は疾病における役割がある。GPR86発現パターンは、また、脳に含まれ、さらにADPニューロトランスミッターとしての潜在的役割を提案している。
異常レベルのレセプター又はそのリガンドが、サンプル中に存在するかどうか、そのいずれかがGPR86シグナリングの可能性ある調節不良を示しているかどうかを決めるために、GPR86レベルが測定され、標準と比較される。ポリペプチドレベルが測定され、例えば、ポリペプチドに特異的な抗体を用いて、免疫組織化学によって測定される。
GPR86活性によって特徴付けられた疾患又は疾病で煩っていると疑いのある個体から単離されたサンプルが、GPR86の抗体と接触させられ、その抗体の結合はその分野で既知であるとして測定される(例えば、二次抗体に結合した(conjugated)酵素の活性を測定することによって)。
GPR86ポリペプチド又はこれをコードするmRNAが野生型であるかどうかを評価する解析は、診断的に用いられることができる。この様式でGPR86調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病を診断するために、サンプルから単離されたRNAが、GPR86のPCR増幅のための鋳型として用いられる。そして、増幅された配列は、標準的方法を用いて直接的に配列化されるか、又は最初にベクターの中にクローン化され、続いて配列決定されるかのいずれかである。野生型GPR86の配列に関して1つ以上コードされたアミノ酸を変化させる配列の差異は、GPR86シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候であり得る。コード配列における変化がサンプル内で同定されるとき、変異レセプター又はリガンドを発現させ、その活性を、野生型GPR86の活性と比較するのに有用である。他の利益の中で、このアプローチは、構造的に活性でヌルな突然変異体を含む新規突然変異体を提供できる。
GPR86シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断は、機能的解析を用いて解析されることもできる。そうすると、細胞膜は又は組織サンプルから調製された細胞抽出物が、本明細書で説明されているように、GPR86の解析に用いられることができる(例えば、リガンド結合解析、GTP結合解析、GTPase解析、アデニレートシクラーゼ解析、cAMP解析、アラキドン酸レベル、リン脂質分解、ジアシルグリセロール、又はイノシトール3リン酸解析、PKC活性解析、又はキナーゼ解析)。検出された活性は、健康な個体又は影響された個体の影響されていない部位から採取した標準的サンプル内の活性と比較される。代替品として、サンプル又はサンプル抽出物が、GPR86を発現する細胞に適用され、続いて標準サンプルに対してGPR86シグナリング活性が測定される。これらの解析のいずれかで測定された10%以上の差異は、GPR86シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候である。
GPR86のリガンドとしてのADPの発見は、細胞内のGPR86の活性をモジュレートする方法を提供する。GPR86活性は、GPR86ポリペプチドの機能をモジュレートする物質をその細胞に配送することによって、細胞内でモジュレートされる。このモジュレーションは、付加的なモジュレーティング物質の同定のための解析の部分としての培養細胞の中、又は例えばヒトを含む動物の中で、行われることができる。物質には、ADP及びここで定義されるようなADPアナローグが含まれ、また本明細書で説明されるようなスクリーニング方法を用いて同定された付加的モジュレーターも同様に含み、米国特許5700786に表示されたADPアナローグのいずれも含まれるが、これらに限定されない。
本発明は、本発明のレセプターのモジュレーターである化合物を提供する。
本発明は、GPR86及びADPのようなリガンドの培養がGα16タンパク質の存在下で行われる解析及び方法を提供する。Gα16タンパク質は、GPR86レセプターと共役して、ホスホリパーゼCを活性させることができる。
