JP4348066B2 - 加水分解酵素を用いる基質の加水分解方法 - Google Patents
加水分解酵素を用いる基質の加水分解方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4348066B2 JP4348066B2 JP2002329483A JP2002329483A JP4348066B2 JP 4348066 B2 JP4348066 B2 JP 4348066B2 JP 2002329483 A JP2002329483 A JP 2002329483A JP 2002329483 A JP2002329483 A JP 2002329483A JP 4348066 B2 JP4348066 B2 JP 4348066B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- water
- reaction
- hydrolase
- electrolytically generated
- hydrolysis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Water Treatment By Electricity Or Magnetism (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、基質を、同基質とは独立した加水分解酵素を用いて加水分解（酵素反応）するための加水分解方法に関する。上記した「基質とは独立した加水分解酵素」とは、基質に内在する加水分解酵素ではなく、加水分解に際して、基質に添加される加水分解酵素を意味する。なお、本願発明の以下の説明では、断りの無い限り、「基質とは独立した加水分解酵素」を単に加水分解酵素という。
【０００２】
【従来の技術】
現在、基質を加水分解酵素を用いて加水分解する技術は、食品の加工分野、食品の調理分野、香料の製造分野、各種の油脂製造分野、工業製品の加工分野、各種製品の汚染除去分野等、極めて広い分野で利用されている。これらの分野では、被加水分解物である基質との関係で、当該基質の加水分解を促進するのに適した加水分解酵素を選択して加水分解反応を行って、有用な分解生成物を得たり、分解生成物を除去して基質の処理を行っている。
【０００３】
このように、当該加水分解方法での加水分解反応（酵素反応）は、加水分解酵素の作用が大きく関与していることから、加水分解反応を円滑かつ迅速に促進するには、酵素反応中、加水分解酵素が高い活性を保持していることが要求される。このため、従来の加水分解方法では、基質と加水分解酵素の反応系に緩衝液を介在させて、反応系を、加水分解酵素が最大の活性状態を保持する一定のｐＨに調整する手段が採られている。
【０００４】
しかしながら、当該加水分解方法を採用する場合においても、加水分解反応の開始に先だって、加水分解酵素の活性を高めておくことが有利である。この点に着目して、本発明者等はすでに、加水分解反応の前段階において、加水分解酵素を活性化する方法を提案している（例えば特許文献１参照）。
【０００５】
上記した特許文献１にて提案している酵素の活性化方法は、加水分解酵素であるアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ等を活性化するもので、当該加水分解酵素を電解生成水に溶解して活性化する手段を採っている。電解生成水としては、有隔膜電解にて生成される電解生成アルカリ性水と電解生成酸性水を採用し、これらの電解生成水を活性化の対象とする加水分解酵素に応じて使い分けしている。例えば、加水分解酵素がα−アミラーゼである場合には電解生成アルカリ性水を採用し、加水分解酵素が酸性プロテアーゼやリパーゼである場合には電解生成酸性水を採用している。
【０００６】
【特許文献１】
特開２０００−２４５４５３号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、上記した特許文献１にて提案している加水分解酵素の活性化方法は、電解生成水が有する固有の機能によって加水分解酵素を活性化させるものであって、基質と加水分解酵素の緩衝液中での加水分解反応の前段階で行われるものである。従って、加水分解酵素を活性化した後に引き続きなされる加水分解反応では、電解生成水の機能が緩衝液によって相殺されて消失されるおそれがあって、加水分解反応の途中では、加水分解酵素が高い活性を保持し得ない状態となるおそれがある。
【０００８】
また、当該加水分解酵素の活性化手段を採用する加水分解方法では、酵素液を調製する操作と基質液を調製する操作の２つの液の調製操作を必要とすることになって、加水分解反応の前段階の調製操作が面倒であり、当該加水分解方法を工業的に利用するのは不利である。
【０００９】
また、工業的規模の加水分解方法では市販の酵素剤を使用するが、酵素の精製には時間と多大な費用がかかり、しかも純度の高い酵素を大量に精製することができないことから、市販の酵素剤は、多数の種類の酵素が混在する純度の低いものである。従って、酵素剤中に混在するわずかな量ではあるが複数の酵素の利用を考慮すれば、反応系に緩衝液を存在させる加水分解方法では、混在する複数の酵素を有効に利用することはできない。
【００１０】
従って、本発明の主たる目的は、本発明者等がすでに確認している電解生成水の加水分解酵素の活性化機能を有効に利用して、基質と加水分解酵素との加水分解反応の開始時点から終了時点までの間、加水分解酵素の活性状態を保持する方法を提供して、反応系に緩衝液を使用することなく、加水分解反応を促進することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、基質とは独立した加水分解酵素により、同基質を加水分解するための加水分解方法に関するものであって、基質と、同基質とは独立した加水分解酵素と、電解生成水の３成分が混在する反応系で加水分解反応を行うものである。
【００１２】
しかして、本発明に係る加水分解方法においては、加水分解の開始時点から終了時点までの間、基質、加水分解酵素および分解生成物の反応系に電解生成水を常に存在させて、加水分解反応を促進させることを特徴とするものである。
【００１３】
本発明に係る加水分解方法においては、前記加水分解酵素として、微生物由来の加水分解酵素を採用することができ、また、前記電解生成水として、水または希薄食塩水を被電解水とする有隔膜電解にて生成される電解生成アルカリ性水または電解生成酸性水を採用することができる。この場合、前記電解生成水の選択にあっては、電解生成水の採用する加水分解酵素に対する活性化機能の有無を判断基準とするものである。
【００１４】
【発明の作用・効果】
本発明に係る加水分解方法は、基質と加水分解酵素と電解生成水の３成分の反応系で加水分解反応を行うものであり、この間、緩衝液を介在させることがないない。このため、当該加水分解方法によれば、加水分解の開始時点から終了時点まで間、基質、加水分解酵素および分解生成物が構成する反応系には常に電解生成水が存在し、当該電解生成水の酵素活性化機能によって、加水分解酵素は加水分解反応の終了時点まで高い酵素活性を保持して、加水分解反応を速やかに促進することになる。
【００１５】
また、本発明に係る加水分解方法では、反応系に緩衝液を介在させることがないため、加水分解反応の前段階において、基質液の調製操作と酵素液の調製操作の２つの液の調製操作を省略することができて、加水分解反応を促進する上で極めて有利である。
【００１６】
また、本発明に係る加水分解方法では、加水分解反応中常に電解生成水が存在しており、かつ、緩衝液等によって酵素に対する活性化機能を相殺されることがないことから、加水分解酵素として市販の酵素剤を使用する場合、酵素剤が含有する主たる酵素以外の複数の加水分解酵素を反応系のｐＨの変化に応じて次々に活性化させて、これらの加水分解酵素を当該加水分解反応に有効に利用することができ、この面からも、加水分解反応を一層促進することが可能になる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明は、加水分解酵素を用いる基質の加水分解方法であり、基質と加水分解酵素と電解生成水の３成分が構成する反応系で、加水分解反応を促進させるものである。本発明に係る加水分解方法では、加水分解の対象とする基質としては、例えば澱粉、タンパク質、脂質、セルロース等を挙げることができ、また、これらの基質に対応する加水分解酵素としては、例えばアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼを挙げることができる。これらの加水分解酵素は、いずれも微生物由来の加水分解酵素である。
【００１８】
これらの各加水分解酵素においては、例えばα−アミラーゼは、澱粉の加水分解酵素として、デキストリン、異性化糖、ブドウ糖、水飴、マルトース、マルトオリゴ糖、シクロデキストリン、カップリングシュガー等の製造に使用され、例えば酸性プロテアーゼは、大豆タンパク質の加水分解酵素として、醤油、味噌、麺つゆ、焼き肉のたれ、ドレッシング等の製造に使用され、例えばリパーゼは、脂質の加水分解酵素として、脂肪酸、石鹸、糖脂肪酸エステル等の界面活性剤、香料、メントール等の製造に使用され、また、例えばセルラーゼは、セルロースの加水分解酵素として、繊維柔軟化加工、セルロースの除去による汚れ除去加工等に使用される。
【００１９】
本発明に係る加水分解方法における最大の特徴は、上記した各基質と各加水分解酵素の適宜の組合わによる加水分解反応において、各基質と各加水分解酵素との反応系に電解生成水を介在させること、換言すれば、基質と加水分解酵素と電解生成水の３成分の反応系で加水分解反応を行うことにある。
【００２０】
本発明に係る加水分解方法では、加水分解反応の開始時点から終了時点までの間、基質、加水分解酵素および分解生成物の反応系に、加水分解酵素に対する酵素活性機能を有する電解生成水が常に存在していることであり、これにより、加水分解酵素は、基質の加水分解が終了する時点まで高い活性状態を保持して、加水分解反応を促進させるものである。
【００２１】
本発明に係る加水分解方法においては、基質と加水分解酵素と電解生成水の３成分の反応系では、加水分解反応の初期の急激な進行によって、そのｐＨが急激に変化して中性の近傍に至り、その後の加水分解反応の進行によって、そのｐＨが漸次中性に近づく現象が認められる。この現象は、反応系にｐＨを一定に保持するための緩衝液が存在しないためであり、電解生成水の高い酵素活性化機能と、当該電解生成水が加水分解反応の終了時まで存在していることによって、酵素剤中のほぼ不可避的に混在している複数の加水分解酵素がｐＨの変化によって順次活性化されて、基質の加水分解反応に寄与しているためと推測される。
【００２２】
基質の加水分解反応の反応系に、同反応系のｐＨを一定に調整するための緩衝液を存続させる従来の加水分解方法では、反応系のｐＨを一定に調整して加水分解酵素の酵素活性を維持して、基質の加水分解反応を促進させることを意図しているものであり、当該加水分解方法では、基質の酸化抑制や二次構造の変化等については全く考慮されていない。また、当該加水分解方法では、加水分解反応で生成される加水分解生成物の酸化抑制については、当然のことながら考慮されていない。
【００２３】
これに対して、本発明に係る加水分解方法においては、基質の加水分解反応の反応系には、ｐＨを一定に調整するための緩衝液を存在させず、これに替えて、加水分解酵素の酵素活性機能を有する電解生成水を存続させているものである。このため、本発明に係る加水分解方法によれば、当該電解生成水が有するｐＨ、酸化還元電位、イオン濃度の特性、および、その他の固有の特性を複合的に有効に利用して、基質の加水分解反応の促進を図ることができ、これにより、加水分解生成物を効率よく生成することができる。
【００２４】
本発明に係る加水分解方法においては、電解生成水として、有隔膜電解にて生成される各電解生成水、すなわち、電解生成アルカリ性水および電解生成酸性水を選択的に採用することができる。これらの電解生成水は、採用する加水分解酵素に応じて使い分けして使用する。
【００２５】
電解生成アルカリ性水および電解生成酸性水を選択する判断基準は、採用する加水分解酵素に対する活性化機能の有無を基準とする。例えば、冒頭で例示している本出願人の先願である特許文献１に明示しているように、α−アミラーゼに対しては電解生成アルカリ性水を選択し、酸性プロテアーゼに対しては電解生成酸性水を選択し、アルカリ性プロテアーゼに対しては電解生成アルカリ性水を選択し、リパーゼに対しては電解生成酸性水を選択し、セルラーゼに対しては電解生成酸性水を選択する。
【００２６】
本発明に係る加水分解方法で採用する電解生成水は、有隔膜電解にて生成される電解生成アルカリ性水または電解生成酸性水であるが、当該有隔膜電解では、被電解水として、水道水、天然水等の一般水や希薄食塩水を採用することができる。原料である被電解水のコストを考慮すれば、被電解水として水道水等の一般水であることが好ましい。
【００２７】
電解生成水、特に電解生成酸性水中に残留する塩素成分（残留塩素成分）の加水分解酵素や基質に対する影響は、残留塩素成分が低濃度の場合には問題ないが、残留塩素成分が高濃度の場合については十分に検討してはいない。このため、高濃度の残留塩素成分の、加水分解酵素や基質に及ぼす影響を皆無とすることを考慮すれば、被電解水は一般水であることが好ましい。
【００２８】
