JP4370874B2 - マイクロアレイ用基板 - Google Patents

Description

本発明は、検体の情報シグナルを蛍光として検出するマイクロアレイ用固相基板の製造方法に関する。

マイクロアレイを用いて試料検体の情報を得る技術は、生物学、医学において欠くことのできない技術になりつつある。例えばＤＮＡマイクロアレイでは、複雑な生物系においてもゲノム全体の発現パターンの研究が可能となり、遺伝子情報量の爆発的な増加がもたらされている。
マイクロアレイのシグナル検出において、マイクロアレイ用基板のバックグランドはＳ／Ｎ比を低下させる原因となり、検出精度を低下させる（例えば、非特許文献１など）。Ｓ／Ｎ比とは、ラベル化された試料検体から得られたシグナル量（シグナル）をラベル化された試料検体から得られたシグナル物質以外の部位から発生したシグナル量（ノイズ）で除した値のことをいい、Ｓ／Ｎ比が高いと検出感度が高くなる。
マイクロアレイ上の物質を検出する手段として蛍光物質を用いる場合、マイクロアレイ固相基板の自己蛍光量がバックグランドとなり、基板の自己蛍光が高いと、Ｓ／Ｎ比が低下する問題がある。また、バックグラウンドにムラが生じた場合、その基板から得られたデータの再現性・信頼性に支障をきたす。

マイクロアレイ用基板として用いられる素材は、ガラスもしくはプラスチック製であることが多いが、通常これらの材料表面は化学的に不活性であることから、生理活性物質を固定化するためには表面修飾を施す必要がある。ガラスやプラスチックなどの不活性な表面に様々な官能基を直接導入することは困難であるため、まずアミノ基を導入しておき、そのアミノ基を介して官能基を導入する方法が一般的である。
基板表面へのアミノ基の導入方法として、アミノアルキルシランによる処理、窒素雰囲気下でのプラズマ処理、アミノ基含有高分子物質のコーティングなどが挙げられるが、処理の簡便性、均一性、再現性の観点から、アミノアルキルシランによる処理が多用されている。一般的に用いられているアミノアルキルシランとしては、アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルメチルジメトキシシランなどの１級アミノ基を有するアミノアルキルシランが挙げられる。

アミノ基を介して官能基を導入する方法として、例えば、２官能性アルデヒドを有するグルタルアルデヒドで処理することにより、基板にアルデヒド基を導入することが知られている（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。マレイミド基を導入する場合は、一端にマレイミド基、一端に活性エステルを有する架橋剤であるＮ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミドなどで処理することができる（特許文献４）。また、同様にＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを導入する場合には、両端に活性エステル基を有するEthyleneglycol−O,O−bis (succinimidylsuccinate)などを用いる。
しかし、固相基板に上記のような表面処理をすることで、基板の自己蛍光量が増大し、この基板の自己蛍光の上昇がＳ／Ｎ比の低下の原因となっていた。そのため、自己蛍光量を低減するための有効な解決手段が求められていた。
「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、２０００年、ｐ.５７ 特開２００２−１７６９９１号公報 特開２００２−１８１８１７号公報 特表２００２−５３２６９９号公報 特開平１１−１８７９００号公報

本発明は、自己蛍光を低減化したマイクロアレイ用固相基板を提供することである。

本発明は、以下の通りである。
（１）生理活性物質を捕捉する物質である捕捉物を固定し、更に捕捉された生理活性物質量を蛍光により検出を行なうマイクロアレイに用いられる基板であって、基板表面に一般式Ｉ、一般式II、及び一般式IIIで表される化合物から選ばれる少なくとも１つのアミノアルキルシランが導入され、アミノアルキルシランのアミノ基とアルデヒド基、マレイミド基、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルのうちの少なくとも１つから選ばれる官能基を介して、アルデヒド基、マレイミド基、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルのうち少なくとも１つから選ばれる官能基が導入されているマイクロアレイ用基板。

（式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅは１〜２０の整数、Ｘ、Ｙは炭化水素基、R₁、R₂、R₃は少なくとも１つはアルコキシ基で、他は炭化水素基を示す。）
（２）基板の材質がプラスチックである（１）記載のマイクロアレイ用基板。
（３）プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（２）記載のマイクロアレイ用基板。
（４）（１）〜（３）いずれか記載のマイクロアレイ用基板に捕捉物を固定化したマイクロアレイ用基板。
（５）捕捉物が核酸、オリゴペプチド、蛋白、糖鎖、脂質の中から選ばれる少なくとも１つであるか、又はこれらの中から少なくとも１つを含む複合体である（４）記載のマイクロアレイ用基板。