本発明は、GPR86に対する抗体を提供する。抗体は、当該分野で知られた標準プロトコルを用いて作られることができる(例えば、抗体:実験マニュアル、編集Harlow及びLane(コールドスプリングハーバープレス社:1988年)。マウス、ハムスター、又はウサギのようなほ乳類が、ペプチドの免疫原型(例えばGPR86ポリペプチド又は抗体応答を引出すことができる抗原的フラグメント、又は上記で説明されるような融合タンパク質)で免疫感作されることができる。抗体を生み出す免疫原は、ポリペプチド(例えば単離された組換えペプチド又は合成ペプチド)とアジュバントを混合することによって調製される。あるいは、GPR86ポリペプチド又はペプチドは、より大きな免疫原タンパク質に対する融合タンパク質として作られることができる。ポリペプチドは、また、笠貝ヘモシアニンの鍵穴のような、他のより大きな免疫原タンパク質に共有結合されることができる。あるいは、GPR86ポリペプチドをコードするプラスミド又はウィルスベクター、又はこれらのタンパク質の断片が、Costagliolaら,2000年,J.Clin.Invest.105:803−811(参考として本明細書に組み入れられる)の中で説明されているように、ポリペプチドを発現するのに用いられ、動物体内で免疫応答を生み出す。抗体を生み出すために、免疫原は、典型的には、ウサギ、ヒツジ、マウスのような実験動物に皮内注射、皮下注射、又は筋肉内注射される。上記で論じた抗体に加えて、遺伝学的に設計された抗体誘導体は、単一鎖抗体のように作られることができる。
本発明のハイスループットスクリーニングキットは、ADP存在下、例えば1nM乃至10μMの範囲の濃度でのADP存在下で、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト、又は本発明のレセプターの阻害剤等のモジュレーター化合物の検出を実行するための必要な手段及び培地のすべてを含む。このキットは、下記の連続的工程を含む。本発明の組換え細胞は、GPR86(P2Y13)レセプターをコードするヌクレオチド配列を含み且つ発現し、WO00/02045(参考として本明細書に特異的に組み入れられる)に説明されるような当業者によく知られた方法によれば、マイクロタイタープレート、例えば96ウェルマイクロタイタープレートのような固体支持体の上で成長させられる。本発明のモジュレーター化合物は、約1nMから10μM以上までの濃度で、好適な濃度のADP(例えば1nM乃至1μMの範囲で)が存在する決められたウェルの培地に添加される。
本発明は、GPR86活性、GPR86への結合を検出するキット、さらにはGPR86シグナリングの調節不良によって特徴付けられる疾患又は疾病の診断に有用なキットをモジュレートする物質などのモジュレーターの検出又はスクリーニングに有用なキットを提供する。本発明の有用なキットは、単離されたGPR86ポリペプチド(膜関連又は細胞関連GPR86ポリペプチド、例えば単離膜上、又はGPR86を発現する細胞、又はSPRチップ上)を含むことができる。本発明のキットは、ADPのようなリガンドを含み得る。さらに、キットは、Gα16ポリペプチドを含む。キットは、GPR86に特異的な抗体も含む。あるいは、又はさらに、キットはGPR86ポリペプチドを発現するようにトランスフォームされた細胞を含むことができる。さらなる態様においては、本発明のキットは、GPR86ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。なおも更なる態様において、本発明のキットは、下記で説明されるようにGPR86の増幅に有用な特異的プライマーを含むことができる。あるいは、本発明のキットは、GPR86シグナリングを検出するための手段を含む。物質,モジュレーター,特性、又は不調の検出は、GPR86又はGPR86特異的核酸プローブに特異的な抗体を用いて達成されることができる。更なる態様において、本発明のキットは、GPR86活性の標準、例えばADPのようなリガンドの存在下でGPR86を発現する細胞系列で測定されるような標準を含むことができる。従って、本発明のキットは全て、述べられた品目又は品目の組合わせ、及びパッケージ材料を含み得る。キットは、また、使用のための指南書も含み得る。