本発明に係る加水分解方法に採用するのに好ましい電解生成アルカリ性水としては、ｐＨが８．５〜１１の範囲、酸化還元電位が１００〜−８００ｍＶの範囲のものである。当該電解生成アルカリ性水のイオン濃度については、被電解水が水道水の場合には硬度が１０〜３００ｍｇ／ｌであり、被電解水が塩類の希薄水溶液である場合には塩濃度が１０〜３００ｍｇ／ｌである。また、採用するに好ましい電解生成酸性水は、ｐＨが３．０〜５．５の範囲、酸化還元電位が９００〜４００ｍＶの範囲であり、イオン濃度については、上記した電解生成アルカリ性水の場合と同様である。これらの各電解生成水は、加水分解反応における加水用水と同様の態様で使用される。
【００２９】
本発明に係る加水分解方法において、電解生成水として電解生成アルカリ性水を採用する場合、電解生成アルカリ性水は、加水分解反応では基質の酸化を抑制しつつ酵素反応を促進させ、加水分解生成物の酸化を抑制しており、フリーラジカル消去能が高い。また、本発明に係る加水分解方法において、電解生成水として電解生成酸性水を採用する場合、電解生成酸性水は、加水分解反応では基質の酸化を抑制しつつ基質の二次構造の変化をも抑制して酵素反応を促進させ、加水分解生成物の酸化を抑制しており、フリーラジカル消去能が高い。
【００３０】
本発明に係る加水分解方法においては、基質、加水分解酵素および電解生成水が構成する反応系が加水分解反応の進行によってｐＨが変化するが、反応系のｐＨの変化に応じて、使用する酵素剤に混在している他の複数の酵素が順次活性化されて加水分解反応に寄与して、加水分解反応を促進させる。
【００３１】
本発明に係る加水分解方法においては、反応系のｐＨを一定に調整する緩衝液を反応系に存続させるものではないことから、加水分解反応の前段階において、従来のごとき基質液の調製操作と酵素液の調製操作を省略することができて、加水分解反応を促進する上で極めて有利である。
【００３２】
本発明者等は、本発明に係る加水分解方法を、加水分解酵素の代表例であるアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼを用いて実施することにより、その作用効果を確認している。下記の「実施例」の項では、その一例である大豆タンパク質（基質）をアスペルギルスオリゼー由来のプロテアーゼ（加水分解酵素）で加水分解反応を行った実験例を詳細に示す。
【００３３】
【実施例】
本実施例は、大豆タンパク質を加水分解（酵素分解）して、抗酸化性で低分子量のペプチド（分子量２５００〜３０００）を生成するのに水が関与していることに着目して、機能性を付与した電解生成水の有効性を評価することを目的としているものである。
【００３４】
従来、大豆の発酵食品である醤油、味噌の製造に用いられている麹菌は、そのほとんどがアスペルギルスオリゼーであり、麹の酵素のなかでもプロテアーゼは、大豆タンパク質を分解するのに最も重要な役割を果たしている。プロテアーゼの活性を高めることは、大豆の発酵食品の品質、食味、収量等の向上や、大豆の発酵食品の製造期間の短縮に寄与する。本実施例では、味噌の製造方法を参考にして、大豆タンパク質の酵素分解に対する電解生成水（電解生成アルカリ性水および電解生成酸性水）の有効性を評価をするものである。
【００３５】
本実施例では、供試水として、水道水を被電解水とする有隔膜電解にて生成された電解生成アルカリ性水および電解生成酸性水、浄水、その他のアルカリ性水および酸性水を採用し、加水分解酵素として、プロテアーゼ（Aspergillus oryze由来）を採用して、大豆タンパク質（基質）を加水分解して低分子量のペプチドを生成する酵素反応実験、および、当該酵素反応に関連する実験を行い、各電解生成水の有効性について検討して評価した。以下には、各実験の内容、各測定方法、および測定結果を詳細に示すとともに、評価を示す。
【００３６】
（１）評価の要約：加水用水として電解生成水を採用すれば、反応系のｐＨを一定に調製するための緩衝液を使用することなく、大豆タンパク質を効率よく加水分解して、低分子量のペプチドを生成することができる。この事実は、従来の加水分解と同等またはそれ以上の効率を得る加水分解反応（酵素反応）を行う場合に、従来の加水分解方法では不可避としている基質液の調製操作と酵素液の調製操作を省略し得ることを教示している。従って、本発明に係る加水分解方法は、低分子量のペプチドの生成に極めて有利な方法である。
【００３７】
使用する電解生成水が電解生成アルカリ性水である場合には、大豆タンパク質の加水分解物である低分子量のペプチドが多く生成されること、および、当該ペプチドはＤＰＰＨラジカル（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl）の消去能力が高く、分解率の上昇にともなって増大する。この現象は、使用する電解生成水が電解生成酸性水である場合もほぼ同様の傾向にある。但し、この現象は、電解生成酸性水の場合には、電解生成アルカリ性水の場合ほど顕著ではない。
【００３８】
大豆タンパク質の加水分解反応（酵素反応）に、電解生成アルカリ性水、電解生成酸性水を採用すれば、基質である大豆タンパク質の酸化を抑制する効果があることを確認した。抗酸化性の高いペプチドを生成するには、基質である大豆タンパク質の酸化を抑制することが重要である。
【００３９】
電解生成アルカリ性水は、アルカリ性プロテアーゼおよび中性プロテアーゼの酵素活性を高めて、基質である大豆タンパク質の加水分解反応を促進させることを確認した。また、電解生成酸性水は、酸性プロテアーゼの酵素活性を高めるが、中性プロテアーゼ の酵素活性を高める効果が無いことを確認した。これらの酵素活性の要因は定かではないが、電解生成水のｐＨ、イオン濃度、酸化還元電位等の特性と、これら以外の特性とが関与しているものと推測される。
【００４０】
（２）実験で採用した試料：基質は、粒径２０μｍ以下に粉砕された水分４．３重量％、タンパク質３９．５重量％、脂質２１．２重量％、糖質２７．２重量％、繊維質３．１重量％、灰分４．７重量％の全脂活性大豆粉末（株式会社ゴトウ食品製）、および、大豆カゼイン（SIGMA社製）である。加水分解酵素は、微生物由来の加水分解酵素（Aspergillus oryzse由来のSIGMA社製PROTEASE Type XXIII）である。供試水は、下記の１０種類の水である。
【００４１】
一般の水道水を浄水器（株式会社メイスイ製FX-21LZ）で残留塩素成分を除去した水（浄水…ＮＷ）、これを被電解水として有隔膜電解式電解水生成装置（ホシザキ電機株式会社製HOX-４０A）にて生成した電解生成アルカリ性水（ｐＨ１０．５…ＥＣＷ１０，５，ｐＨ１０…ＥＣＷ１０，ｐＨ９…ＥＣＷ９）、および、電解生成酸性水（ｐＨ３．５…ＥＡＷ３．５，ｐＨ４…ＥＡＷ４，ｐＨ５…ＥＡＷ５）。
【００４２】
蒸留水（ＤＷ）に水酸化ナトリウムを溶解して調製したｐＨ１０．５のアルカリ性水溶液（ＮａＯＨａｑ．）、および、蒸留水（ＤＷ）に塩酸を溶解して調製したｐＨ３．５の酸性水溶液（ＨＣｌａｑ．）。これらの（ＮａＯＨａｑ．）および（ＨＣｌａｑ．）は、電解生成水のｐＨ、イオン濃度（Ｉｏｎ）、酸化還元電位（ＯＲＰ）の効果を検討するためのコントロールである。
【００４３】
（ＮａＯＨａｑ．）に硫酸ナトリウムを溶解してイオン濃度をｐＨ１０．５の電解生成アルカリ性水と同一になるように調整した水溶液（ＮａＯＨ-Ｉｏｎａｑ．）、および、（ＨＣｌａｑ．）に硫酸ナトリウムを溶解してイオン濃度をｐＨ３．５の電解生成酸性水と同一になるように調整した水溶液（ＨＣｌ-Ｉｏｎａｑ．）
蒸留水（ＤＷ）に硫酸ナトリウムを溶解してイオン濃度を浄水と同一になるように調整した水溶液（ＤＷ-Ｉｏｎａｑ．）、および、（ＮａＯＨ-Ｉｏｎａｑ．）に水素ガスを２００ｍｌ／ｍｉｎで通気してＯＲＰをｐＨが１０．５の電解生成アルカリ性水と同一になるように調整した水溶液（Ｈ2-ＮａＯＨ-Ｉｏｎ ａｑ．）。
【００４４】
（３）供試水の水質分析：ＪＩＳ Ｋ０１０１の工業用水試験方法に基づいて、供試水の水質を分析した。ｐＨの測定には、ｐＨ計（株式会社堀場製作所製Ｍ-１２）を使用。ＯＲＰの測定には、ｐＨ／ＯＲＰ計（株式会社堀場製作所製Ｄ-１３）を使用。電気伝導度（ＥＣ）の測定には、電気伝導度計（株式会社堀場製作所製ＥＳ-１４）を使用。溶存酸素（ＤＯ）の測定には、ｐＨ／ＤＯ計（株式会社堀場製作所製Ｄ-２５）を使用。溶存水素（ＤＨ）の測定には、溶存水素計（東亜電波工業株式会社製ＤＨＤＩ-１）を使用。陽イオンの測定には、原子吸光分光光度計（株式会社日立製作所製Ｚ-５３００）を使用。塩素イオン（Ｃｌ-）の測定には、硝酸銀滴定法を使用。リン酸イオン（ＰＯ4 3-）の測定には、モリブデン青（塩化すずII）吸光光度法を使用。硫酸イオン（ＳＯ4 2-）の測定には、ブルシン吸光光度法を使用。
【００４５】
これらの測定に基づく各供試水の水質の分析結果を、表１および表２に示す。但し、電解生成水については、本実験で主として採用する、電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）および電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）のみを、その代表例として示している。
【００４６】
【表１】
【００４７】
【表２】
【００４８】
電解生成水は、浄水（ＮＷ）を被電解水とする有隔膜電解にて生成したもので、電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ）は電解槽の陰極側電解室で生成され、かつ、電解生成酸性水（ＥＡＷ）は電解槽の陽極側電解室で生成されたものである。電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ）は、ｐＨが９〜１０．５の範囲にあって、被電解水である浄水（ＮＷ）に比較してカチオンが増加し、酸化還元電位（ＯＲＰ）が低下し、溶存水素（ＤＨ）が増加し、電気伝導度（ＥＣ）が増加している。電解生成酸性水（ＥＡＷ）は、ｐＨが３．５〜５の範囲にあって、被電解水である浄水（ＮＷ）に比較してアニオンが増加し、酸化還元電位（ＯＲＰ）が増加し、溶存酸素（ＤＯ）が増加し、電気伝導度（ＥＣ）が増加している。
【００４９】
（４）粉末大豆の溶解時のｐＨ変化の測定：１ｇの粉末大豆に１０ｍｌの供試水を添加してこれを撹拌しつつ、粉末大豆の溶解溶液のｐＨをガラス電極を用いて３０分の間測定した。得られた結果（ｐＨの経時的な変化）を図１に示す。同図に示すｐＨの経時的な変化は、供試水が浄水（ＮＷ）、ｐＨ１０．５の電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）、ｐＨ３．５の電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）、ＨＣｌａｑ．、およびＮａＯＨａｑ．の５種類である。供試水が浄水である場合には、ｐＨの変化は溶解後３０分経過後においてもわずか（ｐＨ０．１）である。
【００５０】
これに対して、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）、電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）である場合には、ｐＨは粉末大豆の溶解直後に大きく変化し、溶解後２分経過後にはほぼ中性近傍に移行している。電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）や電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）は、含有するＯＨ-やＨ+が粉末大豆の成分の官能基と反応して、ＯＨ-やＨ+が短時間に消失したものと認められる。
【００５１】
また、供試水がＨＣｌａｑ．、およびＮａＯＨａｑ．である場合には、電解生成水と同様に、ｐＨは溶解直後に大きく変化し、溶解後１分経過後にはほぼ中性近傍に移行している。このことは、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ）や電解生成酸性水（ＥＡＷ）である場合のｐＨの機能は、水酸化ナトリウム水溶液（ＮａＯＨａｑ．）や塩酸水溶液（ＨＣｌａｑ．）と同等の機能であるものと認められる。
【００５２】
（５）溶出タンパク質量の測定：１ｇの粉末大豆に１０ｍｌの供試水を添加し、これを３０℃で３０分間振とうした後、１４０００×ｇで１５分間冷却遠心分離を行い、得られた上澄みを濾紙（東洋濾紙株式会社製ＮＯ．２）で濾過し、この濾液を、Protein Assey Kit II（Bio-Red）を用いて、Bradford法によって溶出タンパク質の量を測定した。測定は、各供試水について５回行った。得られた結果を図２に示す。溶出タンパク質量は、供試水が浄水（ＮＷ）である場合に比較して、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ）である場合には多く、供試水が電解生成酸性水（ＥＡＷ）である場合にはわずかに少ない。
【００５３】
大豆の主要貯蔵タンパク質はグロブリンであって、グロブリンは平均的な等電点であるｐＨ４．８近傍で最低の溶解度を示す。当該事項を考慮すれば、電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５〜ＥＡＷ５）が当該等電点に近く、かつ、電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５〜ＥＣＷ９）が当該等電点に遠いことから、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ）である場合と電解生成酸性水（ＥＡＷ）での溶出タンパク質量の差は、ｐＨの影響によるものと認められる。また、電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）および電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）と対比するために採用した供試水である水酸化ナトリウム水溶液（ＮａＯＨａｑ．）および塩酸水溶液（ＨＣｌａｑ．）では、同じｐＨにおける溶出タンパク質量が電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）および電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）と同等である結果を得ていることからも、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ）の場合と電解生成酸性水（ＥＡＷ）の場合での溶出タンパク質量の差は、ｐＨの影響によるものと認められる。