本発明によれば、マイクロアレイ用基板の自己蛍光を低減することにより、マイクロアレイの検体のシグナルを精密に検出することができる利点がある。

以下、本発明を詳細に説明する。
上述したように、基板表面へアミノアルキルシランによる表面処理を施した際、基板の自己蛍光量が増大する主たる要因は、表面をアミノ化した後の官能基の導入することにあった。この要因として、アミノ基を介して官能基を導入した際のシッフ塩基およびペプチド結合の形成が挙げられる。例えば、アミノアルキルシラン処理により基板表面にアミノ基を導入した後、グルタルアルデヒド処理を施すと、１級アミノ基とアルデヒド基が反応してシッフ塩基（一般式 Ｒ−ＣＨ＝Ｎ−Ｒ'）が生じ、その結果、蛍光量が大幅に増大する。同様にマレイミド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを導入する場合は、アミノ基との反応の結果形成されるペプチド基等により、蛍光量が増大する。

本発明者は、基板の自己蛍光の原因がアミノアルキルシランによる表面処理後の官能基を導入する過程によるものだけではなく、アミノアルキルシランによる表面処理過程においても基板の自己蛍光が大きく影響されることを見出した。本発明における基板の自己蛍光の低減方法は、アミノ化工程において、２級アミノ基を少なくとも１つ含み、かつ１級アミノ基を含まないアミノアルキルシランを使用することにより達成される。

アミノアルキルシランによる表面処理方法において、基板の自己蛍光量が増大する原因として、次の２点が挙げられる。まず、使用するアミノアルキルシラン自身の蛍光量が存在することである。次に、アミノアルキルシランの末端の１級アミン基が固相基板表面に存在する水酸基に静電的相互作用に付着すること（Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒ ｆａｃｅ Ｓｃｉ．，７４，３９６（１９８０））により、基板の自己蛍光が増大する。さらに、基板表面にカルボニル基やアルデヒド基などの官能基が存在すると、それらの官能基とアミノアルキルシラン末端の１級アミノ基とが反応することにより生成されるシッフ塩基により、蛍光が大幅に増大する。このように、１級アミノ基を含むアミノアルキルシランを使用する場合では、アミノアルキルシランの基板への付着、およびアミノ化後の官能基を導入する際（例えば、グルタルアルデヒド）に、シッフ塩基を生成し、その結果、基板の自己蛍光は増大していた。しかし、本発明で用いるアミノアルキルシランは、１級アミンを含まないため、基板への付着および官能基の導入の際に、シッフ塩基を生成しない。よって、基板の自己蛍光は増大しない。

本発明において、２級アミノ基を少なくとも１つ含み、かつ１級アミノ基を含まないアミノアルキルシランとしては、一般式Ｉ、一般式II、一般式IIIで表され、かつそのR₁、R₂、R₃の少なくとも１つにアルコキシ基を有する化合物を用いることが好ましい。

一般式Ｉにおいては、a＝ｂ、かつR₁、R₂、R₃部の少なくとも２つがメトキシ基（−OCH₃）またはエトキシ基（−OC₂H₅）であることが好ましい。さらに好ましくは、R₁、R₂、R₃部の全てがメトキシ基またはエトキシ基のときである。例えば、ａ=ｂ=３、ｃ=２、R₁＝R₂＝R₃＝（−OCH₃）に相当するＮ，Ｎ’−ビス[３−（トリメトキシシリル）プロピル]エチレンジアミンが例に挙げられる。

一般式IIにおいては、ｄ＝ｅ、かつR₁、R₂、R₃部の少なくとも２つがメトキシ基（−OCH₃）またはエトキシ基（−OC₂H₅）であることが好ましい。例えば、ｄ＝ｅ=３、R₁＝ＣＨ₃、R₂＝R₃＝（−OC₂H₅）に相当するビス（メチルジエトキシシリルプロピル）アミンが挙げられる。さらに好ましくは、R₁、R₂、R₃部の全てがメトキシ基またはエトキシ基のときである。例えば、ｄ＝ｅ＝３、R₁＝R₂＝R₃＝（−OCH₃）に相当するビス（トリメトキシシリルプロピル）アミンが例に挙げられる。

一般式IIIにおいては、Ｘ及び／またはＹが飽和炭化水素基であり、かつR₁、R₂、R₃部の少なくとも２つがメトキシ基（−OCH₃）またはエトキシ基（−OC₂H₅）であることが好ましい。飽和炭化水素基は直鎖状炭化水素基、又は枝分かれ構造をもつ炭化水素基のどちらであっても良い。さらに好ましくは、R₁、R₂、R₃部の全てがメトキシ基またはエトキシ基のときである。例えば、Ｘがイソブチル基（−ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂−）、Ｙがｎ−エチル基（−ＣＨ₂ＣＨ₃）、R₁＝R₂＝R₃＝（−OCH₃）に相当するＮ−エチルアミノイソブチルトリメトキシシランや、Ｘがプロピル基（−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−）、Ｙがメチル基（−ＣＨ₃）、R₁＝R₂＝R₃＝（−OCH₃）に相当するＮ−メチルアミノプロピルトリメトキシシランなどが挙げられる。