トランスジェニックマウスは、遺伝的及び発生生物学の研究のための有用なツール、及び新規配列の機能決定のための有用なツールを提供する。従来のトランスジーン過程(transgenesis)の方法によれば、正常又はモデファイされた遺伝子の付加的コピーが、接合体の雄前核の中へインジェクトされ、レシピエントマウスのゲノムDNAの中へ集積されるようになる。トランスジーンは、樹立されたトランスジェニック株において、メンデルの法則にしたがって伝えられる。トランスジェニック動物を作り出すのに有用な構成要素は、正常プロモータ又は誘導プロモータのいずれか一方;組織発現及び調節のパターンに関して解析されるプロモータのコントロール下でのレポータ遺伝子;及びドミナント突然変異、突然変異プロモータ及び人工的融合遺伝子を含む構成要素を含み、特異的な発生の結果に関して研究される。典型的には、10kb以下のオーダーのDNAフラグメントが用いられて、トランスジェニック動物を構成する(Reeves,1998年,New.Anat.,253:19)。トランスジェニック動物は、本発明の1つ以上の多型性を含む候補遺伝子を含む構成要素とともに作り出されることができる。あるいは、単一の多型性を含む候補遺伝子を発現するトランスジェニック動物が、異なる多型性を含む候補遺伝子を発現する第2のトランスジェニック動物と交差されることができ、2つの多型性の組合わされた影響は子孫の動物の中で研究される。
本発明は、トランスジェニックマウス、ウサギ、ラット、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギなどのトランスジェニック動物を含むが、これらに限定されない。トランスジェニックブタも生産のためのプロトコルは、WhiteとYannoutsos,Current Topics in Complement Research:64回免疫学フォーラム,88-94頁;米国特許No.5523226;米国特許No.5573933:PCT出願WO93/25071;及びPCT出願WO95/04744の中で見いだせる。トランスジェニックマウス作製のプロトコルは、米国特許No.5530177の中で見つけ出すことができる。トランスジェニックラットの作製プロトコルは、BaderとGanten,Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology,追補3:S81−S87,1996年の中で見いだすことができる。トランスジェニックウシの生産プロトコルは、トランスジェニック動物技術,ハンドブック,1994年編集,Carl A.Pinkert,アカデミックプレス社の中で見いだすことができる。トランスジェニックウサギの作製プロトコルは、Hammerら,Nature315:680−683,1985年及びTaylor及びFan,Frontiers in Bioscience2:d298−308,1997年の中で見いだされる。
i 標準
ノックアウト動物は、相同組換えで遺伝子欠失を作り出す方法によって製造される。この技術は、胎児由来で培養の中で維持され、宿主胚盤胞の中へ導入されるときマウス内のあらゆる組織の分化に参加する能力を有している胚性幹(ES)細胞の発展に基づいている。ノックアウト動物は、ES細胞の特異的標的遺伝子に相同組換えを指向することによって生産され、これによりヌル対立遺伝子を生み出す。このヌル対立遺伝子の考えられる表現型の結果(ヘテロ接合体又はホモ接合体子孫のいずれか)を解析することができる(Reeves,上記)。
標的とされた相同組換えの方法は、バクテリオファージP1部位特異的リコンビナーゼCreに基づく部位特異的組換えシステムの発達によって、改良されてきた。バクテリオファージP1部位からのCre−loxP部位特異的DNAリコンビナーゼが、限定された組織又は分化のステージに制限される遺伝子ノックアウトを作り出すために、トランスジェニックマウス解析で用いられる。領域的に限定された遺伝子の欠失、グローバル遺伝子ノックアウトとは反対に、表現型は部分的細胞/組織に寄与されることができる(Marth,1996年,Clin.Invest.97:1999)。あるトランスジェニックマウス株のCre−loxP部位において、loxP部位が興味ある遺伝子の1つ以上のエキソンを側面に配置するように、設計される。「floxed遺伝子」と呼ばれるこのホモ接合体は、細胞/組織タイプ転写プロモータのコントロール下でCre遺伝子を発現する第2のトランスジェニックマウスと交差される。そして、Creタンパク質は、loxP認識配列の間のDNAを切り取り、有効に標的遺伝子機能を除去する(Sauer,1998年,Methods,14:381)。今では、この方法のインビボ実施例は、ほ乳類の組織特異的遺伝子の誘導可能な不活性化を含めてたくさんある(Wagnerら,1997年,Nucleic Acids Res.,25:4323)。
特定の遺伝的多型性/突然変異は、インビボで機能を変更されたタンパク質の原因となることを明らかにするために、問題の遺伝子の野生型コピーを導入することによって変更されたタンパク質機能を「救い出す」ことができる。トランスジェニックマウスの中で発現されたバクテリアの人工的染色体(BAC)クローンを用いたインビボ相補性が、これらの目的のために用いられることができる。この方法は、マウスのサーカデイアンクロック遺伝子の同定に用いられてきた(Antochら,1997年,Cell 89:655)。