【００５４】
（６）粉末大豆を加水分解酵素による加水分解反応試験：１ｇの粉末大豆に加水分解酵素である酵素剤（PROTEASE Type XXIII）２ｍｇを添加し、これに供試水１０ｍｌを加えて１分間撹拌し、これにトルエン２００μｌを加えて４０℃の下８０ｒｐｍで振とうしつつ加水分解反応（酵素反応）を進行させた。この間、反応時間１時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間毎に反応液を採取した。採取した各サンプルについては、採取後直ちに、５分間煮沸して反応を停止させ、引き続き、１４０００×ｇで１５分間冷却遠心分離に付した。次いで、得られた上澄み液を濾紙（東洋濾紙株式会社製ＮＯ．２）で濾過し、濾液（反応液）を得た。得られた各反応液を用いて、タンパク質量、電気泳動を測定した。
【００５５】
また、これらの反応液の１ｍｇを遠沈管に分取し、これにエタノール３ｍｌと７５％のエタノール４ｍｌを加えて１分間撹拌し、１００００ｒｐｍで１０分間冷却遠心分離してエタノール抽出液を得た。得られた各エタノール抽出液を用いて、ニンヒドリン法による総遊離アミノ酸量（タンパク質を構成する遊離アミノ酸の総量）、ＤＰＰＨ法（０．５ｍＭの1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl）によるラジカル消去能、Folin-Ciocalteu法によるフォーリン試薬反応物量、遊離アミノ酸組成含有量を測定した。
【００５６】
各測定項目のうち、タンパク質の測定では、反応開始１時間後および６時間後の反応液を採取したサンプルについては５倍希釈したもの、１２時間後、２４時間後、４８時間後および７２時間後に採取したサンプルについては３倍希釈したものを測定試料として、これらの試料についてProtein Assey Kit II（Bio-Red）を用いて、Bradford法によって測定した。
【００５７】
遊離アミノ酸量の測定では、エタノール抽出液０．５ｍｌを用いて、ニンヒドリン法によって測定した。
【００５８】
電気泳動の測定では、LAEMMLの方法により、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を行った。既製のポリアクリルアミドゲルは、アトー株式会社製のパジェルAE-600型（Lot No.SPG-520L）を用いて、泳動中は３０ｍＡの定電流で行い、染色には、クマシーブリリアントブルーR-250を用いた。
【００５９】
１ｇの粉末大豆に１０ｍｌの供試水を添えて、これを３０℃で８０ｒｐｍで３０分間振とうし、１４００×ｇで１５分間冷却遠心分離を行い、得られた上澄みを濾紙（東洋濾紙株式会社製ＮＯ．２）で濾過して得られたタンパク質抽出液については、タンパク質量を２０μｇに調整して電気泳動に供した。上記した１２時間反応後に採取したサンプルについても、タンパク質量を２０μｇに調整して電気泳動に供した。上記した７２時間反応後に採取したサンプルについては、タンパク質量を４．８μｇに調整して電気泳動に供した。
【００６０】
ラジカル消去能の測定では、エタノール抽出液から２ｍｌを分取して０．５ｍＭのＤＰＰＨ ／エタノール１ｍｌと０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）との混合液に加え、撹拌した後、３７℃で３０分間インキュベートして測定用試料とした。測定では、分光光度計（株式会社日立製作所製Ｕ−２００１型）で５１７ｎｍの吸光度にて測定した。なお、反応液の色が測定結果に与える影響を考慮して、ＤＰＰＨラジカルが関与しない系として、０．５ｍＭのＤＰＰＨ ／エタノールに替えてエタノールを加えたものを各試料の色ブランクとし、インキュベート後に５１７ｎｍでの吸光度を測定し、反応液と色ブランクとの吸光度の差をＤＰＰＨラジカル消去能とした。
【００６１】
フォーリン試薬反応物量の測定では、エタノール抽出液から２００μｌを分取し、これに蒸留水８００μｌを加えて希釈し、これに０．４Ｎのフェノール試薬１ｍｌを加えた後室温で３分間インキュベートし、インキュベート後に１０重量％の炭酸ナトリウム１ｍｌを加えて室温で６０分間インキュベートして測定用試料とした。測定では、分光光度計（株式会社日立製作所製Ｕ−２００１型）で７６０ｎｍの吸光度にて測定し、カテキン相当量としてフォーリン試薬反応物量を求めた。
【００６２】
遊離アミノ酸組成含有量の測定では、エタノール抽出液を用いて、ニンヒドリン法とＨＰＬＣによって測定した。液体クロマトグラフとしては、株式会社日立製作所製の日立Ｌ−６２００を使用し、カラムとして日立＃２６１９Ｆ（４φ×１５０：株式会社日立製作所製）を使用し、遊離液として和光純薬工業株式会社製の日立Ｌ−８５００用緩衝液（Baffer Solution PH-1,PH-2,PH-3）を使用し、反応液として和光純薬工業株式会社製の日立Ｌ−８５００用ニンヒドリン試薬セット（ニンヒドリン試薬／酢酸リチウム＝５０／５０）を使用し、流量を遊離液０．４ｍｌ／ｍｉｎ、反応液０．４ｍｌ／ｍｉｎとした。検出器としては、株式会社日立製作所製の日立Ｌ−４２５０を使用し、検出波長ｖｉｓ５７０ｎｍ，ｖｉｓ４４０ｎｍ、カラム温度６０℃、反応温度１３０℃、注入量１０μｌで検出し、データ解析には、Ｄ−７０００ＨＳＭを採用した。
【００６３】
（７）粉末大豆を用いた加水分解反応試験の結果：微生物由来の加水分解酵素である酵素剤（PROTEASE Type XXIII）および供試水を使用した加水分解反応における、反応液中のタンパク質量の経時的変化を図３に示す。同図に示す反応液中のタンパク質量の経時的変化は、供試水が浄水（ＮＷ）、電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）、および電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の３種類のものである。
【００６４】
加水分解反応開始から反応液中のタンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌに低下するのに要する時間は、供試水が浄水である場合には２２．７時間であるのに対して、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）である場合には１１．４時間であり、供試水が電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）である場合には１８．４時間である。この現象は、各供試水のｐＨに起因するタンパク質の抽出には関係せず、酵素の活性には、ｐＨとは異なる電解生成水（ＥＣＷ，ＥＡＷ）が有する他の特性が関与しているものと認められる。
【００６５】
加水分解反応過程における大豆タンパク質の分解の様子をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果を、泳動パターンとして図４に示す。同図に示す泳動パターン中、Ａは低分子量のマーカプロテインのパターン、Ｂ0，Ｂ12，Ｂ72は供試水が電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）であって、反応開始前のパターン、反応１２時間後のパターン、反応７２時間後のパターンであり、Ｃ0，Ｃ12，Ｃ72は供試水が浄水（ＮＷ）であって、反応開始前のパターン、反応１２時間後のパターン、反応７２時間後のパターンであり、Ｄ0，Ｄ12，Ｄ72は供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）であって、反応開始前のパターン、反応１２時間後のパターン、反応７２時間後のパターンである。
【００６６】
いずれの供試水の場合においても、反応１２時間後では、分子量１５ｋＤ付近において濃いバンドが認められるが、濃度の濃い順序は、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ）、電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）および浄水（ＮＷ）である。また、反応７２時間後では、供試水が浄水（ＮＷ）である場合には、分子量１５ｋＤ付近に単一の濃いバンドが認めらるが、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合にはバンドは認められず、供試水が電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合には薄いバンドがわずかに認められるにすぎない。
【００６７】
浄水（ＮＷ）、および、浄水（ＮＷ）を供試水との場合とは差が認められる電解生成水（ＥＡＷ３．５，ＥＣＷ１０．５）を供試水とする７２時間反応試験を各５回行い、ＤＰＰＨラジカル消去能の測定を行った結果を図５に示す。供試水が浄水（ＮＷ）の場合と電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合ではほぼ同等の活性を示したが、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合は有意に高い活性を示している。この要因を確認するため、総遊泳アミノ酸量、アミノ酸組成、フォーリング試薬反応物、ＤＤＰラジカル消去能の経時的変化を測定した。
【００６８】
加水分解反応液中のニンヒドリン法による総遊離アミノ酸量の経時的変化を図６に示す。総遊離アミノ酸量は、反応開始から２４時間までの間では、供試水がいずれの場合でも急激に増加しており、各供試水間での差は認められない。しかしながら、反応が２４時間経過後では、供試水が浄水（ＮＷ）の場合にはほぼ平衡状態となったが、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）および電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合には経時的に増加していることが認められる。
【００６９】
この現象は、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）および電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合には、酵素活性が電解生成水（ＥＡＷ３．５，ＥＣＷ１０．５）の作用を受けて継続していて、遊離アミノ酸の生成量が増加するものと認められる。総遊離アミノ酸量の差が最も大きい７２時間反応後の反応液のＨＰＬＣによる遊離アミノ酸組成を表３に示す。但し、各アミノ酸の名称については、三文字記号で示す。
【００７０】
【表３】
【００７１】
供試水が電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合には、供試水が浄水（ＮＷ）の場合に比較して、セリン、メチオニン、チロシン、ヒスチジン、アルギニンが高い値であり、トレオニン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンが低い値であった。供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合には、供試水が浄水（ＮＷ）の場合に比較して、チロシンが高い値であるが、他の組成については、浄水（ＮＷ）の場合とほぼ同じ傾向にあることを確認した。
【００７２】
遊離アミノ酸の総量は、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合が低い値であった。また、ニンヒドリン法とＨＰＬＣとのアミノ酸総量の差は、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合が最大となることを確認した。
【００７３】
加水分解反応液中のフォーリン試薬反応物量の経時的変化の結果を、図７に示す。これは、フォーリン試薬反応物量が抗酸化性と相関性があるとする理由に基づくものであって、フォーリン試薬反応物量は、反応開始から２４時間までは、各供試水のいずれの場合にも同じ増加傾向を示すが、供試水が浄水（ＮＷ）の場合には、反応時間が４８時間経過以降では減少傾向を示し、これに対して、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）および電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合には共に増加傾向にあることを確認した。フォーリン試薬反応物量の経時的変化は、総遊離アミノ酸量の経時的変化にほぼ一致している。
【００７４】
加水分解反応液中のＤＰＰＨラジカル消去能の経時的変化を、図８に示す。ＤＰＰＨラジカル消去能は、供試水が浄水（ＮＷ）の場合に比較して、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合には全体的に高く、また、供試水が電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合に全体的にわずかに高いことを確認した。
【００７５】