本発明で用いるアミノアルキルシランの濃度としては、０．０１〜１０体積％が好ましく、０．１〜５体積％がより好ましく、０．５％〜２．５体積％が最も好ましい。１０体積％を超えると、アミノアルキルシランの凝集が激しく、基板への結合性が悪くなり好ましくない。０．０１体積％未満であると、基板への結合性が悪くなり好ましくない。

また、本発明では、アミノアルキルシランによりアミノ基を導入した後、官能基を導入することもできる。導入する官能基としては、アルデヒド基、マレイミド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルが好ましい。これらの官能基の導入方法としては、一般的な方法を用いることができ、例えば、２官能性アルデヒドを有するグルタルアルデヒドで処理することにより、基板にアルデヒド基を導入することができる。また、マレイミド基を導入する場合は、一端にマレイミド基、一端に活性エステルを有する架橋剤であるＮ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミドなどで処理することができる。また、同様にＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを導入する場合には、両端に活性エステル基を有するEthyleneglycol−O,O−bis (succinimidylsuccinate)などを用いる。

本発明のマイクロアレイ用基板の素材は、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができるが、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックが好ましい。プラスチックとしては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、たとえばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。

以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、実施例の範囲に限定されるものではない。
（実施例１）
プラスチック基板を２体積％のＮ，Ｎ’−ビス[３−（トリメトキシシリル）プロピル]エチレンジアミンのエタノール溶液に浸漬した後、純水洗浄し、熱処理することによりアミノ基を導入した。
（実施例２）
実施例１で作製した基板を１体積％のグルタルアルデヒド水溶液に浸漬した後、純水洗浄することでアルデヒド基を導入した。

（実施例３）
プラスチック基板を２体積％のビス（トリメトキシシリルプロピル）アミンのエタノール溶液に浸漬した後、純水洗浄し、熱処理することによりアミノ基を導入した。
（実施例４）
実施例３で作製した基板を１体積％のグルタルアルデヒド水溶液に浸漬した後、純水洗浄することでアルデヒド基を導入した。

（実施例５）
プラスチック基板を２体積％のＮ−メチルアミノプロピルトリメトキシシランのエタノール溶液に浸漬した後、純水洗浄し、熱処理することによりアミノ基を導入した。
（実施例６）
実施例５で作製した基板を１体積％のグルタルアルデヒド水溶液に浸漬した後、純水洗浄することでアルデヒド基を導入した。

（比較例１）
プラスチック基板を１体積％の３−アミノプロピル−トリメトキシシランのエタノール溶液に浸漬した後、純水洗浄し、熱処理することによりアミノ基を導入した。
（比較例２）
実施例２で作製した基板を１体積％のグルタルアルデヒド水溶液に浸漬した後、純水洗浄することでアルデヒド基を導入した。

実施例および比較例における自己蛍光量の測定には、マイクロアレイ用蛍光スキャナー「ScanArray」（Packard BioChip Technologies社製）を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度７０％、励起波長５５０ｎｍ、測定波長５７０ｎｍであった。ＳｃａｎＡｒｒａｙを用いて得られたスキャンイメージから、スキャナーに付属の解析用ソフトウェア「ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ」を用いて基板の蛍光量を数値化した結果を表１に示す。

実施例１、実施例２、実施例３、実施例４、実施例５、実施例６では、比較例１および比較例２と比較して、自己蛍光が低い結果となった。この結果は、本発明の効果を支持するものであった。

本発明のマイクロアレイ用基板は、自己蛍光が低減化し、Ｓ／Ｎ比を高めることができるため、マイクロアレイに使用した場合に検体のシグナルを精密に検出することができる。

Claims (5)

1. 生理活性物質を捕捉する物質である捕捉物を固定し、更に捕捉された生理活性物質量を蛍光により検出を行なうマイクロアレイに用いられる基板であって、基板表面に一般式Ｉ、一般式II、及び一般式IIIで表される化合物から選ばれる少なくとも１つのアミノアルキルシランが導入され、アミノアルキルシランのアミノ基とアルデヒド基、マレイミド基、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルのうちの少なくとも１つから選ばれる官能基を介して、アルデヒド基、マレイミド基、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルのうち少なくとも１つから選ばれる官能基が導入されているマイクロアレイ用基板。
   

   

   （式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅは１〜２０の整数、Ｘ、Ｙは炭化水素基、R₁、R₂、R₃は少なくとも１つはアルコキシ基で、他は炭化水素基を示す。）
2. 基板の材質がプラスチックである請求項１記載のマイクロアレイ用基板。
3. プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである請求項２記載のマイクロアレイ用基板。
4. 請求項１〜３いずれか記載のマイクロアレイ用基板に捕捉物を固定化したマイクロアレイ用基板。
5. 捕捉物が核酸、オリゴペプチド、蛋白、糖鎖、脂質の中から選ばれる少なくとも１つであるか、又はこれらの中から少なくとも１つを含む複合体である請求項４記載のマイクロアレイ用基板。