トリプシンはフローラボラトリーズ(スイス、ビジョー)から得た。培養培地,G418,ウシ胎児血清(FBS),制限酵素,プラチナPfx,及びTaqDNAポリメラーゼは、ライフテクノロジー社(ベルギー,メレルベーク)から購入した。放射性産物myo−D−〔2−3H〕イノシトール(17.7Ci/mmol)はアメルシャム(ベルギー,ゲント)から得た。Dowex AGIX8(ギ酸型)は、Bio−Radラボラトリー(カリフォルニア州,リッチモンド)から得た。ATP,ADP,アデノシン,ADPβS(アデノシン5’−O−(2−チオジホスフェート)),A2P5P(アデノシン2’,5’−ジリン酸),A3P5P(アデノシン3’,5’−ジリン酸),A3P5PS(アデノシン3’−リン酸5’−ホスホサルフェート),UTP,UDP,ITP,IDP,UDP−グルコース及び3−イソブチル−1−メチル−キサンチン(IBMX)がシグマケミカル社(ミズーリ州,セントルイス)から入手された。2−メチルチオ−ADP(2MeSADP)と2−メチルチオ−ATP(2MeSATP)が、リサーチバイオケミカルインターナショナル(マサチューセッツ州,ナティック)から得た。フォルスコリンは、カルバイオケム社(ベルギー,ベルージュ)から購入した。ロリプラム(rolipram)は、ラボラトリーズ・ジャックス・ロジェア(フランス,トラッペス)から授けられた。Erk1及びErk2(202Thyと204Thy)の二重リン酸化型に特異的なモノクローナル抗体は、ニューイングランドバイオラボ(マサチューセッツ州,ベベリー)から入手した。
実施例を経由して、患者は、GPR86のモジュレーター(例えば、本発明のアゴニスト、アンタゴニスト、GPR86阻害剤)の投与によって下記のように治療されることができる。本発明のGPR86のモジュレーターは、患者に投与され、例えば生物学的に適合する溶液又は薬学的に受け入れられるデリバリー担体、消化により、インジェクション、インハレーション、又は他のいくつかの方法のいずれかによって、投与され得る。投与量は患者ごとに変わり;「治療学的に有効な投与量」は、例えば、機能の促進レベルによって(例えば、本明細書で述べられているセカンドメッセンジャー解析において決められるように)決められることができるが、これには限定されない。ADP結合のモニタは、当業者に投与される量を選択し、調節させるようにすることができるだろう。本発明のGPR86のモジュレーターの投与量は、毎日、毎週、毎月、毎年又は患者治療によって適当と考えられるように、繰り返されるだろう。
本発明は、生理学上適合できるキャリアと添加混合された、本発明のGPR86モジュレーターを含む組成物を提供する。本明細書で用いられるように、「生理学上、適合できるキャリア」は、生理学上受け入れられる希釈剤をいい、水、リン酸緩衝化生理食塩水、又は生理食塩水などがあり、さらにアジュバントを含んでもよい。不完全なフロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、又はミョウバンのようなアジュバントが、当該分野でよく知られている材料である。
ヒトP2Y12に強く関係する新規レセプターをコードするイントロンのないコード配列が、3q24領域に位置し、下記特許:WO00/31258ARENA配列番号18のゲノムクローンRP11−25K24(GenBank承認番号AC024886)上に同定された。
GPR86mRNAがいくつかのヒト組織中のRT−PCRによって増幅された(図3A)。
逆転写ポリメラーゼ鎖反応(RT−PCR)実験は、ポリA+RNA(クロンテック社)のパネルを用いて実施された。GPR86プライマーは、次の通りである:GPR86センスプライマー(5’−TGTGTCGTTTTTCTTCGGTG−3’)とGPR86アンチセンスプライマー(5’−CTGCCAAAAAGAGAGTTG−3’)。増幅されたDNAバンドの予期されたサイズは、575bpである。配列をコードするアルドラーゼに基づいて合成された2つのプライマーが、コントロールとして用いられ、443bpの予期されたサイズを伴う産物を生産する:アルドラーゼセンスプライマー(5’−GGCAAGGGCATCCTGGCTGC−3’とアルドラーゼアンチセンス逆5’−TAACGGGCCAGAACATTGGCATT−3’)。約75ngのポリA+RNAが、SuperscriptII(ライフテクノロジー社、メレルベーケ,ベルギー)を用いて逆転写されて、PCRのために用いられた。PCRは、下記条件下でTaqポリメラーゼを用いて行われた:94℃で3分間94℃で1分間38サイクル、58℃で2分間及び72℃で2分間変性。PCR反応のアリコート(10μl)が、1%アガロースゲル電気泳動によって解析された。