（８）大豆カゼインの溶解試験：粉末大豆を基質とする加水分解酵素による加水分解反応における供試水の効果の要因を調べるため、市販の大豆カゼインを各供試水に溶解して、基質の変化を検討する実験を行った。実験では、１ｇの大豆カゼイン（基質）に１０ｍｌの供試水を加えて、これを４０℃、８０ｒｐｍで６０分間振とうしインキュベートし、これを１４０００×ｇで１５分間冷却遠心分離を行い、得られた上澄み液について、ＤＴＮＢ法によって、ＳＨ基量を円偏光二色性法（ＣＤ）によりヘリックス含量を測定した。
【００７６】
ＳＨ基量については、１０倍量に希釈した上澄み液を０．７５ｍｌ分取し、これに蒸留水１．２５ｍｌと１５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍｌを加え、これにＤＮＴＢ（5,5'-dithiobis-2-nitorobenzoic acid ）液 ２０μｌを加えて５分間インキュベートし、これを吸光度の測定試料とした。吸光度の測定では４１２ｎｍの吸光度を測定し、測定値を分光吸光係数１３６００で割った値をＳＨ基量とした。
【００７７】
ヘリックス含量については、同一濃度に調整した各上澄み液を１００倍に希釈し、これを円偏光二色性法に基づくヘリックス含量の測定試料とした。測定は、日本分光株式会社製の円偏光二色分散分光光度計Ｊ−７２０を使用して行い、２５℃における測定試料のＣＤスペクトルを、光路長１ｃｍの石英セルを用いて、スキャンスピード１００ｎｍ、感度１００ｍｄｅｇで測定した。
【００７８】
（９）大豆カゼインの溶解試験の結果：各供試水に抽出したタンパク質のＳＨ基量を測定した結果を図９に示す。ＳＨ基量は、供試水が浄水（ＮＷ）の場合に比較して、供試水が電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合では１．３倍、、電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合では１．８倍と高い値であることを確認した。当該結果から、供試水が電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合では、ｐＨがＳＨ基の酸化を抑制しているものと、また、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合では、還元力がＳＨ基の酸化を抑制しているものと推測さる。
【００７９】
これを確認するため、モデル水による溶解実験を行い、そのＳＨ基量の測定結果を図１０に示す。モデル水としては、（ＨＣｌ-Ｉｏｎａｑ．）、（ＤＷ-Ｉｏｎａｑ．）、（ＮａＯＨ-Ｉｏｎａｑ．）、および、（Ｈ2-ＮａＯＨ-Ｉｏｎａｑ．）の４種類である。ＳＨ基量は、モデル水が（Ｄ．Ｗ-Ｉｏｎ−ａｑ．）である場合に比較して、モデル水が（ＨＣｌ-Ｉｏｎａｑ．）の場合では０．９倍、モデル水が（ＮａＯＨ-Ｉｏｎａｑ．）の場合では１．１倍、モデル水が（Ｈ2-ＮａＯＨ-Ｉｏｎａｑ．）の場合では１．３倍であることを確認した。
【００８０】
以上の結果は、電解生成酸性水（ＥＡＷ）では、ｐＨとイオン濃度以外の特性がＳＨ基の酸化抑制に関与していることを教示し、電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ）では、還元力＞ｐＨ・イオン濃度がこの関係でＳＨ基の酸化抑制に関与していることを教示している。また、モデル水が（Ｈ2-ＮａＯＨ-Ｉｏｎａｑ．）の場合でのＳＨ基量が、電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合でのＳＨ基量より少ないことは、電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）では、ｐＨ、イオン濃度、還元力およびそれ以外の特性がＳＨ基の酸化抑制に関与していることを教示している。
【００８１】
大豆タンパク質が電解生成水に溶解すると、分子の高次構造が変化することを考慮して、ＣＤスペクトルを測定した結果を図１１に示す。大豆カゼインは、水溶液状態ではヘリックス構造に富んだ構造を持っており、これを浄水（ＮＷ）と電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）に溶解した場合には、ヘリックス含量にほとんど変化は認められないが、電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）に溶解した場合には、波長２２５ｎｍ付近のモル楕円率にわずかながら変化が認められる。このモル楕円率の差は、最大で２〜４ｍｄｅｇ程度ではあるが、再現性が認められる。この結果は、電解生成酸性水が大豆カゼインの二次構造に影響を及ぼすことを教示している。
【００８２】
（１０）プロテアーゼ活性の測定
酵素活性は、酸性プロテアーゼについては、酵素剤２５ｍｇに供試水を加えて２５ｍｌに定容（酵素液）して酵素活性を測定し、中性プロテアーゼおよびアルカリ性プロテアーゼについては、酵素剤４ｍｇに供試水を加えて１００ｍｌに定容（酵素液）して酵素活性を測定した。
【００８３】
アルカリ性プロテアーゼの酵素反応では、０．０４Ｍホウ砂緩衝液（ｐＨ９）を含む１．２％カゼイン溶液５ｍｌを５分間予熱したものに、酵素液１ｍｌを加えて開始し、４０℃で６０分間反応後、ＴＣＡ混液５ｍｌを加えて反応を停止し、室温で２０分間放置した後、反応液を濾紙（東洋濾紙株式会社製NO.６）で濾過した。当該濾液を吸光度の測定試料とし、当該濾液０．５ｍｌに０．４Ｍ炭酸ナトリウム２．５ｍｌと０．４Ｎフェノール試薬０．５ｍｌを加えて４０℃で３０分間発色を行って、６６０ｎｍの吸光度を測定した。プロテアーゼ活性は、４０℃で６０分間に１μｇのチロシン相当量の呈色を示す活性を１Ｕとした。
【００８４】
これとの対照として、酵素液をＴＣＡ混液の添加直後に加えて、以下上記と同様の操作を行って吸光度を測定した。但し、ＴＣＡ混液については、酢酸９．３４ｍｌ、酢酸ナトリウム１１．６６ｇ、トリクロロ酢酸８．９９ｇに蒸留水を加え、これを５００ｍｌに定容したものを使用した。
【００８５】
中性プロテアーゼについては、０．０４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で、酸性プロテアーゼについては、０．０４ＭのMcllvain緩衝液（ｐＨ３）を含むカゼイン溶液中で反応を行った。
【００８６】
（１１）プロテアーゼ活性の測定結果：供試水に溶解した酵素剤のプロテアーゼ活性を測定した結果を図１２に示す。各供試水のプロテアーゼ活性は、供試水が浄水（ＮＷ）の場合を１として、その割合で示している。供試水が電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合では、酸性プロテアーゼのみが１．１２倍の活性であることを確認した。供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合では、中性プロテアーゼが１．１２倍、アルカリ性プロテアーゼが１．０８倍の活性であることを確認した。
【００８７】
電解生成水がプロテアーゼを活性化させる要因を確認するため、モデル水（ＨＣｌａｑ．）、（ＤＷ）、（ＮａＯＨａｑ．）に溶解した酵素剤のプロテアーゼ活性を測定した結果を図１３に示す。酸性プロテアーゼおよびアルカリ性プロテアーゼの活性については、酸性水およびアルカリ性水ともに同じ傾向を示すことを確認した。この結果は、電解生成酸性水および電解生成アルカリ性水のｐＨが酸性プロテアーゼおよびアルカリ性プロテアーゼの活性に寄与していることを教示している。中性プロテアーゼの活性については、（ＮａＯＨａｑ．）では０．９５倍とわずかに低下している。この結果は、中性プロテアーゼの活性化には、電解生成アルカリ性水のｐＨ以外の特性が関与していることを教示している。
【００８８】
粉末大豆を基質とするプロテアーゼによる酵素反応実験では、図１に示すように、反応時間の経過とともにｐＨが変化する。このため、ｐＨは中性付近でほぼ安定する反応開始１時間後の各反応液中のプロテアーゼの活性を測定し、その測定結果を図１４に示す。中性プロテアーゼの活性は、浄水（ＮＷ）の場合に比較して、電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合では１．１８倍と高い活性であり、電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合では０．７３倍と低い活性であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】粉末大豆溶解水溶液のｐＨの経時的変化を示すグラフである。
【図２】粉末大豆から各供試水に抽出されたタンパク質量を示すグラフである。
【図３】各供試水における反応液中のタンパク質量の経時的変化を示すグラフである。
【図４】各供試水における反応液中のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す電気泳動パターンである。
【図５】各供試水における大豆タンパク質分解物のＤＰＰＨラジカル消去能を示すグラフである。
【図６】各供試水における大豆タンパク質分解物の総遊離アミノ酸量の経時的変化を示すグラフである。
【図７】各供試水における大豆タンパク質分解物のフォーリング試薬反応物量の経時的変化を示すグラフである。
【図８】各供試水における大豆タンパク質分解物のＤＰＰＨラジカル消去能の経時的変化を示すグラフである。
【図９】各供試水中の大豆カゼインのＳＨ基量を示すグラフである。
【図１０】各供試水（モデル水）の大豆カゼインのＳＨ基量を示すグラフである。
【図１１】各供試水中の大豆カゼインのＣＤスペクトルを示すグラフである。
【図１２】各供試水中のプロテアーゼの活性を示すグラフである。
【図１３】各供試水（モデル水）中のプロテアーゼの活性を示すグラフである。
【図１４】各供試水における反応液中の中性プロテアーゼの活性を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、基質を、同基質とは独立した加水分解酵素を用いて加水分解（酵素反応）するための加水分解方法に関する。上記した「基質とは独立した加水分解酵素」とは、基質に内在する加水分解酵素ではなく、加水分解に際して、基質に添加される加水分解酵素を意味する。なお、本願発明の以下の説明では、断りの無い限り、「基質とは独立した加水分解酵素」を単に加水分解酵素という。
【０００２】
【従来の技術】
現在、基質を加水分解酵素を用いて加水分解する技術は、食品の加工分野、食品の調理分野、香料の製造分野、各種の油脂製造分野、工業製品の加工分野、各種製品の汚染除去分野等、極めて広い分野で利用されている。これらの分野では、被加水分解物である基質との関係で、当該基質の加水分解を促進するのに適した加水分解酵素を選択して加水分解反応を行って、有用な分解生成物を得たり、分解生成物を除去して基質の処理を行っている。
【０００３】
このように、当該加水分解方法での加水分解反応（酵素反応）は、加水分解酵素の作用が大きく関与していることから、加水分解反応を円滑かつ迅速に促進するには、酵素反応中、加水分解酵素が高い活性を保持していることが要求される。このため、従来の加水分解方法では、基質と加水分解酵素の反応系に緩衝液を介在させて、反応系を、加水分解酵素が最大の活性状態を保持する一定のｐＨに調整する手段が採られている。
【０００４】
しかしながら、当該加水分解方法を採用する場合においても、加水分解反応の開始に先だって、加水分解酵素の活性を高めておくことが有利である。この点に着目して、本発明者等はすでに、加水分解反応の前段階において、加水分解酵素を活性化する方法を提案している（例えば特許文献１参照）。
【０００５】
上記した特許文献１にて提案している酵素の活性化方法は、加水分解酵素であるアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ等を活性化するもので、当該加水分解酵素を電解生成水に溶解して活性化する手段を採っている。電解生成水としては、有隔膜電解にて生成される電解生成アルカリ性水と電解生成酸性水を採用し、これらの電解生成水を活性化の対象とする加水分解酵素に応じて使い分けしている。例えば、加水分解酵素がα−アミラーゼである場合には電解生成アルカリ性水を採用し、加水分解酵素が酸性プロテアーゼやリパーゼである場合には電解生成酸性水を採用している。
【０００６】
【特許文献１】
特開２０００−２４５４５３号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、上記した特許文献１にて提案している加水分解酵素の活性化方法は、電解生成水が有する固有の機能によって加水分解酵素を活性化させるものであって、基質と加水分解酵素の緩衝液中での加水分解反応の前段階で行われるものである。従って、加水分解酵素を活性化した後に引き続きなされる加水分解反応では、電解生成水の機能が緩衝液によって相殺されて消失されるおそれがあって、加水分解反応の途中では、加水分解酵素が高い活性を保持し得ない状態となるおそれがある。
【０００８】
また、当該加水分解酵素の活性化手段を採用する加水分解方法では、酵素液を調製する操作と基質液を調製する操作の２つの液の調製操作を必要とすることになって、加水分解反応の前段階の調製操作が面倒であり、当該加水分解方法を工業的に利用するのは不利である。
【０００９】
また、工業的規模の加水分解方法では市販の酵素剤を使用するが、酵素の精製には時間と多大な費用がかかり、しかも純度の高い酵素を大量に精製することができないことから、市販の酵素剤は、多数の種類の酵素が混在する純度の低いものである。従って、酵素剤中に混在するわずかな量ではあるが複数の酵素の利用を考慮すれば、反応系に緩衝液を存在させる加水分解方法では、混在する複数の酵素を有効に利用することはできない。
【００１０】
従って、本発明の主たる目的は、本発明者等がすでに確認している電解生成水の加水分解酵素の活性化機能を有効に利用して、基質と加水分解酵素との加水分解反応の開始時点から終了時点までの間、加水分解酵素の活性状態を保持する方法を提供して、反応系に緩衝液を使用することなく、加水分解反応を促進することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、基質とは独立した加水分解酵素により、同基質を加水分解するための加水分解方法に関するものであって、基質と、同基質とは独立した加水分解酵素と、電解生成水の３成分が混在する反応系で加水分解反応を行うものである。
【００１２】
しかして、本発明に係る加水分解方法においては、加水分解の開始時点から終了時点までの間、基質、加水分解酵素および分解生成物の反応系に電解生成水を常に存在させて、加水分解反応を促進させることを特徴とするものである。
【００１３】
本発明に係る加水分解方法においては、前記加水分解酵素として、微生物由来の加水分解酵素を採用することができ、また、前記電解生成水として、水または希薄食塩水を被電解水とする有隔膜電解にて生成される電解生成アルカリ性水または電解生成酸性水を採用することができる。この場合、前記電解生成水の選択にあっては、電解生成水の採用する加水分解酵素に対する活性化機能の有無を判断基準とするものである。
【００１４】
【発明の作用・効果】
本発明に係る加水分解方法は、基質と加水分解酵素と電解生成水の３成分の反応系で加水分解反応を行うものであり、この間、緩衝液を介在させることがないない。このため、当該加水分解方法によれば、加水分解の開始時点から終了時点まで間、基質、加水分解酵素および分解生成物が構成する反応系には常に電解生成水が存在し、当該電解生成水の酵素活性化機能によって、加水分解酵素は加水分解反応の終了時点まで高い酵素活性を保持して、加水分解反応を速やかに促進することになる。
【００１５】
また、本発明に係る加水分解方法では、反応系に緩衝液を介在させることがないため、加水分解反応の前段階において、基質液の調製操作と酵素液の調製操作の２つの液の調製操作を省略することができて、加水分解反応を促進する上で極めて有利である。
【００１６】
また、本発明に係る加水分解方法では、加水分解反応中常に電解生成水が存在しており、かつ、緩衝液等によって酵素に対する活性化機能を相殺されることがないことから、加水分解酵素として市販の酵素剤を使用する場合、酵素剤が含有する主たる酵素以外の複数の加水分解酵素を反応系のｐＨの変化に応じて次々に活性化させて、これらの加水分解酵素を当該加水分解反応に有効に利用することができ、この面からも、加水分解反応を一層促進することが可能になる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明は、加水分解酵素を用いる基質の加水分解方法であり、基質と加水分解酵素と電解生成水の３成分が構成する反応系で、加水分解反応を促進させるものである。本発明に係る加水分解方法では、加水分解の対象とする基質としては、例えば澱粉、タンパク質、脂質、セルロース等を挙げることができ、また、これらの基質に対応する加水分解酵素としては、例えばアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼを挙げることができる。これらの加水分解酵素は、いずれも微生物由来の加水分解酵素である。
【００１８】
これらの各加水分解酵素においては、例えばα−アミラーゼは、澱粉の加水分解酵素として、デキストリン、異性化糖、ブドウ糖、水飴、マルトース、マルトオリゴ糖、シクロデキストリン、カップリングシュガー等の製造に使用され、例えば酸性プロテアーゼは、大豆タンパク質の加水分解酵素として、醤油、味噌、麺つゆ、焼き肉のたれ、ドレッシング等の製造に使用され、例えばリパーゼは、脂質の加水分解酵素として、脂肪酸、石鹸、糖脂肪酸エステル等の界面活性剤、香料、メントール等の製造に使用され、また、例えばセルラーゼは、セルロースの加水分解酵素として、繊維柔軟化加工、セルロースの除去による汚れ除去加工等に使用される。
【００１９】
本発明に係る加水分解方法における最大の特徴は、上記した各基質と各加水分解酵素の適宜の組合わによる加水分解反応において、各基質と各加水分解酵素との反応系に電解生成水を介在させること、換言すれば、基質と加水分解酵素と電解生成水の３成分の反応系で加水分解反応を行うことにある。
【００２０】
本発明に係る加水分解方法では、加水分解反応の開始時点から終了時点までの間、基質、加水分解酵素および分解生成物の反応系に、加水分解酵素に対する酵素活性機能を有する電解生成水が常に存在していることであり、これにより、加水分解酵素は、基質の加水分解が終了する時点まで高い活性状態を保持して、加水分解反応を促進させるものである。
【００２１】
本発明に係る加水分解方法においては、基質と加水分解酵素と電解生成水の３成分の反応系では、加水分解反応の初期の急激な進行によって、そのｐＨが急激に変化して中性の近傍に至り、その後の加水分解反応の進行によって、そのｐＨが漸次中性に近づく現象が認められる。この現象は、反応系にｐＨを一定に保持するための緩衝液が存在しないためであり、電解生成水の高い酵素活性化機能と、当該電解生成水が加水分解反応の終了時まで存在していることによって、酵素剤中のほぼ不可避的に混在している複数の加水分解酵素がｐＨの変化によって順次活性化されて、基質の加水分解反応に寄与しているためと推測される。
【００２２】
基質の加水分解反応の反応系に、同反応系のｐＨを一定に調整するための緩衝液を存続させる従来の加水分解方法では、反応系のｐＨを一定に調整して加水分解酵素の酵素活性を維持して、基質の加水分解反応を促進させることを意図しているものであり、当該加水分解方法では、基質の酸化抑制や二次構造の変化等については全く考慮されていない。また、当該加水分解方法では、加水分解反応で生成される加水分解生成物の酸化抑制については、当然のことながら考慮されていない。
【００２３】
これに対して、本発明に係る加水分解方法においては、基質の加水分解反応の反応系には、ｐＨを一定に調整するための緩衝液を存在させず、これに替えて、加水分解酵素の酵素活性機能を有する電解生成水を存続させているものである。このため、本発明に係る加水分解方法によれば、当該電解生成水が有するｐＨ、酸化還元電位、イオン濃度の特性、および、その他の固有の特性を複合的に有効に利用して、基質の加水分解反応の促進を図ることができ、これにより、加水分解生成物を効率よく生成することができる。
【００２４】
本発明に係る加水分解方法においては、電解生成水として、有隔膜電解にて生成される各電解生成水、すなわち、電解生成アルカリ性水および電解生成酸性水を選択的に採用することができる。これらの電解生成水は、採用する加水分解酵素に応じて使い分けして使用する。
【００２５】
電解生成アルカリ性水および電解生成酸性水を選択する判断基準は、採用する加水分解酵素に対する活性化機能の有無を基準とする。例えば、冒頭で例示している本出願人の先願である特許文献１に明示しているように、α−アミラーゼに対しては電解生成アルカリ性水を選択し、酸性プロテアーゼに対しては電解生成酸性水を選択し、アルカリ性プロテアーゼに対しては電解生成アルカリ性水を選択し、リパーゼに対しては電解生成酸性水を選択し、セルラーゼに対しては電解生成酸性水を選択する。
【００２６】
本発明に係る加水分解方法で採用する電解生成水は、有隔膜電解にて生成される電解生成アルカリ性水または電解生成酸性水であるが、当該有隔膜電解では、被電解水として、水道水、天然水等の一般水や希薄食塩水を採用することができる。原料である被電解水のコストを考慮すれば、被電解水として水道水等の一般水であることが好ましい。
【００２７】
電解生成水、特に電解生成酸性水中に残留する塩素成分（残留塩素成分）の加水分解酵素や基質に対する影響は、残留塩素成分が低濃度の場合には問題ないが、残留塩素成分が高濃度の場合については十分に検討してはいない。このため、高濃度の残留塩素成分の、加水分解酵素や基質に及ぼす影響を皆無とすることを考慮すれば、被電解水は一般水であることが好ましい。
【００２８】
本発明に係る加水分解方法に採用するのに好ましい電解生成アルカリ性水としては、ｐＨが８．５〜１１の範囲、酸化還元電位が１００〜−８００ｍＶの範囲のものである。当該電解生成アルカリ性水のイオン濃度については、被電解水が水道水の場合には硬度が１０〜３００ｍｇ／ｌであり、被電解水が塩類の希薄水溶液である場合には塩濃度が１０〜３００ｍｇ／ｌである。また、採用するに好ましい電解生成酸性水は、ｐＨが３．０〜５．５の範囲、酸化還元電位が９００〜４００ｍＶの範囲であり、イオン濃度については、上記した電解生成アルカリ性水の場合と同様である。これらの各電解生成水は、加水分解反応における加水用水と同様の態様で使用される。
【００２９】
本発明に係る加水分解方法において、電解生成水として電解生成アルカリ性水を採用する場合、電解生成アルカリ性水は、加水分解反応では基質の酸化を抑制しつつ酵素反応を促進させ、加水分解生成物の酸化を抑制しており、フリーラジカル消去能が高い。また、本発明に係る加水分解方法において、電解生成水として電解生成酸性水を採用する場合、電解生成酸性水は、加水分解反応では基質の酸化を抑制しつつ基質の二次構造の変化をも抑制して酵素反応を促進させ、加水分解生成物の酸化を抑制しており、フリーラジカル消去能が高い。
【００３０】
本発明に係る加水分解方法においては、基質、加水分解酵素および電解生成水が構成する反応系が加水分解反応の進行によってｐＨが変化するが、反応系のｐＨの変化に応じて、使用する酵素剤に混在している他の複数の酵素が順次活性化されて加水分解反応に寄与して、加水分解反応を促進させる。
【００３１】
本発明に係る加水分解方法においては、反応系のｐＨを一定に調整する緩衝液を反応系に存続させるものではないことから、加水分解反応の前段階において、従来のごとき基質液の調製操作と酵素液の調製操作を省略することができて、加水分解反応を促進する上で極めて有利である。
【００３２】
本発明者等は、本発明に係る加水分解方法を、加水分解酵素の代表例であるアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼを用いて実施することにより、その作用効果を確認している。下記の「実施例」の項では、その一例である大豆タンパク質（基質）をアスペルギルスオリゼー由来のプロテアーゼ（加水分解酵素）で加水分解反応を行った実験例を詳細に示す。
【００３３】
【実施例】
本実施例は、大豆タンパク質を加水分解（酵素分解）して、抗酸化性で低分子量のペプチド（分子量２５００〜３０００）を生成するのに水が関与していることに着目して、機能性を付与した電解生成水の有効性を評価することを目的としているものである。
【００３４】
従来、大豆の発酵食品である醤油、味噌の製造に用いられている麹菌は、そのほとんどがアスペルギルスオリゼーであり、麹の酵素のなかでもプロテアーゼは、大豆タンパク質を分解するのに最も重要な役割を果たしている。プロテアーゼの活性を高めることは、大豆の発酵食品の品質、食味、収量等の向上や、大豆の発酵食品の製造期間の短縮に寄与する。本実施例では、味噌の製造方法を参考にして、大豆タンパク質の酵素分解に対する電解生成水（電解生成アルカリ性水および電解生成酸性水）の有効性を評価をするものである。
【００３５】
本実施例では、供試水として、水道水を被電解水とする有隔膜電解にて生成された電解生成アルカリ性水および電解生成酸性水、浄水、その他のアルカリ性水および酸性水を採用し、加水分解酵素として、プロテアーゼ（Aspergillus oryze由来）を採用して、大豆タンパク質（基質）を加水分解して低分子量のペプチドを生成する酵素反応実験、および、当該酵素反応に関連する実験を行い、各電解生成水の有効性について検討して評価した。以下には、各実験の内容、各測定方法、および測定結果を詳細に示すとともに、評価を示す。
【００３６】
（１）評価の要約：加水用水として電解生成水を採用すれば、反応系のｐＨを一定に調製するための緩衝液を使用することなく、大豆タンパク質を効率よく加水分解して、低分子量のペプチドを生成することができる。この事実は、従来の加水分解と同等またはそれ以上の効率を得る加水分解反応（酵素反応）を行う場合に、従来の加水分解方法では不可避としている基質液の調製操作と酵素液の調製操作を省略し得ることを教示している。従って、本発明に係る加水分解方法は、低分子量のペプチドの生成に極めて有利な方法である。
【００３７】
使用する電解生成水が電解生成アルカリ性水である場合には、大豆タンパク質の加水分解物である低分子量のペプチドが多く生成されること、および、当該ペプチドはＤＰＰＨラジカル（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl）の消去能力が高く、分解率の上昇にともなって増大する。この現象は、使用する電解生成水が電解生成酸性水である場合もほぼ同様の傾向にある。但し、この現象は、電解生成酸性水の場合には、電解生成アルカリ性水の場合ほど顕著ではない。
【００３８】
大豆タンパク質の加水分解反応（酵素反応）に、電解生成アルカリ性水、電解生成酸性水を採用すれば、基質である大豆タンパク質の酸化を抑制する効果があることを確認した。抗酸化性の高いペプチドを生成するには、基質である大豆タンパク質の酸化を抑制することが重要である。
【００３９】
電解生成アルカリ性水は、アルカリ性プロテアーゼおよび中性プロテアーゼの酵素活性を高めて、基質である大豆タンパク質の加水分解反応を促進させることを確認した。また、電解生成酸性水は、酸性プロテアーゼの酵素活性を高めるが、中性プロテアーゼ の酵素活性を高める効果が無いことを確認した。これらの酵素活性の要因は定かではないが、電解生成水のｐＨ、イオン濃度、酸化還元電位等の特性と、これら以外の特性とが関与しているものと推測される。