新規レセプターの完全な配列は、1321N1アストロサイトーマ細胞系列をトランスフェクトするために、発現ベクターの中に導入された。予め、いくつかのP2Yサブタイプ(5,13,14)を特徴づけるのに用いた。Gα16タンパクを発現する1321N1アストロサイトーマ細胞は、GPR86プラスミド組換え体又はプラスミド単体を用いてトランスフェクトされた。
ヌクレオチドの潜在的効果は、ヒトGPR86レセプターを発現するCHO−K1細胞におけるcAMP経路上でテストされた。cAMPレベルの顕著な阻害は、フォルスコリンの存在下(4μM)で、低濃度のADP(図5A)及び2MeSADPで観察された。CHO−K1トランスフェクト細胞は、種々のADP濃度及び4μMフォルスコリンの存在下で、10分間、インキュベートされた。そのデータは、3回のうちの1つの代表的実験で得られる3つの実験値の平均±S.D.で表される。ADPのIC50は、1.5±0.6nM(3つの独立した実験の平均値±S.D.)は、30nMで最大阻害率52±7%(3つの独立した実験の平均値±S.D.)である。第2フェーズは、30nMよりも高い濃度で観察される:減少又は小さく増加したアデニルシクラーゼの阻害は、10μMで観察された(図5A)。100ng/mlの百日咳毒素でトランスフェクトされたCHO−K1細胞の18時間−前処理後、ADP(10nM及び100μM)がcAMPレベルの顕著な増加を誘導した(図5B)。CHO−K1トランスフェクト細胞は、種々の濃度のADPと4μMのフォルスコリンの存在下、10分間でインキュベートされた。そのデータは、3回のうちの1回の代表的実験で得られた3つの実験値の平均値±S.D.を表している。CHO−K1トランスフェクト細胞は、100ng/ml百日咳毒素と共に又は伴わずに18時間プレインキュベートされ、次いでADP(100nM及び100μM)又は水(CONT)と4μMフォルスコリンの存在下で10分間インキュベートされた。そのデータは、2回の実験のうち1回の代表的実験で得られた3つ実験値の平均値±S.D.を示す。アデニルシクラーゼ上でのADPの2局面的(biphasic)効果は、ヒトGPR86レセプターでトランスフェクトされた1321N1細胞内で再生産された。
非ヒトトランスジェニック動物の製造方法は、ここで説明される。DNA構成要素は、ほ乳類の生殖系列に導入され、トランスジェニック動物を作り出すことができる。例えば、構成要素の1つ又はいくつかのコピーは、標準的なトランスジェニック技術によってほ乳類の胚のゲノムの中に組み入れられる。
GPR86の活性は、次の方法で検出又は測定されることができる:組換えほ乳類細胞、例えば好適なGPR86(P2Y13)発現ベクターで安定的にトランスフェクトされた1321N1アルトロサイトーマ又はCHO−K1細胞は、実施例3及び4で説明されるように、組織培養プレート上にプレートアウトされる。適当な細胞密度、通常50〜75%の集密性で、培養培地は、ADPリガンド(例えば、1nM乃至1μMの範囲)を含むKRHバッファー溶液(Krebs−Ringer Hepes:NaClが124mM,KClが5mM,MgSO4が1.25mM,CaCl2が1.45mM,KH2PO4が1,25mM,Hepesが25mM(pH7.4)及び8mMグルコース)と取り替えられ、細胞は37℃でさらに30秒間培養される。培養後、細胞は洗浄され、溶解された。ADPリガンドの存在又は不在下でのこの細胞内抽出物中でのGPR86活性は、実施例3及び4で説明されるように、cAMP,MAPキナーゼ/ERKリン酸化及びIP3のような下流のセカンドメッセンジャーの関連する活性を検出することにより決定される。GPR86活性は、ADPの不在下対存在下での、ERKリン酸化における2倍以上の増加またはcAMPレベルの2倍以上の減少として定義される。活性は、またリガンドADPの至適濃度の存在対不在で、セカンドメッセンジャーレベルにおける2倍以上の変化によっても定義される。