【００４０】
（２）実験で採用した試料：基質は、粒径２０μｍ以下に粉砕された水分４．３重量％、タンパク質３９．５重量％、脂質２１．２重量％、糖質２７．２重量％、繊維質３．１重量％、灰分４．７重量％の全脂活性大豆粉末（株式会社ゴトウ食品製）、および、大豆カゼイン（SIGMA社製）である。加水分解酵素は、微生物由来の加水分解酵素（Aspergillus oryzse由来のSIGMA社製PROTEASE Type XXIII）である。供試水は、下記の１０種類の水である。
【００４１】
一般の水道水を浄水器（株式会社メイスイ製FX-21LZ）で残留塩素成分を除去した水（浄水…ＮＷ）、これを被電解水として有隔膜電解式電解水生成装置（ホシザキ電機株式会社製HOX-４０A）にて生成した電解生成アルカリ性水（ｐＨ１０．５…ＥＣＷ１０，５，ｐＨ１０…ＥＣＷ１０，ｐＨ９…ＥＣＷ９）、および、電解生成酸性水（ｐＨ３．５…ＥＡＷ３．５，ｐＨ４…ＥＡＷ４，ｐＨ５…ＥＡＷ５）。
【００４２】
蒸留水（ＤＷ）に水酸化ナトリウムを溶解して調製したｐＨ１０．５のアルカリ性水溶液（ＮａＯＨａｑ．）、および、蒸留水（ＤＷ）に塩酸を溶解して調製したｐＨ３．５の酸性水溶液（ＨＣｌａｑ．）。これらの（ＮａＯＨａｑ．）および（ＨＣｌａｑ．）は、電解生成水のｐＨ、イオン濃度（Ｉｏｎ）、酸化還元電位（ＯＲＰ）の効果を検討するためのコントロールである。
【００４３】
（ＮａＯＨａｑ．）に硫酸ナトリウムを溶解してイオン濃度をｐＨ１０．５の電解生成アルカリ性水と同一になるように調整した水溶液（ＮａＯＨ-Ｉｏｎａｑ．）、および、（ＨＣｌａｑ．）に硫酸ナトリウムを溶解してイオン濃度をｐＨ３．５の電解生成酸性水と同一になるように調整した水溶液（ＨＣｌ-Ｉｏｎａｑ．）
蒸留水（ＤＷ）に硫酸ナトリウムを溶解してイオン濃度を浄水と同一になるように調整した水溶液（ＤＷ-Ｉｏｎａｑ．）、および、（ＮａＯＨ-Ｉｏｎａｑ．）に水素ガスを２００ｍｌ／ｍｉｎで通気してＯＲＰをｐＨが１０．５の電解生成アルカリ性水と同一になるように調整した水溶液（Ｈ2-ＮａＯＨ-Ｉｏｎ ａｑ．）。
【００４４】
（３）供試水の水質分析：ＪＩＳ Ｋ０１０１の工業用水試験方法に基づいて、供試水の水質を分析した。ｐＨの測定には、ｐＨ計（株式会社堀場製作所製Ｍ-１２）を使用。ＯＲＰの測定には、ｐＨ／ＯＲＰ計（株式会社堀場製作所製Ｄ-１３）を使用。電気伝導度（ＥＣ）の測定には、電気伝導度計（株式会社堀場製作所製ＥＳ-１４）を使用。溶存酸素（ＤＯ）の測定には、ｐＨ／ＤＯ計（株式会社堀場製作所製Ｄ-２５）を使用。溶存水素（ＤＨ）の測定には、溶存水素計（東亜電波工業株式会社製ＤＨＤＩ-１）を使用。陽イオンの測定には、原子吸光分光光度計（株式会社日立製作所製Ｚ-５３００）を使用。塩素イオン（Ｃｌ-）の測定には、硝酸銀滴定法を使用。リン酸イオン（ＰＯ4 3-）の測定には、モリブデン青（塩化すずII）吸光光度法を使用。硫酸イオン（ＳＯ4 2-）の測定には、ブルシン吸光光度法を使用。
【００４５】
これらの測定に基づく各供試水の水質の分析結果を、表１および表２に示す。但し、電解生成水については、本実験で主として採用する、電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）および電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）のみを、その代表例として示している。
【００４６】
【表１】
【表２】
電解生成水は、浄水（ＮＷ）を被電解水とする有隔膜電解にて生成したもので、電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ）は電解槽の陰極側電解室で生成され、かつ、電解生成酸性水（ＥＡＷ）は電解槽の陽極側電解室で生成されたものである。電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ）は、ｐＨが９〜１０．５の範囲にあって、被電解水である浄水（ＮＷ）に比較してカチオンが増加し、酸化還元電位（ＯＲＰ）が低下し、溶存水素（ＤＨ）が増加し、電気伝導度（ＥＣ）が増加している。電解生成酸性水（ＥＡＷ）は、ｐＨが３．５〜５の範囲にあって、被電解水である浄水（ＮＷ）に比較してアニオンが増加し、酸化還元電位（ＯＲＰ）が増加し、溶存酸素（ＤＯ）が増加し、電気伝導度（ＥＣ）が増加している。
【００４９】
（４）粉末大豆の溶解時のｐＨ変化の測定：１ｇの粉末大豆に１０ｍｌの供試水を添加してこれを撹拌しつつ、粉末大豆の溶解溶液のｐＨをガラス電極を用いて３０分の間測定した。得られた結果（ｐＨの経時的な変化）を図１に示す。同図に示すｐＨの経時的な変化は、供試水が浄水（ＮＷ）、ｐＨ１０．５の電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）、ｐＨ３．５の電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）、ＨＣｌａｑ．、およびＮａＯＨａｑ．の５種類である。供試水が浄水である場合には、ｐＨの変化は溶解後３０分経過後においてもわずか（ｐＨ０．１）である。
【００５０】
これに対して、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）、電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）である場合には、ｐＨは粉末大豆の溶解直後に大きく変化し、溶解後２分経過後にはほぼ中性近傍に移行している。電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）や電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）は、含有するＯＨ-やＨ+が粉末大豆の成分の官能基と反応して、ＯＨ-やＨ+が短時間に消失したものと認められる。
【００５１】
また、供試水がＨＣｌａｑ．、およびＮａＯＨａｑ．である場合には、電解生成水と同様に、ｐＨは溶解直後に大きく変化し、溶解後１分経過後にはほぼ中性近傍に移行している。このことは、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ）や電解生成酸性水（ＥＡＷ）である場合のｐＨの機能は、水酸化ナトリウム水溶液（ＮａＯＨａｑ．）や塩酸水溶液（ＨＣｌａｑ．）と同等の機能であるものと認められる。
【００５２】
（５）溶出タンパク質量の測定：１ｇの粉末大豆に１０ｍｌの供試水を添加し、これを３０℃で３０分間振とうした後、１４０００×ｇで１５分間冷却遠心分離を行い、得られた上澄みを濾紙（東洋濾紙株式会社製ＮＯ．２）で濾過し、この濾液を、Protein Assey Kit II（Bio-Red）を用いて、Bradford法によって溶出タンパク質の量を測定した。測定は、各供試水について５回行った。得られた結果を図２に示す。溶出タンパク質量は、供試水が浄水（ＮＷ）である場合に比較して、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ）である場合には多く、供試水が電解生成酸性水（ＥＡＷ）である場合にはわずかに少ない。
【００５３】
大豆の主要貯蔵タンパク質はグロブリンであって、グロブリンは平均的な等電点であるｐＨ４．８近傍で最低の溶解度を示す。当該事項を考慮すれば、電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５〜ＥＡＷ５）が当該等電点に近く、かつ、電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５〜ＥＣＷ９）が当該等電点に遠いことから、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ）である場合と電解生成酸性水（ＥＡＷ）での溶出タンパク質量の差は、ｐＨの影響によるものと認められる。また、電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）および電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）と対比するために採用した供試水である水酸化ナトリウム水溶液（ＮａＯＨａｑ．）および塩酸水溶液（ＨＣｌａｑ．）では、同じｐＨにおける溶出タンパク質量が電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）および電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）と同等である結果を得ていることからも、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ）の場合と電解生成酸性水（ＥＡＷ）の場合での溶出タンパク質量の差は、ｐＨの影響によるものと認められる。
【００５４】
（６）粉末大豆を加水分解酵素による加水分解反応試験：１ｇの粉末大豆に加水分解酵素である酵素剤（PROTEASE Type XXIII）２ｍｇを添加し、これに供試水１０ｍｌを加えて１分間撹拌し、これにトルエン２００μｌを加えて４０℃の下８０ｒｐｍで振とうしつつ加水分解反応（酵素反応）を進行させた。この間、反応時間１時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間毎に反応液を採取した。採取した各サンプルについては、採取後直ちに、５分間煮沸して反応を停止させ、引き続き、１４０００×ｇで１５分間冷却遠心分離に付した。次いで、得られた上澄み液を濾紙（東洋濾紙株式会社製ＮＯ．２）で濾過し、濾液（反応液）を得た。得られた各反応液を用いて、タンパク質量、電気泳動を測定した。
【００５５】
また、これらの反応液の１ｍｇを遠沈管に分取し、これにエタノール３ｍｌと７５％のエタノール４ｍｌを加えて１分間撹拌し、１００００ｒｐｍで１０分間冷却遠心分離してエタノール抽出液を得た。得られた各エタノール抽出液を用いて、ニンヒドリン法による総遊離アミノ酸量（タンパク質を構成する遊離アミノ酸の総量）、ＤＰＰＨ法（０．５ｍＭの1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl）によるラジカル消去能、Folin-Ciocalteu法によるフォーリン試薬反応物量、遊離アミノ酸組成含有量を測定した。
【００５６】
各測定項目のうち、タンパク質の測定では、反応開始１時間後および６時間後の反応液を採取したサンプルについては５倍希釈したもの、１２時間後、２４時間後、４８時間後および７２時間後に採取したサンプルについては３倍希釈したものを測定試料として、これらの試料についてProtein Assey Kit II（Bio-Red）を用いて、Bradford法によって測定した。
【００５７】
遊離アミノ酸量の測定では、エタノール抽出液０．５ｍｌを用いて、ニンヒドリン法によって測定した。
【００５８】
電気泳動の測定では、LAEMMLの方法により、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を行った。既製のポリアクリルアミドゲルは、アトー株式会社製のパジェルAE-600型（Lot No.SPG-520L）を用いて、泳動中は３０ｍＡの定電流で行い、染色には、クマシーブリリアントブルーR-250を用いた。
【００５９】
１ｇの粉末大豆に１０ｍｌの供試水を添えて、これを３０℃で８０ｒｐｍで３０分間振とうし、１４００×ｇで１５分間冷却遠心分離を行い、得られた上澄みを濾紙（東洋濾紙株式会社製ＮＯ．２）で濾過して得られたタンパク質抽出液については、タンパク質量を２０μｇに調整して電気泳動に供した。上記した１２時間反応後に採取したサンプルについても、タンパク質量を２０μｇに調整して電気泳動に供した。上記した７２時間反応後に採取したサンプルについては、タンパク質量を４．８μｇに調整して電気泳動に供した。
【００６０】
ラジカル消去能の測定では、エタノール抽出液から２ｍｌを分取して０．５ｍＭのＤＰＰＨ ／エタノール１ｍｌと０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）との混合液に加え、撹拌した後、３７℃で３０分間インキュベートして測定用試料とした。測定では、分光光度計（株式会社日立製作所製Ｕ−２００１型）で５１７ｎｍの吸光度にて測定した。なお、反応液の色が測定結果に与える影響を考慮して、ＤＰＰＨラジカルが関与しない系として、０．５ｍＭのＤＰＰＨ ／エタノールに替えてエタノールを加えたものを各試料の色ブランクとし、インキュベート後に５１７ｎｍでの吸光度を測定し、反応液と色ブランクとの吸光度の差をＤＰＰＨラジカル消去能とした。
【００６１】
フォーリン試薬反応物量の測定では、エタノール抽出液から２００μｌを分取し、これに蒸留水８００μｌを加えて希釈し、これに０．４Ｎのフェノール試薬１ｍｌを加えた後室温で３分間インキュベートし、インキュベート後に１０重量％の炭酸ナトリウム１ｍｌを加えて室温で６０分間インキュベートして測定用試料とした。測定では、分光光度計（株式会社日立製作所製Ｕ−２００１型）で７６０ｎｍの吸光度にて測定し、カテキン相当量としてフォーリン試薬反応物量を求めた。
【００６２】