本発明は、一部分、ADPによるGPR86の活性化、あるいは2MeSADP、ADPβS又は米国特許No.5700786で教示されたADPアナローグのいずれかのようなアナローグ又は等価分子に関する。従って、2つのADPアナローグ、ATP及び2MeSATPは、上述のように、ヒトP2Y13レセプターでトランスフェクトされたAG32細胞でテストされた。AG32細胞は、Gα16タンパク質でトランスフェクトされた1321N1細胞である。
ADPアナローグであるAp3A,Ap4A,Ap5A,及びAp6Aが、上記のヒトP2Y13レセプターでトランスフェクトされたAG32細胞でテストされた。
ポリ〔A〕とポリ〔A〕〔G〕が、上記のようにヒトP2Y13レセプターでトランスフェクトされたAG32細胞についてテストされた。本発明者は、これらの化合物は、ヒトP2Y13レセプターのターゲットとしてデンドライト細胞のワクチン治療に用いられるだろうと考えた。
アンタゴニストは、ヒトGPR86でトランスフェクトされたAG32細胞についてテストされた。AG32細胞が、35mm(直径)ペトリ皿上に播かれ(2×105細胞/ディッシュ)、5%ウシ胎児血清,抗生物質,アンホテリシン,ピルビン酸ナトリウム及び400μg/mlのG418を含むイノシトールフリーのDMEMで、5μCi/ml〔3H〕−myoイノシトールで、24時間標識された。細胞は、Krebs−Ringer Hepes(KRH)バッファー(NaClが124mM,KClが5mM,MgSO4が1.25mM,CaCl2が1.45mM,KH2PO4が1,25mM,Hepesが25mM(pH7.4)及びD−グルコース8mM)内で2時間培養された。刺激に先立って、細胞は、リアクティブブルー2(RB2),スラミン,PPADS又はMRS−2179の存在下で10分間、プレ培養された。そして、この細胞は、ADP100nMの存在下で、30秒間培養された。培養は、1mlの氷冷3%過塩素酸溶液の添加によって停止させた。図11は、アンタゴニスト化合物の存在下でADPによってGPR86活性についての濃度応答曲線を示す。このデータは、3回のうちの代表的な1回の実験において得られる3つの実験値の平均値±S.D.を表す。
ヒトP2Y13−AG32細胞におけるアンタゴニストの効力
値は、3つの独立した実験の平均値±S.D.を表す。
GPR86の候補モジュレーターは、次のように同定されることができる:実施例6で説明される解析は、GPR86の「モジュレーティング」用の異なる候補化合物のスクリーニングに前提を提供する。このシナリオによれば、GPR86が安定にトランスフェクトされた細胞は、ADPリガンドの好適濃度(例えば1nM乃至1μMの範囲)及びアゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト、又は他の候補モジュレーター化合物の異なる濃度で(例えば1nM乃至1μM以上の範囲)で共培養される。室温での培養後、細胞は洗浄され、溶解された。そして細胞抽出物のアリコートが、(実施例3,4,及び6で先に説明したように)セカンドメッセンジャー解析でテストされる。この方式で、GPR86活性上に対するモジュレーター化合物の影響が、ADPリガンド濃度、バッファー組成物、培養時間及び温度の至適テスト条件下で、候補モジュレーター化合物の存在又は不在下で、下流のセカンドメッセンジャーの活性を決めることによって、測定されることができる。この解析は、また、ハイスループットフォーマット(キットの欄で説明されたように)でも行って、種々の濃度でたくさんの候補モジュレーターを同時にテストすることができる。GPR86活性は、至適濃度のADP存在下で、定義された濃度で候補モジュレーター化合物の存在下vs不在下でのセカンドメッセンジャーレベルのいかなる変化も検出することによって決定される。
他の態様は、当業者に明らかであろう。前述の詳細な説明は、単なる明瞭化や単なる好例を提供することは理解されよう。本発明の特質及び範囲は、上記実施例に限定されず、クレームによって拡張される。
Claims (30)
- 第1のサンプル中のGPR86活性を検出する方法であって、
a)配列ID NO:2に示すアミノ酸配列を有するGPR86とADPが結合することを許容する条件下で、前記第1のサンプルにおいて、配列ID NO:2に示すアミノ酸配列を有するGPR86とADPを接触させる工程;及び
b)前記第1のサンプルについてセカンドメッセンジャーを検出する工程
を含む検出方法。 - 配列ID NO:2に示すアミノ酸配列を有するGPR86とADPが結合することを許容する条件下で、前記GPR86を含むがADPは含まない第2のサンプルについてセカンドメッセンジャーを検出する工程
を、さらに含む請求項1に記載の検出方法。 - 前記第1及び第2のサンプルは、前記GPR86として前記GPR86を発現する細胞を含んでいる請求項1又は2のいずれかに記載の検出方法。
- 前記第1及び第2のサンプルは、前記GPR86として前記GPR86を有している細胞膜を含んでいる請求項1又は2のいずれかに記載の検出方法。
- GPR86ポリペプチドを発現したウィルスが誘導され、出芽した該ウィルスの膜内又は膜上で、前記接触工程が行われる請求項1又は2のいずれかに記載の検出方法。
- 前記第1及び第2のサンプルは、更にGα16ポリペプチドを含んでいる請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- GPR86に結合する物質の同定方法であって、
a)GPR86に結合する候補物質(候補結合物質)の存在又は不在下で、配列ID NO:2に示すアミノ酸配列を有するGPR86ポリペプチドと前記ADPが結合することを許容する条件下で、前記GPR86ポリペプチドを前記ADPと接触させる工程;及び
b)前記GPR86と前記ADPとの結合を測定し、前記候補結合物質の不在下での結合に対して、前記候補結合物質の存在下での結合が減少していれば、前記候補結合物質をGPR86に結合する物質であると同定する工程;
を含む同定方法。 - 前記接触工程は、前記候補結合物質を含むサンプルを用いて行う請求項7に記載の方法。
- GPR86のシグナリング活性を増大させる物質を同定する方法であって、
a)配列ID NO:2に示すアミノ酸配列を有するGPR86ポリペプチドと候補物質を接触させる工程;
b)前記候補物質の存在下で前記GPR86ポリペプチドのシグナリング活性を測定する工程;及び
c)前記候補物質の存在下で測定されたシグナリング活性と、ADPと前記GPR86ポリペプチドが接触している反応系で測定されたシグナリング活性とを比較し、
前記候補物質の存在下で測定されたシグナリング活性の量が、前記ADPと前記GPR86ポリペプチドが接触している反応系で測定されたシグナリング活性の量の少なくとも10%であるとき、前記物質は前記GPR86のシグナリングを増大させるアゴニストであると同定する工程
を含み、
前記シグナリング活性の測定工程は、グアニンヌクレオチドの結合若しくは変化、アデニレートシクラーゼ活性、cAMP、プロテインキナーゼC活性、フォスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール3リン酸、細胞内カルシウム、アラキドン酸濃度、MAPキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、レポーター遺伝子発現、又はエクオリンベースアッセイを利用した測定を含む同定方法。 - 前記接触工程は、前記候補物質を含むサンプルにおいて行われる請求項9に記載の方法。
- GPR86のシグナリング活性を減少させる物質を同定する方法であって、
a)前記候補物質の存在又は不在下で、配列ID NO:2に示すアミノ酸配列を有するGPR86ポリペプチドとADPとを接触させる工程;
b)前記GPR86ポリペプチドのシグナリング活性を測定する工程;
c)前記GPR86及び前記ADPを含むが前記候補物質は含まない反応系で測定された前記シグナリング活性量と、
前記ADP、前記GPR86及び前記候補物質を含む反応系で測定されたシグナリング活性とを比較し、
前記候補物質不在の反応系での活性に対して前記候補物質が存在する反応系で測定される前記活性が減少していれば、前記候補物質は前記GPR86のアンタゴニストであると同定する工程
を含み、
前記シグナリング活性の測定工程は、グアニンヌクレオチドの結合若しくは変化、アデニレートシクラーゼ活性、cAMP、プロテインキナーゼC活性、フォスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール3リン酸、細胞内カルシウム、アラキドン酸濃度、MAPキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、レポーター遺伝子発現、又はエクオリンベースアッセイを利用した測定を含む同定方法。 - 前記候補物質が存在する反応系は、前記候補物質を含むサンプルである請求項11に記載の方法。
- 前記接触工程は、前記GPR86を表面に発現する細胞内又は細胞上で行われる請求項7〜12のいずれかに記載の方法。