遊離アミノ酸組成含有量の測定では、エタノール抽出液を用いて、ニンヒドリン法とＨＰＬＣによって測定した。液体クロマトグラフとしては、株式会社日立製作所製の日立Ｌ−６２００を使用し、カラムとして日立＃２６１９Ｆ（４φ×１５０：株式会社日立製作所製）を使用し、遊離液として和光純薬工業株式会社製の日立Ｌ−８５００用緩衝液（Baffer Solution PH-1,PH-2,PH-3）を使用し、反応液として和光純薬工業株式会社製の日立Ｌ−８５００用ニンヒドリン試薬セット（ニンヒドリン試薬／酢酸リチウム＝５０／５０）を使用し、流量を遊離液０．４ｍｌ／ｍｉｎ、反応液０．４ｍｌ／ｍｉｎとした。検出器としては、株式会社日立製作所製の日立Ｌ−４２５０を使用し、検出波長ｖｉｓ５７０ｎｍ，ｖｉｓ４４０ｎｍ、カラム温度６０℃、反応温度１３０℃、注入量１０μｌで検出し、データ解析には、Ｄ−７０００ＨＳＭを採用した。
【００６３】
（７）粉末大豆を用いた加水分解反応試験の結果：微生物由来の加水分解酵素である酵素剤（PROTEASE Type XXIII）および供試水を使用した加水分解反応における、反応液中のタンパク質量の経時的変化を図３に示す。同図に示す反応液中のタンパク質量の経時的変化は、供試水が浄水（ＮＷ）、電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）、および電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の３種類のものである。
【００６４】
加水分解反応開始から反応液中のタンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌに低下するのに要する時間は、供試水が浄水である場合には２２．７時間であるのに対して、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）である場合には１１．４時間であり、供試水が電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）である場合には１８．４時間である。この現象は、各供試水のｐＨに起因するタンパク質の抽出には関係せず、酵素の活性には、ｐＨとは異なる電解生成水（ＥＣＷ，ＥＡＷ）が有する他の特性が関与しているものと認められる。
【００６５】
加水分解反応過程における大豆タンパク質の分解の様子をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果を、泳動パターンとして図４に示す。同図に示す泳動パターン中、Ａは低分子量のマーカプロテインのパターン、Ｂ0，Ｂ12，Ｂ72は供試水が電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）であって、反応開始前のパターン、反応１２時間後のパターン、反応７２時間後のパターンであり、Ｃ0，Ｃ12，Ｃ72は供試水が浄水（ＮＷ）であって、反応開始前のパターン、反応１２時間後のパターン、反応７２時間後のパターンであり、Ｄ0，Ｄ12，Ｄ72は供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）であって、反応開始前のパターン、反応１２時間後のパターン、反応７２時間後のパターンである。
【００６６】
いずれの供試水の場合においても、反応１２時間後では、分子量１５ｋＤ付近において濃いバンドが認められるが、濃度の濃い順序は、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ）、電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）および浄水（ＮＷ）である。また、反応７２時間後では、供試水が浄水（ＮＷ）である場合には、分子量１５ｋＤ付近に単一の濃いバンドが認めらるが、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合にはバンドは認められず、供試水が電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合には薄いバンドがわずかに認められるにすぎない。
【００６７】
浄水（ＮＷ）、および、浄水（ＮＷ）を供試水との場合とは差が認められる電解生成水（ＥＡＷ３．５，ＥＣＷ１０．５）を供試水とする７２時間反応試験を各５回行い、ＤＰＰＨラジカル消去能の測定を行った結果を図５に示す。供試水が浄水（ＮＷ）の場合と電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合ではほぼ同等の活性を示したが、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合は有意に高い活性を示している。この要因を確認するため、総遊泳アミノ酸量、アミノ酸組成、フォーリング試薬反応物、ＤＤＰラジカル消去能の経時的変化を測定した。
【００６８】
加水分解反応液中のニンヒドリン法による総遊離アミノ酸量の経時的変化を図６に示す。総遊離アミノ酸量は、反応開始から２４時間までの間では、供試水がいずれの場合でも急激に増加しており、各供試水間での差は認められない。しかしながら、反応が２４時間経過後では、供試水が浄水（ＮＷ）の場合にはほぼ平衡状態となったが、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）および電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合には経時的に増加していることが認められる。
【００６９】
この現象は、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）および電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合には、酵素活性が電解生成水（ＥＡＷ３．５，ＥＣＷ１０．５）の作用を受けて継続していて、遊離アミノ酸の生成量が増加するものと認められる。総遊離アミノ酸量の差が最も大きい７２時間反応後の反応液のＨＰＬＣによる遊離アミノ酸組成を表３に示す。但し、各アミノ酸の名称については、三文字記号で示す。
【００７０】
【表３】
供試水が電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合には、供試水が浄水（ＮＷ）の場合に比較して、セリン、メチオニン、チロシン、ヒスチジン、アルギニンが高い値であり、トレオニン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンが低い値であった。供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合には、供試水が浄水（ＮＷ）の場合に比較して、チロシンが高い値であるが、他の組成については、浄水（ＮＷ）の場合とほぼ同じ傾向にあることを確認した。
【００７２】
遊離アミノ酸の総量は、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合が低い値であった。また、ニンヒドリン法とＨＰＬＣとのアミノ酸総量の差は、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合が最大となることを確認した。
【００７３】
加水分解反応液中のフォーリン試薬反応物量の経時的変化の結果を、図７に示す。これは、フォーリン試薬反応物量が抗酸化性と相関性があるとする理由に基づくものであって、フォーリン試薬反応物量は、反応開始から２４時間までは、各供試水のいずれの場合にも同じ増加傾向を示すが、供試水が浄水（ＮＷ）の場合には、反応時間が４８時間経過以降では減少傾向を示し、これに対して、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）および電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合には共に増加傾向にあることを確認した。フォーリン試薬反応物量の経時的変化は、総遊離アミノ酸量の経時的変化にほぼ一致している。
【００７４】
加水分解反応液中のＤＰＰＨラジカル消去能の経時的変化を、図８に示す。ＤＰＰＨラジカル消去能は、供試水が浄水（ＮＷ）の場合に比較して、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合には全体的に高く、また、供試水が電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合に全体的にわずかに高いことを確認した。
【００７５】
（８）大豆カゼインの溶解試験：粉末大豆を基質とする加水分解酵素による加水分解反応における供試水の効果の要因を調べるため、市販の大豆カゼインを各供試水に溶解して、基質の変化を検討する実験を行った。実験では、１ｇの大豆カゼイン（基質）に１０ｍｌの供試水を加えて、これを４０℃、８０ｒｐｍで６０分間振とうしインキュベートし、これを１４０００×ｇで１５分間冷却遠心分離を行い、得られた上澄み液について、ＤＴＮＢ法によって、ＳＨ基量を円偏光二色性法（ＣＤ）によりヘリックス含量を測定した。
【００７６】
ＳＨ基量については、１０倍量に希釈した上澄み液を０．７５ｍｌ分取し、これに蒸留水１．２５ｍｌと１５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍｌを加え、これにＤＮＴＢ（5,5'-dithiobis-2-nitorobenzoic acid ）液 ２０μｌを加えて５分間インキュベートし、これを吸光度の測定試料とした。吸光度の測定では４１２ｎｍの吸光度を測定し、測定値を分光吸光係数１３６００で割った値をＳＨ基量とした。
【００７７】
ヘリックス含量については、同一濃度に調整した各上澄み液を１００倍に希釈し、これを円偏光二色性法に基づくヘリックス含量の測定試料とした。測定は、日本分光株式会社製の円偏光二色分散分光光度計Ｊ−７２０を使用して行い、２５℃における測定試料のＣＤスペクトルを、光路長１ｃｍの石英セルを用いて、スキャンスピード１００ｎｍ、感度１００ｍｄｅｇで測定した。
【００７８】
（９）大豆カゼインの溶解試験の結果：各供試水に抽出したタンパク質のＳＨ基量を測定した結果を図９に示す。ＳＨ基量は、供試水が浄水（ＮＷ）の場合に比較して、供試水が電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合では１．３倍、、電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合では１．８倍と高い値であることを確認した。当該結果から、供試水が電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合では、ｐＨがＳＨ基の酸化を抑制しているものと、また、供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合では、還元力がＳＨ基の酸化を抑制しているものと推測さる。
【００７９】
これを確認するため、モデル水による溶解実験を行い、そのＳＨ基量の測定結果を図１０に示す。モデル水としては、（ＨＣｌ-Ｉｏｎａｑ．）、（ＤＷ-Ｉｏｎａｑ．）、（ＮａＯＨ-Ｉｏｎａｑ．）、および、（Ｈ2-ＮａＯＨ-Ｉｏｎａｑ．）の４種類である。ＳＨ基量は、モデル水が（Ｄ．Ｗ-Ｉｏｎ−ａｑ．）である場合に比較して、モデル水が（ＨＣｌ-Ｉｏｎａｑ．）の場合では０．９倍、モデル水が（ＮａＯＨ-Ｉｏｎａｑ．）の場合では１．１倍、モデル水が（Ｈ2-ＮａＯＨ-Ｉｏｎａｑ．）の場合では１．３倍であることを確認した。
【００８０】
以上の結果は、電解生成酸性水（ＥＡＷ）では、ｐＨとイオン濃度以外の特性がＳＨ基の酸化抑制に関与していることを教示し、電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ）では、還元力＞ｐＨ・イオン濃度がこの関係でＳＨ基の酸化抑制に関与していることを教示している。また、モデル水が（Ｈ2-ＮａＯＨ-Ｉｏｎａｑ．）の場合でのＳＨ基量が、電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合でのＳＨ基量より少ないことは、電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）では、ｐＨ、イオン濃度、還元力およびそれ以外の特性がＳＨ基の酸化抑制に関与していることを教示している。
【００８１】
大豆タンパク質が電解生成水に溶解すると、分子の高次構造が変化することを考慮して、ＣＤスペクトルを測定した結果を図１１に示す。大豆カゼインは、水溶液状態ではヘリックス構造に富んだ構造を持っており、これを浄水（ＮＷ）と電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）に溶解した場合には、ヘリックス含量にほとんど変化は認められないが、電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）に溶解した場合には、波長２２５ｎｍ付近のモル楕円率にわずかながら変化が認められる。このモル楕円率の差は、最大で２〜４ｍｄｅｇ程度ではあるが、再現性が認められる。この結果は、電解生成酸性水が大豆カゼインの二次構造に影響を及ぼすことを教示している。
【００８２】
（１０）プロテアーゼ活性の測定
酵素活性は、酸性プロテアーゼについては、酵素剤２５ｍｇに供試水を加えて２５ｍｌに定容（酵素液）して酵素活性を測定し、中性プロテアーゼおよびアルカリ性プロテアーゼについては、酵素剤４ｍｇに供試水を加えて１００ｍｌに定容（酵素液）して酵素活性を測定した。
【００８３】