- 前記接触工程は、前記GPR86を表面に発現している細胞の膜画分を用いて行う請求項7〜12のいずれかに記載の方法。
- 前記接触工程は、出芽したウィルスにより誘導され、GPR86を含有している膜内又は膜上で行われる請求項7〜12のいずれかに記載の方法。
- 前記接触工程は、合成リポソーム内又はリポソーム上で行われる請求項7〜12のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞は、COS7細胞、CHO細胞、LM(TK)細胞、NIH−3T3細胞、HEK−293細胞、K−562細胞、及び1321N1アストロサイトーマ細胞からなる群より選ばれる請求項3,4,13又は14のいずれかに記載の方法。
- Gα16ポリペプチドの共存下で、前記接触工程が実行される請求項7〜17のいずれかに記載の方法。
- 前記測定工程又は前記検出工程は、ラベル変位、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギートランスファー、蛍光消光、及び蛍光分極から選ばれる方法を用いて行われる請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
- 前記候補物質は、天然又は合成ペプチド、ポリペプチド、抗体又はその抗原結合断片、脂質、炭水化物、核酸及び有機低分子からなる群より選ばれる請求項7〜19のいずれかに記載の方法。
- GPR86、GPR86に結合する物質、又はGPR86のシグナリング活性を減少又は増加させる物質に対する結合の検出用キットであって、
配列ID NO:2に示すアミノ酸配列を有するGPR86ポリペプチド及びADP、及びそれらのためのパッケージング材料を含み、前記GPR86ポリペプチドとADPが別々にパッケージされているキット。 - 前記GPR86ポリペプチドはGPR86発現細胞内に存在し、さらにGPR86に特異的な抗体又は別にパッケージされたGPR86特異的核酸プローブを含む請求項21のキット。
- 前記細胞は、COS7細胞、CHO細胞、LM(TK)細胞、NIH−3T3細胞、HEK−293細胞、K−562細胞及び1321N1アストロサイトーマ細胞からなる群より選ばれる請求項22のキット。
- 前記GPR86は、単離された細胞膜内に存在している請求項21のキット。
- さらにGα16ポリペプチドを含む請求項21〜24のいずれかに記載のキット。
- GPR86のシグナリング活性を増大又は減少させる物質のスクリーニングキットであって、
a)配列ID NO:2に示すアミノ酸配列を有するGPR86ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、ADP、及びGPR86シグナリング検出手段、並びにこれらのパッケージング材料を含む;又は
b)GPR86ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフォームされた細胞、ADP、及びGPR86シグナリング検出手段、並びにこれらのパッケージング材料を含み、前記細胞とADPは別々にパッケージされている;
いずれかを含むキットであって、
前記シグナリング検出手段は、グアニンヌクレオチドの結合若しくは変化、アデニレートシクラーゼ活性、cAMP、プロテインキナーゼC活性、フォスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール3リン酸、細胞内カルシウム、アラキドン酸濃度、MAPキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、レポーター遺伝子発現、又はエクオリンベースアッセイを含むスクリーニングキット。 - 前記物質が、配列ID NO:2に示すアミノ酸配列を有するGPR86に特異的な抗体又は当該GPR86特異的核酸プローブを用いて検出される請求項26に記載のキット。
- ADP存在下で配列ID NO:2に示すアミノ酸配列を有するGPR86を発現する細胞において測定されるGPR86シグナリング活性の標準をさらに含む請求項21〜27のいずれかに記載のキット。
- ADPに代えて、2MeSADP,ADPβS、又はAp3Aが用いられる請求項1〜20のいずれかに記載の方法。
- ADPに代えて、2MeSADP,ADPβS、又はAp3Aが用いられる請求項21〜28のいずれかに記載のキット。
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