アルカリ性プロテアーゼの酵素反応では、０．０４Ｍホウ砂緩衝液（ｐＨ９）を含む１．２％カゼイン溶液５ｍｌを５分間予熱したものに、酵素液１ｍｌを加えて開始し、４０℃で６０分間反応後、ＴＣＡ混液５ｍｌを加えて反応を停止し、室温で２０分間放置した後、反応液を濾紙（東洋濾紙株式会社製NO.６）で濾過した。当該濾液を吸光度の測定試料とし、当該濾液０．５ｍｌに０．４Ｍ炭酸ナトリウム２．５ｍｌと０．４Ｎフェノール試薬０．５ｍｌを加えて４０℃で３０分間発色を行って、６６０ｎｍの吸光度を測定した。プロテアーゼ活性は、４０℃で６０分間に１μｇのチロシン相当量の呈色を示す活性を１Ｕとした。
【００８４】
これとの対照として、酵素液をＴＣＡ混液の添加直後に加えて、以下上記と同様の操作を行って吸光度を測定した。但し、ＴＣＡ混液については、酢酸９．３４ｍｌ、酢酸ナトリウム１１．６６ｇ、トリクロロ酢酸８．９９ｇに蒸留水を加え、これを５００ｍｌに定容したものを使用した。
【００８５】
中性プロテアーゼについては、０．０４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で、酸性プロテアーゼについては、０．０４ＭのMcllvain緩衝液（ｐＨ３）を含むカゼイン溶液中で反応を行った。
【００８６】
（１１）プロテアーゼ活性の測定結果：供試水に溶解した酵素剤のプロテアーゼ活性を測定した結果を図１２に示す。各供試水のプロテアーゼ活性は、供試水が浄水（ＮＷ）の場合を１として、その割合で示している。供試水が電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合では、酸性プロテアーゼのみが１．１２倍の活性であることを確認した。供試水が電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合では、中性プロテアーゼが１．１２倍、アルカリ性プロテアーゼが１．０８倍の活性であることを確認した。
【００８７】
電解生成水がプロテアーゼを活性化させる要因を確認するため、モデル水（ＨＣｌａｑ．）、（ＤＷ）、（ＮａＯＨａｑ．）に溶解した酵素剤のプロテアーゼ活性を測定した結果を図１３に示す。酸性プロテアーゼおよびアルカリ性プロテアーゼの活性については、酸性水およびアルカリ性水ともに同じ傾向を示すことを確認した。この結果は、電解生成酸性水および電解生成アルカリ性水のｐＨが酸性プロテアーゼおよびアルカリ性プロテアーゼの活性に寄与していることを教示している。中性プロテアーゼの活性については、（ＮａＯＨａｑ．）では０．９５倍とわずかに低下している。この結果は、中性プロテアーゼの活性化には、電解生成アルカリ性水のｐＨ以外の特性が関与していることを教示している。
【００８８】
粉末大豆を基質とするプロテアーゼによる酵素反応実験では、図１に示すように、反応時間の経過とともにｐＨが変化する。このため、ｐＨは中性付近でほぼ安定する反応開始１時間後の各反応液中のプロテアーゼの活性を測定し、その測定結果を図１４に示す。中性プロテアーゼの活性は、浄水（ＮＷ）の場合に比較して、電解生成アルカリ性水（ＥＣＷ１０．５）の場合では１．１８倍と高い活性であり、電解生成酸性水（ＥＡＷ３．５）の場合では０．７３倍と低い活性であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】粉末大豆溶解水溶液のｐＨの経時的変化を示すグラフである。
【図２】粉末大豆から各供試水に抽出されたタンパク質量を示すグラフである。
【図３】各供試水における反応液中のタンパク質量の経時的変化を示すグラフである。
【図４】各供試水における反応液中のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す電気泳動パターンである。
【図５】各供試水における大豆タンパク質分解物のＤＰＰＨラジカル消去能を示すグラフである。
【図６】各供試水における大豆タンパク質分解物の総遊離アミノ酸量の経時的変化を示すグラフである。
【図７】各供試水における大豆タンパク質分解物のフォーリング試薬反応物量の経時的変化を示すグラフである。
【図８】各供試水における大豆タンパク質分解物のＤＰＰＨラジカル消去能の経時的変化を示すグラフである。
【図９】各供試水中の大豆カゼインのＳＨ基量を示すグラフである。
【図１０】各供試水（モデル水）の大豆カゼインのＳＨ基量を示すグラフである。
【図１１】各供試水中の大豆カゼインのＣＤスペクトルを示すグラフである。
【図１２】各供試水中のプロテアーゼの活性を示すグラフである。
【図１３】各供試水（モデル水）中のプロテアーゼの活性を示すグラフである。
【図１４】各供試水における反応液中の中性プロテアーゼの活性を示すグラフである。
Claims (4)
- 基質を同基質とは独立した加水分解酵素を用いて加水分解する方法であり、基質と、同基質とは独立した加水分解酵素と、電解生成水の３成分が混在する反応系で加水分解反応を行って、加水分解の開始時点から終了時点までの間、基質、加水分解酵素および分解生成物が構成する反応系に常に電解生成水を存在させて、加水分解反応を促進させることを特徴とする加水分解方法。
- 請求項１に記載の加水分解方法において、前記加水分解酵素として、微生物由来の加水分解酵素を採用することを特徴とする加水分解方法。
- 請求項１に記載の加水分解方法において、前記電解生成水として、水または希薄食塩水を被電解水とする有隔膜電解にて生成される電解生成アルカリ性水または電解生成酸性水を採用することを特徴とする加水分解方法。
- 請求項３に記載の加水分解方法において、前記電解生成水の選択は、電解生成水の採用する加水分解酵素に対する活性化機能の有無を判断基準とすることを特徴とする加水分解方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002329483A JP4348066B2 (ja) | 2002-11-13 | 2002-11-13 | 加水分解酵素を用いる基質の加水分解方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002329483A JP4348066B2 (ja) | 2002-11-13 | 2002-11-13 | 加水分解酵素を用いる基質の加水分解方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004159567A JP2004159567A (ja) | 2004-06-10 |
| JP4348066B2 true JP4348066B2 (ja) | 2009-10-21 |
Family
ID=32807463
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002329483A Expired - Fee Related JP4348066B2 (ja) | 2002-11-13 | 2002-11-13 | 加水分解酵素を用いる基質の加水分解方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4348066B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021101639A (ja) * | 2019-12-25 | 2021-07-15 | 株式会社ミカサ | 動物の飼育方法、堆肥の製造方法、および酵素反応の制御方法 |
-
2002
- 2002-11-13 JP JP2002329483A patent/JP4348066B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2004159567A (ja) | 2004-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Generation of antioxidative peptides from Atlantic sea cucumber using alcalase versus trypsin: In vitro activity, de novo sequencing, and in silico docking for in vivo function prediction | |
| KR101174299B1 (ko) | 카세인 가수분해물, 그 제조법 및 그 용도 | |
| BEN‐MEIR et al. | Specificity of Streptomyces griseus aminopeptidase and modulation of activity by divalent metal ion binding and substitution | |
| Oliveira et al. | Antioxidant activity and inhibition of meat lipid oxidation by soy protein hydrolysates obtained with a microbial protease | |
| CN112272701B (zh) | 稳定化的纤维素酶变体 | |
| KR101785430B1 (ko) | 마카 추출물 및 실크단백질을 포함하는 기능성 식품 조성물. | |
| WO2022215688A1 (ja) | 加工ヘンプタンパク質含有液状組成物の製造方法 | |
| JP4348066B2 (ja) | 加水分解酵素を用いる基質の加水分解方法 | |
| Zhang et al. | Changes of antioxidative activities and peptidomic patterns of Auxenochlorella pyrenoidosa protein hydrolysates: Effects of enzymatic hydrolysis and decoloration processes | |
| Zhang et al. | Debittering effect of partially purified proteases from soybean seedlings on soybean protein isolate hydrolysate produced by alcalase | |
| JP3139563B2 (ja) | 米糠蛋白誘導ペプチドの製造方法 | |
| JP2009091306A (ja) | 抗酸化剤 | |
| JPH09294583A (ja) | アミノペプチダーゼｇｘ及びそれを用いるタンパク質の加水分解方法 | |
| JPH04126079A (ja) | 微生物起源カルボキシペプチダーゼｂ様酵素 | |
| FR2541308A1 (en) | Protein hydrolysate free from bitter taste | |
| Silva et al. | Antioxidant activities of chicken egg white hydrolysates obtained by new purified protease of Aspergillus avenaceus URM 6706 | |
| Yamashita et al. | Purification and characterization of isoamyl alcohol oxidase (“Mureka”-forming enzyme) | |
| Ono et al. | Production of water soluble antioxidative plastein from squid hepatopancreas | |
| CN110951808A (zh) | 一种以小球藻粉为原料制备高f值低聚肽的方法 | |
| CN103103241A (zh) | 以玉米醇溶蛋白为原料制备玉米寡肽的方法 | |
| Park et al. | Protein properties of mackerel viscera extracted by supercritical carbon dioxide | |
| CN116268174B (zh) | 一种低苦味的酪蛋白酶解物及其制备方法与应用 | |
| JP3217909B2 (ja) | 加水分解調味料の製造方法 | |
| WO2024071388A1 (ja) | 酵素剤及びその応用 | |
| JP2866286B2 (ja) | 酒類、食品の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051024 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080513 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080627 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081028 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081204 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090630 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090717 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120724 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120724 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130724 Year of fee payment: 4 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |